Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa de cultivo a la era genómica

Transcripción

1 Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa de cultivo a la era genómica Dr. David Rodríguez Lázaro Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria SEGURIDAD ALIMENTARIA: VIEJOS PATOGENOS, NUEVOS RETOS Murcia 29 Enero de 2014

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3 Seguridad Alimentaria? Qué y por qué?

4 USA 9,388,075 casos Scallan et al. (2011). Emerg Inf Dis 17: 7-15

5 Gran impacto económico Coste anual en EE.UU. de casos agudos de gastroenteritis asociados a alimentos ( ): M$ Scharff, M$ M 81% 243% M M (Investigación)

6 SEGURIDAD ALIMENTARIA Gestión del riesgo Análisis del riesgo Epidemiología Exposición Control del riesgo Barreras colectivas Barreras individuales Comunicación del riesgo

7 SEGURIDAD ALIMENTARIA Gestión del riesgo Análisis del riesgo Epidemiología Exposición Control del riesgo Barreras colectivas Barreras individuales Comunicación del riesgo

8 1. Paso final de aislamiento en medio sólido (agar) 2. Este medio será selectivo o diferencial (favorece el crecimiento y/o diferenciará las bacterias bajo estudio según éstas empleen fuentes de energía) 3. Siempre será un resultado presuntivo (NO DEFINITIVO), es necesario confirmación mediante pruebas extras para la correcta identificación

9 Reducción de tiempo de personal TIEMPO = $$$$$ Movilización rápida de los lotes (Reducción tiempo en almacén) Capacidad discriminatoria Origen de contaminación Detección de formas re-emergentes Ausencia de métodos de referencia o adecuados Microorganismos patógenos emergentes: p.ej. Cronobacter Microorganismos alterantes específicos.

10 A nivel mundial: 750 millones análisis anuales Industria alimentaria: 420 millones Análisis de rutina (viables totales): 360 millones Análisis microbiológico: 56 % alimentos 30 % farmacia 10 % agua ambiental 4 % agua de consumo 37,2 % aerobios mesófilos 30,8 % E. coli (coliformes) 15,7 % mohos y levaduras 16,3 % patógenos El coste es igual a la suma del resto Dos ideas importantes: Las compañías diagnósticas preparan tests diagnósticos antes de los requerimientos normativos Las empresas de alimentos no quieren realizar los análisis microbiológicos in situ, prefieren enviarlos a laboratorios alimentarios o centros de investigación Tom Wesler. Strategic Consulting Inc. USA

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13 + Más rápida + Más sencilla + Más sensible + Más específica + permite CUANTIFICACIÓN

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15 Organización Internacional para la Estandarización COMITÉ EUROPEO PARA LA NORMALIZACIÓN CEN/TC 275 Food analysis Horizontal methods WG 6 Microbial contamination

16 La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010.

17 La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año

18 MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN DETECTION Extraction Swabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction SAMPLING 1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation 4. conditions of storage Culture Cell culture Microscopy e.g. Plaque assay TCDI 50 Concentration/pre-enrichment Precipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation immunoconcentration, cationic separation Molecular methods Nuclec acid purification Immunological methods e.g. EIA RIA ELISA TYPING e.g. Sequencing Multiplex PCR serology Amplification Reaction e.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012

19 MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN MENSAJE: Deben ser: 1. Armonizados: definición y uso de PNTs 2. Controlados: uso de controles 3. Validados: empleo de ensayos de validación ( ring trials )

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21 USO de CONTROLES PARA EVALUAR LOS RESULTADOS

22 MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN DETECTION Extraction Swabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction SAMPLING 1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation 4. conditions of storage Culture Cell culture Microscopy e.g. Plaque assay TCDI 50 Concentration/pre-enrichment Precipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation immunoconcentration, cationic separation Molecular methods Nuclec acid purification Immunological methods e.g. EIA RIA ELISA TYPING e.g. Sequencing Multiplex PCR serology Amplification Reaction e.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012

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24 PREPARACIÓN Control del procesado de la muestra Control negativo del procesado de la muestra Control ambiental Control negativo de extracción DETECCIÓN Control positivo de amplificación Control negativo de amplificación Control estándar (sólo para cuantificación) Control de amplificación

25 ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions

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28 adenovirus humano (virus diana) norovirus murino (virus control SPC) 11 laboratorios a nivel europeo

29 El y puede interferir con los resultados finales La definición y discusión de los es El para evitar problemas Los evaluados son para la detección de

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32 Selection and improving of fit-for-purpose sampling procedures for specific foods and risks ( Coordinator Prof. Gerardo Mamfreda UNIBO (IT)

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34 Aproximación: Usar los mismos medios de enriquecimiento (Half-Fraser para L. monocytogenes) Evaluar alternativas para reducir el tiempo para resultados finales Reducir los tiempos de incubación Usar una protocolos de extracción de ADN sencillos y fáciles Usar un método de PCR a tiempo real Evaluar alternativas para reducir el coste del análisis Usar rango de diluciones más bajo (1:3 y 1:5) Parámetros a evaluar: Tamaño de la muestra (25 g o 50 g) Dilución de la muestra (1:3, 1:5 o 1:10) Tiempos de incubación (8, 18 or 24 horas de enriquecimiento) Protocolo de extracción de ADN (calentamiento, resina Chelex, o kit de columna)

35 Comparación métodos alternativos vs ISO standards L. monoctyogenes 1-10 ufc ufc ufc 25 g 50 g Extracción ADN: Calentamiento Chelex columna ISO Diluciones: 1:3 1:5 1:10 Incubación: 8 h 18 h 24 h

36 Dilution Incubation times ISO Baseline QIAGEN Baseline CHELEX Baseline BOILING 1 cfu / sample 1:3 1:5 1:10 50 muestras naturales: 8 h 3/3 0/3 0/3 0/3 18 h 3/3 0/3 0/3 0/3 24 h 3/3 1/3 0/3 0/3 8 h 3/3 0/3 0/3 0/3 18 h 3/3 0/3 0/3 0/3 24 h 3/3 2/3 1/3 0/3 8 h 3/3 0/3 0/3 0/3 18 h 3/3 0/3 0/3 0/3 24 h 3/3 3/3 1/3 0/3 ISO BASELINE 25 contaminadas: 25/25 25/25 25 no-contaminadas: 25/25 25/25

37 Listeria monoctyogenes Dilución 1:10 Half Fraser (ISO) Incubación 24 h Extracción ADN: Columnas de QIAGEN PCR a tiempo real Rodríguez Lázaro et al (2004) Appl. Environ. Microbiol.

38 7 Países 13 Institutos

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41 Investigadores principales: Dr. David Rodríguez Lázaro Dra. Marta Hernández Pérez Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria Becarios: Jaime Ariza Miguel Eva Antolín Simón Técnicos Superiores de Inv: Patricia González García Lorena López Enríquez Antiguos miembros: Dra. Marta Diez (Univ. Burgos, ES) Dra. Lucía González (ITACyL, ES) Dra. Katarina Kovac (Biosistemika Inc., SL) Dra. Mónica Martínez (ICP-CSIC, ES) Dra. Katarina Oravcova (Univ. St. Andrews, UK) Diana Bezos (Univ. Valladolid, ES) Raquel Campo (Univ. Valladolid, ES) Sonia Ramos (Univ. Burgos, ES)

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