Tecnologías Proteómicas en el Control de la Calidad de los Productos Pesqueros

Transcripción

1 Tecnologías Proteómicas en el Control de la Calidad de los Productos Pesqueros Dr. Mónica Carrera Mouriño Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo (IIM) CSIC (Isla de la Toja, 11 Octubre 2013)

2 PROTEÓMICA Definición de Proteómica: Disciplina que comprende el conjunto de metodologías, herramientas y estrategias orientadas al estudio a gran escala de un determinado proteoma Definición de Proteoma: Un proteoma representa el conjunto de proteínas de un organismo, una célula, un orgánulo, etc, en definitiva de cualquier sistema biológico, en un determinado momento, bajo precisas y determinadas condiciones Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo). mcarrera@iim.csic.es

3 PROTEÓMICA CALIDAD Y SEGURIDAD DE ALIMENTOS DE ORIGEN MARINO 1) Control de 2) Alteración en la Origen Calidad PROTEOMICA 3) 4) Microorganismos Alergenos Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo). mcarrera@iim.csic.es

4 1) CONTROL DE ORIGEN 1) Control de Origen PROTEOMICA Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

5 1) CONTROL DE ORIGEN Objetivo: Introducción: La AUTENTIFICACIÓN de especies. Gran preocupación autoridades alimentarias y sanitarias. La familia Merlucciidae (13 especies ) (mayor consumo Europa). - Difícil identificación de la especie. Caracteres morfológicos similares Gran diversidad de taxones comercializados como merluza Coexistencia de caladeros Diversidad de preparaciones en el mercado Fraude comercial (sustitución) - Legislación Etiquetado (Directiva 2000/13/CE y Reales Decretos 1380/2002 y RD 121/2004) - Métodos moleculares de identificación. Genéticos (lentos, no todas las especies) Autentificación de especies de toda la familia Merlucciidae por TÉCNICAS rápidas de PROTEÓMICA.

6 1) CONTROL DE ORIGEN Bottom-Up Proteomics Discovery phase: MALDI-TOF MS 2-DE spot of interest Peptide Mass Fingerprinting Characterization of species-specific Peptide Biomarkers In-gel tryptic digestion ESI-IT-MS/MS MS/MS spectrum Database searching and/or De Novo Sequencing

7 1) CONTROL DE ORIGEN Resultados: Spots diferenciales. Electroforesis bidimensional (2-DE) M. merluccius M. capensis M. senegalensis M. polli M. paradoxus pi>3,75-4,55 M r 11,2-11,55 kda P3 P2 P1 P6 P5 P4 P9 P8 P7 P12 P11 P10 P15 P14 P13 pi 3,75 4,55 5,20 5,85 M r (kda) 97,0 6,55 M. hubbsi M. gayi M. australis polylepis M. australis australis 66,0 45,0 P18 P17 P16 P22 P20 P19 P21 P25 P24 P23 P29 P28 P27 P26 30,0 20,1 14,0 NDK M. productus M. bilinearis Ma. nov. nov. Ma. nov. magellanicus P37 PRVBs P32 P31 P30 P34 P33 P36 P35 P40 P39 P38 Publicación SCI: Carrera et al. Proteomics, 2006, 6:

8 1) CONTROL DE ORIGEN Resultados: MALDI-TOF-MS (masas comunes y específicas) a) 1210,5 b) 1034,5 c) 1193,5 d) 865,3 e) M. merluccius P1 M. capensis M. senegalensis M. polli M. paradoxus M. hubbsi M. gayi M. australis polylepis M. australis australis P4 P7 P10 P13 P16 P19 P23 P ,5 1471,5 M. australis australis P27 M. productus Ma. nov. nov. Ma. nov. magellanicus P30 P35 P m/z ,5 m/z m/z ,4 m/z m/z M. merluccius M. capensis M. senegalensis M. polli M. paradoxus M. hubbsi M. gayi M. gayi M. australis polylepis M. australis australis M. productus M. bilinearis Ma. nov. nov. Ma. nov. magellanicus P2 P5 P8 P11 P14 P17 P20 P21 P24 P28 P31 P33 P36 P39 f) , Publicación SCI: g) ,1 h) i) 1588,7 1619, Carrera et al. Proteomics, 2006, 6:

9 Abundancia Relativa Abundancia Relativa Abundancia Relativa PÉPTIDOS BIOMARCADORES Resultados: Y - M - S - S - G - P - V - F - A - M - V - W - E - G - E - G - I - V - K b 3 b b 7 b 8 b 9 b 10 b 11 b 12 b 13 b 15 b 16 b 17 b Y - M - A - S - G - P - V - F - A - M - V - W - E - G - E - G - I - V - K b 5 b 6 b 7 b 8 b 9 b 10 b 11 b 12 b 15 b 17 b Abundancia Relati va 916, , ,76 [M2H] ,4 1364, ,4 b b b b 730,3 b b 7 b 896, b 12 b 13 b 15 3 b 601,3 10 b b 1560, ,5 869,2 1071,3 1356,4 1617,6 541,1 722,2 940,3 1485,4 1940,5 416,2 1670, m/z LC-MS/MS Secuenciación de novo N - I - I - H - G - S - D - T - V - E - 3 N - A - K b b b b b b b b b 920, , , , 8 b b 4 b b 2 7 b , , b b b 12 b , 3 737, , ,2, 2 776, ,4 1251,5 699,30 [M2H] m/z , ,98 [M2H] ,4 12 b b ,4 14 b 1015, , b 6 b 8 b 15 4 b 9 b b b 888, , b 601, ,3 540,9 835,1 1136,3 1923,9 510,0 731,2 1323,4 1826, m/z N - I - I - H - G - S - D - T - L - E - N - A - K b m/z b 3 b b b b b b b 12 5 b 6 934,4 706,30 [M2H] ,4 1071,4 Publicación SCI: 7 592,9 b b b b 8 11 b , 0 b b ,1 478,2 675, 790, ,1 877, , b , m/z Targeted Proteomics Carrera et al. J. Proteome Res., 2007, 6:

10 1) CONTROL DE ORIGEN TARGETED PROTEOMICS Monitorización de Péptidos Biomarcadores por espectrometría de masas. Identificación rápida de las 13 especies comerciales de merluza Prot. Termoestables: Parvalbúminas (PRVBs) Digestión tríptica ultrarrápida mediante HIFU (High Intensity Focused Ultrasound) Selected MS/MS Ion Monitoring (SMIM) Carrera et al. Anal. Chem., 2011, 83: Publicaciones SCI: Jorge I., Carrera M., et al. J. Mass Spectrom., 2007, 42:

11 Relative abundance 1) CONTROL DE ORIGEN TARGETED PROTEOMICS Protein biomarker purification: PRVBs (70ºC, 5 min) Time: 45 min Rapid in-solution tryptic digestion using HIFU Time: 2 min LC-ESI-IT-MS/MS in SMIM mode Time: 60 min Identificación de la especie (<2h) Método más rápido descrito hasta el momento.

12 1) CONTROL DE ORIGEN TARGETED PROTEOMICS Validado para distintos tipos de Productos Comerciales (frescos, refrigerados, congelados, procesados, inclusive en precocinados)

13 Patente PATENTE OEPM: ES Inventores: Mónica Carrera, José Manuel Gallardo, Carmen Piñeiro, Benito Cañas, Daniel López, Jesús Vázquez, Lorena Barros Título: Procedimiento para la identificación de las especies comerciales de la familia Merlucciidae, elementos necesarios y aplicaciones País prioridad: ESPAÑA Entidad titular: CSIC Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo). mcarrera@iim.csic.es

14 2) ALTERACIONES EN LA CALIDAD Alteraciones en la Calidad 2) PROTEOMICA Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

15 2) ALTERACIONES DE CALIDAD ALTERACIÓN DE LA CALIDAD: PROTEOLISIS Introducción: Deterioro post-mortem productos marinos es un proceso rápido. Destacan la acción de enzimas proteolíticas y la actividad microbiana. Estos mecanismos resultan en cambios estructurales y bioquímicos de los productos marinos. Fiel reflejo en la Apariencia (calidad, frescura). Nuevos métodos de refrigeración de productos pesqueros. Hielo líquido (mezcla microesferas de hieloanticongelante). Objetivo: Métodos clásicos de evaluación de la calidad: análisis sensoriales, fisicoquímicos Selección de BIOMARCADORES PROTEICOS de CALIDAD y vida útil, así como el desarrollo de TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS para la evaluación de la PROTEOLISIS en productos pesqueros sometidos a distintos procedimientos de refrigeración.

16 2) ALTERACIONES DE CALIDAD Resultados: Estudio de proteólisis Sarcomere Z-line Z-line SLURRY ICE FLAKE ICE D0 D2 D5 D8 D12 D15 D19 D22 ST D0 D2 D5 D8 D12 D15 D19 D0 ST Alfa-actinina ELISA ESPECIFICO Publicación SCI: Hielo tradicional Hielo líquido Carrera et al. Int. J. Food Sci. Technol. 43: 69-75

17 3) MICROORGANISMOS PROTEOMICA 3) Microorganismos Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

18 % In ten sity 0 0 3) MICROORGANISMOS Desarrollo de TÉCNICAS PROTEÓMICAS para la detección e identificación de bacterias patógenas y alterantes en productos alimentarios de origen marino. Extract from cells MALDI-TOF MS LC-MS/MS Isolation from seafood Protein/Peptide Phyloproteomic tree Specific spectral profiles De novo MS sequencing SPECLUST Voy a ge r Spe c # 1 => TR[BP = , ] Characteristic peak masses and Peptide Biomarkers

19 3) MICROORGANISMOS SPECTRABANK Librería de espectros Base de Datos pública que contiene las resultados de MALDI-TOF-MS y las [MH] específicas para la identificación de >120 cepas de microorganismos Recién inclusión de Péptidos Biomarcadores obtenidos por LC-MS/MS

20 4) ALERGENOS PROTEOMICA 4) Alergenos Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

21 4) ALERGENOS 4) SECUENCIACIÓN DE NOVO COMPLETA DE NUEVOS ALERGENOS DE PESCADO Introducción: El Pescado es uno de los principales Alimentos Alergénicos (~0.6 % población). Alergia Tipo I (IgE). Parvalbúminas son los principales ALERGENOS de pescado Sólo se conocen la secuencia completa s de 2 PRVBs para toda la familia Merlucciidae (UniProtKB). Objetivo: Aplicar las distintas herramientas PROTEÓMICAS para la secuenciación de novo completa de nuevas PRVBs de la familia Merlucciiade. Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo). mcarrera@iim.csic.es

22 4) ALERGENOS Resultados: Novedosa estrategia para la extensiva secuenciación de novo de nuevas proteínas alergénicas basada en la combinación de las 3 principales aproximaciones PROTEÓMICAS. - Bottom-Up proteomics - Accurate Mr measurement by FTICR-MS (Top-Down proteomics) - Selected MS/MS Ion Monitoring (SMIM) (Targeted proteomics) Protein extract a) Bottom-Up (Classic approach) 2-DE Partial protein sequence Trypsin/ Glu-C MS/MS (CID) Y Peptide identified SEQUEST De novo sequencing N DeNovoX PEAKS Manual sequencing Sequences alignment AFSGILAEADIAAALKACEAAGTFNYKAFFAK SADDIKKAFFVIDQDKS GFIEEDELKLFLQVFSAGARALTDDETKAFLKAGDSDGDGAIGVEEWAALVKA b) Accurate Mr measurement Protein purification FTICR MS Experimental M r Comparison Theoretical M r c) Selected MS/MS Ion Monitoring (SMIM) 2-DE Trypsin MS/MS m/z (z=2) Peptide gap sequence SEQUEST identification De novo sequencing VGLTGK Complete protein sequence AFSGILAEADIAAALKACEAAGTFNYKAFFAKVGLTGKSADDIKKAFFVIDQDKSG FIEEDELKLFLQVFSAGARALTDDETKAFLKAGDSDGDGAIGVEEWAALVKA M r (1.56 ppm)

23 4) ALERGENOS Resultados: Secuenciación de novo completa de 25 nuevas isoformas de parvalbúminas (PRVBs) pertenecientes a todas las principales especies comerciales de la familia Merlucciidae. Mayor trabajo de secuenciación de novo de proteínas haciendo uso únicamente de técnicas de espectrometría de masas. Enriquecimiento de las Bases de Datos de proteínas, las cuales son escasas en spp. marinas. 25 nuevas secuencias completas de Alergenos Alimentarios (Parvalbúminas) Autores: Mónica Carrera, Benito Cañas, Carmen Piñeiro, Jesús Vázquez, José M. Gallardo Base de Datos: UniProtKB Database Nº Accesión: (P86739-P86775) Publicación SCI: Carrera et al. J. Proteome Res., 2010, 9: PREMIO: Mejor Publicación Científica SEProt Autoría, Registro, BASE DE DATOS:

24 4) ALERGENOS DETECCIÓN RÁPIDA DE ALERGENOS DE PESCADO Introducción: Parvalbúminas son los principales ALERGENOS de pescado. SEGURIDAD: Directiva 2007/68/EC, obliga el etiquetado de la presencia de los 14 alergenos alimentarios Métodos inmunológicos. Problemas de crossreactividad de los anticuerpos policlonales. Objetivo: Desarrollo de una nueva estrategia basada en TARGETED PROTEOMICS para la rápida detección de cualquier PRVB de cualquier pescado en cualquier producto alimenticio. Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

25 4) ALERGENOS DISEÑO IN-SILICO DE PÉPTIDOS BIOMARCADORES

26 4) ALERGENOS Resultados: PRVB Purification 45 min HIFU SMIM Allergen detection Time: <2h 2 min 60 min 19 peptide biomarkers Método de detección más rápido descrito hasta el momento y aplicable a cualquier producto alimenticio incluso procesados y precocinados. Validado para 16 especies de pescado Publicación SCI: diferentes. Aplicable a cualquier producto alimenticio inclusive Carrera et al. J. Proteomics 2012, 75: procesados y precocinados.

27 4) ALERGENOS 3.4) FISH ALLERGOMICS, Proteomics and Systems Biology of Fish Allergy CSIC (2013-actualidad) Título proyecto: FISH ALLERGOMICS, Proteomics and Systems Biology of Fish Allergy Entidad subsidiaria: UE VII EUROPEAN FRAMEWORK (Marie Curie IEF) Entidades participantes: Instituto de Investigaciones Marinas (IIM-CSIC), Hospital Carlos III de Madrid, Universidad Complutense de Madrid Duración desde: 2013 hasta: 2015 Investigador principal: Dr. Mónica Carrera Importe total del proyecto: ,20 Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).

28 3) ALERGENOS 3.4) FISH ALLERGOMICS CSIC FISH ALLERGY (2013-actualidad) FOOD SAFETY CONTROL (Control Authorities/Food Industry) a) b) PROTEOMICS c) IMMUNOTHERAPY (Pharmaceutical/Healthcare Organizations) SYSTEMS BIOLOGY Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo). IN SILICO MODEL OF FISH ALLERGY (Research/Healthcare Organizations) (en desarrollo)

29 4) ALERGENOS CSIC (2013-actualidad) Objetivo: 4) PARASITE: Parasite risk assessment with integrated tools in EU fish production value chains Anisakiasis es una parasitosis producida por el consumo de pescado parasitado por larvas de la familia Anisakiidae. 1/3 del pescado de lonjas españolas está parasitado Síntomas clínicos por parasitosis Hipersensibilidad alérgica (Ig-E) No se conocen todos los Ags y epítopos alergénicos. Eficaz la congelación a -20ºC/24h para evitar parasitosis No evita las reacciones alérgicas. Evitar consumo. Desarrollo de estrategias PROTEÓMICAS para la rápida detección e identificación de alergenos procedentes de parásitos de la familia Anisakiidae en cualquier pescado y en cualquier producto alimenticio. (en desarrollo) proyecto liderado por el Prof. Dr. Santiago Pascual (IIM-CSIC)

30 GRACIAS Mónica Carrera. (IIM, CSIC, Vigo).