TALLER 2 GENÉTICA. Entidades monogénicas de herencia clásica o mendelianas

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1 TALLER 2 GENÉTICA Taller 2 Genética. Entidades monogénicas de herencia clásica o mendelianas

2 Taller 2: Los objetivos de este taller son: caracterizar a las entidades monogénicas de herencia clásica (mendeliana); representar los antecedentes familiares en árboles genealógicos, identificar patrones de herencia, estimar riesgos de recurrencia, e interpretar la información que surge de las distintas técnicas de biología molecular. La resolución de los siguientes ejercicios se basa en contenidos de los seminarios de integración de genética 1, 2, 3, 4 y 5. Algunas consideraciones iniciales: A) Cruzamientos controlados y árboles genealógicos: Un cruzamiento controlado se realiza experimentalmente a través del apareamiento entre dos organismos específicos seleccionados por el investigador. El propósito de hacer cruces en genética es: obtener la progenie de un genotipo especifico o, usar las proporciones de los distintos fenotipos de la progenie para deducir los genotipos parentales. El cruzamiento se puede realizar en organismos diploides o en organismos haploides. En los seres humanos, los profesionales de la salud deben recurrir a examinar registros de antecedentes de la familia con la esperanza de que haya emparejamientos informativos (mínimo interrogar 3 generaciones si no hay antecedentes relevantes; y si hubiera algún antecedente seguir interrogando hasta la última generación que pueda ser referida), de modo de poder deducir y distinguir patrones de herencia autosómico dominante / autosómico recesiva y ligadas al cromosoma X. El médico traza la historia de alguna variante del fenotipo (ej.: enfermedad) según la historia de la familia y elabora un árbol, utilizando símbolos estandarizados internacionalmente. En la publicación de Bennett RL, et al (J Genet Counsel, : ) figura la versión actualizada de esta simbología (ver en el anexo del taller). B) Errores en expresiones utilizadas en donde se confunden conceptos que caracterizan al genotipo con conceptos que caracterizan al fenotipo: Frecuentemente se observan expresiones mal utilizadas como: - un individuo presenta un alelo sano y otro enfermo. Esto constituye un error conceptual grave, los alelos son variantes genotípicas que pueden tener una secuencia de ADN igual o distinta a la Wild type, y en seres humanos (diploides) se puede identificar si un individuo es homocigota, heterocigota, compuesto heterocigota o hemicigota (caso de locus en cromosomas sexuales en individuos XY) para los alelos de un determinado locus. Los alelos no se enferman ni están sanos. Por lo tanto la expresión incorrecta un individuo presenta un alelo sano y otro enfermo podría corregirse a un individuo es heterocigota para los alelos de un locus determinado, y estos alelos presentan: uno la variante wild type y el otro un alelo distinto al wild type caracterizado como variante patogénica. - un individuo es portador de una enfermedad. En genética, el concepto de portador (carrier) alude a un individuo que presenta en su genotipo una variante patogénica que puede ser transmitida a la próxima generación. Por lo general se utiliza el concepto de estado de portación al analizar entidades recesivas. Por lo que un individuo que porta una variante patogénica desde el punto de vista genotípico, puede, desde el punto de vista fenotípico tener un fenotipo clínico asintomático o sin enfermedad. C) Nomenclatura utilizada en mutaciones: En la literatura uno puede observar que las mutaciones pueden ser escritas desde el cambio que producen en la secuencia de ADN, en la secuencia de ARN (menos utilizado, sigue reglas similares a la del ADN pero en vez de estar precedida por la letra c., va precedida por la letra r. y se utiliza los nucleótidos A, G, C, U) y/o en la secuencia de aminoácidos del polipeptido. Para la secuencia de aminoácidos hay dos tipos de nomenclatura, un código de una letra y un código de tres letras. La nomenclatura de mutaciones también está estandarizada internacionalmente. Ejemplo ADN Proteína (código 1) Proteína (código 2) Una mutación que a nivel función celular produce pérdida de función c.728 G>A Sustitución: cambio del nucleótido G por A R243Q Cambio de sentido (missense): en la posición 243 del polipeptido, el aminoácido arginina fue reemplazado por glutamina. p.arg243gln Cambio de sentido (missense): en la posición 243 del polipeptido, el aminoácido arginina fue reemplazado por glutamina.

3 Ejercicio 1: Andrés tiene 3 años y padece Hemofilia A (entidad monogénica que produce alteración en el proceso de coagulación por ausencia de Factor 8), esto le provoca grandes sangrados a mínimos roces. Andrés es el segundo hijo de Juan Cruz (34 años) y Lucía (28 años). El hermano de Andrés se llama Axel (8 años) y es sano. Lucía le relata que en su familia hay varios afectados de hemofilia: Gabriel (hermano de Lucia), Lionel (sobrino de Lucia; hijo de su hermana Marcela) y Gustavo (tío materno de Lucia ya fallecido). Lucía no presenta hemofilia pero le comenta que solamente en los partos de sus hijos tuvo sangrados importantes que requirieron intervención médica. 1.1 Dibuje el árbol genealógico de esta familia. Marque en el árbol si hay portadores obligados. 1.2 Justifique a qué tipo de herencia preferentemente podría corresponder este caso 1.3 La pareja le pregunta: cómo puede explicarse que los individuos afectados de la familia de Lucía son únicamente varones? fue por azar? Qué Lucia haya tenido grandes hemorragias en los partos puede estar relacionado con la hemofilia A de su familia? Qué les responde? Justifique 1.4 Si tuvieran deseos de planificar un próximo embarazo Qué riesgo de recurrencia de afectación le informaría a esta pareja? Justifique. Ejercicio 2. El siguiente ejercicio se encuentra basado en trabajo de investigación: Mutaciones en el gen de profilina 1 causan esclerosis lateral amiotrófica familiar (Wu CH, et al. Nature, 2012). Introducción: La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una entidad neurodegenerativa caracterizada por la muerte de neuronas motoras superiores (con somas en núcleos cerebrales) e inferiores (con somas en la médula espinal). Los síntomas de la enfermedad, que suelen aparecer en la vida adulta, involucran debilidad muscular y pérdida progresiva del control de los movimientos voluntarios. La muerte de los individuos afectados suele estar asociada a fallas respiratorias, y ocurre, en promedio, tres años después de la aparición de los síntomas. Las características patológicas típicas de la enfermedad incluyen palidez del tracto corticoespinal debido a la muerte de neuronas motoras, la presencia de inclusiones citoplasmáticas positivas para ubiquitina dentro de las neuronas motoras sobrevivientes, y deposición de agregados patológicos de la proteína TDP-43. Aproximadamente el 10% de los casos son familiares (ELA familiar) y se transmiten con un patrón de herencia monogénico. El resto de los casos son esporádicos (ELA esporádico). Al momento del inicio de la investigación se habían reportado que SOD1, FUS y TDP- 43 eran genes causantes de ELA familiar en distintas familias. Sin embargo, hay otras familias con miembros afectados con ELA que no poseen mutaciones en esos genes. La motivación para identificar nuevos genes causantes de ELA familiar radica en que el descubrimiento de cada nuevo gen implicado en la etiología de esta enfermedad permite comprender mejor la patogénesis de la degeneración de las neuronas motoras y facilita el desarrollo de modelos experimentales. Además, aumenta las probabilidades de generar terapias específicas exitosas. 2.1 De acuerdo a la información del párrafo anterior, puede afirmarse que la ELA familiar es una entidad con heterogeneidad de locus. Defina este concepto.

4 Objetivo y metodología: Con el objetivo de identificar nuevos genes causantes de ELA familiar, los autores del trabajo de investigación seleccionaron dos familias con miembros afectados por ELA, sin mutaciones en los genes SOD1, FUS y TDP-43. La familia 1 posee origen caucásico y la familia 2 origen judío sefaradí. Los pedigrees de ambas familias se muestran en la Figura 1.Para preservar la identidad de las familias se omitió indicar el sexo de los individuos allí representados. Figura 1.Pedigrees de las familias analizadas en el trabajo de investigación Para identificar los genes causantes de ELA familiar, se escogieron de cada una de esas familias 2 miembros afectados para realizar una secuenciación de exoma completo (SEC) a partir de una muestra de sangre de los mismos. La SEC es una de las variantes de la secuenciación de alto rendimiento y se basa en la secuenciación en paralelo de millones de moléculas de ADN que provienen del ~1,5% del genoma que codifica para proteínas (exoma). La potencia de esta técnica, en el contexto del presente trabajo de investigación, se basa en el hecho de que la gran mayoría de variantes patogénicas conocidas (~85%) surgen por mutaciones que se encuentran dentro de la región codificadora de proteínas del genoma Teniendo en cuenta los pedigrees de las familias 1 y 2. Cuál es el patrón de herencia con el que se transmite la ELA familiar? Justifique 2.3 Los investigadores utilizan la técnica de SEC para identificar los genes causantes de ELA familiar. Podría haberse utilizado, en forma alternativa, secuenciación de Sanger? PCR? Southern blot? Justifique su respuesta en cada caso 1 Ten years of next-generation sequencing technology. Van Dijk EL, et al.trends Genet. 2014; 30:

5 Resultados: Se analizó el gen del que provino cada transcripto secuenciado mediante la comparación de su secuencia con una base de datos del genoma humano. Para determinar cuáles de esos transcriptos podrían corresponder a la variante patogénica causante de ELA familiar, fueron filtrados progresivamente utilizando los criterios señalados en la Tabla 1. Notar que en cada paso de filtrado sólo se analizan los transcriptos que han superado el filtrado de los pasos anteriores. Tabla 1: Descripción de los pasos de filtrado (=selección progresiva) de los transcriptos secuenciados Familia 1 Familia 2 Número total de transcriptos identificados en las 2 muestras de cada familia 1- Número de transcriptos codificantes Número de transcriptos comunes a ambas muestras de cada familia 3- Número de transcriptos no reportados como no patogénicos en bases de datos relevantes consultadas 2 4- Número de transcriptos provenientes de genes en heterocigosis y que representen variantes no sinónimas 5- Número de transcriptos confirmados por secuenciación de 2 6 Sanger 6- Número de transcriptos presentes en todos los miembros afectados de la familia Explique por qué el criterio utilizado en cada paso de filtrado (1 a 6) contribuye a identificar la variante patogénica causante de la ELA familiar. El número resultante de candidatos identificados como potenciales mutaciones causales de ELA familiar fueron dos para la familia 1 y tres para la familia 2 (ver Tabla 2). Tabla 2: Genes candidatos obtenidos para cada familia Un hecho a destacar es que ambas familias contienen diferentes mutaciones (C71G y M114T) para un mismo gen: PFN1 (gen de profilina 1), localizado en el cromosoma 17p13.2. La proteína PFN1 posee 140 aminoácidos y es un regulador central del crecimiento de los filamentos de actina mediante su unión a la actina monomérica. En base al resultado obtenido mediante la secuenciación del exoma y los pasos de filtrado posteriores los investigadores sugieren que mutaciones en el gen PFN1 pueden causar ELA familiar. 2.5 Clasifique a las mutaciones encontradas en el gen PFN1 según los siguientes señalados a continuación. Justifique en cada caso su elección: Mutaciones somáticas/ de línea germinal Mutaciones puntuales/ de extensión variable Mutaciones de sustitución/ inserción/ deleción Mutaciones sinónimas /de cambio de sentido/ sin sentido Mutaciones de pérdida/ ganancia de función 2 Bases de datosconsultadas (disponibles online): Single Nucleotide Polymorphism database (dbspn 132), 1000 Genomes Project (May 2011 release) y NHLBI Exome Sequencing Project (ESP)Exome Variant Server. 3 El paso de filtrado número 6 está basado en información adicional al de la secuenciación del exoma completo de los dos individuos por familia. Esa información adicional fue obtenida de otros miembros afectados de las familias en los que se analizaron los transcriptos-candidatos que surgen del paso 5 mediante secuenciación de Sanger.

6 2.6 Los datos encontrados muestran que en los casos de ELA familiar en los que está implicado PFN1 hay heterogeneidad alélica. Defina este concepto. Compárelo y diferéncielo del concepto definido en la pregunta 2.1 La Figura 2 muestra el genotipo de aquellos miembros de las familias cuyo ADN estuvo disponible para el análisis de secuenciación (de Sanger) del gen PFN1. Los cuatro miembros afectados que fueron analizados de la familia 1 poseían la variante C71G del gen PFN1. Un único portador obligado de la variante C71G (III: 13), no desarrolló la enfermedad; sin embargo, la muerte de este individuo ocurrió antes de los 50 años, que es la edad promedio de aparición de síntomas en esta familia. Todos los miembros no afectados de la familia 1 que fueron analizados poseen el genotipo wild type. En familia 2, los ocho individuos afectados que fueron analizados poseían la variante M114T. Un noveno individuo, cuyo ADN no estaba disponible, fue confirmado como poseedor de la variante M114T (III: 2) sobre la base de los genotipos de su compañero reproductivo y sus hijos (no mostrados en el pedigree). De los 7 miembros no afectados que fueron analizados, 5 no poseen la variante M11T. Uno de los individuos que no está afectado y es portador de la mutación tiene 45 años (III: 15) y un segundo portador obligado (II: 4) fue asintomático hasta su muerte, que ocurrió a los 78 años. En referencia al párrafo anterior: 2.7 El genotipo del individuo III: 2 es inferido a partir del análisis del genotipo de otros individuos Cuál debe ser el genotipo del compañero reproductivo y de los hijos para inferir que ese individuo es heterocigota para la variante M114T? 2.8 Qué conclusiones puede sacar respecto de la penetrancia de las mutaciones C71G y M114T del gen de PFN1 sobre el fenotipo de ELA familiar? Validaciones posteriores al análisis de SEC: Para validar a las mutaciones C71G y M114T del gen PFN1 como causantes de ELA familiar, son necesarios ensayos de investigación básica. En ese contexto, dados los impedimentos éticos y prácticos de la experimentación en humanos, el uso de modelos animales es una herramienta particularmente informativa. Considere la generación de un ratón genéticamente modificado con la técnica de CRISPR/Cas: 2.9 Describa brevemente en qué consiste la técnica en su variante de generación de un ratón KO (knock-out) para un gen y en su variante de generación de un KI (knock-in) 2.10 Cuál de los dos abordajes de la técnica de CRISPR/Cas le parece más conveniente para generar un modelo adecuado para estudiar el efecto de las mutaciones de PFN1 halladas mediante SEC? Justifique.

7 Ejercicio 3. Introducción: La Fibrosis quística constituye una patología multisistémica producto de la alteración en el transporte de iones en las células epiteliales. Afecta principalmente, a la secreción de las glándulas exócrinas y a los epitelios de los aparatos respiratorio, digestivo y reproductor. Desde un enfoque genético clásico, se define como una entidad monogénica mendeliana de herencia Autosómica Recesiva (AR). El gen que ha sido asociado a esta entidad es el CFTR (CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR: Gen que codifica a la Proteína Reguladora de la conductancia transmembrana de la Fibrosis quística). Inicialmente se describió a la Fibrosis quística o Mucoviscidosis (FQ) como una enfermedad grave que afectaba a la población pediátrica y que se manifestaba con diferentes grados de enfermedad pulmonar crónica; insuficiencia pancreática con o sin compromiso hepático; pérdida de sal en el sudor y en algunos casos sinusopatía. También se describió que los varones con FQ podían presentar azoospermia obstructiva debido a la ausencia bilateral de conductos deferentes. Posteriormente, y en base al conocimiento de las disfunciones del CFTR, se distinguió dos grandes grupos fenotípicos; los individuos que padecían FQ por un lado, y por otro lado, varones con azoospermia obstructiva sin otro compromiso clínico. Actualmente se considera un concepto aun mayor, que es el de Fenotipos patológicos asociados a mutaciones en el gen CFTR (Fibrosis quística clásica, Fibrosis quística atípica, Desordenes relacionados con la proteína cftr, Sindromes metabólicos asociados a la proteína cftr). Tomando en cuenta esta concepción más amplia, se incluyen también otras entidades fenotípicas y edades adultas de presentación. Variante alélica wild type: El gen asociado a estas entidades es el CFTR cuyo locus está ubicado en 7q31.2; presenta una longitud de 230 kb, contiene 27 exones. Su producto es un ARNm de 6.5 kb, que es traducido en la proteína canal cftr Esta proteína es transportada a la membrana plasmática y está involucrada en el transporte de iones Cl- y HCO3-, y en la regulación de múltiples canales iónicos (entre ellos Canal epitelial de sodio: ENac); en consecuencia, participa en diferentes procesos celulares (Ej.: respuestas celulares a AMPc; transporte de cloruros; modificación del PH intracelular; hiperpolarización de membrana, exocitosis, entre otros) Para mayor información sobre los procesos celulares en donde se asigna rol a la proteína cftr consultar el siguiente link: Variantes alélicas patogénicas: Desde que se identificó el gen de CFTR en 1989, se han descripto alrededor de variantes de secuencia (mutaciones). Los tipos de mutaciones que se relacionan con fenotipos clínicos enfermos son mayormente: mutaciones sin sentido (corren el marco de lectura produciendo codones de terminación prematuros), mutaciones en sitios que regulan procesos de splicing (ARNm más cortos o con estructura inestable, conlleva a una alta velocidad de degradación sin traducción); o mutaciones con cambio de sentido (cambian la secuencia aminoacídica alterando la estructura/función proteica). Estos tipos de mutaciones generan desde un punto de vista funcional celular pérdida de función (alelos nulos o alelos hipofuncionantes). La mutación más prevalente en afectados es c delctt// p.phe508del (mutación que a nivel del ADN representa la pérdida de 3pb entre los nucleótidos del exón 10 y a nivel proteico se expresa como la ausencia del aminoácido fenilalanina en la posición 508, generando un defecto en el plegado proteico que altera su transporte a su localización definitiva en la membrana plasmática, comportándose como un alelo nulo. En esta entidad se clasifican las mutaciones en diferentes clases. La mutación p.phe508del es de clase II. Esta mutación presenta una prevalencia del 70% en población de Europa del norte. En Argentina también es la mutación más frecuente con una prevalencia del 59% en los afectados Busque información y explique brevemente en qué consiste la clasificación que agrupa las mutaciones del gen CFTR en 6 clases. Relaciónelas con procesos caracterizados en biología celular Problema: Una niña de 8 años presenta signos compatibles con fibrosis quística clásica, pero el diagnóstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la presencia de la mutación p.phe508del. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se resuelven luego en un gel de poliacrilamida. A continuación se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia (ver correspondencia numérica)

8 C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido) Explique el patrón de bandas para cada individuo. Pude explicarse el diagnóstico clínico del paciente con esta prueba? Basándose en los resultados obtenidos, se decidió buscar la presencia de la segunda mutación más frecuente, llamada G551D, que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. Para realizar la búsqueda de la mutación G551D se utilizó PCR alelo específica Explique el fundamento de esta variante de PCR. Qué resultados esperaría ver si hay o no amplificación? El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica (los números hacen referencia a los individuos analizados): M: marcadores de peso molecular CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido) Explique cuál es la importancia de los controles utilizados (CA, CB) en función de su patrón de bandas y qué conclusión puede sacar de esta prueba para la familia analizada. Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada. Se decidió secuenciar el gen CFTR y el resultado de la misma correspondiente al exón 3, en la posición 113, apareció una mutación que estaba presente en la madre y en la paciente, pero no en su padre y su hermana. A continuación se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia wild type (figura de la izquierda) y la mutada (figura de la derecha): Explique el fundamento de esta técnica y por qué hay un doble pico en la posición mutada.

9 Puede concluirse que la mutación hallada explica el diagnóstico clínico de fibrosis quística? Justifique Busque información sobre el fármaco Orkambi (Lumacaftor/Ivacaftor) Podría ser una terapia a recomendar en este caso?