TALLER DE GENÉTICA 3 PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

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1 TALLER DE GENÉTICA 3 PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Guía de actividades

2 Taller de Genética III: Pruebas de diagnóstico molecular Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los fundamentos moleculares de la electroforesis de ácidos nucleicos y su uso en las técnicas de Southern blot, PCR y secuenciación. Los objetivos del Taller III son los siguientes: 1- Identificar en qué casos son aplicables las técnicas de diagnóstico molecular 2- Interpretar la información que surge de la aplicación de esas pruebas Ejercicio 1 Introducción. La anemia de células falciformes es una enfermedad sanguínea caracterizada por la presencia de glóbulos rojos con forma anormal (de hoz). La forma de hoz está asociada a una pérdida de flexibilidad celular y resulta en movimientos restringidos de los glóbulos rojos a través de los capilares más pequeños, provocando disminuciones en la disponibilidad de oxígeno de los tejidos por ellos irrigados. La enfermedad es crónica: los individuos se encuentran en buen estado la mayor parte del tiempo, pero sufren periódicamente de dolorosos ataques y su esperanza de vida está disminuida. La anemia de células falciformes es una enfermedad monogénica con un patrón de herencia autosómico recesivo. La causa es una sustitución puntual (A por T) en el gen de la globina que provoca un cambio de sentido en la cadena polipeptídica en dónde ácido glutámico es globina reemplazado por valina. La globina resultante (globina mutante) se denomina hemoglobina S. La hemoglobina S es soluble cuando está completamente oxigenada, pero cuando las tensiones de oxígeno disminuyen sufre un marcado cambio conformacional que conduce a la deformación del glóbulo rojo y a la hemólisis. El diagnóstico molecular para la mutación descripta consiste en amplificar mediante PCR una región de ADN de 233 pb que abarca el sitio de la mutación y luego tratar al producto amplificado con la enzima de restricción Dde I. Esta enzima produce dos fragmentos de 178 y 55 pb, respectivamente. La discriminación de esta prueba se debe a que la mutación produce la pérdida del sitio de restricción para esta enzima. De esta manera, la resolución electroforética puede revelar la presencia o ausencia de la mutación. Problema. Una pareja ha tenido dos hijos: una niña de diez años sana y un niño de cuatro años con anemia de células falciformes. La mujer está esperando un nuevo hijo y se ha realizado un muestreo de vellosidades coriónicas para determinar si su nuevo hijo (el probando), heredará la enfermedad. Se muestra el resultado de la prueba de diagnóstico tal como se describió previamente: M: marcadores de peso molecular 1: control 2: padre 3: madre 4: probando 5: hija de 10 años 6: hijo de 4 años 2

3 A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta el patrón de bandas en cada caso. B- Con los datos obtenidos, dibuje el árbol genealógico de la familia Ejercicio 2 Introducción. En función de la tasa de mutación que en el genoma humano es muy variable se pueden distinguir dos tipos de mutaciones: mutaciones estáticas y mutaciones dinámicas. En las primeras, la tasa de mutación es la misma tanto para la secuencia originada tras la mutación como para la secuencia predecesora. Sin embargo, las mutaciones dinámicas que ocurren en secuencias de ADN repetitivo, se caracterizan por un tipo muy particular de mutación: la expansión de tripletes. En este caso, la tasa de mutación depende del número de copias, por lo que la mutabilidad de una nueva secuencia originada por mutación es diferente de la de la secuencia de la que proviene. Se ha demostrado que las mutaciones dinámicas que originan un aumento en el número de repeticiones en secuencias polimórficas de tripletes repetidos constituyen un nuevo mecanismo de mutación que conduce finalmente a diversas enfermedades neurológicas hereditarias, un ejemplo d estas es la distrofia miotónica (DM) La DM es una enfermedad neuromuscular de herencia autosómica dominante con una incidencia estimada de 1/7.500, siendo la forma más común de distrofia muscular en adultos. El cuadro clínico de los pacientes afectados de DM es muy variable, y aunque son características la miotonía y la progresiva debilidad consecuente, también se ven afectado otros sistemas, produciéndose defectos en la conducción cardíaca, cataratas, hipersomnia, atrofia testicular y calvicie prematura en los varones. Esta extraordinaria variación fenotípica, que tiene lugar tanto entre las distintas familias afectadas como entre los individuos de una misma familia, es una de las características más notables de la DM. El fenómeno de la anticipación (la enfermedad se manifiesta en edades cada vez más tempranas en generaciones sucesivas, presentando además síntomas más severos) junto con el grado variable de penetrancia, son otras características destacables de la DM. Desde el punto de vista clínico, los pacientes se clasifican en tres categorías principales de acuerdo con la edad de manifestación de la enfermedad y la expresión fenotípica de la misma: 1. De manifestación tardía. En muchos casos es difícil de diagnosticar por el ligero grado de afectación que muestran los pacientes. 2. De manifestación en adultos 3. De manifestación temprana, que es la forma más severa de la enfermedad y se ve frecuentemente asociada con un profundo retraso mental neonatal. El defecto molecular subyacente a la DM se ha identificado como un fragmento de ADN inestable que contiene repeticiones de triplete (CTG)n y que sufre expansión en los pacientes afectados por la enfermedad. El número de repeticiones del triplete (CTG)n es muy variable en la población normal, oscilando entre 5 y 27 repeticiones; los pacientes mínimamente afectados tienen al menos 50 repeticiones, mientras que los individuos más severamente afectados portan expansiones de dicha secuencia con cientos e incluso miles de repeticiones. El triplete CTG se localiza en el extremo 3 no traducido (3 UTR) del ARNm de la proteína quinasa de la miotonina (MDPK), es decir, por fuera de la región codificante. El gen MDPK está ubicado en el cromosoma 19 y contiene 15 exones que se extienden aproximadamente 13 kb, produciendo finalmente un polipéptido de 524 aminoácidos. Una vez identificada la amplificación en el número de repeticiones CTG como la base genética de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentrañar cómo la expansión podría producir la enfermedad. Algunos grupos de investigación han demostrado que en células en cultivo, la expansión del número de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la proteína MDPK i. El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un 3

4 elevado número de repeticiones CTG en el extremo 3 del gen podría de algún modo producir una disminución en la tasa de síntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente. Problema. Un niño es diagnosticado clínicamente con la forma temprana de la DM. Las entrevistas y el estudio clínico de los familiares determinan que su madre posee una forma leve de la enfermedad, ypermiten la construcción del siguiente árbol genealógico 1 : Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el árbol genealógico se les realizó una prueba de diagnóstico molecular. Partiendo de sangre periférica, la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restricción NcoI y usando como sonda específica una secuencia que hibrida con una región del gen MDPK muy cercana a la ubicación de los tripletes CTG. El resultado se muestra a continuación. Los números corresponden con los individuos del árbol genealógico. M: marcador de peso molecular A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta el patrón de bandas en cada caso. B- Explique las diferencias en el patrón de bandas de los individuos 2, 3 y 6. Relacione con la expresión fenotípica 1 Los números que figuran en el árbol genealógico hacen referencia al estudio molecular posterior. 4

5 C- Encuentra discordancias entre los resultados de la prueba molecular y el diagnóstico clínico? En caso afirmativo, indique a qué pueden deberse. Ejercicio 3 Introducción. La Fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva más común en la población de origen caucásico, y se presenta en uno de cada 2000 a 2500 nacidos vivos y tiene una frecuencia de portadores de uno cada 20 a 25 nacidos vivos. Los pacientes con fibrosis quística tienen una conducción anormal de cloruros a través de la membrana apical de las células epiteliales, causando secreciones espesas en las vías aéreas, páncreas, intestinos, y vas deferens. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) que está ubicado en el cromosoma 7q31-32., el cual codifica una proteína de 1480 aminoácidos que funciona como un canal de cloruro regulado por AMP cíclico. Se han descripto más de 1000 mutaciones en este gen, muchas de las cuales son muy poco frecuentes. Pero una mutación se destaca por ser la más frecuente. Está presente en cerca del 57% de los cromosomas fibroquísticos en Argentina y se denomina F508, y consiste en una deleción de tres pares de bases (CTT) en el exón 10 que resulta en la pérdida del aminoácido fenilalanina en la posición 508 de la proteína. Problema. Una niña recién nacida presenta signos compatibles con la fibrosis quística, pero el diagnóstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la presencia de la mutación F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se resuelven luego en un gel de poliacrilamida. A continuación se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia (ver correspondencia numérica) C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido) A- Explique el patrón de bandas para cada individuo. Pude explicarse el diagnóstico clínico del probando con esta prueba? Posteriormente, se realizó la búsqueda de la segunda mutación más frecuente, llamada G551D, que es una mutación de sustitución con cambio de sentido que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. B- Determine si la siguiente estrategia experimental es adecuada para detectar la mutación G551D. Justifique su respuesta: Se utilizan primers adecuados para amplificar una región que contenga a la zona de la sustitución. Los productos de amplificación se resuelven en un gel de poliacrilamida 5

6 Para realizar la búsqueda de la mutación G551D se utilizó PCR alelo específica. En este abordaje experimental uno de los primers del par utilizado sólo puede hibridar con la secuencia si está presente la mutación buscada. De modo tal que sólo habrá amplificación en ese caso, y de allí viene el nombre de esta variante de la técnica de PCR. El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica (los números hacen referencia los individuos analizados): M: marcadores de peso molecular CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido) C- Por qué es especialmente importante en esta técnica usar controles? Expliqué cuál es el genotipo de los controles utilizados (CA,CB)en función de su patrón de bandas D- Qué conclusión puede sacar de esta prueba para la familia analizada? Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada. Por esta razón se decidió pasar a otra estrategia experimental: secuenciar el gen de CFTR de los miembros de la familia y compararlo con la secuencia normal. Se utilizó el método de los dideoxi automatizado, en donde cada dideoxi (A,T,C,G) está marcado con un fluoróforo diferente, y la secuencia aparece como una sucesión de picos de fluorescencia de diferentes colores. Durante la secuenciación del exón 3, en la posición 113, apareció una mutación que estaba presente en los individuos 2 y 4, pero no en los individuos 1 y 3. A continuación se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia normal y la mutada: secuencia normal secuencia mutada 6

7 10 E- Por qué hay un doble pico en la posición mutada? F- Puede concluirse que la mutación hallada explica el diagnóstico clínico de fibrosis quística? Discuta Ejercicio 4 Introducción. A excepción de los gemelos idénticos, el material genético de cada individuo es único. Se ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en uno cada 500 nucleótidos. Si el genoma humano contiene 3 _ 10 9 bases, existen entonces, 6 9 _ bases diferentes entre dos personas ii2. Esa variabilidad interindividual puede ser estudiada a nivel fenotípico, es decir, a través del producto génico, o a nivel genotípico mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad humana de interés cada vez mayor con el curso de los años, es su aplicación en pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la identificación de seres humanos involucrados en hechos delictivos, ya sea como víctimas o criminales. Con esos objetivos, la identificación se realizaba inicialmente con análisis morfológicos, bioquímicos e inmunológicos, correspondientes éstos últimos a productos de genes ubicados en una fracción del genoma menor del 10%. Quedaba así un 90% de ADN, no codificante, cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empezó a ser descubierto a partir de los años 80, cuando se reconoció que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso de las enzimas de restricción y los fragmentos de longitud variable que éstas generaban (RFLP) iii. El genoma humano nuclear extragénico está constituido por secuencias únicas y repetidas. Un subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las secuencias repetidas en tándem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de discriminación iv24 ; El ADN repetitivo en tándem está constituido por secuencias que no incluyen genes funcionales y que se disponen en arreglos de repeticiones, una al lado de la otra y cada una de ellas contiene una secuencia central básica16 Se clasifican de acuerdo al tamaño promedio del arreglo en: ADN satélite, ADN minisatélite y ADN microsatélite (Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatélite y el microsatélite son los que mayor importancia tienen hoy día para resolver problemas en identificación humana y pruebas de paternidad. Los loci más variables descubiertos en el genoma humano son las secuencias minisatélites, conocidas como regiones hipervariables y posteriormente, como repeticiones en tandem de número variable (VNTR). Su hipervariabilidad es debida a la diversidad en el número de reiteraciones de determinadas secuencias de nucleótidos las cuales para estos loci, oscilan entre 7 y unos 30 nucleótidos. Existen grandes similitudes en las secuencias de la unidad central que se repite en Figura 1. Repeticiones en tándem de número variable: mini y microsatélites un gran número de minisatélites. Esta similaridad le sugirió a Alec Jeffreys, en Inglaterra, que si se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa unidad central se podrían detectar fragmentos de ADN de longitud variable a través del método de transferencia de Southern y producir, para cada individuo un patrón específico de bandas de ADN al cual denominó "DNA fingerprinting" o huella digital de ADN1v5 Metodología. Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción, seguida por la separación de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del 7

8 ADN y la hibridación con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern propiamente dicho). La identificación de individuos, mediante el análisis de ADN, se basa en el alto nivel de polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un número muy alto de genotipos posibles, a diferencia de los sistemas biológicos de identificación clásicos proteicos, tales como enzimas, grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en cada caso18 Otra ventaja del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier célula nucleada y es muy resistente a la degradación3 Con las sondas multilocus o con una batería de 5 a 6 sondas unilocus, con heterocigosis de alrededor del 90%, el poder de exclusión puede llegar a 99,99%. Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran más abajo, intentan determinar si un individuo que alega ser el padre de un niño es su padre biológico. A tal fin se ha analizado los VNTR de un locus de minisatélite con la metodología descripta previamente. A- Explique por qué el patrón de bandas de cada individuo consta de dos bandas B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas Qué conclusiones puede sacar en cada uno de los casos acerca del lazo biológico entre el padre** y el niño? C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba Son un 100% certeras? Discutir Ejercicio 5 Determine para cada uno de los siguientes casos si haría alguna prueba molecular para realizar el diagnóstico. En caso afirmativo, diga cuál es la prueba que considera más adecuada, y describa brevemente como discrimina un diagnóstico positivo de uno negativo. 1- Enfermedad monogénica con gen identificado. La mutación más frecuente es una sustitución (A por T) en una posición puntual. 2- Enfermedad monogénica con patrón de herencia ligado al X recesivo y gen no descripto. 3- Enfermedad autosómica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones más frecuentes es una inserción de un par de bases en una posición particular. 4- Enfermedad autosómica dominante con gen conocido. El mecanismo mutacional implica expansión de tripletes. 5- Enfermedad multifactorial. Algunos de los genes involucrados se conocen. 6- Enfermedad cromosómica. Translocación robertsoniana entre el cromosoma 14 y el 21. 8

9 Ejercicio 6 El siguiente ejercicio se encuentra basado en trabajo de investigación Mutaciones en el gen de profilina 1 causan esclerosis lateral amiotrófica familiar 2 de Wu CH y colaboradores (Nature, 2012). Introducción: La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la muerte de neuronas motoras superiores (con somas en núcleos cerebrales) e inferiores (con somas en la médula espinal). Los síntomas de la enfermedad, que suelen aparecer en la vida adulta, involucran debilidad muscular y pérdida rápida y progresiva del control de los movimientos voluntarios. La muerte de los individuos afectados suele estar asociada a fallas respiratorias y ocurre, en promedio, tres años después de la aparición de los síntomas. Las características patológicas típicas de la enfermedad incluyen palidez del tracto corticoespinal debido a la muerte de neuronas motoras, la presencia de inclusiones citoplasmáticas positivas para ubiquitina dentro de las neuronas motoras sobrevivientes, y deposición de agregados patológicos de la proteína TDP-43. Aproximadamente el 10% de los casos son familiares (ELA familiar) y se transmiten con un patrón de herencia monogénico. El resto de los casos son esporádicos (ELA esporádico). Al momento del inicio de la investigación se habían reportado que SOD1, FUS y TDP-43 eran genes causantes de ELA familiar en distintas familas. Sin embargo, hay otras familias con miembros afectados con ELA que no poseen mutaciones en esos genes. La motivación para identificar nuevos genes causantes de ELA familiar radica en que el descubrimiento de cada nuevo gen implicado en la etiología de esta enfermedad permite comprender mejor la patogénesis de la degeneración de las neuronas motoras y facilita el desarrollo de modelos experimentales. Además, aumenta las probabilidades de generar terapias específicas exitosas. 1- De acuerdo a la información del párrafo anterior, puede afirmarse que la ELA familar es una entidad con heterogeneidad de locus. Defina este concepto. Objetivo y metodología: Con el objetivo de identificar nuevos genes causantes de ELA familiar, los autores del trabajo de investigación seleccionaron dos familias con miembros afectados por ELA, sin mutaciones en los genes SOD1, FUS y TDP-43. La familia 1 posee origen caucásico y la familia 2 origen judío sefaradí. Los pedigrees de ambas familias se muestran en la Figura 1. Para preservar la identidad de las familias se omitió indicar el sexo de los individuos allí representados. 2 Mutations in the profilin 1 gene cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Wu CH et al. Nature Aug 23;488(7412): doi: /nature

10 Familia 1 Familia 2 Figura 1. Pedigrees de las familias analizadas en el trabajo de investigación Para identificar los genes causantes de ELA familiar, se escogieron de cada una de esas familias 2 miembros afectados para realizar una secuenciación de exoma completo (SEC) a partir de una muestra de sangre de los mismos. La SEC es una de las variantes de la secuenciación de alto rendimiento y se basa en la secuenciación en paralelo de millones de moléculas de ADN que provienen del 1,5% del genoma que codifica para proteínas (exoma). La potencia de esta técnica, en el contexto del presente trabajo de investigación, se basa en el hecho de que la gran mayoría de variantes patogénicas conocidas ( 85%) surgen por mutaciones que se encuentran dentro de la región codificadora de proteínas del genoma Teniendo en cuenta los pedigrees de las familias 1 y 2. Cuál es el patrón de herencia con el que se transmite la ELA familiar? Justifique 3- Los investigadores utilizan la técnica de SEC para identificar los genes causantes de ELA familiar. Podría haberse utilizado, en forma alternativa, secuenciación de Sanger? PCR? CGH array? Justifique su respuesta en cada caso Resultados: Se analizó el gen del que provino cada transcripto secuenciado mediante la comparación de su secuencia con una base de datos del genoma humano. Para determinar cuáles de esos transcriptos podrían corresponder a la variante patogénica causante de ELA familiar, fueron filtrados progresivamente utilizando los criterios señalados en la Tabla 1. Notar que en cada paso de filtrado sólo se analizan los transcriptos que han superado el filtrado de los pasos anteriores. 3 Ten years of next-generation sequencing technology. van Dijk EL, et al. Trends Genet. 2014;30:

11 Tabla 1: Descripción de los pasos de filtrado (=selección progresiva) de los transcriptos secuenciados Familia 1 Familia 2 Número total de transcriptos identificados en las 2 muestras de cada familia Número de transcriptos codificantes Número de transcriptos comunes a ambas muestras de cada familia Número de transcriptos no reportados como no patogénicos en bases de datos relevantes consultadas 4 4- Número de transcriptos provenientes de genes en heterocigosis y que representen variantes no sinónimas 5- Número de transcriptos confirmados por secuenciación de Sanger Número de transcriptos presentes en todos los miembros afectados de la familia Explique por qué el criterio utilizado en cada paso de filtrado (1 a 6) contribuye a identificar la variante patogénica causante de la ELA familiar. El número resultante de candidatos identificados como potenciales mutaciones causales de ELA familar fueron dos para la familia 1 y tres para la famila 2 (ver Tabla 2 ). Tabla 2: Genes candidatos obtenidos para cada familia Gen Mutación Nombre completo del gen Familia 1 PFN1 C71G Profilina-1 XPOT V139A Exportina de tarn Familia 2 FMO2 T390I Dimetilalanina monooxigenasa 2 KIF1C I118L Proteína similar a la kinesina KIF1C PFN1 M114T Profilina-1 Un hecho a destacar es que ambas familias contienen diferentes mutaciones (C71G y M114T) para un mismo gen: PFN1 (gen de profilina 1), localizado en el cromosoma 17p13.2. La proteína PFN1 posee 140 aminoácidos y es un regulador central del crecimiento de los filamentos de actina mediante su unión a la actina monomérica. 4 Bases de datos consultadas (disponibles online): Single Nucleotide Polymorphism database (dbspn 132), 1000 Genomes Project (May 2011 release) y NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) Exome Variant Server. 5 El paso de filtrado número 6 está basado en información adicional al de la secuenciación del exoma completo de los dos individuos por familia. Esa información adicional fue obtenida de otros miembros afectados de las familias en los que se analizaron los transcriptos-candidatos que surgen del paso 5 mediante secuenciación de Sanger. 11

12 En base al resultado obtenido mediante la secuenciación del exoma y los pasos de filtrado posteriores los investigadores sugieren que mutaciones en el gen PFN1 pueden causar ELA familar. 5- Clasifique a las mutaciones encontradas en el gen PFN1 según los siguientes criterios señalados a continuación. Justifique en cada caso su elección: a- Mutaciones somáticas/ de línea germinal b- Mutaciones puntuales/ de extensión variable c- Mutaciones de sustitución/ inserción/ deleción d- Mutaciones sinónimas /de cambio de sentido/ sin sentido e- Mutaciones de pérdida/ ganancia de función 6- Los datos encontrados muestran que en los casos de ELA familiar en los que está implicado PFN1 hay heterogeneidad alélica. Defina este concepto. Compárelo y diferéncielo del concepto definido en la pregunta 1 La Figura 2 muestra el genotipo de aquellos miembros de las familias cuyo ADN estuvo disponible para el análisis de secuenciación (de Sanger) del gen PFN1. Los cuatro miembros afectados que fueron analizados de la familia 1 poseían la variante C71G del gen PFN1. Un único portador obligado de la variante C71G (III:13), no desarrolló la enfermedad; sin embargo, la muerte de este individuo ocurrió antes de los 50 años, que es la edad promedio de aparición de síntomas en esta familia. Todos los miembros no afectados de la familia 1 que fueron analizados poseen el genotipo wild type. En familia 2, los ocho individuos afectados que fueron analizados poseían la variante M114T. Un noveno individuo, cuyo ADN no estaba disponible, fue confirmado como poseedor de la variante M114T (III:2) sobre la base de los genotipos de su compañero reproductivo y sus hijos (no mostrados en el pedigree). De los 7 miembros no afectados que fueron analizados, 5 no poseen la variante M11T. Uno de los individuos que no está afectado y es portador de la mutación tiene 45 años (III:15) y un segundo portador obligado (II:4) fue asintomático hasta su muerte, que ocurrió a los 78 años. Familia 1 Familia 2 Figura 2. Pedigrees de las familias analizadas en el trabajo de investigación indicando el genotipo para el locus de PFN (sólo hay información de algunos miembros). w= wild type; m= mutante. Los asteriscos indican los individuos seleccionados para SEC. += Genotipo inferido (no secuenciado directamente). 12

13 En referencia al párrafo anterior: 7- El genotipo del individuo III:2 es inferido a partir del análisis del genotipo de otros individuos Cúal debe ser el genotipo del compañero reproductivo y de los hijos para inferir que ese individuo es heterocigota para la variante M114T? 8- Qué conclusiones puede sacar respecto de la penetrancia de las mutaciones C71G y M114T del gen de PFN1 sobre el fenotipo de ELA familiar? Validaciones posteriores al análisis de SEC: Para validar a las mutaciones C71G y M114T del gen PFN1 como causantes de ELA familiar, son necesarios ensayos de investigación básica. En ese contexto, dados los impedimentos éticos y prácticos de la experimentación en humanos, el uso de modelos animales es una herramienta particularmente informativa. 9- Considere la generación de un ratón genéticamente modificado con la técnica de CRISPR/Cas: 9a. Describa brevemente en qué consiste la técnica en su variante de generación de un ratón KO (knock-out) para un gen y en su variante de generación de un KI (knockin) 9b. Cuál de los dos abordajes de la técnica de CRISPR/Cas le parece más conveniente para generar un modelo adecuado para estudiar el efecto de las mutaciones de PFN1 halladas mediante SEC? Justifique. i Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mrna as a result of a triplet repeat expansion in myotonic dystrophy. Genomics 1993; 18: ii Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: , iii Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA fingerprinting: State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp iv Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers,1972, p v Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationship, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: ,