INFORME BUFFER ESPECTROFOTOMETRÍA Y. Alumnos: Stephanie Glaves Valentina Jarur Melissa Puentes Luis Silva Amara Valencia.

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1 INFORME ESPECTROFOTOMETRÍA Y BUFFER Alumnos: Stephanie Glaves Valentina Jarur Melissa Puentes Luis Silva Amara Valencia Asignatura: Procedimientos de Laboratorio Clínico Docente : Leonardo Rubio Fecha: 23 de marzo de 2012

2 INTRODUCCIÓN La espectrofotometría es un método muy usado en investigaciones químicas y biológicas que sirven para medir la luz. Este equipo mide la absorbancia o transmitancia de la muestra, según la longitud del espectro de radiación electromagnética. La absorvbancia se define como la transición desde un nivel de energía bajo a una alta. La cual vemos la relación que existe entre la concentración de la solución y su capacidad de absorber radiación o luz. Por lo tanto, al analizar una muestra haciendo incidir un rayo de luz a través de esta, la muestra absorberá o guardara un resto de luz dependiendo del espectro relativo de esta, por ende lo que se mide finalmente en el espectrofotómetro es la luz que no es absorbida por la muestra y que es capaz de atravesarla, esta energía en forma de luz alcanza una placa registradora que medirá cuanta luz atravesó la muestra, luego la lleva un amperímetro la cual se va a transformar y expresar en números. También tenemos el monocromador, que es el filtro que se utilizará para leer los nanómetros de la longitud de onda requerida para cada técnica. Este tiene que ser de un color opuesto; obteniéndose ya sea por el prisma; filtro y la difracción de la luz. Tenemos a los cromóforos, que son aquellos compuestos que poseen dobles enlaces que absorben la luz en el espectro. Es importante saber que lo que estamos midiendo es cuantitativo. Por otra parte, también se demostró para que se usan los amortiguadores o buffer; donde en este caso se hizo el buffer Sorensen o fosfato, a un ph de 7,0 la cual se explicará más adelante si se necesito hacer TITULACIÓN. Objetivos generales: Aprender a usar el espectrofotómetro Determinar cuantitativamente la glucosa de nuestro paciente La importancia de los buffer Aprender y aplicar el concepto de Titulación Interpolación en curva de calibración 1

3 SOLUCION BUFFER Materiales Agitador magnético Papel indicador de ph Peachímetro Pipetas plásticas Vaso precipitado Tubos Gradillas Probetas Agitador magnético Procedimientos y cálculos Preparación de solución de buffer fosfato (SORENSEN) Hicimos una dilución con el cual tendremos un ph neutro final de 7,0. A= 0,2 M NaH2PO4 B= 0,2 M Na2HPO4 DONDE A = X, y B = Y La solución madre sería: X ml de A + Y ml de B; diluyéndolo en 200 ml, donde tenemos que tener X= 39ml e Y= 61 ml Para preparar la disolución debimos hacer el siguiente cálculo: A= 0,2 M NaH2PO4 Na=23 H2= 1X2 H2=1X2 O= 15 P=31 04=16X P.A= 120 gr + 17 gr = 137 g 2

4 0,2 MOLES X MOLES 1000ml ml X= 0,02 MOLES en 100 ml 1 MOL gr 0, X gr X= 2,7 gr en 100 ml Preparación de HCL 0,2 M HCL Peso atómico del reactivo: 36,5 g/mol 1 MOL gr 0,002 MOLES X gr X= 0,073 gr en 10 ml 1L = 1,19 Kg 1000 ml = 1,19 X ml gr X ml ,073 gr X = 0,06 ml X= 60 µl Luego se vació el buffer en un vaso precipitado poniendo a este el agitador magnético. 3

5 Después de que la disolución esté homogénea, introducimos los electrodos del peachímetro en el vaso precipitado con el buffer Fosfato. Resultados Nuestro buffer dio el ph requerido: 7,0 por lo tanto no fue necesario la titulación. La titulación es un proceso químico cuantitativo, el cual determina la cantidad de cierto constituyente en la mezcla. En este proceso, la solución titulante se agrega gradualmente al titulado (analito) para determinar la concentración molar de este en la masa del reactivo. Se utiliza la molaridad conocida del titulante para determinar la cantidad (masa) de este en la solución. En nuestro caso, este proceso se había usado para cambiar en pequeñas cantidades el ph de la solución y así determinar la capacidad amortiguadora de nuestros buffer. 4

6 TÉCNICA DE ESPECTROFOTOMETRÍA Materiales Vaso precipitado Pipeta Matraz aforado Espectrofotómetro Balanza Vidrio reloj Espátula Papel milimetrado Tubos plásticos Gradilla Vaso precipitado Procedimiento 1. Preparar una solución estándar madre de 1000mg/dl de glucosa en agua destilada 2. Preparar diluciones sucesivas con calibradores de glucosa que contengan las siguientes concentraciones: a) 500 mg/dl b) 250 mg/dl c) 125 mg/dl d) 62.g mg/dl 3. Realizar determinación enzimática de glucosa usando los calibradores, solución madre, calibrador comercial, suero control y muestras de pacientes según el siguiente cuadro: solución concentración micro litros Reactivo Solución madre ml Tubo A ml Tubo B ml Tubo C ml Tubo D 62,5 50 1ml Suero control ml Calibrador comercial ml muestras? 50 1ml Blanco con agua destilada ml 5

7 a) Incubar 5 minutos a 37 grados Celsius; leer en espectrofotómetro antes de 60 minutos. b) Pasar a papel milimetrado los resultados de densidad óptica de los tubos madre A, B, C, y D graficar en Y= absorbancia y X= concentración. c) Calcular factor según calibrador comercial; realizar absorbancia y cálculo de resultado de muestra y control según: Resultado = absorbancia x factor d) Obtener mismos resultados por interpolación en papel milimetrado. Resultados en espectrofotómetro Soluciones Absorbanci Concentración Factor a (mg/dl) Muestra Muestra 2 1, ,1 119 Muestra 3 1, ,9 119 Muestra 4 1, ,4 119 Muestra 5 0, ,7 119 Solución madre 1, ,8 119 Tubo A 1, ,7 119 Tubo B 1, ,3 119 Tubo C 1, ,3 119 Tubo D 0,769 91,5 119 Suero control 0,099 11, Blanco 0, Calibrador comercial 0, Con C = f *A. Siendo: F= factor A= Absorbancia C= concentración (mg/dl) 6

8 Gráfico Gráfico e interpolación para cálculo de concentración de las muestras (1, 2, 3, 4 y 5) a partir de la gráfica: MUESTRA Concentración obtenida Concentración real por interpolación M1 ~135 mg/dl 93 mg/dl M2 ~160 mg/dl 92 mg/dl M3 ~370 mg/dl 541 mg/dl M4 ~185 mg/dl 133 mg/dl M5 ~120 mg/dl 87 mg/dl 7

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10 CONCLUSIÓN Las soluciones buffer son sin duda un componente esencial en el organismo, es por esto que se encuentran estrechamente ligados a los mecanismos de mantención del equilibrio químico y la homeostasis sistémica. En este laboratorio pudimos comprobar el efecto amortiguador de una solución buffer preparada por nosotros y las variaciones del ph e integridad sanguínea en ausencia de este. El buffer que elaboramos fuel buffer fosfato, el cual tiene un ph de 7,0, al exponerlo al peachímetro nos dimos cuenta de que la elaboración fue correcta y nos calzo el ph medido con lo esperado, sin embargo si no lo hubiéramos conseguido habríamos tenido que utilizar la técnica de titulación que consiste básicamente en agregar más acido en caso de que el ph fuera muy básico, o viceversa si el p H hubiera resultado muy acido habríamos tenido que agregar más sal, que actúa como el componente básico en este caso. Hicimos un pool de 6 tubos, cada uno con 1 ml de sangre y a cada uno de ellos lo expusimos a distintas soluciones, y estos fueron los resultados: ph T1 T2 T3 T4 T5 T6 Hemólisis Sangre 7,0 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota Buffer fosfato 7,0 3 ml Buffer acetato 4,8 3 ml Buffer barbital 8,0 3 ml Agua destilada 7,0 3 ml Suero fisiológico 7,0 3 ml 1 gota Se puede notar que no ocurrió hemólisis cuando se expuso la sangre al buffer fosfato, esto se debe a que el ph al que trabaja este buffer es muy cercano al ph fisiológico de la sangre, es por esto que no se altero el equilibrio químico de su medio normal y esto llevo a que no hubiera hemolisis. Con los otros buffer si se presento hemólisis ya que mantenían el ph a niveles muy distintos a la normalidad sanguíneas. Sin embargo se presentó hemólisis en el agua destilada a pesar de que en esta existe un ph 7,0, esto se debió a la variación osmótica de los medios, ya que se expuso a los glóbulos rojos a un medio hipotónico con respecto al plasma, es por esto que ellos experimentaron una lisis. Con respecto a la espectrofotometría cabe destacar que es una de las técnicas más usadas en laboratorio clínico, esencial para medir densidades y concentraciones que el ojo humano no es capaz de distinguir. 9

11 En el laboratorio de espectrofotometría preparamos una solución madre de glucosa, desde la cual practicamos diluciones sucesivas para llegar a cuatro tubos con concentraciones conocidas diferentes, esto con el propósito de exponerlas luego al espectrofotómetro y medir sus absorbancias junto con otras muestras proporcionadas por el profesor y controles. Los resultados de esta técnica si bien, no fueron lo exactos que esperábamos, nos sirvieron mucho para experimentar y dimensionar de lo que se trata la espectrofotometría, como funciona y en qué consiste. Sin embargo a juzgar por la variación de los resultados pudimos inferir que el error estuvo básicamente en haber calibrado el blanco con una cubeta que, lo más probable, fue que haya estado rayada por el exceso de uso. Como también podría deberse a un mal pipeteo, un error de rotulación, mala agitación de las muestras o soluciones y como factor principal, el mal estado en que se encontraba el reactivo utilizado, lo cual fue advertido desde un principio por el docente a cargo. Es por esto que coincidimos en que lo más importante en esta técnica es escoger correctamente la longitud de onda a la cual se va a exponer la muestra según el inserto de la técnica, y por lo tanto ser muy cuidadosos con los instrumentos y materiales que se utilizan, ya que a la menor variación los resultados pueden ser distintos en un porcentaje muy importante juzgando que se trata con la vida del paciente. 10

12 BIBLIOGRAFÍA Principios de química: los caminos del descubrimiento. Escrito por Peter William Atkins, Loretta Jones. Química y reactividad química. Escrito por John C. Kotz, Paul M. Treichel, Gabriela C. Weave. 11