COOPERACIÓN DE ONCOPROTEÍNAS EN EL DESARROLLO DE LA LEUCEMIA

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1 COOPERACIÓN DE ONCOPROTEÍNAS EN EL DESARROLLO DE LA LEUCEMIA Investigador principal: Dr. Luciano di Croce Centre de Regulació Genòmica Duración: 3 años

2 1. Resumen La desregulación de los factores de transcripción, coincidiendo con las alteraciones epigenéticas, es un rasgo distintivo de muchos tipos de leucemia. Se sabe que el factor de transcripción c-myc se activa en aproximadamente un 70% de todos los cánceres. Por tanto, nos proponemos estudiar la interacción funcional de c-myc con la proteína de la leucemia promielocítica (PML). A pesar de que la PML por sí sola es una proteína supresora de tumores, su fusión con el receptor de ácido retinoico alfa (RARa) da como resultado una translocación cromosómica en la leucemia aguda promielocítica (APL), convirtiéndose en una potente oncoproteína. Nuestros resultados dilucidarán un aspecto nuevo y posiblemente involucrado en la regulación general del oncógeno Myc, cuya desregulación podría contribuir a una gran variedad de cánceres y leucemia. Nuestro estudio aportará importantes elementos para entender cómo la oncoproteína PML-RARa y Myc cooperan en la regulación de genes y en el desarrollo de APL. El propósito del presente proyecto es caracterizar la interacción y cooperación de c-myc con la proteína supresora de tumores PML y con su homólogo oncogénico PML-RARa, así como identificar los mecanismos de silenciamiento epigenético durante los primeros pasos de progresión de la leucemia. Cada vez existen mayores evidencias de que PML actúa como un gen supresor de tumores. Por el contrario, la expresión de Myc está asociada con la proliferación celular incontrolada y con la inestabilidad genómica, principalmente por la regulación positiva de genes que promueven el crecimiento celular y la proliferación, así como por la regulación negativa de genes que tienen efectos citostáticos y de vigilancia del DNA. Resulta 2

3 significativo que el 15-40% de los pacientes con leucemia aguda promielocítica (APL) presenten trisomía completa o parcial del cromosoma 8 como defectos secundarios, correspondiendo la región más pequeña que se beneficia a 8q23-24, donde se encuentra el gen de c-myc. La observación de que la trayectoria tumorigénica de Myc se seleccione preferentemente en estas malignidades, sugiere que puede ser necesario examinar PML para estudiar la actividad de Myc. Se requiere PML para la represión transcripcional de genes diana alterados, la mayoría de los cuales son también diana de Myc. Sobre la base de estos resultados preliminares, seguiremos 3 líneas paralelas de investigación que afrontará los mecanismos moleculares y los aspectos in vivo del proyecto. Más específicamente, estudiaremos: 1. La interferencia de PML en la función de Myc. Basándonos en nuestro descubrimiento preliminar que PML reduce la vida media de la proteína Myc, estudiaremos este nuevo aspecto en la regulación del oncógeno Myc y su relevancia en la leucemia. 2. La cooperación de Myc con factores de transcripción oncogénicos. Esta parte del proyecto se centrará en la cooperación entre los factores de transcripción oncogénica y Myc Los mecanismos de silenciamiento epigenético impuestos por PML- RARa en la leucemia. El factor de transcripción oncogénico PML-RAR bloquea la transcripción a través del reclutamiento de mecanismos epigenéticos, como DNMT y las proteínas del grupo Polycomb. 2. Resultados Visión general Hemos seguido diferentes líneas de investigación aparentemente independientes (cuyos resultados aparecen publicados en diferentes manuscritos). A pesar de ello, las mencionadas líneas se interconectan, no 3

4 sólo por el uso del mismo sistema modelo (células de leucemias agudas promielocíticas), sino también por el conocimiento acumulado durante estos 3 últimos años sobre cómo múltiples mecanismos están involucrados en las transformaciones leucémicas. Podemos llegar al fondo de estos mecanismos y en el futuro ser capaces de detectar aquellos mecanismos cambiantes para obtener un enfoque terapéutico. Las principales conclusiones son: 1) La desestabilización de Myc mediada por PML y la derepresión de genes que inhiben el ciclo celular como mecanismo regulador importante que permite la diferenciación de células y que podría evitar la proliferación aberrante conducida por la actividad incontrolada de Myc. 2) Myc fosforilado regula un conjunto de genes involucrados en la diferenciación hematopoyética. Se consigue por la interacción directa con otros factores de transcripción básicos. Ya que la interacción se retiene en las células leucémicas, se puede explotar para realzar la diferenciación de células indiferenciadas. 3) El papel clave que desempeña la oncoproteína PML-RAR durante el desarrollo de la leucemia por ser una diana directa de las proteínas del grupo Polycomb. Descripción 1. PML interfiere en la función de Myc Nuestros resultados muestran que la interacción de PML con Myc no sólo provoca una reducción en los niveles proteicos de Myc, sino que también inhibe su función transcripcional con un sesgo en sentido represivo. Mostramos que la proteína PML contribuye a estimular la diferenciación granulocítica a través de la desestabilización de la proteína Myc. Teniendo en cuenta la función de inhibición del crecimiento de los genes diana cdkn2b/p15 y cdkn1a/p21, la degradación de Myc mediada por PML puede 4

5 aportar un mecanismo de regulación importante para mantener la función de Myc controlada y, de este modo, prevenir la proliferación aberrante de las células. En la leucemia aguda promielocítica, la proteína de fusión PML- RARa ejerce su capacidad oncogénica interfiriendo en las funciones normales de RARa y PML. La presencia de la fusión PML-RARa no sólo reduce los niveles endógenos de PML a causa de la ocupación de un alelo, sino que también inhibe activamente muchas de las funciones normales de PML. La pérdida de la regulación negativa de Myc a través de PML puede, en consecuencia, contribuir al desarrollo de cáncer. Es por ello que entender detalladamente la regulación de Myc por parte de PML aporta otra pista importante para entender el complejo proceso de la carcinogénesis. Figura 1. PML induce la degradación de Myc, reactivando los genes reprimidos por Myc. 2. Cooperación de Myc con un factor de transcripción oncogénico Hemos demostrado que un factor de transcripción oncogénico interacciona con Myc. Esto lleva a la corregulación de un conjunto de genes en células leucémicas. La cooperación en la regulación de la transcripción depende estrictamente del estado de fosforilación de Myc. La presencia de ambos factores de transcripción en los genes diana provoca un reclutamiento específico de un conjunto de correguladores, observado a través de la técnica de inmunoprecipitación de la cromatina. Por último, Myc fosforilado 5

6 incrementa la habilidad de los quimioterápicos para inducir la diferenciación de células de leucemia aguda promielocítica. Figura 2. Myc fosforilado facilita la diferenciación de las células cancerígenas. 3. Mecanismos de silenciamiento epigenético inducidos por PML-RARa en leucemia Hemos investigado el papel del grupo de proteínas Polycomb y el complejo NuRD en el establecimiento y mantenimiento del silenciamiento aberrante de genes supresores de tumores durante la transformación inducida por la proteína de fusión asociada a la leucemia PML-RARa. Nuestros resultados muestran que el complejo NuRD desempeña un papel esencial a lo largo de la deposición de marcas epigenéticas. Adicionalmente, si disminuimos la cantidad del complejo represivo Polycomb 2 (knockdown) en células leucémicas, pueden revertirse no sólo las modificaciones de las histonas, sino también inducir desmetilación del DNA de los genes diana de PML- RARa. Esto resulta en la reactivación de los promotores y la diferenciación granulocítica. Cabe resaltar que las alteraciones epigenéticas producidas por PML-RARa pueden ser revertidas a través de tratamiento con ácido retinoico de blastos primarios procedentes de pacientes con leucemia. Nuestros resultados demuestran que la afectación directa del grupo de proteínas Polycomb por un oncógeno desempeña un papel clave durante la carcinogénesis. 6

7 Figura 3. PML-RARa bloquea la transcripción de diferentes genes claves en la diferenciación hematopoyética a través de la interacción con los complejos NuRD y Polycomb. La inhibición de la actividad Polycomb junto con el tratamiento con ácido retinoico puede restablecer la diferenciación normal. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos El papel que desempeña la epigenética en cáncer es cada vez objeto de más estudios, aunque sin embargo, la interacción entre factores de transcripción y alteraciones epigenéticas ha sido poco investigada. Por dicha razón el objetivo de nuestro proyecto fue caracterizar la interacción y cooperación de c-myx con el supresor de tumores PML y su equivalente oncogénico PML- 7

8 RARa, así como identificar los mecanismos de silenciamiento epigenético durante los primeros pasos de la progresión leucémica. Los resultados que hemos obtenido durante nuestra investigación contribuirán a la comprensión general de los pasos moleculares del silenciamiento génico y el papel de la epigenética en el desarrollo del cáncer. Cabe señalar que los tipos de análisis que hemos utilizado pueden proporcionar a su vez nuevos datos funcionales sobre los complejos moleculares recientemente identificados, llevándonos de esta forma a identificar perfiles únicos de alteraciones en leucemia. Además, nuestro trabajo completo ayudará a identificar nuevas dianas biológicas que pueden ser explotadas como terapia en cáncer. Teniendo en cuenta que la desregulación de genes está involucrada en la patogénesis de muchos otros desórdenes, el conocimiento obtenido será aplicable de múltiples formas. Estas aproximaciones técnicas y científicas podrían ser potencialmente aplicadas en estudios de diferentes complejos moleculares y tumores. 4. Publicaciones Buschbeck M., Uribesalgo I., Ledl A., Gutierrez A., Minucci S., Muller S., and Di Croce L. (2007) PML4 induces differentiation by Myc destabilization. Oncogene, 26, Villa R, Pasini D, Gutierrez A, Viré E, Nomdedeu JF, Jenuwein T, Pelicci PG, Minucci S, Fuks F, Helin K, and Di Croce L (2007) Role of the Polycomb repressive complex 2 in leukemia. Cancer Cell, 11,

9 Carnicer MJ, Lasa A, Buschbeck M, Serrano E, Carricondo M, Brunet S, Aventin A, Sierra J, Di Croce L, and Nomdedeu JF. (2008) K313dup is a recurrent CEBPA mutation in de novo acute myeloid leukemia (AML). Ann Hematol, 87, Morey L, Brenner C, Fazi F, Villa R, Gutierrez A, Buschbeck M, Nervi C, Minucci S, Fuks F, and Di Croce L. (2008) MBD3, a component of the NuRD complex, facilitates chromatin alteration and deposition of epigenetic marks. Mol Cell Biol. 28, Buschbeck M, Uribesalgo I, Wibowo I, Rué P, Martin D, Gutierrez A, Morey L, Guigó R, López-Schier H, and Di Croce L. (2009) The histone variant macroh2a is an epigenetic regulator of key developmental genes. Nature Struct Mol Biol. 16,