Di Giorgio, M.; Sardi, M.; Busto, E.; Roth, B.; Menéndez, P.; Bonomi, M.; Vallerga, M.; Taja, M.R. y Mairal, L.

Transcripción

1 Evaluación in vitro de la radiosensibilidad individual en linfocitos de pacientes oncológicos y su correlación con reacciones tardí as adversas a la radioterapia Di Giorgio, M.; Sardi, M.; Busto, E.; Roth, B.; Menéndez, P.; Bonomi, M.; Vallerga, M.; Taja, M.R. y Mairal, L. Publicado como PI 5/03 de la Autoridad Regulatoria Nuclear

2 EVALUACIÓN IN VITRO DE LA RADIOSENSIBILIDAD INDIVIDUAL EN LINFOCITOS DE PACIENTES ONCOLÓGICOS Y SU CORRELACIÓN CON REACCIONES TARDÍAS ADVERSAS A LA RADIOTERAPIA Di Giorgio, M. 1 ; Sardi, M. 2,3 ; Busto, E. 2 ; Roth, B. 4 ; Menéndez, P. 4 ; Bonomi, M. 4 ; Vallerga, M. 1 ; Taja, M.R. 1 y Mairal, L. 3 1 Autoridad Regulatoria Nuclear 2 Hospital Italiano 3 Mevaterapia 4 Instituto de Oncología Ángel Roffo Argentina BACKGROUND Y OBJETIVO La radiosensibilidad individual es una característica inherente al sujeto individual, asociada con una reacción aumentada a las radiaciones ionizantes. Distintos endpoints biológicos tales como sobrevida clonogénica, formación de aberraciones cromosómicas y capacidad de reparación del daño radioinducido han sido aplicados en la evaluación de la radiosensibilidad in vitro. Se ha observado que del 5 a 7% de los pacientes sometidos a protocolos de irradiación terapéutica desarrollan efectos adversos en los tejidos sanos en el volumen de irradiación, denominados respuesta clínica e incluye los efectos agudos y tardíos (con dosis inferiores a la dosis de tolerancia en tejidos sanos) e inducción de cáncer [1]. Se sugiere que la incidencia y severidad de estas reacciones está principalmente influenciada por la susceptibilidad genética a la radiación [2], aunque también contribuirían otros factores. Adicionalmente, la naturaleza de los desórdenes genéticos asociados con hipersensibilidad a las radiaciones (mutaciones en los genes ATM y NBS, relacionados con Ataxia Telangectasia y Nijmegen breakage síndrome respectivamente) sugiere que los mecanismos de reparación del ADN se hallan involucrados. Consecuentemente, la caracterización de la reparación del ADN en los linfocitos mediante la aplicación del test de micronúcleos con bloqueo de la citocinesis (MN) y el ensayo de cometa (electroforesis en gel de células individuales) podrían ser aproximaciones apropiadas para evaluar la radiosensibilidad in vitro. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) evaluar la radiosensibilidad in vitro en linfocitos de dos grupos de pacientes oncológicos (prospectivamente y retrospectivamente evaluados) utilizando el test de MN y ensayo de cometa y su correlación con la respuesta clínica observada y 2) evaluar el potencial predictivo de ambas técnicas. MATERIALES Y MÉTODOS Fueron evaluados 38 pacientes con cánceres de cabeza-cuello (n = 25) y cervix (n = 13), sometidos a esquemas de radioterapia. 19 pacientes fueron evaluados previamente, durante y al finalizar la terapia radiante (grupo prospectivo) y 19 pacientes fueron evaluados de 6-18 meses después del tratamiento (grupo retrospectivo). En el grupo prospectivo se evaluó, mediante el test de MN, la atenuación del efecto citogenético, F(MN), como función del tiempo, d i, entre una exposición y el muestreo, estimándose un factor de recuperación citogenético k y su correlación con la respuesta clínica. [3] F(MN)= ( MN i. e di.k ) 45

3 En el grupo retrospectivo, las muestras de sangre fueron irradiadas in vitro con 0 (control) y 2 Gy utilizando una fuente de cobalto 60 y analizadas mediante el test de MN. Los datos citogenéticos fueron analizados comparando las frecuencias esperadas de micronúcleos (curva de calibración de individuos sanos) con los valores observados después de la irradiación in vitro. Un paciente que manifestó toxicidad tardía fue adicionalmente evaluado mediante el ensayo de cometa aplicando un software de análisis de imágenes, CASP [4]. Las células fueron irradiadas in vitro con 2 Gy. Se evaluó la capacidad de reparación del ADN después de intervalos de tiempos de reparación de 0 80 minutos. El daño inducido en el ADN y la capacidad de reparación fueron cuantificados mediante el momento de la cola del cometa [5], cuya distribución fue ajustada a una distribución de Weibull [6] y se utilizó el parámetro alfa (valor característico) para describir los perfiles de reparación del ADN del paciente analizado y los donantes sanos control, utilizados como muestra de referencia. Las reacciones tardías en los tejidos sanos, incluidos en el volumen de irradiación, fueron evaluadas y correlacionadas con la respuesta citogenética individual proveniente de los test de radiosensibilidad in vitro aplicados (MN y ensayo de cometa). Las integrales de dosis en el volumen de irradiación fueron derivadas de las curvas de isodosis del paciente, obtenidas de la evaluación por tomografía. Para este fin, el volumen de tejido que recibió cada dosis fue calculado y multiplicado por el valor de dosis. La integral de dosis en la región irradiada (kg. Gy) fue obtenida sumando todos los productos dosis-volumen para todas las dosis. La dosis equivalente a todo el cuerpo fue calculada dividiendo la integral de dosis por el peso corporal individual. Test de MN: Se incubaron 0,8 ml a 1 ml de sangre entera, extraída por venopunción, en 8,5 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco) al 25% (v/v) a 37 C durante 72 a 74 horas. Los linfocitos fueron estimulados a dividirse con fitohemaglutinina M 3% (Gibco). A las 44 h de cultivo se agregó citocalasina B (6 µg/ml concentración final, Sigma) a fin de bloquear la citocinesis. A las horas de incubación las células fueron colectadas por centrifugación y tratadas con solución hipotónica, según método de Iskandar (NaCl 0,9% / kcl 0,075 M, 9:1), para lograr la preservación del citoplasma. La fijación se realizó con metanol / acético (3:1) y se coloreó con Giemsa al 5% (ph 6,8). Se estableció la frecuencia de MN evaluando 500 a 1000 células binucleadas por muestra y por dosis, aplicando los criterios de Fenech, M. [7] para la identificación de células binucleadas y MN. Ensayo de Cometa Alcalino: Se realizó de acuerdo a las técnicas de Singh [8] y Tice [9] con modificaciones. Se preparó una fina capa de agarosa de punto de fusión normal al 1,5% sobre portaobjetos. Después de la irradiación, células en 50 µl fueron mezcladas con 120 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% y colocadas sobre los vidrios. Los vidrios fueron sumergidos en solución de lisis fría a ph 10 (NaCl 2,5 M; Na 2 EDTA 100 mm, Tris 10 mm ph 10; Tritón X-100 1%; DMSO 10%) y mantenidos a 4 C durante 60 min. A fin de permitir la desnaturalización del ADN y la difusión del buffer de lisis fuera del gel, los vidrios fueron mantenidos en buffer de electroforesis alcalino a ph 13 (Na 2 EDTA 1 mm /NaOH 300 mm) durante 25 min. Subsecuentemente, los vidrios fueron transferidos a una cuba de 46

4 electroforesis con buffer fresco y la corrida se realizó a 1,33 V/cm durante 25 min a 4 C (20 V- 125 ma). Los vidrios se neutralizaron en Tris 0,4 M ph 7,5 durante 5 min, se tiñeron con bromuro de etidio 20 µg/ml. Todo el proceso fue realizado en oscuridad y a 4 C para impedir daño adicional del ADN. Para la visualización del daño, las observaciones se realizaron con objetivo de 20x utilizando un microscopio de epifluorescencia con filtro de excitación: y filtro barrera de 590. Se evaluaron 50 a 100 cometas por muestra. El daño inducido en el ADN y la capacidad de reparación fueron cuantificados mediante el momento de la cola del cometa de Olive [5]. RESULTADOS Frecuencia MN (observada - espontánea) y = D R2 2 = Pacientes que presentaron toxicidad tardía Dosis equivalente [ Gy] Evaluación prospectiva: Figura 1. Correlación entre la frecuencia de MN y la dosis equivalente a todo el cuerpo, en los pacientes evaluados prospectivamente La Figura 1 muestra que la frecuencia de MN aumenta linealmente con la dosis equivalente a todo el cuerpo. Sin embargo, con el aumento de la dosis física la frecuencia de MN en los pacientes fue menor que la esperada, determinada a partir de la curva de calibración del laboratorio, a partir de individuos sanos (Figura 2). Este fenómeno puede ser atribuido al fraccionamiento de la dosis más que a la condición de irradiación inhomogénea. Para el tratamiento fraccionado en partes del cuerpo que tienen gran volumen y flujo sanguíneo se sugiere que la recirculación de los linfocitos contribuye a la homogeneización final de la dosis total absorbida. Por lo tanto, se puede suponer que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenética parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra. 47

5 0.8 Frecuencia de MN Pacientes con cáncer de cervix Pacientes con tumores de cabeza-cuello Frecuencia de MN esperada Dosis equivalente [Gy] Figura 2. Comparación de los datos citogenéticos de los pacientes con la curva de calibración En la evaluación prospectiva, el factor k correlacionó con la radiosensibilidad individual (Figura 3). Dos pacientes con baja capacidad de recuperación del efecto citogenético desarrollaron toxicidad tardía (fibrosis y rectitis actínica). Frecuencia de MN Radiosensibilidad individual Pacientes con respuesta clínica normal Pacientes con toxicidad tardía k Figura 3. Frecuencia de MN vs. factor de recuperación citogenético k Un bajo valor de k (k 0) demuestra alta radiosensibilidad del pool de linfocitos, es decir, un sujeto con dificultades en la reparación del daño radioinducido en el ADN. Evaluación retrospectiva: En la evaluación retrospectiva, la respuesta citogenética individual sugiere una correlación con el grado máximo de toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus). 48

6 Paciente Dosis = 0Gy Frecuencia Test Observada χ² Dosis = 2Gy Frecuencia Test Observada χ² Tabla 1. Frecuencias de MN espontáneas y radioinducidas (irradiación in vitro con 2 Gy de cobalto 60) en los linfocitos de los pacientes evaluados retrospectivamente, analizadas mediante el test de χ 2. Aplicando el test de χ 2, valores > 3,84 (GL = 1; p < 0,05) indican diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias de MN observadas y esperadas, permitiendo la identificación de individuos radiosensibles (Tabla 1). 0.4 Frecuencia de MN Dosis [Gy] Figura 4. Comparación de las frecuencias de MN observadas con las esperadas a partir de la curva de calibración 49

7 Los linfocitos de 3 de los 4 pacientes que desarrollaron toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus) resultaron significativamente más radiosensibles que los del resto de los pacientes y donantes sanos (Figura 4.). El daño inducido en el ADN del paciente adicionalmente analizado mediante el ensayo de cometa fue medido hasta 80 minutos en intervalos de 5, 10, 20, 30, 50 y 80 min. Para cada individuo, paciente y donantes sanos control, los datos del momento de la cola del cometa fueron ajustados a una función mono-exponencial: TM t ln 2 Τ () t = TM e TM R (1) donde, TM = Momento de la cola del cometa TM 0 = TM inicial reparable TM R = TM residual no reparable T 1/2 = tiempo medio de reparación, tiempo medio requerido por los linfocitos para reparar 50% del daño inicial t = tiempo de incubación después de la exposición a 2 Gy in-vitro El paciente que manifestó osteonecrosis, adicionalmente evaluado mediante el ensayo de cometa, mostró reducción en la capacidad de reparación del ADN. El daño observado en los linfocitos del paciente, a los 10 minutos post irradiación in vitro con 2 Gy, resultó 9,5 veces mayor que el de los controles sanos (Figura 5). 30 Momento de la cola del comerta (alfa de Weibull) τ 1/2 = 27.8 min. Paciente que manifestó osteonecrosis τ 1/2 = 2 min. Pool donantes sanos tiempo [min.] Figura 5. Perfiles de reparación evaluados mediante ensayo de cometa en linfocitos de un paciente y control 50

8 CONCLUSIONES Los datos citogenéticos muestran que el ensayo de MN es apropiado para mediciones biodosimétricas en personas sometidas a radioterapia en regiones corporales con alto flujo sanguíneo o que incluyen médula ósea. Los resultados obtenidos sugieren correlación entre los test in vitro (MN y ensayo de cometa) y la toxicidad tardía. La comparación de la tendencia media de los datos citogenéticos de los pacientes evaluados prospectivamente con la curva de calibración muestra que para dosis equivalentes a todo el cuerpo superiores a 2 Gy, la frecuencia de MN observada resulta menor que la esperada. Este comportamiento se atribuye al fraccionamiento de la dosis. Se sugiere que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenética parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra. Si el valor de frecuencia de MN observado se aproxima a la curva de calibración, esto indicaría pobre recuperación del efecto citogenético, k tiende a cero, y alta radiosensibilidad del pool de linfocitos y por lo tanto del paciente. El ensayo de MN en la evaluación prospectiva presenta la limitación como ensayo predictivo de requerir la acumulación de una dosis equivalente superior a 1,8 2 Gy (más de 10 fracciones) para poner significativamente de manifiesto la capacidad de reparación del ADN, medida mediante el parámetro k que representa el nivel de recuperación citogenética. En la evaluación retrospectiva, tanto las frecuencias espontáneas de MN como las frecuencias radioinducidas (2 Gy in vitro) resultaron significativamente mayores, respecto de las esperadas a partir de la curva de calibración proveniente de individuos sanos, sólo en aquellos pacientes que desarrollaron toxicidad tardía. La evaluación retrospectiva mediante la aplicación del ensayo de MN permitiría predecir la toxicidad tardía en pacientes que requirieran tratamientos de re-irradiación. La aplicación del ensayo de cometa en la evaluación retrospectiva de un paciente permitió confirmar la correlación entre los ensayos in vitro aplicados y la respuesta clínica. Estudios de nuestro laboratorio, aplicando el ensayo de cometa en pacientes hetrocigotas y homocigotas con síndromes de hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes indican que este ensayo podría ser una herramienta apropiada para poner de manifiesto defectos en la capacidad de reparación del ADN. El ensayo de cometa permitió determinar el daño inicial en el ADN, la velocidad de reparación (tiempo medio de reparación) y el daño residual después de un tiempo de reparación específico (80 min). El ensayo provee información de los valores medios (parámetro α de la distribución de Weibull para el momento de la cola del cometa) y de la distribución (histogramas de frecuencia), a nivel de células individuales. La utilización del ensayo de cometa en estudios prospectivos permitiría identificar precozmente subgrupos más radiosensibles con los consecuentes beneficios en el tratamiento radiante. La extensión de estos estudios a un mayor número de pacientes y la aplicación de múltiples factores biológicos pronóstico, incluyendo mediciones de radiosensibilidad en células normales, proliferación tumoral y oxigenación tumoral permitirá obtener información más completa de la radiosensibilidad individual y de la aplicabilidad de ensayos rápidos y de fácil implementación en el laboratorio clínico que puedan ser predictivos de la respuesta del paciente a la radioterapia, permitiendo la elección de un protocolo de radioterapia personalizado para cada paciente, que pueda brindarle una mejor evolución. Adicionalmente, la aplicación de estos ensayos predictivos permitirá a los radioterapeutas ajustar la terapia radiante tanto en los pacientes radiosensibles como en los radioresistentes con la consecuente mejora en la relación terapéutica Aunque las diferencias en radiosensibilidad celular y de tejidos normales es de gran importancia en la determinación de la severidad de la respuesta de los tejidos normales, también deben ser considerados: factores clínicos extrínsecos, pequeñas diferencias en la dosis física y factores que intervienen en la fibrosis, no asociados a la radiosensibilidad intrínseca. 51

9 REFERENCIAS [1] Twardella, D., Chang-Claude, J. Studies on radiosensitivity from an epidemiological point of view overview of methods and results. Radiother Oncol 2002; 62: [2] Popanda, O., Ebbeler, R., Twardella, D. et ál. Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes from breast cancer patients and their correlation with acute skin reactions to radiotherapy. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2003; 55 (5): [3] Catena, C., Conti, D., Parasacchi, P. et ál. Micronuclei in cytokinesis-blocked lymphocytes may predict patient response to radiotherapy. Int. J. Radiat. Biol. 1996; 70 (3): [4] Końca, K., Lankoff, A., Lisowska, H., Kuszewski, T., Góźdź, S., Koza, Z., Wojcik, A. A crossplatform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat. Res. 2003; 534: [5] Olive, P.L., Banáth, J.B., Durand, R.E. Heterogeneity in radiation induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured usingthe comet assay. Radiat. Res. 1990; 122: [6] Ejchart, A., Sadlej-Sosnowska, N. Statistical evaluation and comparison of comet assay results. Mutat. Res. 2003; 534: [7] Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutat. Res. 2000; 455: [8] Singh, N.P., Mc Coy, M.T., Tice, R.R., Schneider, E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 1988; 175: [9] Tice, R.R. The single cell gel/comet assay: a microgel electrophoretic technique for the detection of DNA damage and repair in individual cells. Environmental mutagenesis. D.H. Phillips and S. Venitt, eds. Oxford 1995;