LABORATORIO I: DOSIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

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1 pág. 1 de 1 LABORATORIO I: DOSIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Introducción Los métodos de dosificación de proteínas son utilizados ampliamente en diversas aplicaciones. A continuación se dan algunos ejemplos: - En la industria de los alimentos: Como las proteínas son nutrientes básicos de nuestro organismo, su concentración está asociada con parámetros de calidad de los alimentos, ya sea porque pueden tener influencia en los procesos industriales (gelificación), en el color o aroma de alimentos (productos horneados de panificación, tostado de café) o en el precio de los cereales (porcentaje de proteínas vegetales). - En el laboratorio clínico: Por ejemplo la determinación de proteínas séricas en orina (proteinuria) es un análisis de rutina en el laboratorio de análisis clínico. La proteinuria, primera manifestación de las enfermedades renales, se produce por daño de los filtros que tienen los riñones (glomérulos). Normalmente las proteínas no pueden atravesar dichos filtros. Si los filtros están alterados, los orificios son más grandes, por lo que dejan pasar a las proteínas. Los glomérulos pueden estar alterados por enfermedades propias de los riñones (glomerulonefritis) o por el daño que en los riñones producen enfermedades de otros órganos como por ejemplo la diabetes o el lupus eritematoso sistémico. Hay diferentes métodos disponibles para la cuantificación de proteínas. Para la elección del mismo habrá que tener en cuenta, entre otros: - la cantidad total de proteína disponible, - la concentración de la solución, - la necesidad de conservar la muestra intacta luego del ensayo, - la presencia en la muestra de compuestos que interfieran el ensayo, - la especificidad del ensayo, - la rapidez con la que se necesita el resultado. Las técnicas más utilizadas están basadas en la espectrofotometría. La absorción de un cromóforo a una longitud de onda dada depende de su naturaleza (ε), de su concentración (c) y de la longitud del camino óptico (l) (Ver anexo). Esta relación viene representada por la ley de Lambert-Beer: Absorbancia λ = ε λ.c.l Los métodos espectrofotométricos utilizados en la cuantificación de proteínas pueden dividirse en dos categorías de acuerdo al cromóforo que detecta el ensayo: - Métodos Directos: cromóforos presentes en las proteínas - espectrofotometría en el ultravioleta - absorción de grupos prostéticos - Métodos Indirectos: cromóforos que resultan de las interacciones de las proteínas con otros compuestos - reacción del biuret - ensayo de Lowry - ensayo del ácido bicinconínico - ensayo de Bradford Espectrofotometría en el ultravioleta Las proteínas contienen grupos funcionales que absorben luz en el ultravioleta (UV) y por lo tanto pueden ser utilizados para medir concentraciones por espectrofotometría. En particular, algunos residuos aminoacídicos absorben luz en el UV cercano (Tabla 1). Por otra parte, el enlace peptídico en sí mismo presenta un máximo de absorbancia a λ = 190 nm. Absorbancia a 205 nm La medida de la A 205 (longitud de onda cercana al máximo de absorbancia del enlace peptídico) es especialmente útil para medir concentraciones de proteínas o péptidos que no contienen Trp, Tyr o Cys-Cys. La muestra puede ser recuperada prácticamente intacta después del ensayo, ya que no sufre reacciones químicas. Se utiliza mucho para seguir cromatografías de

2 purificaciones de péptidos. Sin embargo, este método tiene el inconveniente de que muchos compuestos que frecuentemente están presentes en las preparaciones de proteínas absorben luz a esta longitud de onda. Características espectrales de cromóforos encontrados en las proteínas Cromóforo λ (nm)* ε (M -1 cm -1 )** Triptófano (Trp) Tirosina (Tyr) Fenilalanina (Phe) Cistina (Cys-Cys) Tabla 1. * longitud de onda de un máximo de absorbancia, ** coeficiente de extinción molar Absorbancia a 280 nm El triptófano (Trp), la tirosina (Tyr) y la cistina (Cys-Cys) absorben fuertemente luz ultravioleta de λ 280 nm. También la fenilalanina (Phe) absorbe a esta longitud de onda, pero en mucho menor medida (Figura 1). Esta propiedad permite medir la concentración de proteínas midiendo la A 280. Entre 0.5 y 2.0 es el orden de valores de A 280 que pueden presentar soluciones de proteínas de 1 mg/ml. pág. 2 de 2 presentes en esa proteína, y ese valor resulta cercano al ε real de la proteína 1. Conocido el ε de la proteína, se puede determinar la concentración de la solución aplicando la relación de Lambert-Beer. Para una mezcla de proteínas, la medida de la A 280 brinda una aproximación bastante fiable, sobre todo cuando se comparan mezclas de composición similar. Frecuentemente se utiliza el valor de A 280 para expresar la concentración de proteínas. Por ejemplo, puede encontrarse expresiones tales como solución de seroalbúmina de 0.4 unidades de A 280. Las ventajas de este método son la relativa buena sensibilidad ( μg), la simplicidad y la rapidez de ejecución. Además, como la solución de proteínas no es sometida a ninguna reacción química, se puede recuperar la muestra si fuera necesario. Es particularmente útil para seguir la concentración de proteínas durante la elución de una cromatografía. El mayor inconveniente de este método es que la muestra contenga sustancias que absorban luz UV en esa longitud de onda. Y los principales contaminantes potenciales de las preparaciones de proteínas son los ácidos nucleicos, los cuales absorben fuertemente luz UV, con un máximo a alrededor de λ = 254 nm. Una fórmula empírica desarrollada por Warburg y Christian (1941) permite estimar la concentración de proteínas aun en presencia de ácidos nucleicos. Para esto es necesario medir la A 280 y A 260. Conc. proteínas (mg/ml) = 1.55 A A 260 Figura 1. Espectro de absorbancia de aminoácidos aromáticos Otros componentes de la muestra pueden interferir, como por ejemplo detergentes o sustancias que absorban a 280 nm utilizadas para preparar la solución tampón. En estos casos, el problema puede subsanarse incluyendo esas mismas sustancias en el blanco del ensayo. Para una proteína pura de la cual se conozca el contenido de Trp, Tyr y Cys-Cys es posible determinar empíricamente su coeficiente de extinción. Se puede, entonces, calcular el aporte de los ε de Trp, Tyr y Cys-Cys 1 Estas estimaciones son más aproximadas cuando la proteína está desnaturalizada en solución de clorhidrato de guanidina 6M (ver Pace et al., 1995)

3 Reacción del biuret La reacción del biuret está basada en la formación de un complejo azul-púrpura entre los enlaces peptídicos y el ion Cu 2+ en medio alcalino (Figura 2). Este complejo absorbe luz en el espectro visible (λ = 540 nm). Los reactivos utilizados en la reacción son NaOH y SO 4 Cu.5H 2 O. El ion Cu 2+ el que, en condiciones alcalinas, interacciona con los iones de N de los grupos amino formando un complejo azul-púrpura. Cada átomo de Cu 2+ reacciona con dos átomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N. O O C NH RCH C NH RCH Cu 2+ C O HN H CR C HN H CR O Figura 2. Complejo proteína-cu 2+ Este método tiene la ventaja de que es poco influenciado por la composición aminoacídica de las proteínas presentes en la muestra ya que es una reacción en la que interviene directamente el enlace peptídico. Sin embargo, se trata de un método que, comparado con otros métodos disponibles, resulta poco sensible, ya que cada ensayo requiere una cantidad de proteína superior a 100 μg/ml. Además, son numerosos los compuestos que interfieren; entre otros, sacarosa, Tris, glicerol, EDTA. pág. 3 de 3 Cu 2+ del complejo para dar Cu + y enlaces peptídicos oxidados. En el segundo paso, el Cu + reduce el reactivo de Folin-Ciocalteu (inicialmente de color amarillo), lo cual da lugar a varios compuestos de color azul que pueden ser detectados a λ = 750 nm. El componente activo del reactivo de Folin-Ciocalteu es el ácido mixto fosfomolibdotúngstico: 3H 2 O -P 2 O 5-13WO 3-5MoO 3-10H 2 O La reducción de este reactivo se manifiesta por la pérdida de uno, dos o tres átomos de oxígeno del tungstato y/o del molibdato, obteniéndose las especies de color azul. Además de la reacción del complejo biuret formado en la primera etapa, también contribuyen a la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu las cadenas laterales de algunos aminoácidos (Tyr, Trp, y en menor medida Cys-Cys, Cys e His). Este ensayo es mucho más sensible que la simple formación del complejo biuret. Pueden medirse cantidades de proteína del orden de unos pocos microgramos. La susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una de las desventajas del método. Además, algunos agentes reductores frecuentemente utilizados en preparaciones de proteínas (βmercaptoetanol, ditiotreitol) y quelantes de metales (EDTA), interfieren el ensayo. Método del ácido bicinconínico (BCA) El principio de este ensayo es similar al del método de Lowry, ya que depende de la reducción de Cu 2+ a Cu + que es facilitada al formarse el complejo con el enlace peptídico. Método de Lowry En 1927, Folin y Ciocalteu pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que es la base del método descrito más tarde por Lowry en Aún hoy, el método de Lowry es ampliamente empleado. En este ensayo tiene lugar una serie de reacciones de oxidación/reducción cuyos detalles no se conocen con precisión. Transcurre en por lo menos dos pasos. En el primer paso, se forma el complejo del biuret. Las condiciones de este ensayo favorecerían la reducción del Ácido bicinconínico (BCA) El Cu + forma un complejo de color púrpura con el BCA (Figura 3):

4 pág. 4 de 4 Coomassie forma catiónica λ máx = 470 nm (rojo) Coomassie forma neutra λ máx = 650 nm (verde) Coomassie forma aniónica λ máx = 595 nm (azul) unión a proteínas Figura 3. Complejo Cu + - BCA Este complejo presenta un máximo de absorbancia a λ = 562 nm. Una de las mayores ventajas de este ensayo es que es compatible con varios detergentes, iónicos y no iónicos, que se usan para la solubilización de proteínas, así como su alta sensibilidad (0,5 1 μg/ml) Método de Bradford Algunas moléculas presentan afinidad por las proteínas y pueden fijarse a estas de manera no covalente. El ensayo de Bradford se basa en la unión no covalente del Azul de Coomassie (Figura 4) a las proteínas. Figura 4. Azul de Coomassie Este compuesto presenta diferentes espectros de absorción según el estado de protonación en el que se encuentra: la forma catiónica es de color rojo amarronado (máximo de absorbancia a 470 nm), la neutra es verde (máximo a 650 nm) y la aniónica es azul (máximo a 595 nm). La presencia de proteínas favorece el desplazamiento del equilibrio hacia la forma aniónica debido a la interacción de los grupos sulfónicos del Coomassie con los grupos catiónicos las cadenas laterales de algunos residuos aminoacídicos de las proteínas (principalmente Arg y Lys), produciéndose entonces la coloración azul que puede medirse a λ = 595 nm. Entre las principales ventajas de este ensayo está su sencillez ya que se lleva a cabo en un solo paso (se mezcla el reactivo con la solución de proteína, se incuba un corto tiempo y se mide la A 595 ) y su alta sensibilidad. Sin embargo, comparado con algunos de los métodos anteriores, el ensayo de Bradford depende más fuertemente de la composición aminoacídica de la proteína que se mide. Se han señalado variaciones de respuesta entre distintas proteínas de hasta 50 veces. Las sustancias que interfieren el ensayo son menos numerosas que las que interfieren el método de Lowry. No obstante, debe tenerse en cuenta la presencia de detergentes tales como el Triton X100 o el dodecilsulfato de sodio (SDS). A modo de ejemplo, una solución de Tritón X100 1 % o SDS 1 % que no contengan proteínas, sometidas al ensayo de Bradford se comportan en forma equivalente a una solución de seroalbúmina bovina 53 μg/ml o 44 μg/ml, respectivamente.

5 pág. 5 de 5 Cuadro comparativo de métodos de dosificación de proteínas Sensibilidad Depende de la Longitud de Método promedio composición Interferencias onda (nm) (μg/ml) aminoacídica? Espectroscopía en el ultravioleta No Si Lowry Si BCA 562 0,5 No Biuret No Buffer de extracción Detergentes, ác. nucleicos EDTA, ditiotreitol, β-mercaptoetanol Sulfato de amonio, lípidos Sacarosa, Tris, glicerol, EDTA Bradford Si Tritón, SDS Referencias bibliográficas: Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye biding. Analytical Biochemistry 72: Delobette H., Friry A., Plewniak F., Egly J-M. (1991) Le Dosage des Protéines. Le Technoscope de Biofutur 41: Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: Pace, CN, Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G & Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 4:

6 pág. 6 de 6 por la reacción del biuret Objetivos 1. Conocer los principales métodos de dosificación de proteínas. 2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación de la concentración de un cromóforo. 3. Construir una recta de calibración con una solución estándar de proteína para el método del biuret. 4. Establecer la concentración de proteínas de dos muestras problema empleando el método del biuret. Materiales Método - Reactivo de Biuret g de CuSO 4.5H 2 O 6.0 g de Tartrato de sodio y potasio 30 g de NaOH H 2 O destilada... csp 1 L - Solución estándar de proteínas de 5 mg/ml - Suero Fisiológico % de NaCl en agua destilada - Muestras problema de concentración proteica desconocida - A partir de la solución estándar de proteínas de 5 mg/ml hacer una curva de calibración de 6 puntos, en el rango de 0,5 a 5 mg/ml de proteínas. - Para cada uno de los puntos preparar 2 ml de dilución, según el siguiente cuadro: Solución estándar (ml) Suero fisiológico (ml) Conc. de proteínas (mg/ml) ,5 - Homogeneice después de preparar cada solución. - Colocar en una gradilla tubos de ensayo, rotulados de la siguiente forma: 12 tubos para la curva de calibración (2 tubos por cada punto); 3 tubos para cada una de las muestras problema y un tubo para el blanco. Cómo diseñaría este blanco? Desarrollo de color del método del Biuret - Coloque 0.4 ml de cada una de las soluciones proteicas en el tubo de ensayo correspondiente (diluciones de la curva de calibración y las muestras problema). No olvide preparar el blanco. - Agregue 1.6 ml de reactivo del Biuret a cada tubo de ensayo. - Homogeneice cada tubo y deje a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se produzca el desarrollo de color. - Al cabo de este tiempo mida la absorbancia a 540 nm de cada uno de los tubos, contra el blanco. - Dibuje la curva de calibración Abs. 540 nm vs. concentración de proteínas (mg/ml), en papel milimetrado. Cómo utilizaría esta curva para determinar la concentración de proteínas de las muestras problema?

7 pág. 7 de 7 Anexo - Espectrofotometría Ley de Lambert-Beer La intensidad de luz absorbida por una solución se mide por el porcentaje de la luz incidente que atraviesa la muestra. La absorción es función del número de moléculas presentes en la solución (concentración) que absorben luz a esa longitud de onda. I = intensidad de luz transmitida I 0 = intensidad de luz incidente Absorbancia = -log(i / I 0 ) = ε.c.l ε = coeficiente de extinción molar (M -1.cm -1 ). Representa, a una longitud de onda dada, la capacidad que tiene una sustancia determinada de absorber la radiación electromagnética. c = concentración molar del soluto l = longitud de la cubeta (habitualmente 1 cm) Esta relación lineal entre absorbancia y concentración se conoce como Ley de Lambert-Beer. Esta ley normalmente se cumple entre 0 y 2 unidades de absorbancia. En la práctica, empleando un set de soluciones de concentración conocida se construye una curva de calibración estándar, donde se grafica la absorbancia a una determinada longitud de onda vs la concentración. Luego la concentración de una muestra problema puede determinarse a partir del valor de su absorbancia. Ejemplo de curva de calibración estandar Qué instrumento se utiliza para medir la absorbancia de una muestra? Un espectrofotómetro es un instrumento que se emplea para medir la absorbancia o transmitancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Un espectrofotómetro consta de los siguientes componentes clave: - Una fuente que genera una banda ancha de radiación electromagnética: Puede ser una lámpara halógena o de volframio que suministra la luz de la zona visible del espectro ( nm), o de neón, argón o de hidrógeno, para la zona ultravioleta ( nm). - Un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular de la radiación de la fuente. Comúnmente, se utilizan prismas y redes holográficas de difracción, que junto a una rendija de entrada y otra de salida configuran el monocromador. - Un área de muestra: Célula transparente a la radiación incidente monocromática que contiene el material bajo estudio disuelto en un solvente adecuado. Suele ser de 1 cm de espesor.

8 pág. 8 de 8 - Uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación: Normalmente, es un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo. Los espectrofotómetros pueden ser de distintos tipos: - De haz simple. - De doble haz. - Con división de haz. - De doble longitud de onda. Los espectrofotómetros que se manejan convencionalmente son de haz simple o doble. Un esquema se presenta a continuación: Esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple El camino de la radiación electromagnética es el siguiente: - La luz policromática de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador. - Este transmite selectivamente una estrecha banda de luz a través de la rendija de salida. - Esta luz atraviesa el área de muestra hasta el detector. - La absorbancia de la muestra se determina comparando la intensidad de la luz que alcanza el detector después de atravesar la muestra con la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco de reactivo, que contiene todos los reactivos menos la sustancia a determinar). NOTA: cuando se emplee unl espectrofotómetro hay que tener en cuenta que debe de encenderse al menos media hora antes de hacer una medición para estabilizar la emisión de la fuente de luz. Se comprueba que el aparato da una señal estable de ajuste del cero de absorbancia.