FUNDAMENTOS E IMPORTANCIA DE LA UTILIZACIÓN DEL TEST DE ELISA PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRICHINELLOSIS EN CERDOS DE ARGENTINA

Transcripción

1 FUNDAMENTOS E IMPORTANCIA DE LA UTILIZACIÓN DEL TEST DE ELISA PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRICHINELLOSIS EN CERDOS DE ARGENTINA Mabel Ribicich Med Vet. M Sc Parasitología y Enfermedades Parasitarias Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad de Buenos Aires Miembro de la International Commission on Trichinellosis (ICT) mribicich@fvet.uba.ar Introducción El crecimiento demográfico constante en la población mundial, el proceso de urbanización creciente, los mercados globales de comercialización de carnes, la convergencia de salud humana y animal hacia un moderno concepto de Salud Pública y los cambios políticos, económicos, sociales, ambientales y religiosos, condicionan el marcado incremento de la trichinellosis en las personas y en los animales domésticos y salvajes, durante los últimos 2 años. En Argentina, la especie porcina es la comúnmente involucrada en la aparición de brotes humanos. El parásito, perteneciente al género Trichinella, alojado en la carne de cerdo, esperará dentro de su micro hábitat, la llegada del próximo hospedador, que en el caso de ser el hombre, desencadenará una enfermedad parasitaria, con síntomas gastroentericos, fiebre y dolores musculares hasta complicaciones sistémicas con atención hospitalaria e incluso riesgo de muerte. El grado de compromiso del paciente dependerá fundamentalmente de la cantidad de larvas ingeridas y la respuesta inmune del hospedador. Es en este período donde el rol del médico es fundamental, para diagnosticar tempranamente los síntomas de la enfermedad y poder limitar el número de personas afectadas. El veterinario tiene una función primordial para limitar el brote de trichinellosis, determinar la fuente de infección y realizar el seguimiento epidemiológico de esta enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Sin embargo, su rol más preponderante se encuentra en la etapa de prevención, en los establecimientos porcinos y en el frigorífico, realizando la detección del parásito en todos los animales que serán destinados a consumo. La distribución de la parasitosis es mundial, y la epidemiología de la infección varía considerablemente entre las especies involucradas, la dieta, estilo de vida, distribución, comportamiento e interrelaciones entre animales y humanos.

2 Biología molecular Las distintas especies del genero Trichinella con sus similitudes biológicas, la ausencia de características morfológicas distintivas y las especies no encapsuladas como T. pseudospiralis, T. papuae y T zimbabwensis (T1) dificultan el diagnóstico diferencial (Zarlenga, et al., ). La determinación molecular de una larva de Trichinella puede realizarse por medio de un análisis de multiplex-pcr (Pozio, 1999, 22; Zarlenga, ) y permite la identificación de siete especies (T. spiralis, T. nativa, T. britovi, T. pseudospiralis, T. murrelli, T. nelsoni, y T. papuae), un genotipo (Trichinella T6) y tres poblaciones de T. pseudospiralis. Además, otros dos genotipos (Trichinella T8 y Trichinella T9) pueden distinguirse de T. britovi por el análisis de un fragmento de restricción de PCR (RFLP) para el gen que codifica la proteína de 43 kda, la cual es una de las más importantes dentro de los antígenos de excreción-secreción (E/S) producidos in vitro por las larvas. (Wu, 1999). En Argentina, la especie encontrada en humanos, cerdos y otros animales salvajes corresponde a Trichinella spiralis, de acuerdo a la tipificación del Centro de Referencia de Trichinella en Roma, Italia. Aspectos epidemiológicos Las diferencias entre ciclo doméstico y selvático, son solo teóricas, con una retroalimentación constante entre ambos, con presencia de mamíferos, aves y reptiles. Sin embargo, los carnívoros, en la punta de la cadena alimenticia, cumplen un rol determinante para perpetuar el parásito en la naturaleza. Los animales domésticos y salvajes que comparten el nicho ecológico con los cerdos destinados a consumo cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la parasitosis

3 Dentro de los países más afectados se encuentran los de Europa del Este: Rumania, Yugoslavia y Rusia. Estos países, concentran el mayor número de brotes con casos humanos producidos por consumo de carne de caballo, carne de caza y en ocasiones cerdos, que albergaban larvas infectantes de distintas especies de Trichinella. Argentina se encuentra en el cuarto lugar, con consumo fundamentalmente de carne de cerdo cruda o semicocida con L 1 de Trichinella spiralis. Este lugar que ocupa Argentina, junto a otros países de Europa, merece una análisis sociológico de los hábitos y costumbres importados al país a fines del siglo XIX y principios del XX, época en la cual se produjo la mayor corriente inmigratoria y junto con ella la importación de recetas de preparación y conservación de fiambres caseros únicas por sus características en América. En Argentina, la enfermedad en las personas, se mantenía entre 1 y 2 casos anuales. A partir de la década del 9 se observó un notable incremento de personas afectadas (Fig. 1). Las provincias de la zona central del país, Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba son las que concentran el 89% de los casos humanos, mientras que el 11 % restante se reparte entre el sur noreste y noroeste del país (Fig. 2) Fig. 1. Casos de trichinellosis humana en Argentina, durante el período 1961/23 89% 4% 1% 6% Fig. 2. Distribución de la trichinellosis humana en Argentina, según regiones. 89% zona central (Buenos Aires, Córdoba, Santa Fe) Período 1961/23

4 La prevalencia de los focos porcinos, se encuentra entre el 7 y el 1%, mientras que la prevalencia en los frigoríficos habilitados es del.1 y.3%. Esta información, provista por el SENASA, evidencia claramente la necesidad de diferenciar la carne porcina segura, provenientes de establecimientos con buenas practicas de manejo (GPP) y que mantienen una baja prevalencia de la enfermedad, debido al control en el establecimiento, de aquellos donde se crían cerdos en condiciones higiénico sanitarias deficientes. Aspectos inmunológicos Los métodos serológicos, en particular, el test de ELISA, provee oportunidades para la detección rápida de la infección por Trichinella en cerdos y humanos. En los cerdos, el test de ELISA tiene la ventaja que puede ser usado previo al sacrificio de los animales para detectar la infección. La implementación del test de ELISA permite realizar este trabajo en los establecimientos porcinos para de esta manera ofrecer un producto al consumidor, diferenciable en la boca de expendio. Hay características morfológicas relevantes de la L 1 de T spiralis para la repuesta inmune del hospedador, una de ellas es la presencia de esticosoma. El esticosoma es una estructura compuesta por una hilera de 5-55 células discoides llamadas esticocitos que ocupan la mitad anterior de la L 1 infectiva, rodeando el esófago. (Fig. 3) La estructura y función de este órgano ha sido objeto de investigaciones exhaustivas ya que estas células poseen gránulos secretorios y el contenido de los mismos es antigénico. Hay dos tipos de esticocitos en la L 1 infectiva: Los que contienen β gránulos y los que contienen α gránulos. Estos 2 tipos celulares secretan el contenido de sus gránulos durante el ciclo de mudas. Los esticocitos del adulto difieren significativamente de la L 1. T spiralis posee un grupo de antígenos, conocidos como antígenos de respuesta rápida encontrados tan temprano como a las 2 semanas post-infección y otro grupo de antígenos, conocidos como antígenos de respuesta lenta, detectables a las 4 semanas post-infección.

5 Fig. 3. Corte de L 1 de Trichinella spiralis a la altura del esófago, evidenciando el esticosoma. (Takahashi,1997) Los antígenos de respuesta rápida La fosforilcolina (PC) es un hapteno asociado con una variedad de constituyentes parasitarios internos y que posee extensas reacciones cruzadas con proteínas carriers diferentes. La PC está en la larva muscular, en los órganos exócrinos del adulto así como también en los gránulos exócrinos del tracto genital del macho. Los gránulos se descargan externamente y probablemente estimulen el sistema inmune del hospedador para producir anticuerpos anti-pc. Estos anticuerpos anti-pc pueden tener reacciones cruzadas con la hemolinfa, un constituyente exclusivamente intraparasitario. Los antígenos de Trichinella encontrados en infecciones tempranas de humanos y cerdos mostraron reactividad cruzada con anticuerpos de otros parásitos. Esta reactividad cruzada era causada por la presencia de fosforilcolina en estos antígenos. Los antígenos ES del adulto contienen epitopes que difieren de los de las larvas en los músculos. La presencia de PC en los productos de ES del adulto explican porque no hubo éxito en la utilización de antígenos ES del adulto para la realización de inmunodiagnóstico especifico. Por lo tanto, la caracterización de las proteínas carriers antigénicas es esencial para futuros estudios de inmunidad en Trichinella y para entender el rol funcional que ésta debe jugar en el establecimiento de la parasitosis. (Takahashi,1997) Los antígenos de respuesta lenta (Grupo II) La síntesis de antígenos larvales ES se produce en el esticosoma. La larva desarrollada en el quiste comienza la síntesis de antígenos ES después de la formación del esticosoma, esto es a los 14 días post-infección. Los productos E-S de larva pre-enquistada y de la enquistada son antigénicamente diferentes.

6 Se identifican 6 proteínas principales en el grupo II de antígenos en el rango de kda, con punto isoeléctrico y con un epitope inmunodominante G2.1 que contiene fucosa y tyvelosa.(wisnewski, N. et.al., 1993). La diferencia encontrada entre los pesos moleculares y puntos isoeléctricos es debida a las distintas proteínas carriers. Es interesante destacar que los gránulos del esticosoma no son homogéneos, siendo los α y γ gránulos los antigénicos, mientras que dentro de los β gránulos hay antigénicos y noantigénicos. Luego que los ES son secretados, estos son transportados al núcleo de la célula nurse y están involucrados en la formación de la misma. Otros son transportados fuera del quiste teniendo acceso al sistema inmune del huésped, otros son absorbidos sobre la superficie de la cutícula. Esta observación explica porqué la superficie cuticular y los gránulos del esticosoma muestran antigenicidad. Basados en este hallazgo los antígenos reciben el nombre de Superficie/Esticosomal (S/S). Los antígenos S/S son equivalentes a los antígenos ES larvales, sin embargo, los antígenos de superficie y los esticosomales no son exactamente los mismos, ya que los antígenos esticosomales son reconocidos por anticuerpos monoclonales (mabs) NIM-M1 y NIM-M2, mientras que los de superficie solo son reconocidos por NIM-M2. (Takahashi, Y., 1997) La presencia de productos ES sobre la superficie cuticular protegen al parásito de la digestión por el jugo gástrico y en consecuencia las larvas desarrolladas en los quistes musculares son infectivas por vía oral solamente después de la formación del esticosoma (aproximadamente 15 días). Trichinella muestra antígenos de superficie en la primera muda luego de la infección oral, pero los adultos no poseen antígenos ES larvales sobre su superficie. Este mecanismo está involucrado en el cambio en la antigenicidad de la superficie de los nematodes. En la preparación del test de ELISA se utilizan como antígenos los productos excretores secretores E/S de las L 1, y un antígeno purificado y caracterizado que contiene tyvelosa. Hasta la década del 8, los antígenos utilizados eran preparados con extractos totales de las L 1, con interferencias y reacciones cruzadas, especialmente con nematodes del tubo digestivo (Ascaris suum, Trichuris suis) Es a partir de estas investigaciones que se concentran los esfuerzos para lograr un antígeno purificado E/S que pudiera cumplir con los objetivos de lograr una mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico.

7 En animales inoculados con dosis crecientes de T spiralis, se observa un incremento de los títulos positivos que serán de mas temprana aparición (14-56 días postinfección) de acuerdo al numero de larvas inoculadas. (Ribicich, et al., 2) (Fig. 4) (Tabla 1) 1,9,8,7,6,5 D.O Cinetica de anticuerpos anti Trichinella spiralis en cerdos inoculados con 5 larvas (Grupo 3),4,3,2 Cerdo 5 Cerdo 8 Cerdo 15,1 Dias Fig 4. Evolución de los anticuerpos durante 1 días post-infección, en cerdos inoculados con 5 larvas infectantes de T spiralis (Ribicich, et al., 2) Tabla 1. Tiempos de seroconversión y resultados de la DAR de cerdos infectados con dosis crecientes de T spiralis (Ribicich, et al., 2) Grupo Cerdo Nº 1º día positivo ELISA Nº larvas/g (no inoculado) (1 larvas) (5 larvas) (5 larvas) (5 larvas)

8 La sensibilidad del test de ELISA y el valor predictivo para cerdos inoculados experimentalmente con T spiralis se encuentra en el 1 %. Un nuevo desafío consistió en testear la prueba bajo condiciones de campo, con sistemas de crianza de cerdos, propios de la región, con predominio de crianza al aire libre. Los resultados preliminares demostraron que los cerdos criados en sistemas al aire libre y los criados en confinamiento, con un adecuado manejo sanitario demostraron negatividad a la prueba parasitológica directa (digestión artificial) y a las indirectas (test de ELISA). En los animales criados bajo condiciones higiénico-sanitarias deficientes se detectó una prevalencia serológica del 9.27%. (Ribicich, et al., 24) Conclusiones La sensibilidad y valor predictivo positivo del test de ELISA utilizando antígeno ES para el diagnóstico de T spiralis en cerdos en condiciones experimentales se encuentra en el 1%, mientras que en condiciones de campo la sensibilidad de la misma se reporta entre el %. Ambas técnicas Digestión artificial (DAR) y test de ELISA, poseen limitaciones: la sensibilidad de la técnica de ELISA esta en.1 lpg, sin embargo la posibilidad de falsos negativos, la hace inadecuada para su utilización en el frigorífico. Argentina, es considerada zona endémica, en consecuencia, la utilización del test, sumado a acciones en terreno, permitiría ajustar los mecanismos de control y prevención de la enfermedad El diagnostico serológico a través del test de ELISA puede utilizarse con el objetivo de : Herramienta para la vigilancia epidemiológica Manejo de focos porcinos Descarte temprano de animales positivos Acceso a mercados internacionales

9 Bibliografía 1. Bolpe, J; Boffi, R.. Casuistry of Human Trichinellosis in Argentina registered from 199 to Parasite. Vol 8. S78-S8. 2. Campbell, W.C Trichinella and Trichinosis. Plenum Press. New York and London. 3. Gamble, HR; D. Rapic, A. Marinculic and KD Murrell Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis. Veterinary Parasitology, Gamble, H.R, R.C. Brady, L.L. Bulaga, C.L. Berthoud, W.G.Smith, L.A.Detweiler, L.E. Miller, E.A.Lautner Prevalence and risk association for Trichinella infection in domestic pigs in the northeastern United States. Veterinary Parasitology, Gamble, H. R.; A. S. Bessonov; K. Cuperlovic; A.A. Gajadhar; F. Van Knapen; K Noeckler; H. Schenone; X. Zhu., 2. International Commission on Trichinellosis: Recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Veterinary Parasitology. Vol. 93 Nos. 3, Lambillotte, D. and H.R. Gamble. (1996) Evaluation of a rapid ELISA for the detection of serum antibodies in swine to Trichinella spiralis. Abstract book of Ninth International Conference on Trichinellosis, Mexico City, Murrell, K.D; Anderson, W.R.; Schad, G.A.,Hanbury, R.D., Kazacos, K.R., Brown, J., Gamble, H.R., Field evaluation of the ELISA test for swine trichinosis: efficacy of the excretory-secretory antigen. Am.J.Vet.Res. 47, Nader, A; Sommerfelt, I; Franco,A La triquinosis humana y porcina en la República Argentina. Therios Vol. 7 N Pozio, E., Owen, I.L., La Rosa, G., Sacchi, L., Rossi, P., Corona, S Trichinella papuae n. sp. (Nematoda), a new non-encapsulated species from domestic and sylvatic swine of Papua New Guinea. Int. J. Parasitol. 29, Pozio, E; Giuseppe La Rosa. 22. PCR- derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples. In: K Sachse, J. Frey (Eds.), PCR Detection of microbial Pathogens: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa NJ. 11. Ribicich, M; Gamble, H.R; Santillan, G; Miguez, M; Molina, V; Guarnera, E; Basso, N; Franco, A. 2. Evaluation of ELISA test for the diagnosis of porcine trichinellosis. The Pig Journal. Volumen 46. Pags Ribicich, M; H. R. Gamble, A. Rosa, I. Sommerfelt, J. Bolpe, H. Torno, M. Verdier and A. Franco Detection of Trichinella infection in field pigs in Argentina using the ELISA test. XIth Internacional Conference on Trichinellosis. August San Diego, California. USA. 13. Takahashi Y. (1997) Antigens of Trichinella spiralis. Parasitology Today, Vol. 13,no Wisnewski, N., Michael McNeil, Robert B. Grieve and Donald L. Wassom. (1993)Characterization of novel fucosyl and tyvelosyl- containing glyconjugates from Trichinella spiralis muscle larvae stage. Molecular and Biochemical Parasitology. 61, Wu, Z., Nagano, I., Pozio, E., and Takahashi, Y Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) for the identification of Trichinella isolates. Parasitol. 118, Zarlenga, D.S; Chute, M B; Martin, A & Kapel, C.M.O.. A Single, multiplex PCR for differentiating all species of Trichinella. Parasite. Volume 8. Juin. Pag