A LA BÚSQUEDA DE LA HUELLA GENÉTICA DEL CÁNCER DE PULMÓN
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- Ernesto Revuelta Franco
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1 A LA BÚSQUEDA DE LA HUELLA GENÉTICA DEL CÁNCER DE PULMÓN Servicio de Neumología Sesión de Investigación Coordinador: F. Pozo Rodríguez Mª Teresa Agulló Ortuño Centro de Investigación
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3 cdna microarrays 9600 genes Northern Flow cytometry 277 genes correl genes correl. -
4 Oligonucleotide microarrays 4966 genes 50 genes risk index
5 Oligonucleotide microarrays 9248 genes 128 genes metastasis vs. primary tumor 17-gene signature
6 85 pacientes 44 genes a estudio Selección de 8 genes
7 51 SCC genes a estudio 71-gene signature recurrence 79-gene signature death
8 From National Taiwan University College of Public Health (H.-Y.C., W.J.C.), National Taiwan University College of Medicine (H.-Y.C., S.-L.Y., C.-L.C., C.-H.W., S.-F.K., H.-N.L., S.S., W.J.C., J.J.W.C., P.-C.Y.), Academia Sinica (C.-H.C, P.-C.Y.), National Taiwan University Hospital (A.Y., W.-K.C., P.-C.Y.), and dvpharma (H.-J.T.) all in Taipei, Taiwan; and Taichung Veterans General Hospital (G.-C.C., C.-Y.C.) and National Chung-Hsing University (G.-C.C., C.-C.L., J.J.W.C.) both in Taichung, Taiwan. Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, No. 7, Chung-Shan S. Rd., Taipei, Taiwan 100
9 1976: Thermophilus aquaticus Taq polimerasa: Temperatura óptima 80ºC 1983: Desarrollo de la técnica de PCR Kary Mullis 1993: Premio Nobel de Química PATENTES Mullis Cetus Corporation $ $ Cetus Corporation Hoffman-La Roche Roche > $ (2005)
10 Q-PCR Systems: correlacionan una señal de fluorescencia con la cantidad de producto de PCR en una reacción
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12 Real-Time PCR Systems: correlacionan una señal de fluorescencia con la cantidad de producto de PCR en una reacción 1) Detección independiente de la secuencia SYBR Green I Bromuro de Etidio 2) Detección específica de secuencia Simple Probe Hybridization Probes (HybProbe) Hydrolysis Probes (TaqMan)
13 Detection with SYBR Green I La señal fluorescente (530 nm) se adquiere al final de cada fase de elongación
14 Hybridization Probe La señal fluorescente se mide al final de la fase de anillamiento FRET: fluorescente resonance energy transfer
15 Hydrolysis Probes (TaqMan) La señal fluorescente se mide al final de la fase de elongación FRET: fluorescente resonance energy transfer
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17 Real-Time PCR: cuantificación cinética Análisis de los datos en la fase de eficiencia de amplificación constante (exponential phase) n La Amplificación responde a la ecuación: N=N o x E Cp Cp: Crossing point. Determinado por el máximo de la derivada segunda de cada curva. Se considera el punto más proporcional a la concentración inicial
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19 LightCycler 1.5 Roche Applied Science
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21 NECESIDAD DE IDENTIFICAR UNA FIRMA GENÉTICA NSCLC es una enfermedad heterogénea Métodos clínicos inadecuados para predecir el resultado del tratamiento Incluso en pacientes con características clínicas y patológicas semejantes, la evolución clínica es distintas entre los distintos pacientes. Métodos moleculares pueden añadir valor predictivo y pronóstico Microarrays qrt-pcr Clasificación de tumores Formulación de Pronósticos
22 125 pacientes operados de NSCLC (12/1999 a 12/2003) - 60 Adenocarcinomas - 52 Carcinomas de células escamosas - 13 Otros Microarrays: 672 genes asociados a invasividad RT-PCR: Validación de 16 genes Signature: 5 genes Housekeeping: TBP (TATA-box-binding protein) Sondas TaqMan específicas Set de primers ABI Prism 7900HT Método de cuantificación relativa
23 Microarrays: 672 genes asociados a invasividad Incluidos 485 genes con CV 3% 16 genes correlacionan con supervivencia
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26 FIVE-GENE SIGNATURE DUSP6: dual-specificity phosphatase 6 Inactiva las kinasas ERK2. H.R.= 1.73 SUPRESIÓN TUMORAL Y APOPTOSIS MMD: monocyte-to-macrophage differentiation-associated protein Se expresa en macrófagos maduros. H.R.= 2.50 METÁSTASIS TUMORAL STAT1: signal transducer and activator of transcription 1 CRECIMIENTO CELULAR Y APOPTOSIS INDUCE LA EXPRESIÓN DE p21 Y CASPASAS H.R.=0.56
27 ERBB3: v-erb-b2 avian erythrobastic leukemia viral oncogene homolog 3 Miembro de la familia de receptores EGF H.R.= 1.73 SUPERVIVENCIA CELULAR LCK: limphocyte-specific protein tyrosine kinase Miembro de la familia de Tirosín quinasas Src. Se expresa principalmente en células T y es uno de las primeras moléculas de señalización downstream del receptor de células T. INDUCCIÓN DE APOPTOSIS H.R.= 0.43 MOVILIDAD DE CÉLULAS TUMORALES TBP: TATA-box binding protein HOUSEKEEPING
28 FIRMA GENÉTICA Pacientes de ALTO RIESGO Pacientes de BAJO RIESGO -Expresión génica medida por RT-PCR -Decision-tree analysis El modelo de predicción validado en - Una cohorte independiente de 60 pacientes del mismo hospital - Datos de microarray de 86 pacientes con NSCLC, Beer el al.
29 La firma genética de cinco genes fue fuertemente asociada a la supervivencia total y tiempo libre de recidiva
30 INDEPENDENT COHORT SET OF PUBLISED NSCLC
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32 0,81 5,49 4,10 5,24 2, ,25 2,77 1,43 2,42 1, ,21 0,31 1,90 3,20 0, ,37 0,71 0,76 0,96 0, ,11 0,38 0,04 0,21 0, ,09 0,97 0,23 0,64 0, ,20 1,82 1,88 1,78 0, ,70 1,65 0,57 0,12 0, ,76 0,51 2,20 0,29 0, ,44 0,38 0,81 1,74 0, ,76 0,40 0,59 1,97 0, ,77 0,81 0,72 1,27 0, ,65 0,94 0,42 1,96 2, ,85 0,83 0,35 1,44 2, ,04 0,50 0,28 0,94 1, ,16 0,25 0,23 0,37 1, ,78 0,41 1,28 2,36 1, ,93 1,04 0,90 1,47 0, ,38 2,12 0,54 1,00 1, ,22 6,08 0,55 0,92 0, ,78 0,49 1,49 0,72 1, ,30 1,61 1,85 0,77 0, ,07 4,67 0,21 0,79 0, ,32 2,17 0,67 0,91 1, ,21 0,90 0,26 1,05 2, DUSP6 ERBB3 LCK STAT1 MMD CONCENTRATION RATIO 0,37 0,45 1,03 1,20 1, ,12 1,26 0,33 0,65 0, ,31 1,44 0,22 0,13 0, ,17 0,93 1,33 0,85 0, ,84 2,28 1,56 0,75 1, ,34 0,95 0,72 0,93 1, ,11 1,84 0,23 0,36 2, ,85 1,98 1,12 0,66 0, ,91 1,26 1,65 0,60 0, ,94 6,73 0,70 0,82 0, ,64 1,00 3,16 1,61 0, ,05 1,50 0,43 0,40 0, ,26 1,24 2,44 2,35 3, ,45 5,05 0,70 0,80 0, ,23 3,25 0,51 0,50 1, ,11 0,57 0,22 0,49 0, ,41 1,32 0,95 1,66 0, ,36 0,71 1,22 0,95 0, ,27 0,97 1,54 0,81 0, ,58 0,56 0,49 0,51 2, ,38 0,50 1,01 0,89 1, ,60 0,81 1,61 0,65 0, ,74 2,18 0,36 0,63 0, ,56 0,36 0,55 0,16 0, ,40 0,53 2,62 0,86 0, ,57 1,88 0,68 0,62 0, ,87 2,54 0,75 1,75 0, ,94 1,22 1,38 6,38 1, ,35 5,01 0,67 0,92 2, ,81 0,59 0,44 0,50 0, ,26 2,49 0,16 0,13 0, ,73 0,21 0,27 0,32 0, ,82 1,46 0,74 1,35 0, ,19 1,55 0,34 0,84 1, ,87 1,07 0,55 0,34 0,39 9 0,56 0,84 0,39 0,48 0,23 6 1,02 0,66 0,76 1,36 1,29 5 0,74 0,57 0,47 0,85 0,22 3 0,26 0,97 0,26 0,56 0,34 2 0,92 1,09 0,77 1,07 1,44 1 1,27 2,88 1,46 0,76 2, ,59 0,05 0,25 0,39 1, ,14 0,68 0,28 0,49 0, ,12 1,19 0,08 0,82 0, ,38 0,61 0,25 0,57 0, ,78 0,61 0,53 1,22 1, ,76 2,01 1,28 0,50 0, ,38 0,13 0,39 0,57 1, ,33 3,98 0,84 1,11 0, ,55 4,45 1,80 0,80 1, ,47 2,02 1,04 1,04 0, ,93 3,06 1,50 1,34 2, ,49 5,39 0,81 1,36 0, ,14 0,78 0,30 0,62 0, ,10 1,81 0,26 0,23 0, DUSP6 ERBB3 LCK STAT1 MMD DUSP6 ERBB3 LCK STAT1 MMD
33 A LA BÚSQUEDA DE LA HUELLA GENÉTICA DEL CÁNCER DE PULMÓN Servicio de Neumología Sesión de Investigación Coordinador: F. Pozo Rodríguez Mª Teresa Agulló Ortuño Centro de Investigación
34 La presencia de una firma genética de alto riesgo en tumores NSCLC Incremento del Riesgo de Recidiva Descenso en la Supervivencia Media BENEFICIOS Pacientes con firma genética de alto riesgo Terapia adyuvante Targets para el desarrollo de nuevas terapias en cáncer de pulmón
35 PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA LIMITACIONES Microarrays: Elevado número de genes en el perfil génico (difícil en la práctica clínica) Métodos sofisticados de análisis Pérdida de reproducibilidad y validación independiente Los perfiles de expresión génica varían en función de la plataforma y la estrategia analítica utilizadas qrt-pcr: Sólo puede utilizarse para analizar un pequeño número de genes (método alternativo)
36 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA PCR
37 OPTIMIZACIÓN de la CUANTIFICACIÓN 1) Diseño apropiado de Primers y Sondas 2) Temperaturas de anillamiento y elongación 3) Concentración de MgCl 2 4) Concentración de Primers y Sondas 5) Elección del Master Mix (enzima) 6) Volumen de pipeteado (diluciones seriadas y replicados) La calidad de una Sonda de Hidrólisis depende de: - El quenching de la sonda intacta - La eficiencia de hibridación - La actividad 5 3 exonucleasa de la Pol
38 SELECCIÓN DEL GEN HOUSEKEEPING Los genes housekeeping codifican para proteínas que son esenciales para el mantenimiento de las funciones celulares Asumimos que son expresados a niveles constantes en los diferentes tipos celulares Son candidatos para la normalización del resultado final
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40 1) Métodos de validación: CRITICAS REALIZADAS AL ARTÍCULO (I) Los métodos de medición utilizados para definir la firma en las validaciones 1 y 3 son distintos. Lo que origina dudas sobre el decision tree utilizado para el análisis. 2) Predictores independientes de superviviencia: No se han tenido en cuenta tamaño tumoral, SUV, PET. Stefan Michiels, M.Sc. Catherine Hill, Ph.D. Institut Gustave Roussy Villejuif, France Dan J. Raz, M.D. David M. Jablons, M.D. University of California San Francisco, CA ) Sesgo en las curvas Kaplan Meier Los datos utilizados para identificar los genes son reutilizados para clasificar a cada muestra individual. Kevin K. Dobbin, Ph.D. National Cancer Institute Rockville, MD 20852
41 CRITICAS REALIZADAS AL ARTÍCULO (II) 4) Clasificación de los pacientes en bajo y alto-riesgo El modelo puede identificar un subgrupo de pacientes con riesgo medio más que bajo. Ioannis Gounaris, M.D. Plymouth Hospitals National Plymouth PL6 8DH, United Kingdom 5) El diseño del estudio es imperfecto Los 675 genes identificados al principio provienen de una línea tumoral y están relacionados con actividad invasiva. Esta firma no necesariamente tiene que reflejar el comportamiento tumoral y por tanto los resultados predictivos no son consistentes ni independientes. Alfonso Quintás-Cardama, M.D. Don L. Gibbons, M.D., Ph.D. M.D. Anderson Cancer Center Houston, TX 77030
42 REPLICA DE LOS AUTORES La inicial firma genética de 16 genes se identificó usando inicialmente microarrays y posteriormente se depuró a 5 genes por medio de real-time reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) y se validó. Utilizaron un modelo recursive-partitioning decision-tree y variables que pueden ser utilizadas repetidamente en diferentes nodos. No eran objetivos del estudio evaluar si eran predictivos de supervivencia el tamaño tumoral o si era mejor la utilización de SUV o PET. No reutilizaron los datos en la construcción de las curvas Kaplan-Meier.
43 REPLICA DE LOS AUTORES Muestran que el ratio de supervivencia media a los 50 meses entre los pacientes con una firma genética de bajo riesgo fue del:. 85% entre los pacientes con enfermedad en estadio I o II. 65% en una cohorte independiente de pacientes chinos. 90% en un set independiente de datos publicados de microarray de pacientes occidentales. La verdadera cuestión reside en la identificación de una firma genética en pacientes con NSCLC, con el uso de cohortes independientes y su posterior validación.
44 Perfil de expresión genética en el carcinoma no microcítico de pulmón: utilidad de las biopsias endoscópicas, correlación con la histología y predicción pronóstica en pacientes operables. FIS 04/2641 Analizar los perfiles de expresión génica de carcinomas de pulmón no microcítico operables (biopsias endobronquiales y piezas quirúrgicas) mediante microarrays de oligonucleótidos de genoma humano completo. Ajustar un modelo multidimensional con la información molecular obtenida de los perfiles de expresión y la información clínica para predecir niveles de TLE y supervivencia. ARRAYS EXPRESIÓN variaciones en la expresión de miles de genes de forma simultánea
45 A LA BÚSQUEDA DE LA HUELLA GENÉTICA DEL CÁNCER DE PULMÓN Servicio de Neumología Sesión de Investigación Coordinador: F. Pozo Rodríguez Mª Teresa Agulló Ortuño Centro de Investigación
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