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34 Resultados y discusión 26 Capítulo III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Recolección Para la recolección de material vegetal con fines farmacéuticos debe asegurarse la identidad de la droga; que debe ser recolectada e identificada por un personal experto y capacitado. En el presente trabajo, se realizó, la identificación taxonómica del material vegetal por un especialista en la temática, como criterio seguro de su identidad botánica, observándose una total correspondencia con las características del material recogido en herbario y con la descripción botánica establecida en la literatura (Edwin, 1971; León, 1957; Roig, 1988). En la droga que nos ocupa, la recolección del material se realizó de forma manual, pues es la técnica que se aconseja para plantas silvestres. Tuvo lugar en horas tempranas de la mañana, tomando las partes aéreas y procurando dejar ramas suficientes para garantizar el normal desarrollo de la planta y así un uso sostenible de este recurso natural Secado y molinado El material vegetal una vez secado y molinado conservó las características organolépticas establecidas por Tejeda, Se almacenó en bolsas de polietileno en una desecadora protegida de la luz y la humedad, hasta el momento de su utilización Obtención de los extractos Para la obtención de los extractos, el material vegetal seco y molinado se le extrajo mediante soxhlet con éter de petróleo (Teb= 600 a 900) y etanol comercial de manera independiente. El extracto acuoso se obtuvo por reflujo. El extracto etéreo resultante de la extracción presentó una coloración amarilla verdosa intensa de naturaleza oleosa, con etanol se obtuvo un extracto color verde intenso, característico de los extractos alcohólicos obtenidos a partir de hojas con una significativa extracción de pigmentos clorofílicos y el extracto acuoso de color Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

35 Resultados y discusión 27 carmelita rojizo intenso, mantuvo las características propias de decocciones de hojas de esta especie ya evaluadas en estudios anteriores (Machado y Blanco, 2000, Vicet, 2009). Después de rotoevaporado se calculó el rendimiento en base a material vegetal seco. Tabla 1: Rendimiento de los extractos. Extracto Etéreo Etanólico Acuoso Método de Obtención Soxhlet Soxhlet Reflujo Rendimiento % Cuando se analizaron los resultados con respecto al rendimiento de cada uno de los extractos, se observó que los extractos polares (etanólico y acuoso) con 40 y 39% no presentaron diferencias entre si, pero resultan significativamente superiores al extracto etéreo con solo un 5 % de extracción Evaluación fitoquímica de los extractos La naturaleza química de los componentes de los extractos es un elemento importante en la evaluación de estos que van a ser sometidos a evaluaciones farmacológicas, pues dicha información puede orientar hacia la posible acción farmacológica que puedan ejercer y a los posibles metabolitos responsables de tales efectos. En correspondencia a este criterio se realizó la evolución fitoquímica de los tres extractos obtenidos a partir de las hojas de esta planta Tamizaje fitoquímico Para la realización del tamizaje fitoquímico se informan en la literatura variados esquemas de trabajo que comprenden a su vez el uso de diferentes solventes de extracción. Tomando las referencias de estudios anteriores, se realizaron los ensayos para ácidos grasos, quinonas, triterpenos y/o esteroides, azúcares reductores, saponinas, fenoles y/o taninos y flavonoides según especificaciones de Miranda y col Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

36 Resultados y discusión 28 Los resultados obtenidos para estos ensayos aparecen resumidos en la (tabla 2). Tabla 2: Resultados del tamizaje fitoquímico de los extractos Ensayos Sudán Borntrager Liebermann Burchard Felhing Espuma Cloruro fé rrico Shinoda Metabolitos Ácidosgrasos Quinonas Triterpenos/oy esteroides Azúcares reductores Saponinas Fenoles y/o ninos ta Flavonoides Etéreo + + Extractos Etanólico + + Acuoso Es importante señalar que los resultados obtenidos mediante estas técnicas ofrecen solo una visión de la composición química de la planta a estudiar y que no puede tomarse en ningún caso como un resultado concluyente ya que en la presencia o ausencia de un metabolito pueden influir de forma determinante la época de recolección y las deficiencias en la misma, además del tipo de secado y/o conservación. También puede afectar los resultados el estado vegetativo de la planta que puede traer como consecuencia el aumento o disminución de la concentración de los metabolitos. La solubilidad en el solvente empleado y la interferencia de otros metabolitos también pueden afectar de forma significativa la composición del extracto. Estos resultados se encontraron en correspondencia con los informes fitoquímicos de la familia botánica, siendo similares a los obtenidos por Tejeda, 1998 y Hernández, 1999, para drogas provenientes de otras localidades de la región central, lo cual sugiere que este factor no influye notablemente en la composición del material vegetal al menos desde el punto de vista cualitativo Evaluación cromatográfica El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis cualitativo y cuantitativo de materiales o extractos de origen vegetal, ya sea en materias primas, productos terminados o compuestos presentes en fluidos biológicos. Su uso resulta Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

37 Resultados y discusión 29 en muchas ocasiones complementario al tamizaje fitoquimico. Las técnicas cromatrográficas han dado buenos resultados en la separación óptima, identificación y aislamientos de componentes individuales. (Harborne, 1998) Por tales razones, para evaluar las características cromatográficas de los extractos obtenidos se aplicó la cromatografía de capa delgada, empleando en todos los caso placas de sílica gel como fase estacionaria y como fases móviles las que se indican en el epígrafe Las placas se revelaron bajo luz ultravioleta (λ nm), empleando como reveladores vapores de amoníaco y tricloruro de aluminio para los flavonoides (Markhan, 1988). Al utilizar el cloroformo como fase móvil para el extracto etéreo permitió que se observara una mejor resolución que con la fase móvil diclorometano: metanol (9:1), pues para esta no se evidenciaron buenos resultados, ya que solamente se logró separar las bandas correspondientes a los derivados clorofílicos. Los resultados cromatográficos muestran 9 manchas con adecuada separación observables tanto en el visible como al ultravioleta, al ser reveladas con vapores amoníaco se observaron manchas rojas (1, 2, 5, 6) características de los derivados clorofílicos, las que evidenciaron un mejor comportamiento fueron las que tomaron coloración amarilla (3, 4, 7), que indican la presencia de compuestos (flavonoides) y la azul (8) característica de compuestos (fenólicos o flavonoides). Frente al tricloruro de aluminio el comportamiento fue similar, ocurriendo algunas variaciones de las manchas de fluorescencia roja a tonalidades más claras (Mabry, 1970). Se empleó adicionalmente como fase móvil, n-butanol: ácido acético: agua (4:1:5), siendo mejor resueltos los extractos etanólico y acuoso. Los resultados se compararon con los factores de retención (Rf), de los patrones rutina y quercetina (Figura 1). En este caso, los cromatográmas muestran 3, 8 y 7 manchas para los extractos etéreo, etanólico y acuoso, respectivamente. Al revelar con vapores de amoníaco las manchas de mayor interés en el extracto etéreo resultaron la mancha azul (1) y la Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

38 Resultados y discusión 30 amarilla (2) con Rf de 0.82, 0.88 respectivamente, este comportamiento cromatográfico evidenció que el extracto puede presentar flavonoides, en el extracto etanólico fueron las de color amarillo (2, 4, 7) con RF 0.1, 0.52, 0.68, la rojo vino (3) y la de coloración parda (6) con 0.48 y 0.6 de Rf y en el extracto acuoso resultó interesante la presencia de una mancha de color verde amarillento (1), las amarillas (3, 7) y la de coloración parda 6) con Rf de 0.02, 0.1, Fase móvil: n- butanol: ácido acético: agua (4:1:5, fase superior), A: UV (254), B: UV (366), C: Tricloruro de aluminio- UV (366) Figura.1: Cromatográmas de los extractos etéreo, Etanólico y acuoso Para el revelado con tricloruro de aluminio se evidenciaron cambios de coloración solamente en algunas manchas del extracto etanólico y acuoso y en la de los patrones. En el caso del extracto etanólico la mancha (3) tomó una coloración amarilla oscura y en las del extracto acuoso los cambios fueron en la (1), la cual tomó fluorescencia y la (6) que cambió a amarillo oscuro. Las manchas de los patrones sufrieron cambios significativos, la de la rutina evidenció una coloración amarillo oscuro y la de la quercetina amarillo fluorescente. Los patrones evidenciaron una sola mancha, para la rutina de coloración parda y para la quercetina amarilla con comportamiento típico frente a los reveladores utilizados. Después de haber calculado los Rf para cada mancha y teniendo en cuenta las que evidenciaron mejor comportamiento, se compararon los Rf de cada una de las manchas de los extractos con el de los patrones, obteniéndose que el Rf de la Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

39 Resultados y discusión 31 mancha (3) en el extracto etanólico y el de la (6) en el extracto acuoso son similares al Rf de la rutina, evidenciando la presencia de flavonoides y en específico de rutina Determinación de flavonoides totales Los flavonoides han sido reportados como poseedores de múltiples actividades biológicas entre las que se encuentra su acción antioxidante (Gorinstein col, 2004, Dasgupta De, 2007), estos constituyen dentro de la composición de la Capraria Biflora. L los metabolitos con mayor potencialidad de tener actividad antioxidante. El contenido total de flavonoides para los extractos (etéreo, etanólico y acuoso) de la Capraria Biflora.L fue calculado empleando la curva de calibración de la rutina (Figura 2) Cur va de Ca libr a c ión de la Rutina y = 7.6x R 2 = A b so rb an cia C o n ce n tr ació n m g /m L 0.15 Figura. 2: Curva de calibración de la rutina para flavonoides totales. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de rutina por gramos de extracto seco (mger/gs) (Tabla 3). Tabla 3: Resultados de flavonoides totales Extractos Etéreo Etanólico Acuoso mg/ml Rutina mger/g s Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

40 Resultados y discusión 32 Resulta importante destacar que el éter de petróleo a pesar de ser un disolvente no polar permite extraer algunos tipos de flavonoides; estos pueden estar metoxilados o glicosilados, lo cual modifica notablemente la solubilidad y por tanto no ser extraídos con disolventes polares. En estudios anteriores se planteó la posibilidad de que los flavonoides presentes en la fracción clorofórmica de las hojas de Capraria biflora.l podrían estar metoxilados en la posición 3 ó 4 del anillo B, o en la posición 7del anillo A (Vicet, 2009), lo cual puede explicar su presencia en el extracto etéreo y también la respuesta cromatográfica observada frente al amoníaco y ALCL 3 discutida ya en el epígrafe Estos valores resultan de gran importancia al valorar la actividad antioxidante de los extractos ya que un gran número de trabajos reportados refieren que la misma posee una relación directa con la presencia de estos compuestos en la fuente natural Estos valores no aparecen informados en la literatura y poseen gran importancia en el análisis de la actividad biológica de los productos naturales, dada la gran variedad de investigaciones que se han reportado, relacionando la presencia de estos compuestos en alguna propiedad farmacológica Actividad antioxidante de los extractos La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada frente a los antioxidantes sintéticos BHT y ácido ascórbico y los patrones de origen natural rutina y quercetina por diferentes métodos: la actividad estabilizante del radical libre DPPH y la medida del poder reductor Actividad estabilizante del radical DPPH En este ensayo se procesaron las curvas de calibración correspondientes a cada uno de los patrones utilizados (rutina, quercetina, y ácido ascórbico) y los tres extractos con los que se trabajó en el estudio, de las cuales de obtuvo la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación correspondiente a cada uno (Figura 3). Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

41 Resultados y discusión 33 Cur va de Calibr ación E. Etanólico Cur va de Calibr ación E. Ete r e o y = x y = x R2 = R2 = % ASRL %ASRL Conce ntr ación m g/m L Cur va de Calibr ación Rutina y = x R 2 = y = x R 2 = % ASRL 70 % ASRL 0.1 Conce ntr ación m g/m L Cur va de Calibr ación E. Acuos o Conce ntr ación m g/m L Curva de Calibración Que rce tina Conce ntr ación m g/m L 0.03 Curva de Calibración Ac. As córbico y = x R2 = y = x R2 = % ASRL % ASRL Conce ntración m g/m L Conce ntración m g/m L 0.03 Figura. 3: Curvas de calibración obtenidas para los extractos y los patrones estudiados en el ensayo de la actividad estabilizante del radical libre DPPH. Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

42 Resultados y discusión 34 Estas curvas permitieron determinar la actividad antioxidante de cada uno de los extractos expresada como Concentración Inhibidora Media (IC 50) e Índice de Actividad Antioxidante (AAI), los cuales se muestran en la (Tabla 4). Tabla 4: Actividad estabilizante del radical DPPH de los extractos y los patrones Muestras Extracto Etéreo Extracto Et anólico Extracto Acuoso Rutina Quercetina Acido Ascórbico Concentración (mg/ml) ASRL (%) IC 50 mg/ml IAA *Se consideró pobre actividad antioxidante cuando IAA <0.5, moderada actividad antioxidante cuando 0.5<IAA<1.0, fuerte actividad antioxidante cuando Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

43 Resultados y discusión <IAA<2.0 y muy fuerte cuando IAA>2.0, según la propuesta de (Scherer y Teixeira (2009) Los resultados de la actividad antioxidante indican que los extractos fueron capaces de atrapar radicales DPPH de una manera dependiente de la concentración. Los valores obtenidos de IC50 para los extractos muestran una gran diferencia al compararlos con los valores obtenidos de los patrones utilizados. El extracto etanólico mostró valores superiores de actividad antioxidante, aunque discreta, con una IC50 de 0.11 mg/ml, no existiendo una diferencia marcada con el resto de los extractos. Se puede referir que la actividad antioxidante de los tres extractos estudiados de la planta, por este mecanismo de actividad estabilizante del radical DPPH, es baja para las concentraciones estudiadas. Lo anterior fue corroborado por la metodología propuesta por (Scherer y Teixeira (2009), quienes proponen la evaluación de este ensayo a través de la determinación del Índice de actividad antioxidante (IAA). Al clasificar el poder antioxidante de los extractos según la escala propuesta por estos autores, se concluyó que los tres extractos evaluados tienen una pobre actividad antioxidante, según este mecanismo de oxidación, en las concentraciones estudiadas. La actividad estabilizante de las muestras estudiadas fue Quercetina >> Rutina > Acido Ascórbico >>> Extracto etanólico > Extracto etéreo > Extracto acuoso. La mayor actividad observada para la quercetina se debe fundamentalmente a que esta acción farmacológica resulta dependendiente de los aspectos estructurales de los compuestos. En relación con la actividad antioxidante de los flavonoides, se puede considerar que los estudios de la actividad secuestradora de RL e inhibición de la POL, incluyen un grupo catecol como rasgo estructural fundamental, junto con el grupo carbonilo en posición 4, en conjugación con el doble enlace entre los carbonos 2 y 3. El grupo OH libre de la posición 3 aparentemente incrementa la capacidad antioxidante porque la forma libre es más lipofílica que la glicosídica y un grupo OH en posición 5 puede aumentar la Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

44 Resultados y discusión 36 actividad antioxidante por incremento de la deslocalización electrónica. La conjugación total del anillo piránico con el resto de la molécula, lo cual es típico de las antocianidinas, incrementa la estabilización de los radicales formados, se produce un aumento de la actividad antioxidante, pero al mismo tiempo la presencia de un grupo pirogalólico predispone hacia una actividad prooxidante (Pérez, 2003) Medida del poder reductor La actividad antioxidante de la planta se complementó midiendo su capacidad para reducir el Fe3+ a Fe2+, monitoreando la formación de un complejo coloreado (reacción tipo Fenton).La Figura 4 (Tabla 5) ilustra el poder reductor del extracto etéreo, etanólico y acuoso, comparados con el BHT, quercetina y ácido ascórbico. Poder Reductor 3.5 Extracto Etéreo Absorbancia 3 Extracto Etanólico 2.5 Extracto Acuoso 2 Quercetina 1.5 BHT 1 Acido Ascórbico Concentración m g/m L Figura. 4: Poder reductor de los extracto evaluados. El incremento de la absorbancia en la mezcla de reacción es indicativo del incremento del poder reductor (Benzie y Strain, 1996). Muchos autores sostienen que la actividad antioxidante de algunos extractos polares es debida, al menos, a la presencia de sustancias con grupos hidroxilos, los cuales ejercen su acción por donación de protones (capacidad secuestrante de radicales Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

45 Resultados y discusión 37 libre), o bien por interacción, adición o combinación de radicales o por reacciones redox (transferencia de electrones). En cualquier caso es importante la estructura planar y espacial del compuesto antioxidante presente en el extracto (Jung col., 2006 Tabla 5: Valores de la absorbancia de los extractos y de los antioxidantes sintéticos y en el sistema de poder reductor. Valores de Absorbancia para cada extracto y patrón Concent ración (mg\ml) Extracto Extracto Etéreo Etanólico Extracto Acuoso Quercetina BHT Acido Ascórbico Los extractos a las concentraciones probadas mostraron menor habilidad para reducir el Fe3+, en comparación con todos los patrones empleados, a igual concentración. Esto puede ser indicativo de que los extractos no muestran un fuerte poder para reducir el Fe3+ a Fe2+ a concentraciones altas para las cuales los patrones no muestran variación alguna. En general los resultados obtenidos para la determinación de la actividad antioxidante resultaron inferiores a la esperada dada la concentración de flavonoides totales, pues generalmente se asocia que una planta con alto contenido de compuestos flavonoides totales deberá presentar una mayor actividad antioxidante, sin embargo se puede observar que en algunas plantas se manifiesta una actividad antioxidante superior a lo esperado o por el contrario, una baja actividad que no se relaciona con el contenido de flavonoides. Esto es indicativo de que la capacidad antioxidante de una planta se debe al efecto combinado de diversos factores, como puede ser la presencia de otro tipo de metabolitos antioxidantes, o bien, una actividad pro-oxidativa que se contrapone al potencial antioxidante. Saily Quesada Yero Evaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas de Capraria Biflora.L

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