REGULACIÓN DE LAS VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL DEPENDIENTES DE LAS PRESENILINAS EN CÁNCER DE PIEL

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1 REGULACIÓN DE LAS VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL DEPENDIENTES DE LAS PRESENILINAS EN CÁNCER DE PIEL Investigador principal: Dr. Carlos A. Saura Antolin Facultat de Medicina UAB Duración: 3 años

2 1. Resumen Las presenilinas (PS) son las unidades catalíticas del complejo γ-secretasa, una aspartil proteasa que regula las vías de señalización celular de la proteína precursora de β-amiloide (APP), Notch-1 y β-catenina. Mutaciones autosómicas dominantes en los genes de las presenilinas (PS: PS1 y PS2) causan Alzheimer familiar hereditario al alterar el metabolismo del APP y la generación del péptido β-amiloide, el cual se acumula en forma de placas en el cerebro de enfermos de Alzheimer. Además, las PS regulan procesos de proliferación, ya que su inactivación parcial en ratones knockout PS1-/- o PS1+/-; PS2-/- causa tumores de piel malignos y benignos, respectivamente. Los mecanismos moleculares implicados en la formación de tumores debido a la pérdida de función de las PS son desconocidos. Debido a que la desregulación de las vías de señalización de Notch-1 y β-catenina han sido implicadas en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el epitelial, y que el receptor de EGF (EGFR) favorece procesos oncogénicos, hipotetizamos que las PS podrían causar transformación celular en procesos oncogénicos en la epidermis mediante la regulación de las vías de señalización de Notch-1, β-catenina i/o EGFR. Los objetivos de este estudio han sido: 1) determinar los mecanismos moleculares por los cuales las PS podrían regular la expresión y señalización del receptor de EGF; 2) determinar la función de las PS durante el desarrollo de tumores epiteliales en piel, y 3) estudiar los mecanismos moleculares por los cuales las PS regulan la señalización de EGFR y Notch durante el desarrollo de cáncer de piel. Para cumplir estos objetivos se diseñó el siguiente plan de trabajo: 1. Determinar los mecanismos moleculares por los cuales las PS regulan la expresión y señalización de EGFR. Se estudió la regulación transcripcional y degradación del receptor de EGF mediante técnicas bioquímicas en fibroblastos de piel de embriones de ratones controles y PS -/-. 2

3 2. Examinar el papel de las PS en el desarrollo de cáncer de piel in vivo. En este contexto, se generó un nuevo modelo knockout inducible de deleción de ambas PS en piel (eps cdko) mediante la inactivación específica e inducible de ambas PS en queratinocitos del estrato basal de la epidermis. 3. Determinar las vías de señalización por las que las PS regulan el receptor EGFR y Notch durante el desarrollo de cáncer de piel. Se estudiaron los niveles y activación de los receptores EGFR y Notch, así como los niveles de β-catenina en queratinocitos primarios y piel de ratones controles y eps cdko. Los resultados obtenidos indican que la inactivación de las PS causa transformación celular al potenciar la señalización de EGFR en células inmortalizadas y queratinocitos primarios de ratones knockout de PS. Observamos un incremento en la expresión y señalización de EGFR debido a un retraso en la degradación a causa de la alteración de la ubiquitinización/desubiquitinitzación de este receptor. La regulación de la degradación de EGFR por PS depende de la actividad de la E3 ubiquitina ligasa Fbw7. En este trabajo hemos descrito por primera vez que la pérdida de función de PS produce un exceso en la transcripción génica de Fbw7, el cual regula positivamente los niveles de EGFR. Estos resultados han sido corroborados en un modelo de ratón inducible con deficiencia específica de PS en piel (eps cdko), generado durante el desarrollo de este proyecto. Los ratones eps cdko desarrollan espontáneamente tumores de tipo escamoso (SCC) en la piel del cuello y presentan susceptibilidad tumoral frente a la exposición de agentes citotóxicos. Estos resultados son muy relevantes, ya que a pesar de actuar Fbw7 normalmente como un gen supresor de tumores en algunos tejidos, hemos demostrado por primera vez que Fbw7 está aumentado en un proceso tumoral epitelial y promueve transformación celular en la epidermis. 3

4 2. Resultados 1. La inactivación de les PS en fibroblastos causa un incremento de la proliferación y transformación oncogénica que depende de la señalización de EGFR. La inactivación de las PS en fibroblastos y queratinocitos primarios causa un incremento de la proliferación, especialmente en condiciones bajas de suero o factores tróficos, y confiere capacidad de crecimiento de forma independiente al sustrato, indicativo de transformación oncogénica. Para discernir los receptores específicos implicados en el fenotipo proliferativo realizamos un cribado farmacológico. El fenotipo oncogénico adquirido es bloqueado al inhibir específicamente la vía de señalización de EGFR con PD y PD pero no inhibiendo ErbB2 (AG825), PDGFR/VEGFR (SU4312), IGFR (Picropodophyllin) o FGFR (SU5402). La inactivación de las PS en fibroblastos embrionarios causa un incremento en los niveles de EGFR y una activación sostenida de su señalización medida con la activación Raf, MEK1/2, ERK1/2 i p90-rsk. Este aumento es debido a un retraso de la degradación constitutiva e inducida por ligando en ausencia de PS, efecto que es independiente de la actividad γ-secretasa. 2. La inactivación de las PS aumenta los niveles la ubiquitina ligasa Fbw7, la cual ubiquitiniza y estabiliza el EGFR. Fbw7 es una ubiquitina ligasa que actúa como gen supresor de tumores en varios tipos de cáncer. En fibroblastos deficientes en PS detectamos niveles elevados de Fbw7 y una disminución de sus dianas, C-jun y el fragmento C- terminal de Notch, indicando un incremento en su actividad. Las PS regulan negativamente e independientemente de la actividad γ-secretasa, la activación transcripcional de Fbw7. La expresión de Fbw7 en células 293T causa un incremento en la ubiquitinación y estabilidad de EGFR, resultando un aumento en la fosforilación y activación de EGFR. Opuestamente, la inactivación de Fbw7 en fibroblastos embrionarios o células epiteliales 4

5 disminuye la expresión de EGFR, demostrando que Fbw7 actúa estabilizando el EGFR. 3. La inactivación de Fbw7 revierte el efecto oncogénico producido por la ausencia de PS. Para demostrar que Fbw7 contribuye a la transformación celular de fibroblastos PS-/- mediada por EGFR, analizamos la capacidad de crecimiento independientemente del sustrato de fibroblastos control y PS-/- al inactivar Fbw7 mediante sirna. El silenciamiento de Fbw7 produce una reducción significativa en la activación de EGFR y en el número de colonias formadas en medio semisólido, siendo muy similar al número obtenido al bloquear la vía de señalización de EGFR mediante el inhibidor PD Estos resultados apoyan la hipótesis de que el incremento en los niveles de Fbw7 produce transformación celular mediada por la vía de señalización de EGFR en células de piel deficientes en PS. 4. Generación y caracterización morfológica de ratones condicionales knockout de PS en piel (eps cdko). Para examinar si las PS intervienen en procesos proliferativos in vivo, se generó un nuevo modelo murino de tumores epiteliales de piel inducible inactivando ambas PS en la capa basal de la epidermis (eps cdko). Los ratones eps cdko son viables y no presentan ninguna alteración fenotípica hasta los 2 meses de edad, momento en el que inician un rápido deterioro, muriendo a una edad máxima de 3 meses de edad. El análisis histológico de la piel de los ratones eps cdko demostró la presencia de hiperplasia e hiperqueratinización de la epidermis, así como desorganización de las capas de la piel (figura 1). Además, las lesiones cutáneas de la piel del cuello de los ratones eps cdko corresponden a un proceso tumoral altamente vascularizado histológicamente clasificado como tumor de tipo escamoso (SCC). Existe infiltración de la epidermis en el estroma e hipodermis, evidenciada por perlas de queratina inmersas en la parte dérmica de la piel, característica propia de los SCC. De forma muy interesante, ratones 5

6 deficientes únicamente en PS1 no presentan ningún tipo de alteración a los dos meses de edad, indicando que presenilina es un gen supresor de tumores dosis-dependiente. 5. Las vías de señalización de EGFR y Fbw7 están alteradas en la piel de los ratones condicionales knockout eps cdko. La caracterización morfológica de los SCC desarrollados por los ratones eps cdko mostró un incremento de los niveles totales de β-catenina en la capa basal epitelial. Estos resultados corroboran otros trabajos anteriores en modelos de deleción parcial de PS (Xia et al., 2001; Tournoy et al., 2004). Comparado con ratones controles, se detectó un incremento en los niveles del receptor EGFR coincidiendo con la hiperproliferación de la piel de la espalda y en queratinocitos primarios de ratones eps cdko. Además, se detectó un incremento de los niveles de ERK1/2 fosforilada, indicando una activación de esta vía. El análisis mediante inmunohistoquímica y Western Blotting demostró un incremento de Fbw7 y una disminución de fragmento intracelular de Notch1 (NICD) en la epidermis y queratinocitos primarios de ratones eps cdko. Estos resultados indican que la formación de tumores de piel de tipo escamoso en los ratones eps cdko está asociada a un incremento en los niveles de β-catenina, Fbw7 y a una disminución de su substrato NICD (figura 2). Figura 1. Los ratones deficientes en presenilinas en epidermis (eps cdko) presentan tumores escamosos de piel (SCC). Las imágenes A, B i C muestran tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) representativas de piel de la espalda de ratones controles (PS1/PS2), deficientes en PS1 (eps1 cko) o deficientes en ambas PS (eps cdko) a los 2,5 meses de edad. Las imágenes D, E y F muestran tinciones de la piel del cuello de los mismos animales. Se observa que en ausencia de ambas PS se produce una hiperproliferación e hiperqueratosis de la epidermis y el desarrollo de tumores SCC en la piel del cuello. En la imagen G y la ampliación de la misma (H) se muestran con mayor detalle los tumores SCC desarrollados por los ratones eps cdko. Se observa una masiva hiperproliferación infiltrante, angiogénesis (señalada con puntas de flecha) y la presencia de perlas de queratina (asteriscos). Barra de escala: 50 µm. 6

7 Figura 2. Vías de señalización reguladas por las presenilinas durante la proliferación y transformación celular de la epidermis. Los resultados obtenidos indican que las presenilinas (PS) generan y promueven la degradación del fragmento intracelular de Notch-1 (NICD) a través de su actividad g-secretase y Fbw7, respectivamente. Por el contrario, PS modula negativamente, directa o indirectamente, a través de Fbw7, la ubiquitinación y estabilidad de EGFR (Rocher-Ros et al., 2010). 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos En el presente proyecto de investigación hemos puesto de manifiesto que los genes de las PS actúan como genes supresores de tumores en la epidermis, ya que ratones con una deleción específica de PS en piel desarrollan tumores de tipo escamoso (SCC). Este fenotipo es debido a la desregulación de las vías de señalización de Notch y EGFR a través de un mecanismo regulado por la ubiquitina ligasa Fbw7 (Figura 2). Nuestros resultados indican que presenilina es un importante gen supresor de tumores al regular diferentes vías de señalización implicadas en proliferación y diferenciación de la epidermis. Los ratones eps cdko generados y descritos en el desarrollo de este proyecto podrían ser un buen modelo experimental para el estudio de la eficacia de fármacos antitumorales para el tratamiento de tumores de piel de tipo escamoso. Asimismo, el ensayo de esta terapia en este modelo permitiría examinar el efecto sobre las vías de señalización de EGFR, Fbw7, β--catenina y Notch, y que en este y otros trabajos han estado implicadas en procesos oncogénicos. Por otro lado, se han utilizado inhibidores de la actividad γ-secretasa en leucemia linfoblástica de las células T (T-ALL) en la cual el incremento de la vía de señalización de Notch debido a mutaciones en este receptor es el principal inductor de la enfermedad. Nuestro grupo ha demostrado la existencia de una actividad supresora de tumores de presenilina independiente de su actividad γ-secretasa. Este hecho indica que no es posible considerar presenilina como diana terapéutica indiscriminada, 7

8 ya que su inhibición podría causar efectos opuestos a los deseados. De la misma forma, la regulación de EGFR por Fbw7 se tiene que tener en cuenta al diseñar posibles aproximaciones terapéuticas que incluyan la potenciación de la actividad de Fbw7 en otras patologías oncogénicas. Además, tal como hemos demostrado en este trabajo, el hecho de que presenilina sea un gen clave en el desarrollo tumoral, lo convierte en un buen candidato para ser utilizado como biomarcador terapéutico en procesos tumorales. Los resultados derivados de este proyecto serán la base para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de tumores cutáneos, el cual tendrá gran relevancia para el diseño de estrategias terapéuticas para combatir esta enfermedad. 4. Publicaciones Rocher-Ros V, España J and Saura CA. Presenilin regulates EGF receptor-mediated signaling. X International Conference on Alzheimer s Disease and Related Disorders (poster). Madrid, Juliol Alzheimer s & Dementia 2006, Vol 2 (3) p S497. Rocher-Ros V, Mao J-H, Gines S, Metzger D, Chambon P, Balmain P. and Saura CA. Presenilin regulates EGFR signaling and cell transformation through the ubiquitin ligase Fbw7. Oncogene (en prensa) Rocher-Ros V, Aznar-Benitah S and Saura CA (2010) Presenilin acts as a dose-dependent tumor suppressor gene in the skin (en preparació). 8

9 Saura CA. Presenilins/g-secretase and inflammation. Frontiers Aging Neuroscience (en prensa). 9