Análisis Instrumental FCEyN

Transcripción

1 Análisis Instrumental FCEyN Cromatografía gaseosa Alejandro Leciñana 2017

2 Cromatografía de Gases En la cromatografía de gases (GC), la muestra se vaporiza y se inyecta en la entrada de la columna. La elusión se efectúa con un gas inerte (He), o que no sea reactivo respecto de la muestra (N 2 o H 2 ). Diferencia con otros tipos de cromatografía: la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito. El analito pasa a la fase móvil de acuerdo a su presión de vapor (función de la temperatura), y de la afinidad que tenga por la fase estacionaria. Fase estacionaria: Líquida (GLC): es la más habitual. La fase líquida se encuentra inmovilizada sobre un sólido inerte (fase fija), o en las paredes de un tubo capilar. Sólida (GSC): de aplicación limitada a especies gaseosas de bajo peso molecular. Debido al carácter no lineal del proceso de absorción, los picos suelen presentar un coleo importante.

3 El cromatógrafo

4 Gas carrier He e H 2 presetan H mínimo para altas velocidades de flujo. También se utilizan N o Ar 2 Presión de ingreso: 1.7 a 4,5 atm (10 a 50 psi de sobrepresión) Velocidad de flujo columnas empacadas columnas capilares 25 a 150 ml/min 1 a 25 ml/min Se utilizan reguladoras de presión y válvulas reguladoras de caudal, para mantener constantes las condiciones de ingreso del gas, y se asume que por ello la velocidad de flujo es constante. Se utilizan medidores electrónicos de flujo (de masa o de volumen), al final de la columna. Se recomienda utilizar gases de pureza mayor a % Se colocan filtros con tamiz molecular para eliminar el agua, O 2 y eventuales impurezas orgánicas.

5 Presión y velocidad de flujo

6 Sistema de inyección La inyección debe ser instantánea : ingresar a la columna como un pico de vapor. El puerto de inyección se termostatiza a 50 ºC por encima del P eb del compuesto menos volátil de la muestra

7 Sistema de inyección Tres tipos básicos de inyección Sin división (non split) en columnas empacadas (0.2 a 20 ul) Con división (split injection) en columnas capilares (entre 100 y 500 veces menos) Directa o en columna (column injection)

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10 Para bajas relaciones de division (splitting), las areas se vuelven no lineales y no se puede cuantificar bien.

11 Inyección de gases Reproducibilidad relativa mejor al 5%

12 Ventajas y desventajas Inyección con division (splitting) para analitos en concentracion apreciable. picos mas finos y la mejor separacion. limite de detección y baja repetitividad para analisis cuantitativo. Inyección sin division para analitos en muy baja concentracion. baja repetitividad y baja separacion (el atrapamiento del disolvente enfría el inicio de la columna y los picos salen muy anchos). Inyección directa en columna La mejor para cuantificar (no se pierde analito). Útil cuando no se puede calentar el analito por descomposicion. La separacion es media.

13 Análisis Headspace Permite el análisis de componentes volátiles de una muestra compleja en la cual la matriz no resulta de interés. Se evitan complejas separaciones químicas

14 Tipos de columnas dos tipos básicos empaquetadas (partículas dentro de la columna como en HPLC) capilares o abiertas (sólo tienen fase estacionaria en la superficie interior) longitudes entre 2 y 100 m. de acero inoxidable, de vidrio, de silica fundida o de teflon suelen venir enrolladas para que entren dentro del horno del equipo de CG.

15 Tipos de columnas

16 Columnas abiertas (capilares) WCOT wall-coated open tubuar column PLOT porous layer open tubular column SCOT support-coated open tubular column (menor eficiencia pero mayor capacidad; fase fija ~ 30 um espesor donde se absorbe la fase estacionaria líquida) FSOT fused silica open tubular column (1979) diámetro interno 0.25 mm y 0.32 mm.

17 Columnas empaquetadas de vidrio, acero inoxidable, Cu, Al o teflon. 2-3 metros de largo diametros interiores de 2 a 4 mm. llenas de un soporte sólido recubierto por una capa fina ( µm) de la fase estacionaria líquida. Baja resolución pero admiten gran cantidad de muestra Soporte sólido: partículas esféricas pequeñas con área específica > 1 m 2 /g. Considerando que la diferencia de presión para alcanzar una velocidad de flujo razonable del gas carrier varía en forma inversa al cuadrado del diámetro de partículas, y no es conveniente superar los 50 psi: Usualmente el diámetro es de entre 60 y 100 mesh (250 a 149 µm)

18 Fase líquida estacionaria Esa fase líquida debe tener las siguientes propiedades 1. baja volatilidad (punto de ebullición al menos 100 o C mas alto que la maxima temperatura operativa de la columna). 2. estabilidad térmica y química. 3. características del solvente tales que los valores de k y α para los analitos sea convenientes. 4. no sangrar de su soporte sólido, para lo cual se suele unir en forma covalente al soporte mediante alguna reacción. La elección de la fase estacionaria define la eficacia de la separación Bibliografía Internet Recomendaciones de los proveedores

19 Fase líquida estacionaria Criterio de separación: fases afines con los analitos a resolver: lo similar disuelve lo similar. Fases polares contienen grupos funcionales como CN,-CO y OH Fases no polares hidrocarburos o dialkilsiloxanos Fases altamente polares poliester Cuando la coincidencia de polaridad entre la fase estacionaria y los analitos es buena, el orden de elución está determinado por el punto de ebullición de las especies.

20 Fase líquida estacionaria Tanto para columnas empacadas como capilares, las siguientes fases generan separaciones eficaces en más del 90% de las muestras.

21 Polidimetil xiloxano

22 Polidimetil xiloxano con los R = CH 3 tenemos un líquido relativamente no polar. Si reemplazo parte de los CH 3 por bencil, cianopropil o trifluoropropil en el esqueleto del polixiloxano, aumento su polaridad. El polietilen glicol, por su parte, es ampliamente utilizado para separa especies polares.

23 El horno Convencional (baño de aire en circulación) Flash (calentamiento resistivo en la proximidad de la columna) Microndas Infrarrojo Es necesario que se pueda variar la temperatura como sea necesario. La programación de la temperatura y su variación permite mejorar la resolución y obtener tiempos de elución convenientes (economía del análisis). La programación de la temperatura equivale a los gradientes de solventes en HPLC. Una temperatura apenas superior al promedio de los puntos de ebullicion de los componentes de la muestra suele dar tiempos de elusión razonables (2 a 30 min). Para muestras con analitos de intervalo amplio de volatilidad, casi siempre hay que usar temperatura programada.

24 Detectores en cromatografía gaseosa Detector ideal Sensibilidad adecuada (10-8 a g soluto/s) Buena estabilidad y reproducibilidad Respuesta lineal de varios ordenes de magnitud Intervalo de temperaturas de 25 o C a 400 o C Mínimo tiempo de respuesta independiente de la velocidad de flujo Fácil de usar y resistente a trato inadecuado Respuesta similar a cada grupo de solutos Que no destruya la muestra Ningun detector es ideal

25 Detectores en cromatografía gaseosa

26 Flame Ionization Detectors (FID) El detector de ionizacion en llama es el más ampliamente utilizado. Se aplica a casi todas las muestras. La salida de la columna ingresa directamente en una llama aire-h 2

27 Flame Ionization Detectors (FID) La mayoría de los compuestos orgánicos producen iones y electrones al ser pirolizados a la temperatura de la llama de H 2 /aire, y son detectados al monitorear la corriente que se produce. El proceso de ionización de compuestos de C en la llama no es bien conocido, sin embargo el número de iones producido es aproximadamente proporcional al número de átomos reducidos de carbono presentes. Es un detector sensible a la masa y no a la concentración, con lo cual es poco sensible a cambios en la velocidad de flujo. Los carbonilos y carboxilos casi no producen iones, y por lo tanto no se detectan: presenta baja sensibilidad para cetonas, aldehídos y acidos carboxilicos, halógenos y aminas. No presenta señal para gases no combustibles H 2 O, CO 2, SO 2 y NO x.

28 Flame Ionization Detectors (FID) Se aplica un potencial de volts a la llama que contiene el analito. Se mide la corriente en la llama (~10-12 A). El detector FID tiene alta sensibilidad (~10-13 g/s), amplio intervalo lineal (~10 7 ), y bajo ruido. Es destructivo para la muestra.

29 Thermal Conductivity Detector (TDC) Es el detector más universal y uno de los más antiguos. El elemento sensor es una resistencia eléctrica a potencial constante, que disipa su energía en el gas que sale de la columna. Si la conductividad térmica disminuye por la presencia de algun analito en el gas, la temperatura en la resistencia aumenta, y se detecta el analito. El H y el He tienen conductividades entre 6 y 10 veces superiores a la de la mayoríade los compuestos orgánicos. Para la resistencia se usa un alambre de Pt, Au, W o un termistor NTC de semiconductor.

30 Thermal Conductivity Detectors(TCD) Ventajas Universalidad (detecta especies inorgánicas y orgánicas) Simplicidad Gran intervalo dinámico (~10 5 ) No es destructivo, asi que se pueden colocar otros detectores detrás o hasta colectar la muestra (GC preparativa). Desventajas Baja sensibilidad (~10-8 g solute/ml gas carrier ), lo que significa entre 10 4 a 10 7 veces menos que otros detectores. Esto impide su utilización en algunas columnas capilares con pequeñas cantidades de muestra.

31 Thermal Conductivity Detectors(TCD)

32 Electron-Capture Detectors(ECD) Muy utilizado usados en muestras ambientales (detecta selectivamente compuestos con halógenos, como pesticidas y PCBs). No detecta hidrocarburos, alcoholes ni aminas. La salida de la columna pasa frente a un emisor de partículas β, usualmente 63 Ni. Esto provoca la ionización del gas carrier (generalmente N 2 ) y la generación de muchos electrones secundarios. En ausencia de analito estos electrones producen una corriente eléctrica constante (fondo). La corriente disminuye fuertemente en presencia de sustancias orgánicas que contienen grupos funcionales electronegativos que pueden capturar electrones (halógenos, peróxidos, quinonas, y grupos nitro). Respuesta lineal limitada a dos órdenes de magnitud.

33 Atomic Emission Detectors (AED) La salida de la columna se coloca en un plasma de helio energizado a microondas, que lo calienta hasta atomizarlo y emitir luz. la luz se analiza con un espectrofotómetro de matriz de diodos.

34 Thermionic Detectors (TID) También llamado de llama alcalina Es un FID modificado con una bolita de vidrio que contiene RbSO 4. Su respuesta a atomos de P y N está aumentada de 10 4 a 10 6 veces respecto a C. Comparado con un FID normal, es 500 veces más sensible a compuestos conteniendo P y 50 veces más para compuestos conteniendo N. Eso lo hace muy útil para detectar medicamentos, pesticidas y herbicidas que suelen contener estos elementos. Obviamente, no se puede usar N 2 como gas carrier.

35 Detector: espectrometría de masas (GC/MS) La espectrometría de masas puede considerarse el sistema de detección más importante en CG. Se utilizan con columnas capilares, ya que con columnas empacadas es necesario minimizar los volúmenes grandes de eluentes antes de ingresar al MS. Fuente de iones: impacto de electrones y ionización química. MS: cuadrupolares ó ion-trap

36 Interfase con espectrometría de masas (GC/MS) separador molecular, basado en la diferencia de velocidades relativas de difusión. Para columnas empacadas. Membrana semipermeable. Su selectividad depende de la polaridad y el peso molecular del soluto

37 Interfase con espectrometría de masas (GC/MS) Interface open-slip Un separador de flujo controla que no supere 1 ml/s, en cuyo caso incorpora He. Se utiliza en columnas capilares. Permite que la salida de la columna se mantenga a presión atmosférica. Interface capilar directa. No presenta V muerto y tiene menor costo.

38 Resultados con espectrometría de masas (GC/MS) Como ejemplo: si en una corrida cromagofráfica de 10 minutos, el MS realiza barridos sucesivos cada segundo, obtengo 600 espectros. Análisis de los datos Cromatograma total de iones: la abundancia iónica en cada espectro se suma y se grafica en función del tiempo (el dibujo será similar a un cromatograma convencional). Gráfico del espectro de masas a un determinado tiempo del cromatograma, para identificar las especies que eluyen en ese momento Monitoreo del ion seleccionado o cromatograma de masas: monitoreo un determinado valor de m/z a través de la corrida cromatográfica.

39 Interfase con espectrometría de masas (GC/MS) Cromatograma total de iones Monitoreo del ion m/z= 168 Gráfico del espectro de masas a t = 10,46 min, permite identificar al βcarbonilo norharmane (alcaloide)

40 Aplicaciones de CG (cualitativas) La cromatografía gas-líquido se aplica a compuestos que son apreciablemente volátiles y estables térmicamente hasta algunos cientos de grados Celsius. Aplicaciones Criterio de pureza de compuestos orgánicos (presencia o no de picos adicionales que permiten estimar muy aproximadamente la cantidad de contaminación presente). Puedo confirmarlo con otra columna y a otros temperaturas. Evaluación de procedimientos de purificación y de grado de avance de reacciones. Los tiempos de retencion t R son útiles para la identificación de compuestos incógnita presentes en una muestra.

41 Análisis cuantitativo La señal del detector se utiliza para cuantificar los compuestos. Se considera el área bajo la curva en cada pido (me independizo del coleo de los picos, lo que no sucede si considero la altura de picos). Método del standard externo (curva de calibración) Método del standard interno: minimizo los efectos de incertidumbre de volumen de muestra, velocidad del flujo y en condiciones de la columna. Condiciones del standar interno Debe estar ausente en la muestra analizada Debe separarse bien de otros picos de la muestra Debe tener t r cercano al del analito a cuantificar Pueden alcanzarse desviaciones standard relativas del orden del 0,5%.

42 Optimización Cromatografía gaseosa de alta velocidad Elijo sacrificar selectividad y resolución (mayor ensanchamiento de bandas) L Longitud de columna menor u velocidad del gas carrier mayor k factor de retención menor