M. C. Productos Naturales y Alimentos Análisis Químico Cuantitativo. Cromatografía de gases Dr. Raúl Salas Coronado

Transcripción

1 M. C. Productos Naturales y Alimentos Análisis Químico Cuantitativo Cromatografía de gases Dr. Raúl Salas Coronado 1

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3 Diagrama esquemático para un cromatógrafo de gases típico 3

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5 Fase móvil En GC, las fases móviles más frecuentes son H 2, He, Ar y N 2, que ofrecen la ventaja de ser químicamente inertes tanto para la muestra como para la fase estacionaria. La elección del gas por tador suele depender del detector del aparato. En las columnas empacadas, F = ml/min En las columnas capilares, F = 1-25 ml/min La velocidad del flujo real se mide con un medidor de flujo colocado a la salida de la columna. 5

6 Medidores de flujo de gases Gas del cromatógrafo Jabón Electrónico digital De película de jabón 6

7 Gases acarreadores Por excelencia el gas acarreador más utilizado es el He. La pureza del gas es muy importante. Especificaciones y precios del helio (Cilindro tamaño K) Calidad Pureza Precio Grado investigación % $ 424 US Ultrapuro % $ 211 US Pureza alta % $ 94 US 7

8 Tamaños estándares de cilindros Comparación de tamaño de cilindros 8

9 Viscosidad ( Pa x s) Eficiencia como una función de la velocidad lineal del gas acarreador Curvas típicas de van Deemter (valores promedio) Velocidades lineales promedio (cm/s) Cambio en la viscosidad con T ( C) 9

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11 Introducción de muestra El método de inyección más común consiste en usar una micro-jeringa para inyectar una cantidad pequeña de muestra en solución, por ejemplo 0.5 L, a través de una septa de goma a un puerto de vaporización flash en la cabeza de la columna. Tipo émbolo en aguja Aguja émbolo en aguja Barril de la jeringa Tipo émbolo en barril Aguja abierta 11

12 Automuestreador de líquidos Existen sistemas que se pueden configurar para 6, 12 ó 150 muestras. También existen autoinyectores con inyección en columna, y de volúmenes grandes de inyección con inyección múltiple. 12

13 Inyectores El inyector, tiene diferentes funciones. 1. Entrada de la muestra 2. Vaporizar la muestra y mezclarla con el gas acarreador 3. Trasladar muestra a la cabeza de la columna. Las características de los inyectores difieren de acuerdo al tipo de columna. El uso de un sistema de inyección automático puede significativamente incrementar la precisión de las mediciones 13

14 Inyector de vaporización directa para columnas empacadas Septa de goma Fin de la jeringa Roscado superior O-ring que sella la aguja de la jeringa durante la inyección Sección cruzada de una septa de pico de pato Septa Gas acarreador Liner Columna Una septa hecha de goma de silicona Barril del inyector Abertura pico de pato que abre fácilmente y sella confiablemente 14

15 Inyector con split calentado durante una inyección La muestra debe vaporizarse y homogenizarse cuando alcance la columna. Jeringa Gas acarreador Liner del inyector Purga de salida Muestra evaporándose La mayor porción del gas acarreador y la muestra que entran al inyector son venteados a la atmósfera. Mientras que una fracción menor es enviada a la columna. Entrada de columna Flujo de split Flujo de columna 15

16 Inyección splitless La inyección splitless es más adecuada para el análisis de trazas de solutos de alto punto de ebullición que pueden ser inyectados con un disolvente de bajo punto de ebullición Temperaturas recomendadas para inyecciones splitless 16

17 Split 17

18 Splitless 18

19 En el modo de split una velocidad de flujo alta de un gas acarreador arriva a la cámara de vaporización donde se mezcla con los vapores de la muestra inyectada. Una válvula de venteo, regulada a flujos de ml/min, separa este flujo en dos fracciones, de las cuales la porción más grande se ventea desde el inyector, llevándose con ella la mayor parte de la muestra introducida. La relación de split típicamente varía entre 1:20 y 1:500. Relación de split = vel. de flujo a la salida del split + vel.de flujo a la salida de la columna Vel. de flujo a la salida de la columna 19

20 Energía requerida para evaporar 1 L de disolvente y calentarlo a 250 C Energía consumida en kcal Disolvente Calentamiento Vaporización Total K. Grob and M. DeMartin, J. High Res. Chromatogr. 15, 335 (1992) 20

21 En análisis cuantitativo El uso de la inyección split/splitless puede resultar en errores en concentración propio de la fuerte discriminación entre compuestos que tienen diferente volatilidad. La composición de la fracción entrante a la columna es diferente a la eliminada desde el inyector. Este modo de operación se debe evitar cuando se usa un estándar externo. No obstante, este problema se puede corregir parcialmente con una buena elección de un liner. 21

22 Inyector de vaporización de temperatura controlada Este inyector llamado PTV, es conceptualmente similar al modelo de split/splitless. La temperatura del inyector se puede programar para realizar un un gradiente, por ejemplo de 20 a 300 C, en una pocas décimas de segundo. Por consiguiente, las ventajas de la inyección split/splitless se combinan con aquellas de una inyección en frio a la columna. 22

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24 Liners 24

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29 Horno controlado termostáticamente 29

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34 Columnas Hay dos tipos de columnas, las cuales difieren en su desempeño: Las columnas empacadas y las columnas capilares. Para columnas empacadas la fase estacionaria se deposita o enlaza por reacción química a un soporte poroso. Para las columnas capilares una capa delgada de fase estacionaria se deposita en, o enlaza a la superficie interna de la columna. (a) Columna empacada de acero de 3.18 mm (b) Columna 530 de 0.53 mm (c) Columna capilar de 0.2 mm (d) Detalles de una columna capilar 34

35 Imágenes de columnas empacadas (izquierda) y capilares (derecha) 35

36 Columnas empacadas Estas columnas, hoy en día son poco usadas, tienen diámetros de 1/8 ó ¼ (3.18 y 6.35 mm) y una longitud de entre 1 y 3 m. Se fabrican en acero o vidrio, la pared interna del tubo se trata para evitar efectos catalíticos con la muestra. Ellas pueden resistir una velocidad de flujo acarreador en el intervalo de 10 a 40 ml/min. Contienen un soporte poroso estable e inerte en el cual una fase estacionaria se puede impregnar o enlazar (entre 3 y 20 %) 36

37 Sección longitudinal de una columna empacada Soporte sólido Fase móvil (Gas acarreador) Fase líquida (estacionaria) 37

38 Columnas capilares (tubular abierta) Estas columnas están hechas de sílice fundida de la más alta pureza obtenida por la combustión de SiCl 4 en una atmósfera rica en oxígeno. El diámetro interno del tubo usado para esas columnas varía de 100 a 530 m, su espesor es de 50 m y la longitud de 12 a 100 m. Esas columnas se vuelven flexibles por la aplicación de una cubierta externa de poliimida, un polímero térmicamente estable (T max = 370 C) o una película de aluminio delgada. 38

39 Columnas 530 m Constituida de un capilar de 0.53 mm de diámetro interno con longitud que varía de 5 a 50 m, Requieren de una velocidad de flujo de gas acarreador de al menos 5 ml/min y puede ser tan alto como 15 ml/min, flujos cercanos usados en columnas empacadas. 39

40 Columnas capilares Columna tubular abierta de pared recubierta 1. WCOT 2. SCOT 3. PLOT Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria líquida. 40

41 Comparación de columnas empacadas y WCOT 41

42 Columnas capilares SCOT y PLOT Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas empacadas (tierra de diatomáceas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última. 42

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44 Efectos del diámetro de columna 44

45 Soportes sólidos representativos* * Fabricados por una marca comercial exclusiva de la compañía Celita NA = no disponible 45

46 Características de los soportes de tierras diatomáceas La superficie de los soportes de tierras diatomáceas es muy activa para muestras polares. Estos soportes contienen grupos hidroxilos libres que pueden formar enlaces de hidrógeno indeseables con las moléculas de soluto y causar picos con cola. De igual manera, el material más inerte (Chromosorb White) necesita lavarse con ácido (designado AW) y silinizarse para hacerlo todavía más inerte. Algunos reactivos silinizantes típicos son el dimetildiclorosilano y el hexametildisililazano. Los soportes blancos desactivados se conocen por nombres tales como Supelcoport, Chromosorb W-HP, Anachrom Q. Una desventaja de la desactivación es que esos soportes llegan a ser hidrofóbicos, y su recubrimiento con una fase estacionaria líquida puede dificultarse. 46

47 Tamaño de partícula y malla 47

48 Soportes sólidos representativos 48

49 Fases estacionarias líquidas recomendadas 49

50 Cargas equivalentes de fase estacionaria (porciento en peso) para tres soportes sólidos 50

51 Fases estacionarias seleccionadas para cromatografía Gas-Líquido 51

52 Volúmenes de muestra para diferentes tipos de columnas 52

53 Parámetros operacionales para una fase estacionaria en GC L = longitud de la columna u = velocidad de la fase móvil T = temperatura de la columna β = relación de fases, que afecta el factor de capacidad k Las condiciones de operación de los cromatógrafos permiten modificaciones en términos de T y u. 53

54 Relación de fases Para comparar o predecir el comportamiento de las columnas capilares es útil calcular la relación de fases (β). d c = diámetro interno de la columna d f = es el espesor de la película depositada en la superficie interna. Si los compuestos a ser separados son volátiles, se debe elegir una columna con una β < 100 y viceversa. Una columna de 320 m con un d f = 1 m, tiene una β = 80. Mientras que una de 250 m con un d f = 0.2 m, tiene una β =

55 Relaciones de fase (β) para algunas columnas típicas 55

56 Temperatura 56

57 DETECTORES 57

58 Aplicaciones de detectores comercialmente disponibles para GC 58

59 Detector de Ionización de Flama (FID) El detector de ionización de flama es el más comúnmente usado en GC. Es casi universal y consiste en la combustión de los solutos en una flama de H 2 /aire para producir una corriente mensurable. La mayoría de los átomos de carbono, salvo los carbonilos y carboxilos, generan señales. No resulta útil para detectar la gran mayoría de los compuestos inorgánicos y muchos gases tales como CO 2 y H 2 O. 59

60 Detector de fósforo nitrógeno (NPD) Comparado con el FID, este detector termoiónico tiene una flama más pequeña en la cual la descomposición catalítica de compuestos conteniendo nitrógeno (N), o fósforo (P), producen, muy específicamente, iones negativos los cuales se reciben en un electrodo colector. Este detector comprende un pequeño cilindro de cerámica dopado con sales alcalinas (por ejemplo sulfato de rubidio). Se aplica un voltaje para conservar un plasma pequeño de 800 C en la combustión de una mezcla aire/hidrógeno. En esas condiciones el nitrógeno presente en el aire no produce iones. La sensibilidad del detector está típicamente entre 0.1 y 4 pg/s para analitos conteniendo nitrógeno y fósforo, con un intervalo de linealidad de cinco órdenes de magnitud. 60

61 Detectores FID y NPD Los electrómetros usados con los detectores permiten la medición de muy pequeñas intensidades. La respuesta de esos flujos de masa dependientes de los detectores no se afectan por el gas make-up. 61

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63 Detector de Captura de Electrones Es un detector selectivo que proporciona una respuesta muy alta para aquellos compuestos que capturan electrones. Estos incluyen materiales halogenados tales como los pesticidas. El detector requiere de un emisor de partículas beta (electrones) y generalmente se usa 63 Ni, aunque algunas veces también se usa tritio. Se prefiere el níquel debido a que se puede usar a temperaturas incluso superiores a los 400 C y es muy seguro de usar. Los electrones emitidos por el emisor ionizan al gas acarreador (N 2 ), provocando la emisión de electrones adicionales que originan una corriente eléctrica entre un par de electrodos. Cuando un soluto con capacidad de captura de electrones eluye decae la corriente. 63

64 Detector de Conductividad Térmica (TCD) El TCD es un detector universal en el que la señal es un cambio de la conductividad térmica de la fase móvil. Cuando la fase móvil sale de la columna, pasa sobre un filamento de wolframio-renio. La resistencia eléctrica de este filamento depende de su temperatura, que a su vez, es función de la conductividad térmica de la fase móvil. El Helio es la fase móvil de elección cuando se utiliza un TCD, debido a su conductividad térmica alta. 64

65 Detector de Conductividad Térmica (TCD) 65

66 Detector de fotoionización (PID) Un detector de fotoionización es un detector de iones que utiliza fotones de alta energía, en la región del ultravioleta (UV), para romper las moléculas en forma de iones cargados positivamente. La luz UV excita las moléculas, dando como resultado la pérdida temporal de electrones de las moléculas y la formación de iones con carga positiva. El gas adquiere carga eléctrica y los iones producen una corriente eléctrica, que es la señal de salida del detector. La corriente se amplifica y se muestra en un amperímetro. Los iones se recombinan de nuevo con los electrones después de pasar el detector para volver a formar las moléculas originales. 66

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68 Comparación de los intervalos de trabajo para detectores para GC comunes 68

69 APLICACIONES 69

70 EJEMPLO Importancia del estándar interno Marriot y Carpenter publicaron los datos siguientes referidos a cinco inyecciones de una mezcla de metilisobutilcetona 10 % v/v (pico 1) y p-xileno al 1 % v/v (pico 2): Pregunta: Admitiendo que el p-xileno es el analito y la metilisobutilcetona el estándar interno, determinar el intervalo de confianza del 95 % para la estandarización con un punto, usando y sin usar un patrón interno. Marriot, P. J.; Carpenter, P. D. J. Chem. Educ. 1996, 73,

71 Solución Para un patrón externo de un punto (omitiendo el patrón interno), la relación entre el área del pico, A 2, y la concentración, C 2 de p-xileno es: A 2 = kc 2 Sustituyendo la concentración conocida de patrón de p-xileno y las áreas del pico adecuadas, se obtienen los valores siguientes para la constante k: Inyección A B C D E k Promedio = C 2 = 1 % (v/v) Desv. Std. = CV (%) =

72 Valores de t para el 95 % de intervalo de confianza Promedio = Desv. Std. = CV (%) = μ = ± = ±