PHILADELPHIA P210 Q - PCR Alert kit Ref. RTSG07-210

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: PHILADELPHIA Q - PCR Alert kit Ref. RTSG Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE Q - PCR Alert AmpliMASTER RTSG P RTS000 RTSG07-210_Front

2 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCIPIO DE LA PRUEBA pág. 2 PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO pág. 2 MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 3 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 3 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 MUESTRAS Y CONTROLES pág. 5 PROCEDIMIENTO pág. 6 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO pág. 12 CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES pág. 13 BIBLIOGRAFÍA pág. 15 PROBLEMAS Y SOLUCIONES pág. 16 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 17 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sitio WEB: C El producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX» forma parte de una prueba de amplificación de los ácidos nucleicos para la búsqueda del ADNc del reordenamiento BCR-, translocación t(9;22), cromosoma Philadelphia, variante (), para el dosaje del ADNc de respecto del ADNc del gen () en el producto de la reacción de transcripción inversa obtenido del ARN total extraído de muestras de sangre periférica recolectada en EDTA o citrato, sangre medular recolectada en EDTA o citrato, suspensiones de linfomonocitos y suspensiones de leucocitos. El producto se utiliza, junto con los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio, en el diagnóstico y monitoreo de los casos de leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia linfoblástica aguda (ALL) positivas para este marcador. Los resultados obtenidos con este producto se puede alinear con la Escala Internacional (IS) utilizando el factor de conversión que se puede obtener gracias al producto «PHILADELPHIA RNA Reference» de ELITechGroup S.p.A., calibrado con respecto a la "1 st World Health Organization (WHO) International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR- translocation by RQ-PCR". PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba prevé la realización, para cada muestra, de una reacción de amplificación real time por duplicado para el target y una reacción de amplificación real time por duplicado para el control. Las cuatro reacciones se realizan en una microplaca con un termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (thermal cycler para real time). En los primeros dos pocillos se efectúa una reacción de amplificación específica para una región del ARNm y en los otros dos pocillos una reacción de amplificación específica para una región del ARNm de utilizando el ADNc producto de la reacción de transcripción inversa del ARN extraído de las muestras en examen. En cada reacción de amplificación la sonda específica marcada con el fluoróforo FAM se activa cuando hibrida con el producto específico de la reacción de amplificación. La emisión de la fluorescencia aumenta al aumentar de los productos específicos de las reacciones de amplificación y es medida y registrada por el aparato. La elaboración de los datos permite determinar la presencia y el título del ADNc de BCR- en la muestra de partida con respecto al ADNc de de referencia. La estandarización del sistema ha sido realizada en equipos Applied Biosystems de la serie PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO El producto provee los siguientes componentes: AmpliMIX Una mezcla de oligonucleótidos primers específica para para la amplificación real time en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas desechables (tapón con aplicación BLANCA). Cada probeta contiene 110 µl de solución, suficientes para 24 reacciones. Los oligonucleótidos primers para son específicos para una región del del ARNm que se origina en el reordenamiento BCR- variante. AmpliMIX Una mezcla de oligonucleótidos primers específica para para la amplificación real time en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas desechables. Cada probeta contiene 110 µl de solución, suficientes para 24 reacciones. Los oligonucleótidos primers para son específicos para una región del ARNm del gen humano que codifica. El producto permite efectuar 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de y 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de, estándar y controles incluidos (por ejemplo, 19 pacientes en una única sesión). MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado AmpliMIX AmpliMIX mezcla de oligonucleótidos primers, tapón BLANCO mezcla de oligonucleótidos primers 2 x 110 µl 2 x 110 µl Oligonucleótidos, TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Triton X-100 Oligonucleótidos, TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Triton X SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 1/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 2/17

3 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO - Campana de flujo laminar. - Guantes sin polvo descartables de látex o similares. - Mezclador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Agua bidestilada estéril. - Termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia. OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos para la extracción del ARN de las muestras a analizar, los reactivos para la transcripción inversa del ARN, los reactivos optimizados para la amplificación, los reactivos de detección (sondas fluorescentes) y los ADN estándar de cantidad conocida no están incluidos en este producto. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes productos accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAzol» (código EXTR01), kit de extracción del ARN de muestras celulares y no celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones. «RT - kit plus» (código BRK200), kit de transcripción inversa del ARN con "random primer"; el kit permite efectuar 50 transcripciónes inversas. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mezcla de reactivos optimizados, microplacas y láminas adhesivas para la amplificación real time; el producto permite efectuar 96 reacciones. «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE» (código RTSG P), sondas fluorescentes para la amplificación real time del ADNc de y del ADNc de ; el producto permite efectuar 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de y 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de. «PHILADELPHIA Q - PCR Standard» (código STDG07-210), ADN plasmídico en cantidad conocida para obtener la curva estándar para el ADNc de y para el ADNc de ; el producto permite efectuar 4 sesiones. «PHILADELPHIA RNA Reference» (código SPG07-210), las mezclas de RNA total en cantidad conocida para convertir los resultados en la Escala Internacional (SI) de la"1 st World Health Organization (WHO) International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR- translocation by RQ-PCR"; el producto permite efectuar 6 sesiones. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Este producto es para uso exclusivo in vitro. Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121C durante una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales utilizados para realizar la prueba como si fuesen potencialmente infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material combustible monouso debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos / la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el producto antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el producto durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del producto. Utilizar sólo los reactivos presentes en el producto y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de productos de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos, requieren personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos deben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes Las probetas que contienen AmpliMIX son desechables y por lo tanto deben utilizarse sólo una vez en la preparación de la mezcla de reacción. AmpliMIX no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 3/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 4/17

4 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX MUESTRAS Y CONTROLES PROCEDIMIENTO Muestras Este producto debe utilizarse con el producto de la reacción de transcripción inversa (ADNc) obtenido del ARN extraído de las siguientes muestras biológicas: sangre periférica recolectada en EDTA o citrato, sangre medular recolectada en EDTA o citrato, suspensiones de linfomonocitos y suspensiones de leucocitos. Sangre periférica recolectada en EDTA y sangre medular recolectada en EDTA o citrato de sodio La sangre periférica recolectada en EDTA o sangre medular recolectada en EDTA o citrato de sodio destinada a la extracción del ARN debe extraerse según las indicaciones del laboratorio, transportarse a +2C / +8C y conservarse a +2C / +8C por un máximo de cuatro horas. Cuando se parte de sangre periférica o medular se aconseja separar los linfomonocitos en Ficoll TM según las indicaciones del laboratorio. La cantidad óptima de leucocitos para extraer el ARN total es aproximadamente de células. No congelar la sangre periférica o medular para evitar la degradación del ARN. Las instrucciones para la extracción del ARN están incluidas en el Manual de instrucciones de uso del producto «EXTRAzol». Suspensiones de linfomonocitos o de leucocitos Las suspensiones de linfomonocitos o de leucocitos destinadas a la extracción del ARN deben ser preparadas según las indicaciones del laboratorio, colocadas en Solución fisiológica estéril o PBS estéril, enumeradas y conservadas a +2C / +8C por un máximo de cuatro horas. La cantidad óptima de linfomonocitos o de leucocitos para extraer el ARN total es aproximadamente de células. No congelar las suspensiones de linfomonocitos o de leucocitos para evitar la degradación del ARN. Las instrucciones para la extracción del ARN están incluidas en el Manual de instrucciones de uso del kit «EXTRAzol». Sustancias interferentes El ADNc debe ser producto de ARN que no contenga heparina o hemoglobina o Ficoll TM para evitar fenómenos de inhibición y la aparición de frecuentes resultados no válidos. No son disponibles datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Controles de amplificación Es absolutamente necesario convalidar cada una de las sesiones de amplificación preparando una reacción de control negativo y una reacción de control positivo. Para el control negativo utilizar agua bidestilada estéril (no provista en el producto) agregándola a la reacción en lugar del ADNc obtenido de la muestra. Para el control positivo utilizar el producto «PHILADELPHIA Q - PCR Standard». Controles de calidad Se aconseja confirmar todo el procedimiento de análisis de cada una de las sesiones, extracción, transcripción y amplificación, utilizando una muestra negativa y una muestra positiva ya testadas. Notas referidas a la reacción de transcripción inversa El kit «RT - kit plus» es un sistema de transcripción inversa del ARN que utiliza los "random primer" para producir la reacción de polimerización, requiere agregar el ARN extraído en un volumen de 10 µl, y tiene un volumen final de 25 µl. La cantidad óptima de ARN total a agregar en la reacción de transcripción inversa con un volumen final de 25 µl es de aproximadamente 1 µg. Programación de la sesión de amplificación real time (A realizarse en el área de amplificación / detección de los productos de amplificación) Antes de iniciar la sesión, tomando como referencia la documentación del equipo, es necesario: - encender el thermal cycler para real time, encender el computador de control, iniciar el software destinado y abrir una sesión "absolute quantification"; - programar el "detector" para la sonda para con el "reporter" = "FAM" y el "quencher" = "TAMRA" y denominarlo ""; - programar el "detector" para la sonda para con el "reporter" = "FAM" y el "quencher" = "TAMRA" y denominarlo ""; - para cada pocillo en uso de la microplaca, programar los "detector" (tipo de fluorescencia a medir), el "passive reference" = "ROX" (normalización de la fluorescencia medida) y el tipo de reacción (muestra, control negativo de amplificación, ADN estándar con la correspondiente cantidad conocida). Completar el Plan de trabajo adjunto al final de este manual de instrucciones de uso transcribiendo estas informaciones o bien imprimir la organización de la microplaca. El Plan de trabajo deberá seguirse con atención durante la transferencia de la mezcla de reacción y de las muestras a los pocillos. Nota: para la determinación del título del ADNc en la muestra de partida es necesario preparar dos series de reacciones con Q - PCR Standard (10 5 copias, 10 4 copias, 10 3 copias, 10 2 copias) para obtener las dos Curvas estándar, una para y una para. Nota: Los pocillos de cada duplicado deben ser denominados con el mismo nombre. Se ilustra a continuación, a modo de ejemplo, cómo puede organizarse el análisis de 3 muestras. M1 M1 M2 M2 M3 M3 CN CN 10 2 M M M M M M CN 10 5 CN Leyenda: M1 - M5: reacciones para con las muestras a analizar; CN: reacción para con el Control negativo; 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, reacciones para con el DNA standard 10 2, 10 3, 10 4 e 10 5 copias. M1 - M5: reacciones para con las muestras a analizar; CN: reacciones para con el Control negativo de amplificación; 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, reacciones para con el ADN estándar 10 2, 10 3, 10 4 e 10 5 copias. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 5/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 6/17

5 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX Tomando como referencia la documentación del equipo, programar en el thermal cycler los parámetros del ciclo térmico indicando 45 ciclos, un volumen de reacción de 25 µl y, cuando sea posible, la opción 9600 emulation. Ciclo térmico de amplificación Fase Temperaturas Tiempos Descontaminación 50C 2 min. Desnaturalización inicial 95C 10 min. 95C 15 seg. 45 ciclos 60C 1 min. Preparación de la amplificación (A realizarse en el área de extracción / preparación de la reacción de amplificación) Antes de iniciar la sesión es necesario: - extraer y descongelar las probetas con las muestras a analizar. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar las probetas de AmpliMIX (tapón con aplicación BLANCA) y de AmpliMIX necesarias para la sesión teniendo presente que el contenido de cada probeta es suficiente para preparar 24 reacciones y que todas las reacciones para y para deben ser preparadas por duplicado. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar un número de probetas de AmpliPROBE (tapón con aplicación BLANCA) y de AmpliPROBE igual al de las respectivas probetas de AmpliMIX. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer un número de probetas de AmpliMASTER igual al de las probetas de AmpliMIX. Escribir con tinta indeleble "" y la fecha en la etiqueta de las probetas. Centrifugar las probetas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer un número de probetas de AmpliMASTER igual al de las probetas de AmpliMIX. Escribir con tinta indeleble "" y la fecha en la etiqueta de las probetas. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar las probetas de Q - PCR Standard necesarias para las reacciones para y para que deben ser preparadas por duplicado. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer la Microplaca de amplificación que será utilizada en la sesión, prestando atención de manejarla con guantes sin polvo y de no dañar los pocillos. 1. Transferir 100 µl de AmpliMIX en la probeta de AmpliMASTER con la inscripción "". Mezclar bien pipeteando tres veces el volumen de 100 µl en la mix. 2. Transferir 100 µl de AmpliPROBE en la probeta de AmpliMASTER con la inscripción "". Mezclar bien pipeteando tres veces el volumen de 100 µl en la mix. 3. Mezclar durante 5 segundos con el vortex a baja velocidad, evitando producir espuma. 4. Centrifugar las probetas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido. 5. Repetir el procedimiento desde el punto 1 al punto 4 agregando a la probeta de AmpliMASTER con la inscripción "" el reactivo AmpliMIX y el reactivo AmpliPROBE. 6. Transferir, depositándolos cuidadosamente en el fondo, 20 µl de la mezcla de reacción "" así obtenida en los pocillos "" de la Microplaca de amplificación como fue establecido previamente en el Plan de trabajo (recordar prever dos pocillos para cada muestra, dos pocillos para el Control Negativo y dos pocillos para cada Q - PCR Standard). 7. Transferir, depositándolos cuidadosamente en el fondo, 20 µl de la mezcla de reacción "" así obtenida en los pocillos "" de la Microplaca de amplificación como fue establecido previamente en el Plan de trabajo (recordar prever dos pocillos para cada muestra, dos pocillos para el Control Negativo y dos pocillos para cada Q - PCR Standard). Nota: Si no se utiliza toda la mezcla de reacción, conservar las probetas "" y "" con el volumen restante en lugar oscuro a - 20C por un máximo de un mes. Congelar y descongelar la mezcla de reacción SÓLO UNA VEZ. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 7/17 8. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 5 µl de ADNc de la primera muestra en los dos pocillos "" y en los dos pocillos "" de la Microplaca de amplificación como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. Proceder de igual manera con los ADNc de las demás muestras. 9. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 5 µl de Agua bidestilada estéril (no provista en el producto) para el control negativo de amplificación en los dos pocillos "" en los dos pocillos "" de la Microplaca de amplificación como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. 10. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 5 µl de - Q - PCR Standard 10 2 copias en los dos pocillos "" y en los dos pocillos "" de la Microplaca de amplificación como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. Proceder del igual manera con los demás - Q - PCR Standard (10 3, 10 4, 10 5 copias). 11. Sellar cuidadosamente la Microplaca de amplificación con la Lámina adhesiva de amplificación. 12. Transferir la Microplaca de amplificación en el thermal - cycler para real time al área de amplificación / detección de los productos de amplificación y comenzar el ciclo térmico de amplificación. Análisis cualitativo de los resultados Los valores registrados de la fluorescencia emitida por la sonda específica para (detector FAM "") en las reacciones de amplificación y por la sonda específica para (detector FAM "") en las reacciones de amplificación deben ser analizados con el software del equipo. Antes de efectuar el análisis, tomando como referencia la documentación del equipo, es necesario: - programar manualmente el intervalo de cálculo del Nivel de fluorescencia de fondo (Baseline) desde el ciclo 6 al ciclo 15*; *Nota: En caso de una muestra positiva con alto título de o, la fluorescencia FAM de la sonda específica para o puede comenzar a crecer antes del 15º ciclo. En este caso el intervalo de cálculo del Nivel de fluorescencia de fondo debe ser establecido desde el ciclo 6 al ciclo en el cual la fluorescencia FAM comienza a crecer. - programar manualmente el Umbral (Threshold) para la fluorescencia FAM "" en 0,2; - programar manualmente el Umbral (Threshold) para la fluorescencia FAM "" en 0,2; Los valores de fluorescencia emitidos por las sondas específicas en las reacciones de amplificación y el valor Umbral de fluorescencia permiten determinar el Ciclo Umbral (Threshold cycle, Ct), el ciclo en el cual se ha alcanzado el valor Umbral de fluorescencia. En las reacciones de amplificación con el Q - PCR Standard 10 5, el valor de Ct de las sondas específicas para y para se utiliza para confirmar la amplificación y la detección como se describe en las tablas siguientes: Reacción del Q - PCR Standard 10 5 (FAM "") Resultado de la prueba Amplificación / Detección Ct 25 POSITIVO CORRECTA Reacción de los Q - PCR Standard 10 5 (FAM "") Resultado de la prueba Amplificación / Detección Ct 25 POSITIVO CORRECTA Si el resultado de las reacciones de amplificación del Q - PCR Standard 10 5 es Ct > 25 o Ct No determinado (Undetermined), no ha sido detectada correctamente la presencia de ADN blanco. Se han verificado problemas en la fase de amplificación o en la de detección (preparación incorrecta de la mezcla de reacción, dispensación incorrecta de la mezcla de reacción o de los estándar, degradación de la sonda o de los estándar, programación incorrecta de la posición de los estándar, programación incorrecta del ciclo térmico) que pueden provocar resultados incorrectos. La sesión no es válida y se debe repetir a partir de la fase de amplificación. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 8/17

6 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX En las reacciones de amplificación del Controlo negativo, el valor de Ct de las sondas específicas para y se utiliza para confirmar la amplificación y la detección como se describe en la tabla siguiente: Reacción Control negativo (FAM "") Resultado de la prueba Amplificación Ct No determinado NEGATIVO CORRECTA Reacción Control negativo (FAM "") Resultado de la prueba Amplificación Ct No determinado NEGATIVO CORRECTA Si el resultado de las reacciones de amplificación del Control negativo es distinto de Ct No determinado (Undetermined), ha sido detectada la presencia de ADN blanco. Se han verificado problemas en la fase de amplificación (contaminación) que pueden causar resultados incorrectos y falsos positivos. La sesión no es válida y se debe repetir a partir de la fase de amplificación. En las reacciones de amplificación de cada muestra, los valores de Ct de la sonda específica para son utilizados para detectar la presencia de ADNc blanco, mientras que los valores de Ct de la sonda específica para son utilizados para confirmar la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección. Nota: Verificar con el software del equipo (Results, Amplification plot, delta Rn vs Cycle) que el Ct sea determinado por un aumento rápido y regular de los valores de fluorescencia y no por fenómenos de pico o aumento de la señal de fondo. Este producto tiene capacidad para detectar una cantidad mínima de 10 copias de ADNc de por reacción de amplificación (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en la página 13). Los resultados como Ct de las reacciones de amplificación de cada muestra son utilizados para la búsqueda de como se describe en la siguiente tabla: Reacciones de la muestra (FAM "") Ct No determinado Ct Determinado (FAM "") Ct > 29 o Ct No determinado Idoneidad de la muestra Resultado de la prueba ADNc de no idónea no válido - Ct 29 idónea válido, negativo Ct > 29 o Ct No determinado NO DETECTADO idónea* válido, positivo PRESENTE Ct 29 idónea válido, positivo PRESENTE Si el resultado de la reacción de amplificación de una muestra es Ct No determinado para la sonda específica para y Ct > 29 o Ct No determinado para la sonda específica para, no ha sido posible detectar de manera eficiente el ADNc de. En este caso se han verificado problemas en la fase de amplificación (amplificación no eficiente o nula), en la fase de transcripción inversa (transcripción inversa no eficiente o nula) o en la fase de extracción (pérdida del ARN, presencia de inhibidores, ARN obtenido degradado) que pueden causar resultados incorrectos y falsos negativos. La muestra no es idónea, la prueba no es válida y debe repetirse a partir de la extracción de una nueva muestra. Si el resultado de la reacción de amplificación de una muestra es Ct No determinado para la sonda específica para y Ct 29 para la sonda específica para, el ADNc de no ha sido detectado en el ADNc obtenido de la muestra, pero no se puede excluir que el ADNc de esté presente con un título inferior al límite de detección del producto (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en la página 13). En este caso el resultado sería un falso negativo. Los resultados obtenidos con esta prueba deben ser interpretados considerando todos los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio correspondientes al paciente. *Nota: Cuando en la reacción de amplificación correspondiente a una muestra ha sido detectada la presencia de ADNc de pero la amplificación del ADNc de presenta un Ct > 29 o Ct No determinado, la muestra de todas maneras es apta desde el punto de vista cualitativo y el resultado positivo de la prueba es válido. Sin embargo, en este caso no se pueden utilizar los datos para el análisis cuantitativo de los resultados (ver las páginas siguientes). Análisis cuantitativo de los resultados Después de realizar el procedimiento para el análisis cualitativo de los resultados se puede llevar a cabo el análisis cuantitativo de los resultados correspondientes a las muestras positivas. Los valores de Ct de las sondas específicas para y en las reacciones de amplificación de los cuatro Q - PCR Standard se utilizan para calcular las dos Curvas estándar (Standard Curve) de la sesión de amplificación y para confirmar la amplificación y la detección como se describe en la siguiente tabla: Curva Estándar (FAM "") Intervalo de aceptación Amplificación / Detección Coeficiente de Correlación (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA Curva Estándar (FAM "") Intervalo de aceptación Amplificación / Detección Coeficiente de Correlación (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA Si el valor del Coeficiente de correlación (R2) no está contenido dentro de los límites, se han verificado problemas en la fase de amplificación o de detección (preparación incorrecta de la mezcla de reacción, dispensación incorrecta de la mezcla de reacción o de los estándar, degradación de la sonda o de los estándar, programación incorrecta de la posición de los estándar, programación incorrecta del ciclo térmico) que pueden causar resultados incorrectos. La sesión no es válida y se debe repetir a partir de la fase de amplificación. Los valores de Ct de las sondas específicas para y para en las reacciones de amplificación de cada muestra y las Curvas estándar para y para de la sesión de amplificación son utilizados para calcular la Cantidad (Quantity) de los ADNc de y de presentes en las reacciones correspondientes a las muestras. Este producto tiene capacidad para dosar de a 10 copias de ADNc de por reacción de amplificación (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en la página 13), como se describe en la tabla siguiente: Resultado de la muestra (FAM "") ADNc de por reacción Cantidad > 1 x 10 6 SUPERIOR A x 10 1 Cantidad 1 x 10 6 = Cantidad Cantidad < 1 x 10 1 INFERIOR A 10 Este producto tiene capacidad para dosar de a 100 copias de ADNc de por cada reacción de amplificación (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en la página 13), sin embargo a los fines del dosaje cuantitativo el intervalo útil es el comprendido entre y aproximadamente copias (correspondiente a un Ct de aproximadamente 29), como se describe en la tabla siguiente: Resultado de la muestra (FAM "") Cantidad > 1 x 10 6 ADNc de por reacción SUPERIOR A DE COPIAS ~ 1 x 10 3 Cantidad 1 x 10 6 = Cantidad Cantidad < ~ 1 x 10 3 INFERIOR A ~ COPIAS (MUESTRA NO IDÓNEA) SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 9/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 10/17

7 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX Análisis de los duplicados Cuando este producto es utilizado para el dosaje cuantitativo de, los resultados (Cantidad) de las reacciones de amplificación correspondientes a las muestras se utilizan para calcular el porcentaje de copias de ADNc de respecto de las copias totales del ADNc de ( %) presentes en la muestra de partida según la siguiente fórmula: Cantidad de ADNc de %= x 100 Cantidad de ADNc de Antes de proceder al cálculo % se deben analizar los datos obtenidos en las dos repeticiones de la muestra. En la tabla siguiente se muestran los distintos casos que se pueden presentar en una sesión de amplificación y el correspondiente enfoque aconsejado en la evaluación del dato que debe ser interpretado considerando todos los datos clínicos y los demás exámenes de laboratorio pertenecientes al paciente: Muestra Idoneidad de la muestra ADNc de Cantidad de ADNc de 1 repetición idónea PRESENTE promedio de 2 repetición idónea PRESENTE Cantidades de ADNc de 1 repetición idónea NO DETECTADO 2 repetición idónea NO DETECTADO 1 repetición idónea PRESENTE (< 10 copias) Cantidad de ADNc de donde esté 2 repetición idónea NO DETECTADO presente 1 repetición idónea PRESENTE (> 10 copias) 2 repetición idónea NO DETECTADO 1 repetición no idónea 2 repetición idónea 1 repetición no idónea 2 repetición no idónea PRESENTE o NO DETECTADO PRESENTE o NO DETECTADO PRESENTE o NO DETECTADO PRESENTE o NO DETECTADO 0 % Cantidad de ADNc de promedio de la Cantidad de ADNc de promedio de la Cantidad de ADNc de promedio de la Cantidad de ADNc de Repetir el análisis de la muestra Repetir el análisis de la muestra Repetir el análisis de la muestra Los resultados obtenidos con esta prueba deben ser interpretados considerando todos los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio correspondientes al paciente. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Utilizar con este producto sólo el ADNc obtenido por transcripción inversa del ARN extraído de las siguientes muestras humanas: sangre periférica recolectada en EDTA o citrato, sangre medular recolectada en EDTA o citrato, suspensiones de linfomonocitos y suspensiones de leucocitos. No utilizar con este producto ADNc obtenido por transcripción inversa de ARN extraído de muestras heparinizadas: la heparina inhibe las reacciones de trascripción inversa y de amplificación de los ácidos nucleicos y causa resultados no válidos. No utilizar con este producto el ADNc obtenido por transcripción inversa del ARN contaminado con hemoglobina o Ficoll TM : estas sustancias pueden inhibir las reacciones de transcripción inversa y de amplificación de los ácidos nucleicos y pueden provocar resultados no válidos. No son disponibles datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Los resultados obtenidos con este producto dependen de la correcta recolección, transporte, conservación y preparación de las muestras; para evitar resultados erróneos es necesario tener una particular atención a estas fases y seguir atentamente las instrucciones provistas con los productos para la extracción de los ácidos nucleicos. La metodología de amplificación nested de los ácidos nucleicos utilizada en este producto, debido a su alta sensibilidad analítica, está sujeta a contaminación por parte de muestras clínicas positivas para, de los controles positivos y de los mismos productos de la reacción de amplificación. Las contaminaciones llevan a resultados falsos positivos. Las modalidades de realización del producto son capaces de reducir las contaminaciones; sin embargo, estos fenómenos pueden evitarse sólo con una buena práctica de las técnicas de laboratorio y siguiendo atentamente las instrucciones provistas en este manual. Este producto requiere personal instruido para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere indumentaria y áreas de trabajo adecuadas para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere personal instruido para los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos para evitar resultados incorrectos. Este producto requiere áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación para evitar resultados falsos positivos. Este producto requiere el uso de indumentaria de trabajo e instrumentos destinados a la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación para evitar resultados falsos positivos. Un resultado negativo obtenido con este producto indica que los ADNc no han sido detectados en el producto de la transcripción inversa obtenido del ARN extraído de la muestra, pero no se puede excluir que los ADNc estén presentes con un título inferior al límite de detección del producto (límite de detección del producto, ver apartado sobre las Características de las prestaciones en las páginas 13); en este caso el resultado sería un falso negativo. Como para cualquier otro dispositivo de diagnóstico, los resultados obtenidos con este producto deben ser interpretados considerando todos los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio correspondientes al paciente. Como para cualquier otro dispositivo de diagnóstico, existe un riesgo latente de obtener resultados no válidos, falsos positivos y falsos negativos con este producto. Dicho riesgo latente no puede ser eliminado ni reducido totalmente. Este riesgo latente en situaciones particulares, puede contribuir a decisiones equivocadas también con consecuencias potencialmente graves para el paciente. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 11/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 12/17

8 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES Sensibilidad analítica: límite de detección para La sensibilidad analítica para de esta prueba permite identificar la presencia de aproximadamente 10 moléculas de ADN blanco en las 5 µl de ADNc extraído agregadas a la reacción de amplificación. La sensibilidad analítica para de la prueba, como límite de detección, ha sido testada utilizando un ADN plasmídico que contiene el producto de amplificación cuya concentración inicial ha sido medida espectrofotométricamente. El ADN plasmídico ha sido diluido con un título de 10 copias / 5 µl y fue utilizada en 50 repeticiones para realizar la amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. (ver apartado sobre los productos accesorios). Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Muestras N positivas negativas 10 copias ADN plasmídico Sensibilidad analítica: intervalo lineal de medición para La sensibilidad analítica para de esta prueba, como intervalo lineal de medición, permite determinar un título de a 10 moléculas de ADN blanco en los 5 µl de ADNc obtenido agregados a la reacción de amplificación. La sensibilidad analítica para de la prueba, como intervalo lineal de medición, ha sido determinada utilizando un panel de diluciones (1 log 10 entre una dilución y la siguiente) de ADN plasmídico que contiene el producto de amplificación cuya concentración inicial ha sido medida espectrofotométricamente. Los puntos del panel de 10 7 moléculas por reacción a 10 1 moléculas por reacción han sido utilizados en 9 repeticiones para efectuar la amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis de los datos obtenidos, realizado con la regresión lineal, ha demostrado que la prueba presenta una respuesta lineal para todos los puntos del panel (coeficiente de correlación lineal superior a 0,99). El límite superior del intervalo lineal de medición para ha sido fijado en 10 6 moléculas / 5 µl, en torno a un logaritmo del valor del estándar de amplificación Q - PCR Standard de concentración más alta, (10 5 moléculas / 5 µl). El límite inferior del intervalo lineal de medición para ha sido fijado en 10 moléculas / 5 µl, en torno a un logaritmo del valor del estándar de amplificación Q - PCR Standard de concentración más baja, (10 2 moléculas / 5 µl). Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Límite superior Límite inferior Sensibilidad analítica para : Precisión Intervalo lineal de medición copias ADNc de / reacción 10 copias ADNc de / reacción El estudio de la precisión para de la prueba, entendida como variabilidad de los resultados obtenidos con distintas repeticiones de una muestra en una misma sesión, permitió determinar un Coeficiente de Variación porcentual (CV %) promedio del 24,9% dentro del intervalo lineal de medición de 10 6 moléculas / 5 µl a 10 moléculas / 5 µl. Sensibilidad analítica: intervalo lineal de medición para La sensibilidad analítica para de esta prueba, como intervalo lineal de medición, permite determinar un título de a 100 moléculas de ADN blanco en los 5 µl de ADNc obtenido agregados a la reacción de amplificación. La sensibilidad analítica de la prueba, como intervalo lineal de medición, ha sido determinada utilizando un panel de diluciones (1 log 10 entre una dilución y la siguiente) de ADN plasmídico que contiene el producto de amplificación cuya concentración inicial ha sido medida espectrofotométricamente. Los puntos del panel de 10 7 moléculas por reacción a 10 1 moléculas por reacción han sido utilizados en 9 repeticiones para efectuar la amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis de los datos obtenidos, realizado con la regresión lineal, ha demostrado que la prueba presenta una respuesta lineal para todos los puntos del panel de a 100 moléculas (coeficiente de correlación lineal superior a 0,99). El límite superior del intervalo lineal de medición para ha sido fijado en 10 6 moléculas / 5 µl, en torno a un logaritmo del valor del estándar de amplificación Q - PCR Standard de concentración más alta, (10 5 moléculas / 5 µl). El límite inferior del intervalo lineal de medición para ha sido fijado en aproximadamente moléculas / 5 µl, correspondiente a un Ct de aproximadamente 29, ya que este valor representa el valor mínimo útil a los fines de este dosaje cuantitativo. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Límite superior Límite inferior Sensibilidad analítica para : Precisión Intervalo lineal de medición copias ADNc de / reacción ~ copias ADNc de / reacción El estudio de la precisión para de la prueba, entendida como variabilidad de los resultados obtenidos con distintas repeticiones de una muestra en una misma sesión, permitió determinar un Coeficiente de Variación porcentual (CV %) promedio del 11,5% dentro del intervalo lineal de medición de 10 6 moléculas / 5 µl a 100 moléculas / 5 µl. Sensibilidad analítica para : Exactitud El estudio de la exactitud para de la prueba, como diferencia entre el promedio de los resultados obtenidos en una misma sesión con distintas repeticiones de una muestra y el valor teórico de la concentración de la muestra, permitió determinar una Inexactitud porcentual promedio del 11,8% dentro del intervalo lineal de medición de 10 6 moléculas / 5 µl a 100 moléculas / 5 µl. Sensibilidad diagnóstica: eficiencia de detección y cuantificación en eventuales polimorfismos La sensibilidad de diagnóstico de la prueba, como eficiencia de detección y cuantificación en eventuales polimorfismos, ha sido evaluada por comparación de secuencias con bases de datos nucleotídicas. El análisis de las regiones elegidas para la hibridación de los oligonucleótidos primers de las AmpliMIX ( y ) y de las sondas fluorescentes de las AmpliPROBE ( y ) en la alineación de las secuencias disponibles en la base de datos de los genes humanos BCR y ha demostrado su conservación y la ausencia de mutaciones significativas. Sensibilidad analítica para : Exactitud El estudio de la exactitud para de la prueba, como diferencia entre el promedio de los resultados obtenidos en una misma sesión con distintas repeticiones de una muestra y el valor teórico de la concentración de la muestra, permitió determinar una Inexactitud porcentual promedio del 9,9% dentro del intervalo lineal de medición de 10 6 moléculas / 5 µl a 10 moléculas / 5 µl. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 13/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 14/17

9 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX Sensibilidad diagnóstica: muestras positivas La sensibilidad de diagnóstico de la prueba, como confirmación de muestras clínicas positivas, ha sido evaluada realizando el análisis de un panel de muestras positivas para, resultando igual al 90,5%. La sensibilidad diagnóstica ha sido evaluada utilizando como material de referencia 42 muestras positivas para testadas con un método de amplificación real time por un laboratorio externo. Cada muestra fue utilizada para realizar el procedimiento de análisis, transcripción inversa y amplificación, con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Muestras N positivas negativas Muestras positivas para Las cuatro muestras que se esperaba que fueran positivas resultaron negativas tanto con los productos ELITechGroup S.p.A., como con el sistema de amplificación real time del laboratorio externo, el dato concuerda con el dato clínico ya que las muestras provienen de pacientes en remisión molecular mayor. Especificidad analítica: marcadores potencialmente interferentes La especificidad analítica de la prueba, como reactividad cruzada con otros marcadores potencialmente interferentes, ha sido evaluada confrontando las secuencias con base de datos nucleotídicas. El análisis de alineación de las secuencias de los oligonucleótidos primers de las AmpliMIX ( y ) y de las sondas fluorescentes de las AmpliPROBE ( y ) con las secuencias disponibles en la base de datos de regiones genómicas humanas diferentes de los genes humanos BCR y, entre ellas las del genoma humano completo, ha demostrado su especificidad y la ausencia de homologías significativas. Especificidad diagnóstica: muestras negativas La especificidad de diagnóstico de la prueba, como confirmación de muestras clínicas negativas, ha sido evaluada realizando el análisis de un panel de muestras negativas para, resultando mayor del 94,7%. La especificidad de diagnóstico ha sido evaluada utilizando como material de referencia 20 muestras negativas para testadas con un método de amplificación real time por un laboratorio externo. Cada muestra fue utilizada para realizar el procedimiento de análisis, transcripción inversa y amplificación, con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Muestras N positivas negativas Muestras negativas para Una muestra dio un resultado no válido. Nota: Los datos y los resultados completos de las pruebas realizadas para evaluar las características de las prestaciones del producto están señaladas en la Sección 7 del Fascículo Técnico del Producto "PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX" y "PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE", FTP RTSG BIBLIOGRAFÍA J. Gabert et al. (2003) Leukemia 17: E. Beillard et al. (2003) Leukemia 17: PROBLEMAS Y SOLUCIONES ADN blanco no detectado en las reacciones de los Q - PCR Standard o bien Coeficiente de correlación de la Curva estándar no válido. Causas posibles Error en la preparación de la mezcla de reacción. Soluciones Controlar los volúmenes de reactivos dispensados durante la preparación de la mezcla de reacción. Error en la dispensación de la microplaca. Dispensar cuidadosamente las reacciones en la microplaca siguiendo el plan de trabajo. Controlar los volúmenes de mezcla de reacción dispensados. Controlar los volúmenes de estándar distribuidos. Degradación de la sonda. Degradación de los estándar. Error en la programación del equipo. Presencia de ADN blanco en la reacción de Control negativo Causas posibles Error en la dispensación de la microplaca. Error durante la programación del equipo. Microplaca mal cerrada. Contaminación del agua bidestilada estéril. Contaminación del mix de amplificación. Contaminación del área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Utilizar una nueva alícuota de sonda. Utilizar una nueva alícuota de estándar Controlar la posición de las reacciones de es programada en el equipo. Controlar el ciclo térmico programado en el equipo. Soluciones Evitar esparcir el contenido de las probetas de las muestras. Cambiar siempre el tip entre una muestra y la otra. Dispensar cuidadosamente muestras, controles negativos y estándar en la microplaca siguiendo el plan de trabajo. Controlar la posición de muestras, controles negativos y estándar programada en el equipo. Cerrar con cuidado la microplaca. Presencia de fluorescencia de fondo elevada en las reacciones Causas posibles Error en la programación de la "baseline". Utilizar una nueva alícuota de agua estéril. Utilizar una nueva alícuota del mix de amplificación. Limpiar superficies y instrumentos con detergentes acuosos, lavar batas, sustituir probetas y tips en uso. Soluciones Programar el intervalo de cálculo de "baseline" en una zona de ciclos en la cual la fluorescencia de fondo ya se encuentre estabilizada (controlar los registros "component") y que la fluorescencia de la señal no haya comenzado a crecer todavía, por ejempio del ciclo 9 al ciclo 15. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 15/17 SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 16/17

10 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Número de catálogo. Límite superior de temperatura. Código de lote. Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. CONT Contenido. Atención, consultar las instrucciones de uso. Fabricante. La adquisición de este producto permite al comprador su utilización para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos para proveer servicios de diagnóstico humano in vitro. Este derecho es otorgado sólo si el producto provisto se utiliza junto con los productos con licencia "Positive Control" o Q - PCR Standard de ELITechGroup S.p.A. Por medio de la adquisición no se otorga ningún derecho general o otra licencia de tipo diferente de este derecho específico de uso. SCH mrtsg07210m_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 17/17

11 HOJA DE TRABAJO A B C D E F G H

12 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE RTSG P PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE RTSG P ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO pág. 1 MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 2 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 2 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 PROCEDIMIENTO pág. 4 BIBLIOGRAFÍA pág. 4 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 4 USO PREVISTO El producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE» forma parte de una prueba cuantitativa de amplificación de los ácidos nucleicos para la búsqueda del ADNc del reordenamiento BCR-, translocación t(9;22), cromosoma Philadelphia, variante () y para el dosaje cuantitativo del ADNc de respecto del ADNc del gen () en el producto de la reacción de transcripción inversa obtenido del ARN total extraído de muestras de sangre periférica recolectada en EDTA o citrato, sangre medular recolectada en EDTA o citrato, suspensiones de linfomonocitos y suspensiones de leucocitos. El producto se utiliza, junto con los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio, en el diagnóstico y monitoreo de los casos de leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia linfoblástica aguda (ALL) positivas para este marcador. Los resultados obtenidos con este producto se puede alinear con la Escala Internacional (IS) utilizando el factor de conversión que se puede obtener gracias al producto «PHILADELPHIA RNA Reference» de ELITechGroup S.p.A., calibrado con respecto a la "1 st World Health Organization (WHO) International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR- translocation by RQ-PCR". PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sitio WEB: C El producto provee los siguientes componentes: AmpliPROBE Una sonda fluorescente específica para para la amplificación real time en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas desechables (tapón con aplicación BLANCA). Cada probeta contiene 110 µl de solución, suficiente para 24 test. SCH mrtsg07210p_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 1/4 La sonda para marcada con el fluoróforo FAM y bloqueada con el fluoróforo TAMRA es específica para una región del ARNm que se origina en el reordenamiento BCR- variante. AmpliPROBE Una sonda fluorescente específica para para la amplificación real time en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas desechables. Cada probeta contiene 110 µl de solución, suficiente para 24 test. La sonda para, marcada con el fluoróforo FAM y bloqueada con el fluoróforo TAMRA, es específica para una región del ARNm del gen humano que codifica. El producto permite efectuar 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de y 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de, estándar y controles incluidos (por ejemplo, 19 pacientes en una única sesión). MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado AmpliPROBE AmpliPROBE sonda fluorescente marcada con FAM / TAMRA, tapón BLANCO sonda fluorescente marcada con FAM / TAMRA 2 x 110 µl 2 x 110 µl Oligonucleótidos fluorescentes, TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Triton X-100 Oligonucleótidos fluorescentes, TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Triton X-100 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO - Campana de flujo laminar. - Guantes descartables de látex o similares. - Mezclador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Agua bidestilada estéril. - Termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (thermal - cycler para real time). OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos para la extracción del ARN de las muestras a analizar, los reactivos para la transcripción inversa del ARN, los reactivos optimizados para la amplificación, los reactivos primers (oligonucleótidos) y los ADN estándar de cantidad conocida no están incluidos en este producto. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes productos accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAzol» (código EXTR01), kit de extracción del ARN de muestras celulares y no celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones. «RT - kit plus» (código BRK200), producto de transcripción inversa del ARN con "random primer"; el kit permite efectuar 50 reacciones. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mezcla de reactivos optimizados, microplacas y láminas adhesivas para la amplificación real time; el producto permite efectuar 96 reacciones. «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX» (código ), oligonucleótidos primers para la amplificación real time del ADNc de y del ADNc de ; el producto permite efectuar 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de y 24 determinaciones por duplicado para el ADNc de. «PHILADELPHIA Q - PCR Standard» (código STDG07-210), ADN plasmídico en cantidad conocida para obtener la curva estándar para el ADNc de y para el ADNc de ; el producto permite efectuar 4 sesiones. «PHILADELPHIA RNA Reference» (código SPG07-210), las mezclas de RNA total en cantidad conocida para convertir los resultados en la Escala Internacional (SI) de la"1 st World Health Organization (WHO) International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR- translocation by RQ-PCR"; el producto permite efectuar 6 sesiones. SCH mrtsg07210p_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 2/4 - -

13 PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE RTSG P PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE RTSG P ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Este producto es para uso exclusivo in vitro. Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121C durante una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales utilizados para realizar la prueba como si fuesen potencialmente infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material combustible monouso debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos / la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el producto antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el producto durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del producto. Utilizar sólo los reactivos presentes en el producto y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de productos de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos, requieren personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos deben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los reactivos Las probetas que contienen el AmpliPROBE son desechables y por lo tanto deben utilizarse sólo una vez en la preparación de la mezcla de reacción. SCH mrtsg07210p_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 3/4 AmpliPROBE no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. PROCEDIMIENTO El producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliPROBE» debe utilizarse con el producto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» y el producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX» para obtener la mezcla de reacción. Los componentes AmpliPROBE y AmpliPROBE están listos para su uso, por lo tanto deben utilizarse agregándolos directamente en las respectivas mezclas de reacción. El procedimiento completo, que prevé la preparación y la realización de dos reacciónes de amplificación real time en dos pocillos de microplaca con un termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (thermal cycler para real time), se describe de manera detallada en el manual de instrucciones para el uso que se adjunta al producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX». Las características de las prestaciones y los límites del procedimiento de la prueba completa de se describen de manera detallada en el manual de instrucciones para el uso que se adjunta al producto «PHILADELPHIA Q - PCR Alert AmpliMIX». CONT Número de catálogo. Límite superior de temperatura. Código de lote. Utilizar antes del último día del mes. BIBLIOGRAFÍA J. Gabert et al. (2003) Leukemia 17: E. Beillard et al. (2003) Leukemia 17: Dispositivo médico diagnóstico in vitro. SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. Contenido. Atención, consultar las instrucciones de uso. Fabricante. La adquisición de este producto permite al comprador su utilización para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos para proveer servicios de diagnóstico humano in vitro. Este derecho es otorgado sólo si el producto provisto se utiliza junto con los productos con licencia "Positive Control" o Q - PCR Standard de ELITechGroup S.p.A. Por medio de la adquisición no se otorga ningún derecho general o otra licencia de tipo diferente de este derecho específico de uso. SCH mrtsg07210p_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 4/4

14 Q - PCR Alert AmpliMASTER reactivos optimizados para la amplificación real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reactivos optimizados para la amplificación real time RTS000 RTS000/2 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO pág. 1 MATERIAL PROVISTO EN EL KIT pág. 2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT pág. 2 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 2 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 PROCEDIMIENTO pág. 4 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 4 USO PREVISTO El producto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» forma parte de pruebas cuantitativas de amplificación de los ácidos nucleicos para la búsqueda y el dosaje de un ADN blanco con el método de amplificación real time en muestras de ADN extraído o de ADNc obtenido de ARN extraído. El producto, es un accesorio de los productos de la serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Alert AmpliPROBE», «Q - PCR Standard» y «Positive Control», de ELITechGroup S.p.A. El producto se usa en la preparación de pruebas diagnósticas basadas en el método de amplificación real time. DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sitio WEB: +2 C +8 C El producto en el formato completo (código RTS000) provee la mezcla de reactivos optimizados para la amplificación real time AmpliMASTER, en una solución estabilizadora dosificada en cuatro probetas y lista para su uso, tres Microplacas para amplificación de 96 pocillos y tres Láminas adhesivas para amplificación. El producto en el formato reducido (código RTS000/2) provee la mezcla de reactivos optimizados para la amplificación real time AmpliMASTER, en una solución estabilizadora dosificada en dos probetas y lista para su uso, dos Microplacas para amplificación de 96 pocillos y dos Láminas adhesivas para amplificación. La mezcla de reactivos provee: el sistema tampón, el cloruro de magnesio y los nucleótidos trifosfatos, el fluoróforo de referencia pasivo ROX para la normalización de la fluorescencia, la enzima Uracil-N-glucosidasa (UNG) para la inactivación de las contaminaciones por productos de amplificación y la enzima Taq ADN polimerasa de activación térmica (hot Start). Nota: las Microplacas para amplificación no deben ser utilizadas con los equipos Applied Biosystems de la serie 7000, que tienen montado el bloque térmico "FAST". El producto en el formato completo (código RTS000) permite efectuar 96 determinaciones, estándar y controles incluidos. El producto en el formato reducido (código RTS000/2) permite efectuar 48 determinaciones, estándar y controles incluidos. MATERIAL PROVISTO EN EL KIT Producto formato completo código RTS000 Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado AmpliMASTER mezcla de reactivos optimizados 4 x 340 µl Microplaca para amplificación Lámina adhesiva para amplificación microplaca de 96 pocillos de 0,2 ml TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Cloruro de magnesio, Desoxirribonucleótidos trifosfatos, ROX, Uracil-Nglicosilasa, Taq ADN polimerasa lámina adhesiva selladora Producto formato reducido código RTS000/2 Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado AmpliMASTER mezcla de reactivos optimizados 2 x 340 µl Microplaca para amplificación Lámina adhesiva para amplificación microplaca de 96 pocillos de 0,2 ml TRIS base, TRIS clorhidrato, Glicerol, Cloruro de magnesio, Desoxirribonucleótidos trifosfatos, ROX, Uracil-Nglicosilasa, Taq ADN polimerasa lámina adhesiva selladora MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT - Campana de flujo laminar. - Guantes descartables de látex o similares. - Mezclador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de desplazamiento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Agua bidestilada estéril. - Termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (thermal cycler para real time). OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos primers (oligonucleótidos), los reactivos de detección (sondas fluorescentes), los ADN estándar de cantidad conocida y los controles heterocigotas de ADN plasmídico no están incluidos en este kit. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes kits de accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleótidos primers para la amplificación real time. serie «Q - PCR Alert AmpliPROBE», sondas fluorescentes para la amplificación real time. serie «Q - PCR Standard», ADN plasmídico de cantidad conocida para obtener la curva estándar. serie «Positive Control», control heterocigota de ADN plasmídico. - - SCH mrts000_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 1/4 SCH mrts000_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 2/4

15 Q - PCR Alert AmpliMASTER reactivos optimizados para la amplificación real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reactivos optimizados para la amplificación real time RTS000 RTS000/2 Este kit es para uso exclusivo in vitro. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121Cº durante una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales utilizados para realizar la prueba como si fuesen potencialmente infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material de uso único combustible debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos / la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el kit antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el kit durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del kit. Utilizar sólo los reactivos presentes en el kit y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de kits de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la trascripción inversa, la amplificación y la revelación de ácidos nucleicos, requieren de personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción/ preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción/ preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción/ preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción/ preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de desplazamiento positivo o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos seben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de desplazamiento positivo o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes. Con la AmpliMASTER se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. PROCEDIMIENTO El kit «Q - PCR Alert AmpliMASTER» debe utilizarse con los kits de la serie «Q - PCR Alert AmpliMIX» y «Q - PCR Alert AmpliPROBE» para obtener la mezcla de reacción. AmpliMASTER está listo para usar, por lo tanto debe utilizarse directamente en la preparación de la mezcla de reacción. El procedimiento completo, que prevé la preparación y la realización de una reacción de amplificación real time en microplaca con un termostato programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (thermal cycler para real time), se describe de manera detallada en el manual de instrucciones para el uso que se adjunta a los kits de la serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». Las características de las prestaciones y los límites del procedimiento de la prueba completa de búsqueda y dosaje de ADN blanco se describen de manera detallada en el manual de instrucciones para el uso adjunto a los kits de la serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». Número de catálogo. Límites de temperatura. Código de lote. SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. Atención, consultar las instrucciones de uso. Fabricante. La adquisición de este producto permite al comprador utilizarlo para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos con el fin de proveer servicios de diagnóstico humano in vitro. Este derecho es otorgado sólo si el producto suministrado se utiliza junto a productos con licencia "Positive Control" o "Q - PCR Standard", de ELITechGroup S.p.A. Por medio de la adquisición no se otorga ningún derecho general u otra licencia de tipo diferente de este derecho específico de uso. SCH mrts000_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 3/4 SCH mrts000_es 28/05/13 Revisión 04 Pág. 4/4