Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Guía de Trabajo Práctico Nº1 Química Biológica

Transcripción

1 Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Guía de Trabajo Práctico Nº1 Química Biológica

2 CONSIDERACIONES ANTES DE COMENZAR A TRABAJAR EN EL LABORATORIO 1. Se debe utilizar guardapolvo de mangas largas y guantes. Se deberá usar el cabello recogido evitando el uso de accesorios colgantes. 2. No se debe pipetear con la boca. Se deben utilizar dispositivos para pipetear (propipetas). 3. No está permitido comer, beber, fumar o maquillarse en el ámbito del laboratorio. Fumar está prohibido en cualquier espacio cerrado. 4. Las manos deben lavarse cuidadosamente con agua y jabón después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 5. Toda persona que utilice guantes descartables no deberá tocar objetos, ni superficies de uso común, tales como: teléfono, lapiceras, picaportes, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. Los guantes descartables se deben desechar en los sitios que corresponden según el tipo de material manipulado. 6. No se debe correr o realizar movimientos bruscos en los laboratorios. 7. Utilizar las zonas especialmente indicadas para el manejo de sustancias peligrosas, no contaminar áreas destinadas a otros usos. 8. No arrojar líquidos en las piletas de lavado ni residuos sólidos sin consultar al docente a cargo. Los residuos tóxicos y biológicos deben descartarse según las normas indicadas en el Manual de manejo de residuos peligrosos de la FCByF. 9. Avisar inmediatamente al docente cualquier incidente o accidente. 1

3 QUÍMICA BIOLÓGICA. Año 2018 Día 1: TÉCNICA DE PIPETEO Y CURVA DE CALIBRACIÓN DEL MÉTODO DE BRADFORD Objetivos: Comprender la correcta manipulación de las micropipetas y realizar una curva de calibración del método de Bradford para su posterior utilización en la cuantificación de proteínas. A- Manipulación de las micropipetas Las micropipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Todas las micropipetas de pistón disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un código de color según el volumen a dispensar (Figura 1) µl Hasta 10 µl µl Figura 1 Instrucciones para el manejo de una micropipeta (Figura 2): 0. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado y colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste. 1. Oprimir pistón con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido. 2

4 2. Liberar lentamente la presión sobre el pistón. Después de 2 3 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente. 3, 4 y 5. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el líquido, presionar lentamente el pistón hasta el primer tope. Después de un segundo, y sin soltar el pistón, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope. 6. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente y descartar la punta de plástico. Figura 2 PARA NO DAÑAR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES QUE POSEE LA MICROPIPETA: - El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta. - Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba. - Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido. - Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta. 3

5 Profundidad de inmersión de la punta La profundidad de inmersión de la punta es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños (Figura 3). Si la punta se sumerge demasiado, se aspirará más líquido debido al aumento de la presión. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%. Figura 3 Uniformidad al pipetear Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión también hasta un 5%. Ángulo de inmersión vertical Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º de ésta, puede mejorar la precisión hasta en un 2,5%. 4

6 Técnica de dispensación Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier líquido restante en el orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta en un 1%. Otra técnica consiste en emitir directamente en la superficie del líquido. Si se dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de la dispensación. Enjuague previo de puntas Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la película de líquido en el interior de la punta. El enjuague previo también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra. Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la precisión. Utilización de una pipeta adecuada para el volumen que se aspira Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la pipeta. Seguir este consejo puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. Cometemos mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen máximo de la pipeta que estamos utilizando. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Reconocimiento del rango de volumen permitido por cada micropipeta. 2. Pipetear los siguientes volúmenes de agua utilizando las micropipetas adecuadas: 625, 170, 55 y 10 µl. 5

7 B- Determinación de la concentración de proteínas Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV o en la capacidad que tienen de unir determinados colorantes. Absorción ultravioleta de las proteínas. Todas las proteínas son capaces de absorber fuertemente debajo de los 230 nm debido al enlace peptídico. Sin embargo, a esta longitud de onda también absorben otros compuestos que pueden interferir en la utilización de esta medida en la determinación de la concentración de proteína (por ejemplo, altas concentraciones de ciertos buffers). Ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético; sin embargo, tres de ellos (tirosina, triptófano y fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano. Dado que la mayoría de las proteínas poseen residuos de aminoácidos aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución. Método de Bradford. Este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de proteínas (Bradford, 1976). Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar. El complejo colorante-proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. Este método es más sensible, simple y rápido que otros como por ejemplo el método de Gornall (Gornall y col., 1949). En este trabajo práctico se realizará la curva de calibración del método de Bradford para posteriormente (Día 3) cuantificar la concentración de proteínas en las distintas fracciones de la purificación de la lisozima. 6

8 MATERIALES: -Solución de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G ml de etanol al 95% ml de ácido fosfórico al 85%. Llevar a 1 litro con H 2 O. Filtrar con papel Whatman N 1. Conservar a 4 C. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Agregar distintos volúmenes del testigo, completando a 0,7 ml con H 2 O, mezclar y adicionar 0,7 ml de Azul Brillante de Coomassie (volumen final= 1,4 ml). Respetar el orden del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 580 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora. Trabajar en tubos Eppendorf. El blanco se realizará por triplicado y los puntos de la curva de calibración por simplificado. Testigo: BSA 0,1 μg/μl Sensibilidad: 1-10 μg de proteína en el volumen final de la determinación. Curva de calibración sugerida: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 μg del testigo. NOTA: El alumno deberá concurrir a la siguiente clase de laboratorio con la curva de calibración en Abs corregida vs µg proteína para que el docente la evalúe. No es necesario que esté con formato de informe. 7