XXXVII Congreso SEBBM

LIBRO DE RESÚMENES

Pósters XXXVII Congreso SEBBM 2

Granada 204 Pósters Primera edición: Septiembre 204 los autores, 204 XXXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular Publica: Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) Producción editorial: Rubes Editorial, S.L. Sicilia, 253 6º 4ª. 08025 Barcelona 3

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Índice Agradecimientos....................................................................... 5 Comité organizador..................................................................... 6 Junta Directiva de la SEBBM.............................................................. 7 Socios protectores de la SEBBM............................................................ 7 Conferencias plenarias................................................................... 8 Simposios............................................................................ S Biomedicina molecular............................................................ S2 Biotecnología de plantas y productos de valor añadido...................................... 5 S3 Estructura y función de proteínas..................................................... 9 Pósters............................................................................... 23 4 P00 II Workshop sobre la Innovación Docente en la Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular...... 24 P0 Apoptosis.................................................................... 27 P02 Bases moleculares de la patología................................................... 33 P03 Biología del desarrollo........................................................... 50 P04 Biología molecular computacional................................................... 53 P05 Biomembranas y bioenergética..................................................... 55 P06 Bioquímica de la nutrición........................................................ 62 P07 Bioquímica perinatal............................................................ 66 P08 Bioquímica y biología molecular de plantas............................................ 68 P09 Biotecnología molecular.......................................................... 76 P0 Estructura y función de proteínas.................................................... 86 P Genómica y proteómica........................................................... 03 P2 Metabolismo del nitrógeno........................................................ 2 P3 Neurobiología molecular.......................................................... 7 P4 Parasitología molecular........................................................... 25 P5 Radicales libres y estrés oxidativo................................................... 33 P6 Regulación de la expresión génica y dinámica del genoma.................................. 4 P7 Regulación metabólica........................................................... 49 P8 Señalización celular............................................................. 59 P9 Transgénesis en mamíferos........................................................ 73 P20 Transportadores de membrana...................................................... 75

Granada 204 Pósters Agradecimientos Nuestro agradecimiento a las entidades públicas y privadas que han colaborado económicamente en la realización del XXXVII Congreso de la SEBBM. Ministerio de Economía y Competitividad Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Junta de Andalucía Universidad de Granada Parque de las Ciencias Turismo Ciudad de Granada Fundación BBVA Fundación Lilly Fundación Ramón Areces L Oréal For Women in Science FEBS PABMB Bio-Rad Canvax BIOTOOLS Condalab Cultek Ecogen Eppendorf Gilson Izasa-Werfen Neuron Panreac Applichem Sarstedt StabVida Vitro Fisher Scientific Sigma 5

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Comité organizador Presidente Juan Luis Ramos (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada - Abengoa Research, Sevilla) Comité ejecutivo Federico Mayor Menéndez (presidente de la SEBBM, Centro Biología Molecular «Severo Ochoa», Universidad Autónoma de Madrid) Miguel Alaminos Mingorance (Facultad de Medicina, Universidad de Granada) María Dolores Girón González (tesorera, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada) Tino Krell (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Irene Díaz Moreno (responsable de Congresos y Cursos de la SEBBM, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, CSIC-Universidad de Sevilla) Miguel Ángel Navarro Carretero (Instituto de Parasitología y Biomedicina «López-Neyra»-CSIC, Granada) Enrique de la Rosa Cano (responsable de Grupos de la SEBBM, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) Joaquín Ros i Salvador (coordinador de la Comisión Asesora de Congresos SEBBM, Facultad de Medicina, Universidad de Lérida) Rafael Salto González (secretario, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada) María Dolores Suárez Ortega (vicepresidenta, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada) Otros miembros del Comité organizador - Junta Directiva de la SEBBM Alicia Alonso Izquierdo (vicepresidenta y Responsable de Relaciones Internacionales de la SEBBM, Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad del País Vasco) Juan P. Bolaños Hernández (responsable del Portal Electrónico de la SEBBM, Instituto de Biología Funcional y Genómica, IBFG, Universidad de Salamanca) Carme Caelles Franch (responsable de Jóvenes de la SEBBM, IRB-Barcelona, Universidad de Barcelona) Marta Cascante Serratosa (responsable de Cónsules de la SEBBM, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona) Crisanto Gutiérrez Armenta (tesorero de la SEBBM, Centro Biología Molecular «Severo Ochoa», CSIC- UAB, Madrid) Almudena Porras Gallo (secretaria Científica Electa de la SEBBM, Facultad Farmacia, Universidad Complutense de Madrid) Isabel Varela Nieto (secretaria Científica de la SEBBM, Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid) Otros miembros del Comité organizador - Comité local: Mª José Alejandre Pérez (Facultad de Ciencias, Universidad de Granada) Matilde Barón Ayala (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Andrés Belver Cano (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Francisco Gamarro Conde (Instituto de Parasitología y Biomedicina «López-Neyra», CSIC, Granada) Juan José Lázaro Paniagua (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Ana Linares Gil (Facultad de Ciencias, Universidad de Granada) Eduardo López-Huertas León (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Esperanza Ortega Sánchez (Facultad de Medicina, Universidad de Granada) Mariam Sahrawy Barragán (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Luisa María Sandalio González (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Alberto M. Vargas Morales (Facultad de Farmacia, Universidad de Granada) 6

Granada 204 Pósters Junta directiva de la SEBBM Presidente Federico Mayor Menéndez (202-206) Vicepresidenta Alicia Alonso Izquierdo (200-204) [Relaciones exteriores y COSCE] Secretaria Isabel Varela Nieto (200-204) [Divulgación] Tesorero Crisanto Gutiérrez Armenta (202-206) Vocales Marta Cascante Serratosa (200-204) [Cónsules] Enrique de la Rosa Cano (200-204) [Grupos Científicos] Juan Luis Ramos Martín (200-204) [Empresa y Patrocinadores] Juan Pedro Bolaños Hernández (202-206) [Página web] Carmen Caelles Franch (202-206) [Jóvenes Investigadores] Irene Díaz Moreno (202-206) [Congresos y Cursos] Secretaria Electa Almudena Porras Gallo (202-204) Socios protectores de la SEBBM Los Socios protectores de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) contribuyen al progreso de la ciencia. 7

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Conferencias Plenarias 8

Granada 204 Conferencias Plenarias Conferencia inaugural Alberto Sols Fundación BBVA CP0- (R0-) Selfish genes vs selfish metabolism: how environmental bacteria conquer the chemical space Víctor de Lorenzo Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid-Cantoblanco, ES Bacteria that colonize sites polluted by industrial waste are capable of metabolizing synthetic and recalcitrant chemicals that have been in the biosphere for only a few years. This capability is orchestrated by the integration of environmental and physiological signals into regulatory systems that tightly control the expression of genes that are in charge of degrading such molecules. The emergence of these capabilities is due not only to the adaptation of catabolic enzymes acting on new substrates, but also to the emergence of new regulators that firmly control the expression of the genes involved in the production of catabolic enzymes. This scenario provides a good case to examine how transcriptional factors that respond to small molecules can adjust their specificity to novel signals, the significance of the effects of individual changes on overall behaviour of the evolving regulators and the role of other environmental and physiological circumstances in the process. Biological bottlenecks for biodegradation of recalcitrant compounds include [i]unfavourable thermodynamics of (bio) chemical reactions at stake, [ii] lack of specificity of existing pathways and enzymes for novel substrates, and [iii] physicochemical stress encountered in polluted sites. Besides these limitations, bacterial cells also experience increased endogenous oxidative stress during metabolism of aromatic compounds, which is exacerbated when enzymes meet suboptimal substrates. Two experimental systems were employed to examine this issue. First, we studied the regulation of the TOL plasmid-encoded upper and lower operons of the soil bacterium Pseudomonas putida mt-2, a toluene and m-xylene degrader, on the background of endogenous production of reactive oxygen species (ROS) during the process. ROS-responsive dyes and flow cytometry helped to quantify stress associated to each metabolic block and its relationship with redox metabolism. We also examined oxidative stress brought about by the still-evolving 2,4-dinitrotoluene biodegradative pathway in Burkholderia sp. DNT. The dnt pathway of this bacterium apparently evolved from a precursor naphthalene degradation route and the first enzyme (2,4-dinitrotoluene dioxygenase) maintains some activity towards its earlier substrate []. Examination of both in vivo reactions and the associated regulatory system suggests that ROS production is the first bottleneck that evolving pathways have to overcome for dealing with novel compounds [2]. Evolutionary consequences [3] -and some hints for engineering new biocatalysts [4] will be discussed. References [] de las Heras, A., Chavarría, M. and de Lorenzo V. Mol Microbiol 20; [2] Pérez-Pantoja, D., Nikel P.I., Chavarría M. and de Lorenzo, V. [3] de Lorenzo, V. BioEssays 204; 36: 226-35.Phil Trans B Roy Soc 203; 368: 2020377. Conferencia plenaria L Oréal-UNESCO For Women in Science CP02- (R02-) Structures and mechanisms of bacterial transcriptional regulation via oligomeric proteins Xiadong Zhang Centre for Structural Biology, Imperial College London, Londres, UK Bacterial gene transcription depends on the binding of RNA polymerase to a wide range of sigma factors that recognize specific promoter DNA sites to achieve specificity. Two classes of sigma factors exist in bacteria. The σ 70 class includes most sigma factors and the RNAP σ 70 -promoter complex can often spontaneously converts to the open complex, which is competent for transcription. In contrast, the complex between RNAP and its major variant sigma factor σ 54 remains as a closed complex which is incompetent for transcription until ATP hydrolysis-dependent remodelling by activator proteins occurs. The activator proteins, which belong to the AAA+ protein family, bind remotely to the DNA sequences upstream of the transcriptional starting site and contact RNAP-σ 54 through DNA looping. Most AAA+ activators contain three domains: a N-terminal regulatory domain, a central AAA+ domain and a C-terminal DNA binding domain. The regulatory domain senses environmental changes and controls the activities of the AAA+ domain while the AAA+ domain contacts RNAP-σ 54 and uses ATP binding and hydrolysis to remodel the closed complex. In addition, bacteria gene transcription can be inhibited though simple blockage of promoter sites. Over the last few years we have used a combination of X-ray crystallography, cryo-electron microscopy single particle analysis and functional analysis to understand why RNAP-σ 54 remains as a closed complex, how the AAA+ activator interacts with and induces changes in RNAP-σ 54 that ultimately lead to transcriptional activation and how binding and hydrolyzing ATP are coupled to the activation process. I will present our results and explain why RNAP-σ 54 is unable to proceed to transcription, how a hexameric AAA+ protein interacts with and remodels the asymmetric RNAP-σ 54 -DNA using ATP binding and hydrolysis, how these activators are organised at the enhancer-binding site and how their ATPase activity is controlled by both the regulatory and DNA-binding domains. In addition, I will discuss how oligomeric proteins interact with their DNA operators in order to achieve repressive functions. Conferencia plenaria Leloir CP03- (R03-) The brain speaks back to the ear: molecules, physiology and pathology of the efferent olivocochlear-hair cell synapse Ana Belén Elgoyhen Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular, Dr. Héctor N. Torres, CONICET, Buenos Aires, AR In bringing information about the world to an individual, sensory systems perform a series of common functions. Each system responds with some specificity to a stimulus and each one employs some specialized receptor cells at the periphery to translate specific stimuli into electrical signals that all neurons can use. That initial electrical event begins the process by which the central nervous system constructs an orderly representation of for example, sounds, odors, tastes and objects. Thus, basic sound detection begins when sound waves strike the eardrum, which transmits that physical stimulus to the organ of Corti within the cochlea, the sensory epithelium of the mammalian inner ear. Here the primary receptor cells known as inner hair cells transform the information into electrical signals that are sent to the central nervous system by the auditory nerve. However, unlike vision, touch and the chemical senses, sound processing is modulated by efferent signals that travel in reverse, from the brain back to the inner ear. One fundamental question in auditory neuroscience is what role(s) this feedback plays in our ability to hear. The presentation will overview our work over the years which has contributed to elucidate the molecules which operate at this efferent olivocochlear-hair cell synapse, how the synapse operates to fine tune amplification in the inner ear and the role of the efferent system in protection from acoustic trauma. 9

Conferencias Plenarias XXXVII Congreso SEBBM Conferencia plenaria Niemeyer - PABMB CP04- (R04-) Caveolin-, a pleiotropic molecular switch in cancer development and progression Andrew F.Q. Quest Laboratorio de Comunicaciones Celulares, Centro de Estudios Moleculares de la Célula (CEMC), Centro de Estudios Avanzados en Enfermedades Crónicas (ACCDiS), Programa de Biología Celular y Molecular, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago de Chile, CL Cancer is a leading cause of human suffering and death worldwide, whereby most patient deaths are caused by metastatic dissemination rather than primary tumor growth. Understanding the mechanisms that favor such development is currently an area of great interest given the potential it holds for designing successful therapeutic intervention strategies. A central dogma in cancer research over the last decades has been that changes at the molecular level, referred to as gain-of-function in oncogenes or lossof-function in tumor suppressor genes, contribute to the genesis of this disease. Because it is generally thought that any given protein will belong to one or the other category, but not to both, treatment strategies will in general terms seek to enhance tumor suppressor and block oncogene function. Paradoxically, Caveolin- (CAV), a member of the caveolin family of scaffolding proteins, is implicated in cancer development and progression both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. In recent years, research from this laboratory has sought to shed light on this enigma. Tumor suppression by CAV was linked to E-cadherin-dependent suppression of genes, including survivin and cyclooxygenase-2, and augmented apoptosis. However, in the absence of E-cadherin, CAV promotes metastasis. More recent studies implicate CAV tyrosine phosphorylation and activation of a novel Rab5-Rac signaling axis in enhanced tumor cell migration, invasion and metastasis. In the presence of E-cadherin, signaling via this pathway and metastasis are suppressed. Thus, CAV switches roles in an E-cadherin-dependent manner. Understanding such context-dependent variations in protein function has important ramifications for our basic understanding of signal transduction processes and cancer, as well as for the development of successful strategies to treat the disease. Acknowledgements: FONDECYT-FONDAP 5300, FONDECYT 30250, ACT (AFGQ). posttranscriptional regulation of gene expression. Examples will be presented that highlight the role of structural changes and conformational dynamics in the recognition of the 3 splice site RNA during eukaryotic pre-mrna splicing, translational regulation and RNA stability. Conferencia plenaria de clausura Fundación Ramón Areces CP06- (R06-) Understanding the role of proteolysis in disease Charles S. Craik University of California San Francisco, San Francisco, US Virtually any biological process can be linked to a proteolytic event. With approximately 2% of the human genome encoding a protease a plethora of these enzymes exist, several of which have already been shown to play roles in diverse physiological processes including development, innate and adaptive immunity, cell cycle regulation and apoptosis. In situations where a unidirectional signal is required, the hydrolysis of a peptide bond can provide an irreversible, one-way event in a complex signaling pathway. Similarly, the genomes of most other organisms ranging from viruses and microorganisms to metazoans have 2 to 4% of their genomes dedicated to proteases. In cases where there is a direct link between the proteolytic event and disease, significant opportunities exist for therapeutic intervention. For these reasons, there has been a great deal of interest in protease biology and in dissecting the complex regulation, localization and activation of protease function. Identifying the actual proteases involved in physiological events, locating the natural substrates of the enzymes and selectively regulating their activity is of prime importance to the field. This talk will focus on a highly important subset of the large area of proteolysis to provide a window into this rich area of research. Methodologies will be presented that allow the global activity of proteolysis to be determined in complex biological systems and permit the non invasive imaging of protease activity in various disease states. These efforts to understand the mechanism of proteolysis in a biological context and in several cases, the relationship between proteolysis and disease are providing insights regarding how best to regulate proteolysis in infectious diseease and cancer. Conferencia plenaria FEBS National Lecture CP05- (R05-) Dynamics of protein-rna interactions in posttranscriptional regulation of gene expression Michael Sattler Institute of Structural Biology, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, and Center for Integrated Protein Science Munich and Biomolecular NMR, Technische Universität München, Garching, München, DE Eukaryotic multi-domain proteins play crucial roles in the regulation of gene expression and cellular signaling. The structure of these proteins often depends on dynamic domain arrangements that are modulated by binding to RNA and/or other proteins. We employ integrated structural biology combining solution techniques such as NMR-spectroscopy and small angle scattering experiments with crystallography to study the structure and dynamics of multi-domain proteins involved in various aspects of 0

Granada 204 Pósters Simposio : Biomedicina molecular

Simposios XXXVII Congreso SEBBM S. Enfermedades moleculares S.- (R.-) Pancreatic cancer: From molecular understanding to personalized treatment Manuel Hidalgo Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES Pancreatic cancer remains one of the most deadly cancers. Over the last few years, the genomic landscape of pancreatic cancer as well as precursor pancreatic cancer lesions have been deciphered in great depth. These studies show that PDA develops as the consequence of accumulation of mutations in key oncogenes and tumour suppressor genes. The disease, once established, is characterized by high complexity, heterogeneity and genomic instability. Despite this facts, some patients harbour actionable mutations which targeting has resulted in significant clinical benefit. Indeed, one of the most active areas of research in PDA is the development of strategies and approaches to personalize the treatment of patients. This is a complex field that can be tackle from many complementary angles. Our group has been interested in using patient derive xenogaft (PDX) models, aka Avatar mouse models, to guide cancer treatment. A piece of freshly collected tumour is implanted in immunodeficient mouse models, expanded, treated with different anticancer agents alone and in combination to select the most effective drug/regimen to treat the patient cancer. Our data show that the approach is highly predicted but, because of complexity and cost issues, not widely applicable to clinical practice at the present stage. To solve some of these limitations we are working on different aspects. One area is technological development to increase the take rate of tumours and to speed time to engraftment and expansion time. Currently, these figures are approximately 60-80 % and 5-7 months. Studies are in progress to optimize this aspect. Another key question is the selection of agents, both alone and in combination, to be tested in the model. In this regard, it is important to integrate biomarker assessment in the tumour to pre-select a series of treatment candidates that can then be tested in the PDX models. To this end, we have now integrated next generation sequencing and assessment of copy number variation in patient s tumour. These studies provide us with an unbiased overview of the tumour genomic landscape. From this data, using different bioinformatics and biological methods we extract the most relevant drug targets that are then bench tested against the patient Avatar mouse model to select the most effective treatment. Another area of great interest in PDA therapeutics is the cancer microenvironment. PDA is known for a flourish cancer stroma composed of extracellular matrix and cells including inflammatory, immune and cancer associate fibroblast. Strategies aiming to eliminate the cancer stroma with agents such as hyaluronidase and Hh inhibitors among others have received substantial attention. nabptx, an agent proposed to target SPARC, one of the key elements in the PDA stroma, has shown improvement in overall survival and has received regulatory approval for this disease. Agents in this category will also be reviewed. Finally, strategies to target the cancer stem cell will be presented. Laboratory studies have shown the presence of a small percentage of cells in PDA tumours with stem properties. These cells can be identified by membrane markers and are considered to be resistant to chemotherapy and radiotherapy. It is possible, that CSC is responsible for cancer failure after definitive chemotherapy and radiotherapy and there is significant interest in developing agents to selectively eliminate these cells. S.-2 (R.-2) Assessing the therapeutic role of Vav oncoproteins in high-incidence diseases Xosé R. Bustelo, Salvatore Fabbiano, Javier Robles, Luis Francisco Lorenzo, María Barreira, Mauricio Menacho-Márquez Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca, ES Although there is a wide consensus regarding the potential therapeutic role of Rho/Rac GDP/GTP exchange factors (GEFs), we have no formal demonstration that such idea is true for most high-incidence diseases. Tackling this issue has been in fact rather difficult so far, since the human genome contains more than 70 GEFs that, in many cases, are coexpressed in the same cell types and tissues. Due to this, it is of paramount importance to utilize disease-mimetic animal models to characterize unequivocally the spectrum of GEF-dependent diseases, identify the best therapeutic targets of the GEF family for specific high-incidence diseases or disease subtypes and, in addition, unveil the GEF-dependent Achilles heels present in those diseases that can be used to devise new ways to attack them pharmacologically. In our lab, we are addressing the above issues using as working model the Vav GEF subfamily. The three members of this subfamily present in mammalian species (Vav, Vav2, Vav3) are characterized by being directly regulated by phosphorylation on specific tyrosine residues. Due to this, these GEFs are specialized in connecting stimulated upstream protein tyrosine kinases with the activation of downstream Rho/Rac GTPases during both normal and pathophysiological signaling responses. To this end, we are using both standard and secondgeneration genetically modified mice to assess the pros and cons of the inactivation of these proteins in a number of high-incidence diseases. Using this approach, we have discovered that two Vav subfamily members (Vav2 and Vav3) play critical roles in breast and skin primary tumorigenesis, the metastasis of cancer cells to the lung, obesity, and obesity-linked comorbodities (i.e., metabolic syndrome, liver esteatosis, type II diabetes). We have also discovered that the inactivation of any of those two proteins also leads to negative effects in the cardiovascular system. However, such collateral defects can be easily bypassed by treatments with currently available anti-hypertension therapies. Finally, the dissection of the role of Vav proteins in these diseases has allowed us to discover biological programs and gene signatures that have favored the molecular understanding of those diseases, the identification of new targets, and the diagnosis of some of those diseases. In this talk, we will provide an overall view of the progress made in these areas. S.-3 (R.-3) Muerte celular, senescencia y autofagia en la pérdida de audición relacionada con la edad: regulación por IGF- Isabel Varela-Nieto, Adelaida Celaya 2, Alejandro Gibaja 2, Sara Pulido 2, Rocio de Iriarte 2, Marta Magariños 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM), IdiPAZ y CIBERER, Madrid, ES, 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) y CIBERER, Madrid, ES, 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM), Facultad de Ciencias (UAM) y CIBERER, Madrid, ES La deficiencia congénita en el factor de crecimiento similar a la insulina tipo (IGF-) es una enfermedad rara humana que produce alteraciones severas del crecimiento y sordera neurosensorial. Este factor neurotrófico es fundamental en la diferenciación postnatal tardía de la cóclea, su ausencia causa muerte por apoptosis de las neuronas auditivas tipo I, y otras alteraciones celulares en el receptor periférico y en las vías auditivas centrales. Entre los mecanismos implicados se ha descrito la activación de quinasas de estrés (MAPK8/9 y 4-FoxP3) y la inhibición de rutas de supervivencia (AKT), de proliferación (MAPK/3-FoxM/p27Kip) y de diferenciación celular (MEF2). El IGF- en la edad adulta es un protector ótico, mantiene la fisiología coclear y promueve la supervivencia de las neuronas auditivas. Durante el envejecimiento, se produce senescencia neuronal, un aumento en la expresión de genes de la maquinaria autofágica (Becn, Atg4b yatg5) y en los niveles de marcadores proteicos de autofagosomas (LC3-II y p62), neuroinflamación y una disminución en los niveles de IGF- que progresa pari pasu con la pérdida auditiva relacionada con la edad (ARHL). El componente neurodegenerativo de la ARHL empeora en situaciones patológicas de déficit de IGF-, agudizándose el fenotipo molecular, celular y funcional, e incluso predispone al receptor auditivo a sufrir un mayor daño cuando se somete a estrés. 2

Granada 204 Simposios En conclusión, el IGF- es un neuroprotector ótico que favorece la supervivencia celular, mientras que su déficit promueve procesos de inflamación que producen un aumento del daño en la cóclea. Este trabajo ha sido fi nanciado por los proyectos FP7-innova2 AFHELO y la MCA TARGEAR. S.2 Señalización celular «cascadas y dianas» S.2- (R.2-) The loss of memory in Alzheimer disease Jesús Ávila de Grado Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES Memory impairment in Alzheimer disease (AD) could be related to a defect in the function of hippocampal region of an AD patient. In this region, dentate gyrus plays an important role in the formation of new memories. The study of neurogenesis in dentate gyrus, in mouse models for AD, has indicated some important features that could also take place in Alzheimer disease patients. S.2-2 (R.2-2) The role of the JNK pathway in insulin resistance Carme Caelles Universidad de Barcelona, Barcelona, ES During the last decade, the c-jun N-terminal kinase (JNK) has emerged as a major regulator of the insulin signalling and, hence, glucose homeostasis. By directly targeting the insulin receptor substrate (IRS)- and -2 for serine phosphorylation, JNK inhibits insulin signalling at very early steps. Actually, JNK is activated by insulin and acts as a negative feedback mechanism to turn off insulin signal under physiological conditions. However, abnormal JNK activation due to stress, such as oxidative or endoplasmic reticulum stress, or pro-inflammatory signals induces, by this IRS-phosphorylation dependent mechanism, insulin resistance. In fact, the insulin-sensitizing drugs and peroxisome-proliferator activated receptor (PPAR) γ ligands thiazolidinediones (TZDs) restore glucose homeostasis through inhibition of JNK, further supporting the role of this kinase as a major mediator of obesity-induced insulin resistance. In addition to the role of JNK in peripheral insulin-target tissues, JNK activity also regulates insulin action in pancreatic β-cells. In this regard, in vivo ectopic activation of JNK this cell type renders a glucose-intolerance phenotype in mice due to the impairment of glucose- and insulin-induced insulin secretion and gene transcription. Moreover, results form these mice demonstrate a direct action of TZDs on pancreatic β-cells as TZD treatment inhibits this ectopic JNK activation and, thereby, restores insulin signalling and glucose- and insulin-induced secretion in pancreatic islets, and glucose tolerance in the mice. S.2r-3 (R.2-3) Deciphering the insights of poly(adp-ribosylation) in metastasis Francisco Javier Oliver Pozo Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are a group of DNA-dependent nuclear enzymes (also named ARTD) which catalyze the synthesis and transfer of negatively charged ADP-ribose moieties from nicotinamideadenine-dinucleotide (NAD + ) to a number of target protein substrates, leading to the alteration of chromatin associated proteins. PARP-, the founder member, is an active player in tumor adaptation to metastasis and PARP inhibitors, recognized as promising therapeutic agents against homologous recombination deficient tumors, have novel properties responsible for the anti-metastatic actions in different tumor settings. Poly(ADP-ribosyl)ation modulates pro-metastasic activities such as hypoxic response, angiogenesis and epythelial to mesenchymal transition (EMT). Furthermore, key transcription factors are fine-tuned through this action, helping to the adaptation of tumor to a hostile microenvironment, the recruitment of new vessels, and stimulate the cellular changes promoting EMT. In this presentation we summarized some of the findings that focalize on PARP- s action on tumor aggressiveness, suggesting new therapeutic opportunities against an assembly of tumors not necessarily bearing DNA repair defects. S.3 Ingeniería tisular y medicina regenerativa S.3- (R.3-4) BIOLAMINATION for customised, rapid tissue fabrication: printer optional Robert Brown University College London. Institute of Orthopaedics & Musculoskeletal Sciences, RNOH, Stanmore Campus, Londres, UK A quiet revolution is happening under the umbrella of tissue engineering as we begin to understand that there are two distinct approaches available for producing tissues. Not surprisingly, the approach we select has a profound effect on the technology we use. Firstly, and most familiar, is the idea of growing tissues by cultivation of cells in/on a substrate (often in bioreactors). Secondly we can directly fabricate simple living tissues, in the same way we make cell-phones. In this case there is little or no contribution from the cells, though they are incorporated as one of the basic building blocks. Fabricating tissues directly is a concept which has entered largely from public excitement around the extension of ideas in 3D bio-printing to incorporate living cells and proteins into the system. In fact 3D cell-printing is only one of a family of approaches which is better termed BIO-LAMINATION, in which thin layers (micron scale) of proto-tissue are laid down in series to build up a stack and produce the gross-scale tissue. In fact although bio-printing provides the popular image, it is presently far from the most effective example of fabrication by bio-lamination, as technical problems of cell survival and natural matrix polymerisation are complex. Other bio-lamination approaches include electro-spinning and cell and matrix layering. Although attractive, the need for bio-printing and spinning approaches to assemble the X-, Y-, AND Z-planes simultaneously creates a technical hurdle. Matrix and cell layering techniques avoid this by firstly mass-fabricating the X-Y plane layers, then stacking them to give the Z-plane in a separate stage. Cell-rich constructs are fabricated by expansion of cell sheets on specialised surfaces, matrix-rich X-Y layers by rapid cocompression of cells and matrix proteins (eg collagen). Bio-lamination fabrication has the capacity to mass produce real tissues (cells embedded in a native extracellular matrix) in minutes. They can be mass- produced reproducibly, economically, with simple or complex stacks of tissue layers. They are already available for 3D tissue drug or disease screening, customised grafts and advanced drug delivery. But however we produce the component laminae, they require a number of special processing features. These include the need (i) to incorporate living cells INTO the fabric of the matrix at time zero (so no cell-seeding stage but conditions must be 3

Simposios XXXVII Congreso SEBBM non-lethal): (ii) to fabricate the matrix primarily from a natural (eg protein) fibre network; (iii) to provide tight, monitored controls such that the layers are definable and reproducible when mass produced: (iv) to produce simple constructs in minutes (rather than days/weeks). Where these criteria can be met, new opportunities for high impact applications become possible. S.3-2 (R.3-5) Tejidos artificiales. Del laboratorio a la clínica Antonio Campos Facultad de Medicina, Universidad de Granada, Granada, ES La ingeniería tisular constituye un ámbito de investigación multidisciplinaria que, sustentada en la histología, tiene por objeto la construcción de tejidos artificiales. Para la elaboración de los mismos, son necesarias células madre con capacidad de proliferación y diferenciación selectiva, así como de biomateriales de distinta naturaleza capaces de reproducir las propiedades biomecánicas de los tejidos nativos. En la necesidad de articular las propiedades biológicas de las células y las propiedades derivadas de la naturaleza físico-química de los biomateriales radica el éxito de la ingeniería tisular y, por tanto, la construcción de un tejido artificial idóneo para la terapéutica. Un ejemplo de articulación específica es la construcción de una córnea artificial en la que son necesarios biomateriales de calidad óptica y células diferenciadas para el revestimiento y la regulación del transporte iónico a partir del humor acuoso. El desarrollo de la ingeniería tisular está llamado a generar una importante actividad industrial de base nanotecnológica, al configurarse, además de como herramienta terapéutica, como sustituto de los animales de experimentación en el contexto de la legislación europea. S.3-3 (R.3-6) Cardiac reverse remodelling by epigenetic ways Susana González CNIC, Instituto de la Salud Carlos III, Madrid, ES The most important determinant of cardiovascular health is a person s age. Cardiovascular disease (CVD) is a scourge of the developed world, where it is the leading cause of morbidity and mortality. Despite the significant progress on many fronts in the cardiovascular field, heart failure is a particularly debilitating form of cardiovascular disease, with a 50% death rate in 5 years after diagnosis [Harvey and Leinwand, 20]. Thus, numerous gaps in our current knowledge of cardiac aging remain to be filled. The role of epigenetic circuits has been extensively studied in cardiac development and inherited cardiac disease [Chang and Bruneau, 202]. In contrast, critical non-inherited epigenetic modifications controlling age-associated homeostatic cardiac function in cardiovascular pathophysiology remain poorly understood. Most studies of atherosclerosis or cardiomyopathies have been performed in young mice, while studies of genetic and pharmacological interventions that extend lifespan rarely assessed whether CVD or heart function was improved [North and Sinclair, 202]. Given that the epigenetic Polycomb-member Bmi is central transcriptional instructor in adult stem cell maintenance [Luis et al., 202], but unknown cardiac implication, and regulates lifespan in mammals by targeting components of key longevity pathways such as p6 INK4a, we have explored the possible implication of Bmi in the maintenance of adult cardiac function. Using a combination of conditional knockout models and biochemical analysis, we have demonstrated that Bmi protects against dilated cardiomyopathy (DCM) by repressing cardiac senescence. 4

Granada 204 Pósters Simposio 2: Biotecnología de plantas y productos de valor añadido 5

Simposios XXXVII Congreso SEBBM S2. Ingeniería genética de plantas S2.- (R2.-) The creation and utility of synthetic genotypes in plants: boundaries between metabolic engineering and synthetic biology C. Zhu, T. Capell, Paul Christou 2 Department of Plant Production and Forestry Science, ETSEA, University of Lleida-Agrotecnio Center, Lleida, ES, 2 Department of Plant Production and Forestry Science, ETSEA, University of Lleida- Agrotecnio Center, Lleida, ES. Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats, Barcelona, ES An engineered extended ketocarotenoid pathway in rice and maize will be used as an example to illustrate how synthetic biology principles and multigene transfer can result in the formation of new molecular entities with useful biological properties. The creation of specialized novel sequestering structures facilitates the accumulation of metabolic precursors which can subsequently be decorated be different ketolases and hydroxylases to produce diverse combinations of ketocarotenoids in an organ- or tissue-specific manner. The quantitative and qualitative carotenoid and ketocarotenoid profiles of particular transgenic lines depend on the expression of the integrated transgene complement. Thus the generation and characterization of a combinatorial transgenic population is a pre-requisite to select specific lines with particular chemodiversity. We will discuss the fundamental mechanisms that underpin these experiments and we will highlight animal feeding trials to demonstrate the effects of diets fortified with particular combinations of target metabolites on products derived from such animals. S2.-2 (R2.-2) Hydrogen peroxide signal transduction in plants. Gathering the pieces Frank van Breusegem Ghent University, Ghent, BE Different biotic and abiotic stresses adversely affect plant growth and development leading to worldwide yield losses. A common theme within these environmental factors is the perturbation of reactive oxygen species (ROS) homeostasis. Despite the great economic importance, the signal transduction mechanisms of the oxidative stress response in plants are poorly understood. We conducted several genetic and chemical screens, together with proteomic approaches in order to obtain a more comprehensive overview on the different components of the network that govern the oxidative stress response. Theses efforts identified several genes as new members of the oxidative stress gene network in plants, together with small molecules that are able to interfere with specific events during the oxidative stress response in plants. The potential of these genes and molecules for providing abiotic stress tolerance in commercially relevant plants will be assessed in the future. S2.-3 (R2.-3) Transcriptional networks and epigenetic regulation at the core of the plant circadian clock Paloma Mas Centro de Regulación en AgriGenómica (CRAG). Consorcio CSIC- IRTA-UAB-UB, Bellaterra, Barcelona, ES The circadian clock is a biological time keeper mechanism able to regulate biological rhythms with a period of approximately 24-hours. In many organisms, transcriptional and translational feedback loops underlie the circadian function at the core of the clock. In Arabidopsis, the evening oscillator component TIMING OF CAB EXPRESSION (TOC) was proposed to activate morning-expressed oscillator genes. In our studies, we have shown that TOC does not function as an activator but rather as a general repressor of oscillator gene expression. Repression occurs through TOC rhythmic association to the promoters of the oscillator genes, demonstrating that the morning and evening oscillator loops are connected through the repressing activity of TOC. Chromatin remodeling has also emerged as a crucial regulatory mechanism in a number of cellular processes including the circadian clock. Indeed, the circadian oscillation of core clock genes correlates with the sequential accumulation of Histone acetylation and trimethylation. Inhibition of these marks abolishes oscillator gene expression, indicating that they are critical for gene activation. Increased clock-repressor binding was observed when Histone trimethylation was blocked, suggesting that this mark might regulate the progression from activation to repression. The histone methyltransferase SET DOMAIN GROUP 2/ARABIDOPSIS TRITHORAX RELATED 3 (SDG2/ATXR3) contributes to this regulation because oscillator gene expression, Histone trimethylation and repressor binding are altered in plants mis-expressing SDG2/ATXR3. Our future research goal is to fill the existing gap in the plant circadian field by identifying other molecular determinants responsible for particular histone marks at the core of the clock and their relevance controlling plant responses to the environment. S2.2 Biología de sistemas y biología sintética S2.2- (R2.2-) Directed enzyme evolution: rational thoughts for non-rational experiments Miguel Alcalde Institute of Catalysis, ICP-CSIC, Cantoblanco, Madrid, ES Over the past 20 years, directed evolution has been seen to be the most reliable approach to protein engineering. This tool that has revolutionized the manner in which proteins are manipulated in the laboratory in order to improve their application in distinct industrial settings and to engineer complex metabolic pathways opening a research ground in synthetic biology. By mimicking the mutation, recombination and selection processes that occur naturally in evolution, in vitro evolution provides a means of directing the evolution of genes toward specific goals in a manner that may not occur in a natural environment. Here, we summarize some successful examples from our laboratory to tailor ligninolytic genes (laccases, peroxidases, peroxygenases) in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This lecture will pay special attention to the use of the DNA recombination machinery of S. cerevisiae to accelerate artificial evolution, complementing the traditional in vitro methods to generate tailor-made enzymes. References [] P. Molina-Espeja, E. Garcia-Ruiz, D. Gonzalez-Perez, R. Ullrich, M. Hofrichter and M. Alcalde. Appl Environ Microb 204, 80: 3496-507. [2] D. Gonzalez-Perez, P. Molina-Espeja, E. Garcia-Ruiz and M. Alcalde. PloS ONE 204; 9 (3): e9099. [3] P. Torres-Salas, D. Mate, I. Ghazi., F.J. Plou, A.O. Ballesteros and M. Alcalde M. Chem Bio Chem 203; 4: 903-8. [4] D. Mate, D. Gonzalez-Perez, M. Falk, R. Kittl, M. Pita, A.L. De Lacey, R. Ludwig, S. Shleev and M. Alcalde. Chem Biol 203; 20: 223-3. [5] D. Gonzalez-Perez, E. Garcia-Ruiz and M. Alcalde M. Bioengineered 202; 3: -6. [6] E. Garcia-Ruiz, D. Gonzalez-Perez, F.J. Ruiz-Dueñas, A.T. Martinez and M. Alcalde. Biochem J 202; 44: 487-98. [7] D. Mate, C. Garcia-Burgos, E. Garcia-Ruiz, A.O. Ballesteros, S. Camarero, and M. Alcalde. Chem Biol 200; 7: 030-4. [8] M. Zumárraga, T. Bulter, S. Shleev, J. Polaina, A. Martinez-Arias, F.J. Plou, A. Ballesteros, and M. Alcalde. Chem Biol 2007; 4: 052-64. 6

Granada 204 Simposios S2.2-2 (R2.2-2) Microbial life-styles and adaptive changes of macromolecular synthesis Soren Molin Department of Systems Biology and Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Denmark Technical University of Denmark, Lyngby, DK Bacteria belonging to the genus Pseudomonas posses a broad metabolic repertoire, which allows them to grow in a wide variety of environments. This versatile potential for growth and persistence is reflected in the large genome sizes in Pseudomonas bacteria and in a parallel large number of regulatory genes. Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen living in the environment, and under some conditions it has the capacity to colonize humans, where it may develop life long persistent infections. Moving from the outer environment to a human environment constitutes a significant change of living conditions challenging the regulatory and metabolic repertoire of the bacteria. In patients suffering from the genetic disorder cystic fibrosis (CF) P. aeruginosa frequently develops persistent infections of the airways, and over periods of thousands of bacterial generations mutations accumulate in the bacterial populations, which gradually increase the persistence fitness resulting in severe chronic lung infections. In a large study of more than 40 young CF patients we have investigated the evolutionary dynamics of more than 50 different strains of P. aeruginosa, from which we have sequenced more than 600 genomes covering airway residence times from -0 years. One of the striking observations made from this investigation is that adaptive mutations in genes encoding global regulatory proteins, including RNA polymerase associated sigma factors, are very frequent in CF isolates obtained from patients with early stage P. aeruginosa airway infections. We are currently studying the relationship between the phenotypes associated with some of these regulatory mutations and the microbial life-style in CF airways, and examples of such relationships will be presented. It will be documented how specific mutations in regulatory genes may switch the phenotype from one typical life-style to another more compatible with the novel environment. It is hypothesized that this pattern of mutational changes observed in infecting bacterial populations may represent bacterial adaptive evolution in many other scenarios, where bacteria move from one environment to another. metabolic machinery. Aside from the carbon and energy stockpiling function ascribed to the polymers themselves, GAPs play a critical physiological role in PHA metabolism and granule formation. Phasins form part of the mediation element network responsible for granule localization and segregation. PHA synthase and depolymerase are also attached to the granules, and operate a continuous metabolic cycle that ensures the turnover of the accumulated polymer and plays a key role in the maintenance of metabolism homeostasis. PHAs, traditionally considered bacterial reservoirs of carbon and energy, are now recognized as having many physiological roles. In P. putida, PHA production ensures a more robust metabolism and improves bacterial fitness. Acting as a futile cycle, PHA metabolism balances the storage vs. spillage equilibrium of both carbon and energy, thus determining cell size and morphology. PHA metabolism is controlled by the network of local and global regulators controlling the pathways involved in carbon and nitrogen assimilation. PHAs are valuable nutrients for producer strains, but since they can be extracellularly degraded they are also useful to the wider microbial community.the predation of PHA- producers by bacterial predators such as B.dellovibrio bacteriovorus has an important effect on microbial population dynamics since PHA granules and free HA oligomers are released into the environment. These can be then incorporated into the microbial metabolism of not-necessarily accumulating/degrading strains, enhancing their biological fitness. The system-wide nature of PHA metabolism makes it a real challenge to design PHA-producing bacteria using synthetic biology strategies. S2.3 Hispano-Mexicano S2.3- (R2.3-0) Biotecnología de anticuerpos: mejora y desarrollo de nuevos antivenenos Alejandro Alagón Cano Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autonóma de México, México DF, MX S2.2-3 (R2.2-3) The polyhydroxyalkanoate systems metabolism; much more than a bioplastic production María A. Prieto Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES Polyhydroxyalkanoate (PHA) are one of the current alternatives to petroleum-based plastics. From an industrial standpoint, PHAs are attracting extensive interest as technical-grade polymers due to their singular set of properties: (i) substitution potential for industrial thermoplastics such as polypropylene, polyethylene, polyvinylchloride and polyethylene terephthalate, (ii) biodegradability both in aerobic and anaerobic conditions, including aquatic environments, (iii) biobased, renewable origin, (iv) biocompatibility with cells and tissues and (vi) structural diversity. The physiology of PHA production has aroused much interest since the ability to accumulate these compounds is widespread among bacteria and PHA metabolism influences many cell activities. This is of particular interest with respect to model bacterial strains such as Pseudomonas putida KT2440, an outstanding candidate for the development of microbial chassis with specialized phenotypes. The use of cutting-edge technologies such as transcriptomics, proteomics and metabolic flux analyses has improved our understanding of the interplay between PHA metabolism, which is extremely context-dependent, and other cell functions. PHA granules represent supramolecular complexes that carry granule associated proteins (GAPs), essential protein components of the PHA S2.3-2 (R2.3-) Structure and function of bacterial fructosyltransferases: fructans in traditional mexican fermentation products Agustín López-Munguía Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, MX Fructansucrases (GH68) are enzymes that catalyze the transfer of the fructosyl unit of sucrose to a growing fructan polymer. Depending on the chemical nature of the resulting fructosidic bond, these enzymes may be classified as levansucrases (LS) when the resulting polymer (levan) is linked through β (2 6) bonds or inulosucrases (IS) when β (2 ) linked fructosyl units are formed in the main chain (inulin). We first reported the unusual mosaic structure of inulosucrase (IslA) in Leuconostoc citreum CW28, a strain isolated from Pozol, a corn traditional lactic fermentation product traditionally consumed in the south of México. IslA, which is highly specific for inulin synthesis, has a b-propeller catalytic domain with high identity to SacB, the levansucrase from Bacillus subtilis. However, IslA also bears additional domains in both, the amino and carboxyl terminal regions, domains already described in glucansucrases from lactic acid bacteria. Glucansucrases are enzymes that carry out the synthesis of glucans from sucrose, in an analogous mechanism. The same structural features found in IslA were later identified and characterized in several bacterial strains, including the industrial dextran producing strain (Leuconostoc mesenteroides NRRL B-52F) as well as in the sequenced 7

Simposios XXXVII Congreso SEBBM genome of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293. Both glucans and fructans are present in pulque, a traditional fermentation product that dates back to the Mesoamerican culture. Pulque is obtained from aguamiel, a sap extracted from various agave species. In this conference several aspects related with the structural properties of these glycosyltransferases, are described, as well as their role in the traditional Mexican fermented products and their potential applications in fructan synthesis. S2.3-3 (R2.3-2) LINE- retrotransposition in Fanconi anemia patients José Luis García Pérez GENYO-University of Granada, Granada, ES It is becoming increasingly evident that Long Interspersed Element- (LINE- or L) retrotransposons have played an important role in shaping the structure and function of mammalian genomes. Ls are members of the non-long-terminal-repeat (non-ltr) retrotransposon family, which are widely spread in the human genome. New L mobilization events have resulted in a variety of genetic disorders providing a constant source of human genetic diversity. L might ensure its evolutionary transmission to new generations through the accumulation of new insertions during early embryonic development or in germ cells. Thus, L insertions can act as mutagens in the embryonic phase. In fact, endogenous Ls are expressed in Human Embryonic Stem Cells (hescs) and human induced pluripotent stem cells (hipscs). Additionally, others and we have shown that engineered human Ls can retrotranspose in hescs and ipscs at a low level. In sum, these data reveal that both hescs and hipscs are an excellent model to study LINE- accumulation and its genomic impact in humans. On the other hand, it is well established that L retrotransposition occurs by a mechanism known as target site-primed reverse transcription (TPRT), which requires both the L-encoded endonuclease and reverse transcriptase activities. However, it has been reported that L can mobilize through an endonuclease-independent pathway (ENi), in which the element inserts at sites of DNA disrepair. Notably, recent data from our lab has demonstrated that the mobilization of L is de-regulated in Fanconi Anemia (FA) patients, including the ENi pathway. FA is a rare disease characterized by infant mortality and genomic instability, suggesting that de-regulated LINE- retrotransposition may affect genomic fluidity in FA patients. 8

Granada 204 Pósters Simposio 3: Estructura y función de proteínas 9

Simposios XXXVII Congreso SEBBM S3. Receptores y proteínas de membrana S3.- (R3.-) Transportadores heteroméricos de aminoácidos: hacia su estructura atómica Albert Rosell, Lukasz Kowalczyk, Joana Fort, Ekaitz Errasti, Paola Bartoccioni, Elena Alvarez-Marimon, Meritxell Costa 2, Marcel Meury 3, Guillem Portella, Laura Pérez 4, Arturo Rodríguez- Banqueri, Ana Obando, Antonio Zorzano 5, Modesto Orozco 6, Xavier Carpena 7, José Luis Vázquez-Ibar 8, Juan Fernández-Recio 4, Dimitrios Fotiadis 4, Ignacio Fita 7, Manuel Palacín 9 IRB Barcelona, Barcelona, ES, 2 IRB Barcelona y Swiss National Centre of Competence in Research TransCure, University of Bern, Bern, CH, 3 Swiss National Centre of Competence in Research TransCure, University of Bern, Bern, CH, 4 Barcelona Supercomputing Center, Barcelona, ES, 5 IRB Barcelona y Universidad de Barcelona, Barcelona, ES, 6 IRB Barcelona, Barcelona Supercomputing Center y Universidad de Barcelona, Barcelona, ES, 7 Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, 8 IRB Barcelona y Institute of Biology and Technology Saclay (ibitec-s), Gif-sur-Yvette Cedex, FR, 9 IRB Barcelona, Universidad de Barcelona y CIBERER, Barcelona, ES Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) son el único ejemplo conocido de transportadores de solutos constituidos por dos subunidades unidas por un puente disulfuro. En metazoos, la subunidad pesada es responsable del tráfico del heterodímero a la membrana plasmática mientras que la subunidad ligera es el transportador. Los HAT están involucrados en patologías como aminoacidurias, cáncer, infección viral y adicción a cocaína. En los últimos siete años se ha incrementado el conocimiento estructural de estos transportadores de forma notable. El ectodominio de la subunidad pesada humana 4F2hc (4F2hc-ED) se ha resuelto a 2.Å revelando homología estructural con amilasas bacterianas. 4F2hc-ED adolece de los residuos catalíticos clave pero mantiene la hendidura catalítica para la que no se conocen ligandos. Homólogos bacterianos con baja identidad de secuencia (<20% con las subunidades ligeras como el intercambiador arginina/agmatina AdiC de E. coli) han sido resueltos a 3.0 Å y revelan un plegamiento de tipo LeuT, característico de varias familias de transportadores de solutos. La expresión del heterodímero 4F2hc/LAT2 humano en Pichia ha permitido obtener el primer modelo a baja resolución de un HAT (2 Å) por tinción negativa, análisis por docking y confirmación por entrecruzamiento de residuos de cisteina. Este modelo ha revelado por primera vez la posición relativa de 4F2hc-ED sobre la subunidad ligera, ofreciendo una explicación estructural de la estabilización del complejo. Se presentarán las estrategias que estamos siguiendo para resolver la estructura atómica de homólogos bacterianos más robustos y de HAT eucariotas. Estas estructuras facilitarán la comprensión del papel de 4F2hc en la actividad del transportador asociado y la conexión funcional con integrinas. S3.-2 (R3.-2) Implicación del transportador ABCG2 en la infección por el parásito Leishmania Francisco Gamarro, David León-Guerrero, Jenny Campos-Salinas, José Ignacio Manzano, Elena González-Rey, Mario Delgado, José María Pérez-Victoria, Santiago Castanys Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES Las proteínas ABC (ATP-binding cassette) constituyen una de las mayores familias a lo largo de toda la escala biológica, desempeñando una gran diversidad de funciones, entre otras el transporte activo de moléculas a través de las membranas. Los sustratos conocidos son estructuralmente diversos, encontrando entre ellos lípidos y fármacos. En el parásito Leishmania, responsable de la segunda enfermedad parasitaria en importancia conocida como leishmaniasis, existen 42 genes de la familia ABC. Hemos caracterizado un nuevo transportador ABC de Leishmania, denominado ABCG2 implicado en el proceso de infección. Los análisis realizados con parásitos que expresan una versión inactiva del transportador (DN) o con parásitos mutantes nulos para ABCG2 mostraron que este transportador es necesario para la exposición de fosfatidilserina (PS) en la cara externa de la membrana plasmática del parásito. Este fenotipo se correlacionó con una deficiente capacidad de infectar macrófagos peritoneales. Se ha descrito que la exposición transitoria de PS en la superficie del parásito es necesaria para el proceso de infección celular. Además, los estudios de infección en un modelo experimental de leishmaniasis cutánea mostraron que los animales infectados con parásitos DN no desarrollaban ninguna lesión, mostrando una inflamación y carga parasitaria más baja que los animales infectados con los parásitos control. Todos estos resultados evidencian la implicación del transportador ABCG2 en la exposición de PS en la membrana del parásito, en la infección y virulencia de Leishmania. S3.-3 (R3.-3) Transferencia de electrones entre proteínas: de la cinética a la molécula única Carlos Gómez-Moreno, Carlos Marcuello 2, Rocio de Miguel 3, Marta Martínez Júlvez 4, Anabel G Lostao 5 Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2 Instituto de Nanociencia de Aragón Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3 CEA, Paris, FR, 4 BIFI. Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 5 Instituto de Nanociencia de Aragón/ Fundación ARAID, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES El proceso de transferencia de electrones entre proteínas constituye la base de muchas reacciones que son fundamentales para los seres vivos. La fotosíntesis, la respiración, la fijación de nitrógeno, la desaturación de los ácidos grasos, etc., son ejemplos representativos. En ellos, las proteínas que intercambian electrones deben interaccionar durante un muy breve espacio de tiempo para que el electrón/es pase(n) de una proteína a la otra. Durante más de 25 años nuestro grupo ha investigado el mecanismo mediante el cual se produce el reconocimiento entre las proteínas que deben interaccionar. El trabajo se ha centrado en el estudio de la enzima Ferredoxina NADP + reductasa, que interviene en la producción de NADPH en la fotosíntesis y sus proteínas complementarias, la Ferredoxina (Fd) y la Flavodoxina (Fld), todas ellas de la cianobacteria Anabaena PCC 79. Técnicas cinéticas, tanto en estado estacionario como preestacionario (inducida por láser y de flujo interrumpido) junto con el empleo de muestras mutadas en posiciones concretas han permitido concluir que la interacción seinicia mediante la orientación de las superficies de reconocimiento por atracción electrostática seguida por una reorganización de ambas moléculas mediante interacciones hidrofóbicas. La cristalización y resolución de la estructura del complejo entre la FNR y la Fd de Anabaena han ratificado nuestra propuesta al determinar que los grupos propuestos para la interacción están próximos en el complejo y que los centros redox se encuentran a distancias que son compatibles con la reacción. Recientemente hemos iniciado una línea de trabajo que se apoya en el uso de la Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM) para estudiar el proceso de interacción desde el punto de vista de la molécula individual. La razón de esta decisión está en la esperanza de que la observación directa de las moléculas que interaccionan permita mostrar detalles del proceso que no son asequibles mediante el estudio del conjunto de los componentes de la reacción. Se ha desarrollado una estrategia que permite inmovilizar las proteínas con la orientación adecuada para que se produzca la interacción con su pareja y medir la eficiencia del proceso de acercamiento así como la magnitud de la fuerza ejercida. Los resultados de la medida de las fuerzas intermoleculares de los complejos transitorios entre las proteínas 20

Granada 204 Simposios implicadas en la transferencia de electrones se interpretan de acuerdo con el modelo propuesto anteriormente que indicaba que la interacción FNR:Fd es más fuerte y específica que la que se presenta en la FNR:Fld. Las mayores fuerzas de ruptura medidas entre la FNR y la Fd frente a las obtenidas entre la FNR y la Fld indican la mayor mecanoestabilidad del complejo entre la FNR y su pareja natural la Fd. S3.2 Macromoléculas en la enfermedad y vacunas S3.2- (R3.2-) Vacunas contra enfermedades prevalentes Mariano Esteban Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, ES La vacunación es la estrategia más efectiva y menos cara para controlar y erradicar las enfermedades humanas. Muchas enfermedades han sido controladas mediante vacunación, pero hay otras para las que no hay vacunas disponibles. Anualmente cerca de 2 millones (M) de personas mueren a causa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), cerca de 3M de tuberculosis, 700.000 de malaria, más de 7M por cáncer, 2M están infectadas de leishmania y 70M con hepatitis C (HCV). Además, enfermedades en personas de avanzada edad, como Alzheimer y Parkinson, sin tratamientos efectivos disponibles, están siendo abordadas mediante vacunación. Las dificultades en el desarrollo de vacunas se deben al desconocimiento de la patología del microorganismo, diseño del inmunógeno, protocolos de inmunización, y a la definición de la correlación inmune de protección. Con los nuevos avances tecnológicos derivados de la biología de sistemas y las aproximaciones inmunológicas, el enfoque de las vacunas ha cambiado. Nuestro grupo se embarcó hace varios años en el desarrollo de vacunas para enfermedades para las que no hay vacunas, utilizando vectores poxvirales. De las lecciones aprendidas de la biología del vector poxviral virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) y de los estudios en el desarrollo de vacunas, hemos generado y patentado varios candidatos vacunales contra VIH/SIDA, hepatitis C (HCV), chikungunya, malaria, leishmania, cáncer de próstata, y algunos han entrado en ensayos clínicos, como con VIH. De hecho, hemos producido un candidato vacunal para VIH- (MVA-B) que ha sido utilizado en dos ensayos clínicos de fase I en España, con buenos resultados inmunológicos. En la conferencia, presentaremos la descripción de vectores atenuados de poxvirus, interacción con el hospedador, preclínica y clínica frente a modelo de patógenos y estado de vacunas. S3.2-2 (R3.2-2) dutpases, the unexplored family of signalling molecules José R. Penadés, Alberto Marina 2 Institute of Infection Immunity and Inflammation, Universidad de Glasgow, Glasgow, UK, 2 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV- CSIC), Valencia, ES Deciphering the molecular mechanisms that control relevant cellular processes is of utmost importance to understand how viruses, prokaryotic and eukaryotic cells work. The diversity of living organisms suggests that there are novel regulators still to be discovered, which may uncover new regulatory paradigms. dutpases (Duts) are assumed to be ubiquitous enzymes regulating cellular dutp levels to prevent misincorporation of uracil into DNA. Recently however, Duts have been involved in the control of several relevant cellular processes, including transfer of mobile genetic elements, regulation of the immune system, autoimmunity or apoptosis, suggesting that they perform regulatory functions. This talk aims at investigating the unexplored impact of Duts as novel signalling molecules. S3.2-3 (R3.2-3) NETs from infection to autoimmunity Arturo Zychlinski Max Planck Institute for Infection Biology, Berlín, DE Neutrophils are one of the first lines of defence of the immune system agains tmicrobes. These cells kill microorganisms effectively by phagocytosis and by the formation of extracellular structures, called Neutrophil Extracellular Traps (NETs). NETs are made of chromatin and specific neutrophil proteins and are released after a unique cell death program that requires the production ofradical oxygen species (ROS) and the relocation of neutrophil elastase to the nucleus. NETs help limit and control infection and also can activate the acquired immune system. Thus, formation of NETs appears to be necessary for an efficient clearing of microbes but can also initiate and exacerbate autoimmune responses. S3.3 Interacción proteína/proteína y complejos multiproteicos S3.3- (R3.3-) Structural characterisation of the chaperone Hsp70 folding network José María Valpuesta Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Colmenar Viejo, Madrid, ES The 70 kda heat shock proteins (Hsp70s) form a family of highly conserved molecular chaperones present in all domains of life and in most subcellular compartments of eukaryotic cells. Hsp70s, acting in concert with J Hsp40s and nucleotide exchange factors (NEFs) assist a multitude of different cellular protein-folding processes during protein maturation and quality surveillance [,2]. Besides, Hsp70s can interact with other major chaperones like Hsp90s, Hsp0s and CCT [3-6], in some cases via other co-chaperones, which act as physical linkers. We have been working over the last years in characterizing, using mostly electron microscopy and image processing, the interaction of Hsp70s with some of these chaperones and co-chaperones in an effort to understand the interactions that take place between these proteins, that act in coordination, forming part of an assembly line, to make the protein folding process a more efficient one. References [] Kampinga, H.H., and Craig, E.A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat Rev Mol Cell Biol 200; : 579-92. [2] Hartl, F.U., Bracher, A., and Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 20; 475: 324-32. [3] Schuermann, J.P., Jiang, J., Cuéllar, J., Llorca, O. Wang, L., Taylor, A.B., Demeler, B.,Morano, K., Hart, P.J., Valpuesta, J.M., Lafer, E.M. and Sousa, R. Structure of the Hsp0:Hsc70 Nucleotide Exchange Complex. Mol Cell 2008; 3: 232-43. [4] Cuéllar, J., Martín-Benito, J, Scheres, S.H.W., Sousa, R., Moro, F. López-Viñas, E., Gómez-Puertas, P., Muga, A, Carrascosa, J.L. and Valpuesta, J.M. The structure of a CCT:Hsc70NBD complex suggests a mechanism for Hsp70 delivery of substrates to the chaperonin. Nat Struct Mol Biol 2008; 5: 858-64. [5] Cuéllar, J., Perales-Calvo, J.,Muga, A., Valpuesta, J.M. and Moro, F. Structural insights into the chaperone activity of the 40 kda heat shock protein DnaJ. Binding and remodeling of a native substrate. J Biol Chem 203; 288: 5065-74. [6] Lorenz, O.R., Freiburger, LRutz,, D.A., Krause, M., Zierer, B.K. Alvira, S. Cuéllar, J., Valpuesta, J.M, Madl, T., Sattler, M, and Buchner, J. Modulation of the Hsp90 chaperone cycle by a stringent client protein. Mol Cell 204; 53: 94-53. 2

Simposios XXXVII Congreso SEBBM S3.3-2 (R3.3-2) Descubriendo interacciones entre enzimas proteolíticas, sus inhibidores y ligandos proteicos por MS-proteómica funcional Francesc Xavier Avilés, G. Covaleda, S. Tanco, O. Tort, A. Otero, J. Vendrell, J. Lorenzo, M. Alonso del Ribero 2, M.A. Chávez 2 Instituto de Biotecnología y de Biomedicina y Dpto. de Bioquímica, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona, ES, 2 Centro de Estudios de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, CU Actualmente se tiende hacia una visión integrada de las enzimas proteolíticas (proteasas) y acompañantes moleculares in vivo, especialmente en el contexto genómico-proteómico-interactómico. Ello también se da en unas de sus variantes más frecuentes como son las metaloproteasas y, dentro de ellas, en las metalocarboxipeptidasas (MCP). El fuerte incremento en el número de MCP detectadas en la última década pone en evidencia de que aún no se comprende su acción simultánea o específica sobre sustratos, extensible a sus restricciones por ligandos e inhibidores naturales. El hecho de que tales sustratos, y sus efectores, sean frecuentemente de naturaleza proteica, añade grados adicionales de sofisticación a estas interacciones (p.e. a niveles químico-físicos, de capacidad de discriminación y cinéticos), así como en la modulación de actividades y especificidades que promueven [-3]. Hoy en día podemos evaluar en cerca de 30, el número de variantes de dichas enzimas MCP, clasificadas entre formas M4A, B y C, y las recientemente emergentes formas citosólicas (tipo CCP) para la subfamilia M4D [4,5]. Dado que todas ellas parecen conservar el dominio canónico de metalocarboxipeptidasa y los sitios de reconocimiento equivalentes, es un desafío real la comprensión de la relación compleja entre ellas, su interacción discriminativa con sustratos naturales (peptídicos o proteicos, dado que son proteasas), y con los inhibidores proteicos ambientales. También lo es para diseñadores de fármacos la generación de ligandos que específicamente las controlen [2]. Las MCP, como otras proteasas, tienen otra propiedad característica interactómica: actúan de forma transiente sobre sustratos proteicos, promoviendo cortes sobre ellos que afectan fuertemente su conformación y funcionalidad. Cómo detectar dichas interacciones transientes no suele ser una tarea fácil, aunque factible [6-8]. También se suele desconocer el papel que juegan en la naturaleza numerosos inhibidores proteicos de ellas, que se encuentran en sistemas biológicos muy diversos. Se discutirá casos recientes de descubrimiento de dichos inhibidores y/o ligandos-sustratos, y de estrategias proteómicas e interactómicas, basadas en espectrometría de masas, así como de biología estructural seguidas para su identificación y caracterización [3,6,8-0]. También, si cabe, se presentarán datos de Maldi- MS-Imagen (MS-imagen de tejidos) para alguna de dichas biomoléculas. Bibliografía [] Arolas, JL, Vendrell, J, Avilés, FX, Fricker LD: Curr Pharm Des 2007; 3: 349-66. [2] Fernandez D, Pallares I, Vendrell J, Aviles FX: Biochimie 200; 92: 484-500. // Fernandez D, Pallares I, Covaleda G, Vendrell J, Aviles FX: Curr Med Chem 203; 20: 595-608. [3] Covaleda G, Alonso-del-Rivero MA, Chávez MA, Avilés FX, Reverter D: J Biol Chem 202; 287: 9250-8. [4] Rodriguez de la Vega M, Sevilla RG, Hermoso A, Lorenzo J, Tanco S, Diez A, Fricker Ll D, Bautista JM, Aviles FX: FASEB J 2007; 20: 85-65. // Rodriguez de la Vega M, Lorenzo J, Aviles FX, Bautista JM: FASEB J 203; 27: 424-3. [5] Otero A, Rodriguez de la Vega M, Tanco S, Lorenzo J, Aviles FX, Reverter D: FASEB J 202; 26: 3754-64. [6] Yanes O, Villanueva J, Querol E, Aviles FX: Nature Protoc 2007; 2: 9-30. // Sanglas L et al.: PNAS 2009; 06: 743-47. [7] Morell M, Czihal P, Otvos L, Aviles FX, Ventura S: Proteomics 2008; 8: 3433-42. [8] Van Damme P, et al., Aviles FX, Gevaert K: Nature Meth 200; 7: 52-5. [9] Tanco S, Lorenzo J, Garcia-Pardo J, Degroeve S, Martens L, Aviles FX, Gevaert K, Van Damme P: Mol Cell Proteom 203; 2: 2096-0. [0] Alonso del Rivero M, Reytor ML, Trejo SA, Chávez MA, Avilés FX, Reverter D: Structure 203; 2: 8-26. S3.3-3 (R3.3-3) Force generation by FtsZ bacterial cytoskeletal protein: what we have learned from single filament analysis Marisela Vélez ICP, CSIC, Madrid, ES FtsZ is a bacterial cytoskeletal protein that polymerizes on the inner surface of the bacterial membrane and contributes to generate the force needed for cell division. In the presence of GTP the individual protein monomers interact longitudinally to form filaments that can then aggregate to form higher order structures on the membrane surface. These filament aggregates are dynamic and exchange monomers from the solution. The final outcome of this dynamic rearrangement on the surface is the generation of force that bends the cell membrane inward. The rich self-assembling behavior of the protein is reproduced in vitro on supported lipid membranes using isolated proteins. Reversible GTPinduced polymerization observed with Atomic Force Microscopy (AFM) showed that the type of attachment to the surface and the type of lipid present on the membrane determine the shape of the filament aggregates observed. The detailed structural and dynamic information obtained with the AFM has allowed comparing the experimental results with theoretical models that describe the polymerization in terms of a simple set of monomermonomer interactions. Experimental results controlling the orientation of the monomers on the surface, together with molecular dynamics simulations and theoretical models have revealed that filament curvature, twist, orientation and the strength of the surface attachment are all important for determining the amount of force that the filaments can exert on the surface. References Mateos-Gil, P.; Paez,A.; Hörger, I, Rivas, G.; Vicente, M.; Tarazona, P. and Vélez, M. Depolymerization dynamics of individual filaments of bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PNAS 202; 09 (2): 8338. González de Prado Salas, P., Encinar, M., Vélez, M. and Tarazona, P. FtsZ protein on bilayer membranes: effects of specific lateral bonds. Soft Matter 203; 9: 6072. Encinar, M.; Kralicek, A.; Martos, A.; Krupka, M.; Alonso, A.; Cid, Sa.; Rico, A.; Jiménez, M.; Vélez, M. Polymorphism of FtsZ filaments on lipid surfaces: role of monomer orientation. Langmuir 203; 29: 9436-46. González de Prado Salas, P., Hörger, I., Martín-García, F., Jesús Mendieta, Alvaro, A., Encinar, M., Gómez-Puertas, P., Vélez, M., and Tarazona, P. Torsion and curvature of FtsZ. Soft Matter 204; 0: 977-86. 22

Granada 204 Pósters Pósters 23

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P00. II Workshop sobre la Innovación Docente en la Enseñanza de la Bioquímica y la Biología Molecular P00- (R00-2) Ciencia para Todos. Una experiencia para aprender divulgando Pilar Roca, J. Oliver, A. Valle Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat de les Illes Balears, Palma de Mallorca, ES Entre las competencias genéricas que debemos evaluar los profesores de grados de Ciencias está la trasmisión de información, ideas, problemas y soluciones a público especializado y no especializado. Un grupo de profesores de la UIB nos planteamos trabajar esta competencia en nuestras asignaturas, por lo que pensamos en desarrollar un encuentro entre jóvenes universitarios y estudiantes de primaria, secundaria y bachillerato, de esta manera nació CIENCIA PARA TODOS. La experiencia tenía un doble objetivo: fomentar las vocaciones científicas y la difusión de la Ciencia, y utilizar el encuentro para que los estudiantes de grado aprendieran divulgando. Entre las actividades del encuentro podemos señalar experiencias científicas, exposiciones (mujeres y ciencia, alimentación equilibrada, animales exóticos, minerales, plantas carnivoras), talleres de visualización de moléculas, juegos científicos. Además se presentó el blog que recoge los experimentos propuestos. Los alumnos en el desarrollo de la actividad se implicaron de manera activa tanto en el planteamiento de las experiencias de laboratorio (usando materiales caseros o que puedan encontrar en los colegios e institutos), como en el montaje y presentación a las personas que acudieron al encuentro. En el evento participaron 250 estudiantes de la UIB, y recibimos más de 3.500 visitantes. La evaluación del grado de satisfacción por parte de los visitantes fue muy alta, al igual que de los alumnos de la UIB. Mientras que los profesores que participaron con sus asignaturas estamos ya trabajando en el encuentro de 205. Agradecimientos: alumnos de Facultad de Ciencias y Escuela Politécnica de la UIB, profesores y personal de administración que nos ayudaron en el montaje y desarrollo de la misma. FECYT (FCT-3-7535), ICE-UIB. P00-2 (R00-) La bicicleta de Krebs, una iniciativa estudiantil para el aprendizaje del metabolismo (y más) Hugo Pineda, Lola Nevado, Sara Bernárdez, Mª Jesús Pacheco, Juan J. Criado, Florencio Palomas, Miguel Ángel Medina Torres 2 Alumnos de la asignatura optativa Bioquímica Metabólica de la Licenciatura en Biología de la Universidad de Málaga en el curso 202-3, Málaga, ES, 2 Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, e IBIMA (Instituto de Biomedicina de Málaga). Unidad 74, CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES Bioquímica Metabólica es una asignatura que se ha ofertado como optativa de segundo ciclo en la Licenciatura de Biología y como asignatura de libre configuración en las Licenciaturas de Química e Ingeniería Química de la Universidad de Málaga durante todos los años de vigencia del último plan de estudios de licenciaturas, actualmente en vías de extinción. Configurada alrededor de tres bloques o unidades temáticas (Regulación integrada del metabolismo, Regulación de los ejes centrales del metabolismo y Metabolismo en acción), la asignatura siempre se ha caracterizado por su sistema de auténtica evaluación continuada, por su flexibilidad y libertad en el desarrollo de sus contenidos y por ofrecer a los alumnos un espacio propio para convertirse en protagonistas corresponsables de la configuración de la asignatura. Ello ha brindado ocasión para el desarrollo de numerosas iniciativas estudiantiles para la enseñanza-aprendizaje del metabolismo perfectamente exportables a otros ámbitos de la docencia universitaria. En este marco de referencia se encuadra La bicicleta de Krebs, una iniciativa alentada por los cinco alumnos que firman esta comunicación y que consiguió la activa participación de más de la mitad de los alumnos inscritos en el curso 202-3 (que fue el que contó con mayor número de matriculados en la asignatura). En palabras de los promotores de esta iniciativa: Quién no ha pensado alguna vez: Qué aburrimiento de clase!? No habrá algún modo de aprender esto de una forma más amena y divertida? Aunque a veces nos hagan creer que no, sí que la hay. La bicicleta de Krebs es un buen ejemplo de que hay respuestas positivas a esta última pregunta. Una respuesta, además, que en este caso ha sido encontrada, creada, desarrollada y llevada a cabo por los propios alumnos. P00-3 (R00-5) Hacia un enfoque evolutivo en la enseñanza de la Bioquímica Juan Antonio Aguilera Mochón Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I. Universidad de Granada, Granada, ES La célebre sentencia de Dobzhansky, nada tiene sentido en Biología si no es a la luz de la Evolución, apenas se aplica, sorprendente y lamentablemente, en la enseñanza de la Bioquímica. Para empezar, hay que hacer ver a los alumnos que lo que existe no es una Bioquímica, sino una enorme diversidad de bioquímicas (que se desarrollan, es cierto, en torno a una unidad muy notable). Nuestros alumnos estudian el ciclo del citrato, el código genético, los mecanismos de control sin plantearse nunca por qué son como son, esto es cómo y por qué surgieron en la evolución? Por ejemplo, por qué el código genético tiene precisamente esos aminoácidos, y no otros, y no más, y sólo de la serie L...? Sin embargo, hay razones para sospechar que el ciclo del citrato pudo empezar funcionando al revés, que el código genético coevolucionó con las rutas de biosíntesis de aminoácidos y se congeló, que no es indiferente desde el punto de vista evolutivo que la inducción o la represión génicas se realicen a través de mecanismos de control positivo o negativo, etc. Un alumno de Bioquímica que no tenga idea de cómo pudo y puede la evolución inventar nuevas actividades enzimáticas y nuevas rutas tiene un entendimiento de corto alcance de la lógica molecular de lo viviente. Para que esa visión sea suficientemente comprensiva, es necesaria, además, una reflexión sobre el problema del origen de la vida. La visión evolutiva (hasta donde nos es posible en la actualidad) de la Bioquímica mejora de manera decisiva la comprensión de la vida. Este enfoque evolutivo se ha aplicado con éxito durante años en la asignatura Bioquímica evolutiva, impartida por el Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular I de la Universidad de Granada. P00m-4 Servicio de Texto Orientado ibiotecsto: multiplataforma interactiva para la docencia de Biotecnología Maximino Manzanera Ruiz, Alberto Vargas 2, Rafael Salto 2, Antonio Suarez 2, Margarita Aguilera, Juan Ignacio Vilchez, Cristina García- Fontana Dept. Microbiología. Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Depto Bioquímica y Biología Molecular II. Universidad de Granada, Granada, ES Proponemos el uso de un libro digital interactivo en formato de multiplataforma para la materia de Biotecnología Farmacéutica que sea accesible a través de tabletas, ordenadores y móviles inteligentes (smartphones). A través de esta propuesta estamos generando un material bibliográfico de actualidad, mediante un sistema que permite una puesta 24

Granada 204 Pósters al día constante de contenidos, gracias a la incorporación rápida y especializada de contenidos de forma constante por parte del profesor. Igualmente consideramos que es especialmente útil para la docencia de esta materia el suministro de información en formato vídeo. Este formato permite una mejor comprensión y asimilación de conceptos por parte del alumnado que en caso contrario pueden ser confusos y llevar a interpretaciones erróneas. Estas interpretaciones erróneas son difíciles de detectar hasta la evaluación de los estudiantes, lo que implica un cierto grado de insatisfacción por parte del alumnado, así como por parte del profesorado en cuanto a la adquisición de conocimientos y competencias del estudiante de esta materia. A través de esta solicitud pretendemos lograr el suministro de herramientas didácticas con los siguientes objetivos: (i) Generar un material bibliográfico en español actualizable en sus contenidos. (ii) Suministrar contenidos digitales tales como vídeos y esquemas animados. (iii) Desarrollar un sistema de autoevaluación continuo por parte del alumnado con actividades para el desarrollo de las competencias propuestas en la Guía Docente de la materia. P00-5 Diseño de clases prácticas de Bioquímica Metabólica: estudio metabólico comparativo de las situaciones de ayuno y alimentación María del Mar Sola Zapata, José Luis Periago Mínguez, Paloma Hortelano de la Lastra Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES En los Grados de Farmacia y NHyD de la UGR, los contenidos docentes de metabolismo se imparten en la asignatura Bioquímica Metabólica con 4,5 ECTS teóricos y,5 ECTS prácticos. Hemos diseñado unas clases prácticas que pretendemos sean formativas y amenas al mismo tiempo. El planteamiento general consiste en desarrollar un estudio comparativo de algunos parámetros bioquímicos en dos situaciones metabólicas claramente diferenciadas, ayuno y alimentación. Se han elegido algunos compuestos y actividades enzimáticas que principalmente se afectan por el ayuno y que ilustran claramente la regulación adaptativa de las rutas metabólicas. Durante cuatro clases presenciales de laboratorio, explicadas por un profesor, se realizan: a) Las determinaciones de las concentraciones (supuestamente séricas) de glucosa, 3-hidroxi-butirato y glicerol mediante espectrofotometría; b) La determinación cualitativa de la concentración sérica de ácidos grasos libres mediante cromatografía en capa fina y c) La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática de la glucosa 6-fosfatasa hepática. Una quinta clase se dedica a la integración metabólica de los resultados obtenidos. El material utilizado como muestra biológica es diferente en cada caso. Tuvimos en consideración que la metodología estuviera adaptada a los aún escasos conocimientos técnicos que los alumnos poseen en ese momento, tratando de impedir así que la complicación metodológica desviara la atención del alumno de los aspectos metabólicos de las prácticas que, creemos, constituyen el principal objetivo de esta asignatura. Estas clases se han impartido durante los últimos tres cursos académicos con un considerable grado de satisfacción de los alumnos y de los profesores del departamento responsables de ellas. P00-6 (R00-4) Utilización de códigos QR en el aprendizaje del sistema endocrino mediante trabajo en grupo y presentación en vídeo Gracia Morales Kucharski, Ana María Sánchez Moral Universidad Europea de Madrid, Villaviciosa de Odón, ES Objetivos: Como objetivo principal se busca que los alumnos sean capaces de adquirir conocimiento sobre el tema propuesto mediante la búsqueda autónoma de información. Pero además se quieren conseguir otros dos objetivos relacionados íntimamente con el anterior:. Desarrollar la capacidad de comunicación del conocimiento adquirido a otros alumnos. 2. Utilización de nuevas tecnologías (códigos QR, vídeos, uso de internet) para comunicar lo aprendido. Se pretende con estos objetivos conseguir que el alumno elabore un pensamiento estructurado y sintético ya que debe ser capaz de explicar a sus compañeros el tema propuesto usando un lenguaje científico pero suficientemente claro. Descripción: Los alumnos se dividen para formar grupos de trabajo. A cada grupo de trabajo se le asignará una glándula del sistema endocrino. Se les facilitan guiones o apuntes que pueden utilizar para guiarse durante la elaboración del tema asignado. Asimismo se les facilita bibliografía que deben consultar para realizar el trabajo. Una vez elaborado el tema deben grabar un vídeo en el que presentan el tema elaborado. La grabación se realiza con un teléfono móvil y las explicaciones pueden realizarse de manera oral ayudándose con diapositivas del tipo power point o con la aplicación o medios que consideren oportunos (dibujos, etc.) El vídeo se cuelga en una web (youtube, moodle, etc.) a la que el resto de grupos puede acceder con una clave, de manera que no esté abierta de modo general. Cada grupo de trabajo se identifica con un código QR. La lectura de este código muestra cuál es el tema que desarrolla este grupo. El tema, a su vez, se identifica con otro código QR. La lectura de este segundo código lleva a una dirección URL (normalmente de youtube) en la que se encuentra el vídeo con la presentación del tema. La exposición de los códigos QR (mediante una impresión de los mismos) se realiza en el aula habitual el día que se determine. La evaluación de los conocimientos adquiridos por los alumnos se realiza mediante una prueba objetiva de tipo test. Además, se pretende que los alumnos dentro de un grupo evalúen el trabajo del resto de componentes del grupo siguiendo una rúbrica. P00-7 Bioquímica Estructural y Metabólica: Un libro adaptado para la docencia de la Bioquímica en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada Alberto M. Vargas Morales, Fermín Sánchez de Medina Contreras Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES Hemos escrito y editado, en octubre de 203, un libro de texto de Bioquímica (Bioquímica Estructural y Metabólica, Ed. Técnica AVICAM, Granada, 203) con el principal objetivo de que sea utilizado como manual de apoyo al estudio por los alumnos de las asignaturas básicas con contenidos bioquímicos, Bioquímica Estructural y Bioquímica Metabólica, de los Grados de Farmacia, Nutrición Humana y Dietética (NHyD) y Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CyTA) de la Universidad de Granada. El libro está dividido en dos partes diferenciadas para ajustarlo a la distribución docente que la Bioquímica tiene en los Planes de Estudios de estos Grados. Nos propusimos la elaboración de este libro como iniciativa de acercamiento docente al alumno que comienza los estudios universitarios, dado que la mayoría de los magníficos textos de Bioquímica con los que contamos no son consultados por los alumnos porque exceden sus requerimientos en contenidos y grado de dificultad. Por esta razón, nuestro planteamiento se basaba en cubrir principalmente los siguientes objetivos: - Abarcar de forma resumida todos los objetivos docentes de Bioquímica de las asignaturas básicas en los Grados de Farmacia, NHyD y CyTA. - Concretar la información imprescindible. - Utilizar un lenguaje asequible adaptado al alumno de los primeros cursos universitarios. - Amenizar el texto con gran número de esquemas e ilustraciones. 25

Pósters XXXVII Congreso SEBBM - Destacar ejemplos y aplicaciones en Farmacia y Nutrición, para lo que se han incorporado Recuadros adicionales al texto. La utilización de este libro durante varios cursos académicos nos permitirá valorar el grado de consecución de nuestros propósitos docentes. P00-8 (R00-3) Proyecto Netbooks Uno a Uno: entrenamiento de docentes de escuelas secundarias de Argentina para el desarrollo y uso efectivo de recursos informáticos en el aula Ayelen Toro, Virginia Revora 2, Pablo Calzadilla 3, Lucía Chemes 4, Silvina Ponce Dawson 5, Cristina Caputo 5, Roberto Gabriel Pozner Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR, 2 IIB- INTECh (CONICET), San Martín, AR, 3 Unidad de Biotecnología, IIB-INTECh (CONICET), Chascomús, AR, 4 Fundación Instituto Leloir, Buenos Aires, AR, 5 Departamento de Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR El Programa Conectar-Igualdad fue creado en Argentina en 200 para reducir las brechas digitales, educativas y sociales en el país y consiste en la adjudicación de netbooks a alumnos y docentes de escuelas secundarias de gestión estatal. El Programa pretende el uso de las netbooks en la escuela y los hogares y se propone lograr una sociedad alfabetizada en las nuevas TIC. Para impulsar un uso efectivo de estas nuevas herramientas digitales se diseñó un curso de capacitación destinado a docentes de escuela media de asignaturas relacionadas con ciencias. El curso consistió en 4 encuentros de 4 horas de duración cada uno, se realizaron tutoriales que incluían diferentes secuencias didácticas diseñadas para usar programas específicos. En el caso de los docentes de Química Biológica, se trabajó con los programas Excel, Image J, Chemsketch y Avogadro. El primer encuentro se enfocó en el uso general de la netbook y se detectó una gran disparidad de saberes en el uso de las PC, dificultando la capacidad de atención de los docentes que tenían habilidades previas. Sin embargo, a lo largo del curso la heterogeneidad del grupo se redujo debido a la complejidad creciente de las aplicaciones. A modo de cierre, los docentes realizaron un trabajo final que consistió en una presentación en modalidad póster de alguna actividad, que cada docente debía desarrollar con sus estudiantes utilizando la netbook. Los trabajos presentados muestran que los objetivos del curso se cumplieron satisfactoriamente, ya que pudieron plasmar sus aprendizajes en el aula y cuáles consideraban que eran las ventajas y desventajas de su uso. En las conclusiones de dichos trabajos la mayoría coincidió en el aspecto positivo de la incorporación de las netbooks en el aula ya que genera entusiasmo en los estudiantes. P00-9 Trabajando competencias docentes mediante el diseño, realización y presentación de un taller de criminología para secundaria y bachillerato Adamo Valle, Pilar Roca, Jordi Oliver Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat de les Illes Balears. Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES Entre las competencias genéricas de los planes de estudio del grado de Bioquímica están la de fomentar el trabajo en equipo, la capacidad organizativa y la expositiva. Dentro del marco del proyecto FECYT Ciencia para todos nos planteamos que los alumnos de la asignatura Métodos y Técnicas en Biología Molecular de tercer curso, diseñasen un Taller de criminología y lo presentasen a alumnos de secundaria y bachiller. El taller debía consistir en un conjunto de experimentos para determinar la identidad de un asesino a partir de las pruebas halladas en una escena del crimen. Las actividades debían de ser sencillas, de bajo coste y que fuesen comprensibles para el público en general. Los alumnos en grupos de 6 bajo supervisión del profesor prepararon el material y las actividades, que se filmaron e implementaron en un blog para poder ser consultadas y utilizadas por profesores de secundaria. Los alumnos plantearon el taller de criminología como un escenario distribuido en tres espacios: la escena del crimen donde se recogían las pruebas (pelo, huellas dactilares, detección de sangre con luminol); el laboratorio de criminología, donde se analizaban las pruebas (grupo sanguíneo, DNA, pelo, etc.) y la pizarra de los sospechosos donde por descarte debían de identificar el asesino. Mediante encuesta se evaluó la opinión de los alumnos que visitaron el taller, así como la de los alumnos de grado que participaron en la actividad. El taller de criminología fue una de las actividades mejor valoradas por los visitantes, y nuestros alumnos reconocieron haber trabajado aspectos relacionados con competencias del grado como el trabajo en equipo, la capacidad organizativa y expositiva. Agradecimientos: alumnos del grado de Bioquímica (BQ3) de la UIB. FECYT, ICE-UIB. P00-0 Análisis del modelo de reparto de tareas en un trabajo en grupo reglado (TEG-R) para alumnos de Genética de primer curso de Grado de Biología Oscar de Luis Área de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón (Madrid), ES En 200 se presentó una adaptación del Aprendizaje Basado en Problemas para la evaluación continua de la asignatura de Genética del Grado de Biología de la U. Rey Juan Carlos. La actividad consiste en la elaboración, por parte de un grupo de trabajo, de una memoria escrita consistente en un resumen analítico y un análisis crítico de un artículo científico publicado en inglés, en revista con índice JCR. La defensa en público de la memoria por parte de todos los componentes del grupo es obligatoria. Esta herramienta ha sido perfeccionada para profundizar en la evaluación, calificación y adquisición por el alumnado de las competencias generales de la asignatura. Con los datos del período 2009-203 se valoró en un reciente estudio la adecuación de esta actividad. Sin embargo, no se contempló determinar si el modelo de organización interna libremente elegido por cada grupo de trabajo puede ser o no determinante a la hora de alcanzar las competencias propuestas y una calificación adecuada. Con los datos del período 20-204 se han detectado tres tipos principales de organización interna: una dinámica grupal cohesionada donde todos los componentes del equipo trabajan globalmente, una dinámica de reparto de tareas por partes temáticas reconocibles de corte más individualista, y una dinámica de reparto de tareas por fragmentos no temáticos de la carga de trabajo. Cabría esperar que a mayor cohesión interna en el grupo de trabajo los resultados fueran mejores por que se alcanzan mejor todas las competencias por parte de cada miembro del equipo, pero si establecemos como criterio de eficiencia obtener una calificación superior a la media del curso se observa que el modelo de reparto temático de tareas permite la máxima eficiencia en la calificación. Estos datos preliminares permiten proponer una relación entre el esfuerzo y el rendimiento en cada tipo de organización. Se propone también modificar el protocolo de seguimiento del profesor y el cuestionario de autovaloración obligatorio de los alumnos para obtener datos más precisos con los que contrastar la hipótesis esfuerzorendimiento. 26

Granada 204 Pósters P00- Oportunidades de formación en biomedicina y biotecnología a nivel europeo: el Curso Towards a Scientific Career: an Introductory Course for Research in Biomedicine and Biotechnology - BIOMED-TECH Inmacualda Llamas Company, María Dolores González Girón 2, Fernando Hernández-Mateo 3, Rafael Salto González 2 Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 3 Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES Los programas intensivos Erasmus han ofrecido hasta ahora la oportunidad de desarrollar actividades de formación en campos concretos. Nosotros hemos aprovechado este marco para realizar dos ediciones de un curso que tiene el objetivo principal de dirigir alumnos hacia una carrera profesional en el ámbito de la investigación en Biomedicina y Biotecnología. Para ello, en las diferentes ediciones del programa hemos seleccionado alumnos de las Universidades de Granada (España), Universidad de Nottingham (Reino Unido), Universidad de Bayreuth (Alemania) y Universidad de Nova Lisboa (Portugal), que han convivido durante 2 semanas y que han recibido un programa intensivo de orientación y formación en el área de Biomedicina y Biotecnología. El programa se ha estructurado mediante una serie de mesas redondas con charlas impartidas por profesores procedentes de las 4 universidades implicadas y figuras relevantes en el área de conocimiento. Además se han realizado visitas a empresas del área y así, como empresas agregadas al proyecto, han participado Abbott Laboratories S.A., Bio- Iliberis R&D, Neuron Bio y la Fundación MEDINA. La formación de los alumnos se ha completado con la realización de talleres prácticos sobre quorum sensing, síntesis de neoglicoproteínas, bioinformática y mutagénesis sitio específica de proteínas. Los profesores del curso han tutorado a los alumnos y los han asesorado en cómo orientar su actividad profesional hacia la investigación en Biomedicina y/o Biotecnología, conocer aspectos prácticos de la carrera científica académica y en la industria, analizar los perfiles científicos profesionales y establecer una red inicial de contactos en instituciones públicas así como en la industria. El hecho de que se hayan seleccionado alumnos de último curso de grado, de master y alumnos de doctorado ha posibilitado establecer un proceso de mentorización entre ellos. Otros resultados alcanzados, en este caso para el profesorado ha sido el facilitar la cooperación entre universidades y con la industria y establecer procedimientos docentes para la motivación del alumnado hacia la investigación como salida profesional. Actividad financiada por el Organismo Autónomo de Programas Educativos Europeos (OAPEE) 202--ES-ERA0-0083 y 203--ES- ERA0-74542, El Vicerrectorado de Relaciones Internacionales y el Campus de Excelencia CEI-BIOTIC de la Universidad de Granada. P00-2 La Bio(Química) en la vida cotidiana: método para estimular el interés de los estudiantes Rafael Salto González, Luisa Carlota López Cara 2, María del Mar Sola Zapata, Alberto Manuel Vargas Morales, María Dolores Girón González Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES Divulgar de forma atractiva la ciencia y hacerla asequible a todos los públicos no siempre es fácil, especialmente si el área de conocimiento tiene una cierta complejidad, lo que hace que sea difícil de comprender para el estudiante. Tal es el caso de asignaturas como Bioquímica Estructural, Bioquímica Metabólica y Química Orgánica I y II. Todas están situadas en el primer y segundo curso de los Grados que se imparten en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada. Pensamos que las competencias adquiridas por los alumnos en su etapa preuniversitaria no siempre son las más apropiadas o no son suficientes para obtener el rendimiento adecuado en estas asignaturas. Nuestra misión como profesores es que el alumno adquiera las competencias específicas de nuestras asignaturas de la manera más asequible y dinámica utilizando todos los recursos que estén a nuestra disposición. Las técnicas y herramientas empleadas para despertar el interés y motivar a los estudiantes son numerosas. Cuando durante la docencia de una asignatura, le indicamos al estudiante direcciones de internet donde pueden consultar modelos tridimensionales o vídeos de técnicas de biología molecular entre otros, comprobamos que despiertan más interés que un libro de consulta o divulgativo como La doble hélice de James D. Watson donde se narran de forma dinámica los experimentos que llevaron a la dilucidación de la estructura del DNA. Una forma amena y divertida para introducir el conocimiento en las aulas es referirnos al cine, a la televisión o a los periódicos para ilustrar con ejemplos ciertos aspectos de la asignatura. Las películas y series de gran audiencia ofrecen contextos donde situados los conceptos químicos y bioquímicos nos permiten mostrar a los estudiantes la realidad o la ficción de ejemplos más o menos cotidianos que están acostumbrados a ver pero que no han terminado de asimilar. Los profesores que presentan esta propuesta saben por experiencia, que ciertos procesos químicos y bioquímicos siempre son recordados por los alumnos cuando recurrimos a casos de la vida cotidiana o del cine y televisión. Durante el primer año de implantación se ha aumentado en un 20% el rendimiento académico de los alumnos. Proyecto 203-80. Vicerrectorado de Ordenación Académica y Profesorado. Secretariado de Innovación Docente. Universidad de Granada. P0. Apoptosis P0- Investigating the membrane topology of BAX/BAK and the role of mitochondrial membrane lipids in BAX/BAK activation Héctor Flores Romero, Juan García-Valero, Ane Landajuela, Olatz Landeta, Itsasne Bustillo, Miguel García-Porras, Oihana Terrrones, Gorka Basañez Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES Mitochondrial outer membrane (MOM) permeabilization is the point of no return in many forms of apoptotic cell death. The lethal effect of MOM permeabilization is twofold, as it allows activation of pro-apoptotic caspase enzymes and also damages normal mitochondrial function. The BCL-2 family members BAX/BAK are crucial effectors of MOM permeabilization that adopt inactive conformations in healthy cells. It is well established that functional BAX/BAK activation is a complicated process, involving profound conformational changes in these proteins, and culminating with assembly of a protein-permeable pore in the MOM. However, our current structural knowledge of BAX/BAK primarily originates from studies with the protein in solution, although the active locus of these proteins is at the MOM. In addition, increasing evidence indicates that selected MOMlocalized lipids modulate the BAX/BAK-driven MOM permeabilization pathway during apoptosis.given the inherent complexity of the cellular apoptotic network, we use in vitro reconstituted systems bearing physiological relevance to try elucidating the membrane topology of BAX/ BAK, and their functional modulation by apoptosis-related lipid effectors. 27

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P0-2 (R0-3) Cathepsin D promotes the cleavage of PARP- mediated by inactivation of BRCA in MCF-7 cells Juan M. Esteve, Ghita Ghislat 2, Erwin Knecht 2 Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad CEU Cardenal Herrera, Castellón de la Plana, ES, 2 Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES The breast cancer type susceptibility protein (BRCA) is a tumor suppressor involved in the maintenance of genetic stability in response to DNA damage, due to the control of cell cycle progression and activation of DNA repair pathways. Cells with BRCA mutations manifest DNA synthetic lethality and apoptosis after pharmacological inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase- (PARP-), a nuclear enzyme that contributes to the resolution of DNA breaks. Hence, PARP- inhibitors represent a potential novel strategy for the treatment of BRCA-mutated malignancies. Our study demonstrates that the silencing of BRCA activates the cleavage of PARP-, and slows the cell cycle since it increases the percentage of cells in G phase and reduces that in the S + G 2 /M phase of the cell cycle. In relation to the mechanism of PARP- fragmentation, it has been shown that caspases-3 and -7 cleave and, consequently, inactivate PARP- and DNA repair, thereby contributing to apoptotic cell death. However, in MCF-7 cells silenced for BRCA, we show that the PARP- cleavage was not accomplished by caspases-3 and -7. What type of proteases could then be responsible for cleavage of PARP-? The fact that lysosomal proteases, cathepsins, can be released from lysosome and function in the cytosol to regulate apoptosis, and that BRCA decreases the 52 kda form of cathepsin D (CD), suggest a potential role of CD on PARP- cleavage. In this sense, we found that levels of three forms of CD (procathepsin D, the 52 kda form which leaves the Golgi apparatus and is targeted to lysosomes (and also to secretion in cancer cells); a lysosomal enzymatically-active intermediate of 48 kda; and a lysosomal active mature form of 34 kda) were increased in BRCA-silenced MCF-7 cells, but mainly precursor and intermediate forms. Furthermore, we also observed that BRCA silencing enhances CD mrna levels, and our preliminary results suggest no changes in relation to the rate of the intracellular degradation of CD protein, leading to the conclusion that BRCA inactivation increases CD levels mainly by the control of its synthesis and not of its degradation. Finally, we demonstrate that the cleavage of PARP- and cell cycle slowing mediated by silencing of BRCA are dependent on CD in MCF-7 cells, and this PARP- fragmentation is accomplished by the catalytic activity of CD. In summary then, tumor suppressor protein BRCA inhibits PARP- cleavage and negatively regulates CD synthesis in MCF-7 cells, and this PARP- cleavage is positively regulated by CD. Our results provide new data for understanding the molecular and cellular mechanisms by which BRCA is involved in DNA repair, as well as to explain how PARP- inhibitors trigger apoptosis in BRCA-mutated cells. P0r-3 Does sulforaphane protect against MPP+/PQ oxidative stress effect in mouse embryonic fibroblasts through the activation of Nrf2/Keap pathway? Elisa Pizarro Estrella, J.M. Bravo San Pedro 2, R. Gómez Sánchez 3, S.M.S. Yakhine-Diop, M. Rodriguez-Arribas, R.A. González-Polo, J.M. Fuentes Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, 2 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y BIología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura. Cáceres, ES. IMSERM, U848, Institut Gustave Roussy, Université Paris Sud, Villejuif, Paris, FR, 3 Department of Cell Biology, Center for Molecular Medicine, University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL Several studies have demonstrated the ability of Nrf2 transcription factor to control the cytoprotective adaptive response in the brain using PD models. In this sense, brain samples from animals with neurodegeneration by oxidative stress have shown that increased nuclear Nrf2 may have a protective effect on dopaminergic neurons in the SNpc, and on the other hand, in MEFs it is has been observed the induction of antioxidant defenses from this pathway after exposure to inducing agents. The chemical characteristics of the agents which have the ability to interact with the Nrf2/ Keap pathway show differences from each other in the chemical structure or how to interact (directly or indirectly) with the pathway. Sulforaphane (SFN) is a naturally isothiocyanate presents in cruciferous plants. This substance shows in its structure a highly electrophilic central carbon (-N = C = S) which can easily react with the sulfhydryl groups of Keap to form dithiocarbamates, so in this fact lies its ability to promote the translocation of the transcription factor Nrf2 to the nucleus. However, it has been found that this substance can play a dual role, as a chemotherapeutic agent or as a promoter of antioxidant defenses. Based on this powerful cellular defense of Nrf2 factor against oxidative stress and based on the chemical features offered by SFN, the aim of this work was to determine whether the activation of this axis exerted a protective effect or not against MEFs induced PQ and MPP + cytotoxicity and on the other way, if that substance could modulate another celular processes such as autophagy, apoptosis or acetylation, thinking that this model could be used to elucidate the Nrf2 potential role as a molecular therapeutic target value. This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR0054); Instituto de Salud Carlos III (PI/00040, PI2/02280 and CB06/05/004). M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad de Extremadura. R.G-S. was supported by a FPU predoctoral fellowship (Ministerio de Educación, Spain), E.P-E. was supported by a predoctoral fellowship (CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P. was supported by a Miguel Servet research contract (Instituto de Salud Carlos III, Spain). P0-4 IfDotMeter : a new tool for immunofluorescence analysis Mario Rodríguez Arribas, Elisa Pizarro Estrella, Rubén Gómez Sánchez 2, Sokhna Maryama Seidina Yakhine Diop, Alejandro Cristo 3, Antonio Grajera Hidalgo 4, José Manuel Bravo San Pedro 5, José Manuel Fuentes Rodríguez, Rosa Ana González Polo Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, 2 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Department of Cell Biology, Center for Molecular Medicine, University Medical Center, Utrecht, NL, 3 IEEE Aerospace and Electronic Systems. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, 4 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, 5 Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). INSERM, U848, Institut Gustave Roussy, Université Paris Sud, Villejuif, Paris, FR Most of laboratories interested in autophagy use different imaging software for managing and analyzing heterogeneous parameters from immunofluorescence experiments (LC3-puncta quantification and determination of number and size of lysosomes, among others). In this sense, one helpful solution would be some software working in user s 28

Granada 204 Pósters laptop or workstation able to access to all image settings and provide a quick and easy-to-use analysis of these data. For this reason, we have designed an application called IFDOTMETER which runs on the major operating systems because it has been programmed using Java (Sun Microsystems) as the computer platform. Briefly, IFDOTMETER software has been created to quantify a variety of biological hallmarks, including mitochondrial morphology, nuclear condensation, cell area, quantification of number or size of different puncta staining and so on. Once specific parameters have been defined, IFDOTMETER allows you to analyze a large number of images in an objective and automatic way, without the supervision of researcher. Results obtained are stored in a spreadsheet. Thus, researchers can perform a comprehensive and precise analysis of a high number of images in an automated manner, making easier than before this routine chore. Here we will show results obtained with IFDOTMETER applying different treatments and staining in different cell lines to demonstrate that this new tool would be useful to the scientific community because of both being more objective and saving time. This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR0054); Instituto de Salud Carlos III (PI/00040, PI2/02280 and CB06/05/004). M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad de Extremadura. E.P-E. was supported by a predoctoral fellowship (CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P. was supported by a Miguel Servet research contract (Instituto de Salud Carlos III, Spain). Authors thank FUNDESALUD for providing helpful assistance. P0-5 Nuevas funciones génicas en apoptosis y autofagia celular identificadas mediante genómica funcional Felipe Xosé Pimentel Muiños Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC). CSIC-Universidad de Salamanca, Salamanca, ES Previamente en el laboratorio hemos diseñado un sistema de alto rendimiento para identificar funcionalmente moléculas capaces de inducir diferentes modalidades de muerte celular al ser sobreexpresadas. Este abordaje se basa en el uso de sistemas robóticos que facilitan el manejo sistemático de genotecas de cdna clonadas en vectores de expresión, y en la transfección de los clones en células susceptibles y en combinación con GFP. Tras el escrutinio de 35.000 clones de una genoteca humana, hemos identificado un total de 90 elementos genéticos cuya expresión induce muerte celular. De forma interesante, aunque la mayoría son capaces de provocar muerte celular apoptótica, otros inducen formas de muerte celular morfológicamente atípica, diferentes de la apoptosis. Dentro de los clones apoptóticos hemos identificado el transportador mitocondrial de fosfato, y trabajo adicional demostró que esta molécula forma parte del poro de transición de permeabilidad que media la liberación de citocromo c y la activación de las caspasas en algunos paradigmas de apoptosis. Por otro lado, dentro de los clones atípicos hemos descubierto una nueva proteína transmembrana denominada TMEM59. Estudios adicionales indicaron que esta molécula induce un fenómeno atípico de autofagia celular implicado en defensa contra agentes infecciosos, y no parece tener un papel fisiológico en muerte celular. Por tanto, a través de un sistema no sesgado de identificación funcional hemos podido adscribir funciones celulares nuevas, bien a genes conocidos que previamente no se habían implicado en una determinada función (transportador de fosfato), o a genes nuevos cuya función fisiológica se desconocía por completo (TMEM59), demostrando el potencial de este tipo de aproximaciones para anotar funcionalmente el genoma. P0-6 Apoptotic efficacy of etomoxir in HL60 human acute myeloid leukemia cells. Cooperation with arsenic trioxide and glycolytic inhibitors, and regulation by oxidative stress and protein kinase activities María Cristina Estañ Omaña, Eva Calviño Vanegas, Susana Calvo Alonso, María del Carmen Boyano-Adánez 2, Elena de Blas, Eduardo Rial, Patricio Aller Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 2 Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES Fatty acid synthesis and metabolism are frequently exacerbated in leukemia cells, and may therefore represent a target for therapeutic intervention. Therefore, we analyzed the pro-apoptotic and chemosensitizing action of the fatty acid oxidation inhibitor etomoxir (Eto) in HL60 human acute myeloid leukemia cells. Etomoxir caused negligible lethality at concentrations up to 00 μm, but greatly potentiated apoptosis induction by the anti-leukemic agent arsenic trioxide (ATO) and, with lower efficacy, by other anti-tumour drugs (etoposide, cisplatin). Etomoxir dose-dependently inhibited mitochondrial respiration while stimulating glycolysis, but caused minimal alterations in intracellular nucleotide pools (ATP, ADP, AMP). In addition, etomoxir caused moderate oxidative stress and stimulated the LKB-/AMPK pathway, all of which might in part explain the chemo-sensitizing capacity of the drug with ATO. Etomoxir also cooperated with the glycolytic inhibitor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) to induce apoptosis, and the combined etomoxir/2-dg treatment stimulated Akt and ERK phosphorylation/activation. Apoptosis generation by etomoxir plus 2-deoxy-D-glucose was further increased by co-treatment with ATO, a response apparently explained by the capacity of ATO to prevent defensive Akt and ERK activation. In summary, co-treatment with etomoxir may represent an interesting strategy to increase the cytoreductive efficacy of ATO and 2-deoxy-D-glucose, as well as of etomoxir itself which, although clinically important anti-tumour agents, exhibit limited efficacy in monotherapy. P0-7 Mecanismos involucrados en el efecto antiapoptótico de leptina en placenta humana a término Ayelen Rayen Toro, Antonio Pérez Pérez 2, Victor Sanchez Margalet 2, Bernardo Maskin 3, Cecilia Varone IQUIBICEN - Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autonoma de Buenos Aires, AR, 2 Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 3 Hospital Nacional Profesor A. Posadas, Buenos Aires, AR Durante la implantación embrionaria se genera un diálogo materno fetal que involucra la acción de múltiples reguladores, siendo uno de ellos la leptina. Esta proteína de 6 kda fue descubierta en tejido adiposo con la función de regular el balance energético del organismo. También se expresa en placenta humana donde podría tener efectos sobre el crecimiento, la supervivencia, la angiogénesis y la inmunomodulación placentaria. Resultados previos de nuestro grupo demostraron que la leptina aumenta la proliferación celular y supervivencia en células placentarias. El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la leptina sobre la apoptosis de células placentarias.se utilizaron como modelos de trabajo explantos placentarios a término, los cuales se obtuvieron del tejido trofoblástico de placentas humanas derivadas de partos vaginales normales. Los explantos fueron incubados en DMEM-F2 sin SFB durante 24h para inducir la muerte celular, como control se incubaron los explantos en DMEM-F2 con SFB al 0%. Por Western Blot y qrt-pcr se analizó la expresión de distintas proteinas involucradas en el proceso de apoptosis, y se evaluó la fragmentación del DNA. 29

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Encontramos que en presencia de leptina disminuye la proteina p53 y su isoforma fosforilada en Ser46, indicadora de activación de la vía apoptótica. También evaluamos el efecto de leptina sobre mediadores pro y antiapoptóticos. Hallamos que leptina disminuye la expresión de Bax y Bid, y genera un aumento en la expresión de Bcl-2. Asimismo, el tratamiento con leptina disminuye la activación de Caspasa-3. Comprobamos dicho efecto analizando el fragmento clivado de PARP-, el cual disminuye en presencia de leptina. Confirmamos el efecto antiapoptótico de leptina, estudiando la fragmentación del DNA, la cual disminuye con el tratamiento con leptina. Todos estos resultados refuerzan la noción de la leptina como una importante citoquina placentaria, con la función de promover la supervivencia de las células trofoblásticas. P0-8 (R0-4) Lack of oligonucleosomal DNA degradation during caspase-dependent cell death is a common trait of human glioblastoma multiformederived cells due to improper activation of DFF40/CAD María Sánchez Osuna, Fina Martinez-Soler 2, Sònia Pascual-Guiral, Mercè Garcia-Belinchón, Victoria Iglesias-Guimarais, Elisenda Casanelles, Gerard Plans 3, Jordi Bruna 3, Avelina Tortosa 3, Victor J. Yuste Cell Death, Senescence and Survival Group, Dept. Bioquímica i Biologia Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, UAB - Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Barcelona, ES, 2 Department of Basic Nursing, Institut d Investigació Biomèdica de Bellvitge-Universitat de Barcelona, Barcelona, AF, 3 Unit of Neuro-Oncology, Services of Neurology and Neurosurgery, Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona, ES Apoptosis is a tightly regulated process characterized by oligonucleosomal DNA degradation and nuclear fragmentation. These apoptotic hallmarks appear when the Caspase-activated DNase (DFF40/CAD) becomes activated. Here, we show different human glioblastoma multiformederived (hgbm) cells in which caspase-dependent cell death occurs in the absence of oligonucleosomal DNA degradation. After apoptotic stimuli, hgbm-derived cells activate the executioner caspases, thus processing and inhibiting ICAD, the inhibitor of DFF40/CAD. However, injured cells do not hydrolyze their DNA into oligonucleosome-sized pieces. Moreover, most injured hgbm cells display heterogeneous nuclear alterations characterized by highly compacted chromatin, in the absence of the classical apoptotic nuclear fragmentation. Both in vivo and in vitro approaches demonstrate that higher levels of DFF40/CAD endonuclease make hgbm cells competent to undergo oligonucleosomal DNA degradation after apoptotic stimuli. Intriguingly, the overexpression of DFF40/CAD does not alter the nuclear morphology observed in apoptotic wild type hgbm cells. Altogether, these data highlight a new apoptotic paradigm where nuclear alterations are DFF40/CAD-independent despite proper caspase activation. This is the first time reporting a common trait in hgbm cells which may be taken into consideration to design effective chemotherapy to target these extremely aggressive tumors. Work supported by Ministerio de Economía y Competitividad, European Regional Development Fund (ERDF) Grant SAF202-3485 and Generalitat de Catalunya Grant 2009SGR-346. S-O, M. holds an FPU fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN). P0r-9 Mitochondrial pathway mediators as pharmacological targets to improve cisplatin therapeutic utility Laura Prieto García, Sandra Sancho Martínez, José Miguel López Novoa, Francisco López Hernández 2 Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL) y Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca, Salamanca, ES, 2 Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL), Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca e Instituto de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León (IECSCYL), Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Cisplatin is a chemotherapeutic drug widely used against a variety of cancers. Its clinical utility is limited by its side effects, result of cisplatin action in normal cells. Cisplatin toxicity is determined by target tissue and cell accumulation, subcellular handling and trafficking through diverse subcellular structures. This drug causes cell death both by apoptosis and necrosis linked to cisplatin concentration. For a better control of cisplatin s side effects, pathways leading to activation of both types of cell death need to be clarified in order to identify suitable pharmacological targets and implement appropriate treatments with a theranostic approach. The aim of this work is to establish a hierarchy in cisplatin cytotoxic mechanisms and to clarify the role of the mitochondrial pathway in this process. We used cultured human lymphoma (Jurkat T cells) to investigate the biochemical and phenotypic characteristics of the death mode induced by increasing concentrations of cisplatin. For this purpose the cells were treated for 4, 8, 2 and 8 hours with different concentrations of cisplatin (0-000 microm). In order to put in perspective the main pathways of cell death induced by cisplatin we used different stable trasfectants of Jurkat cells in which main mitochondrial pathway proteins were modified, such as Jurkat Bcl-2 (which presents overexpression of an antiapoptotic protein Bcl-2), Jurkat C9DN (which presents overexpression of a catalytically inactive form of caspase 9) and their control carrying the empty vector (pcdna3.0). Our results indicate that concentrations of cisplatin inducing a necrotic-like cell death mode are capable of activating the apoptotic machinery. We demonstrate that caspase 9 activity and antiapoptotic Bcl- 2 protein play a critical role in the cytotoxicity mechanism induced by cisplatin, accordingly with the increase in the viability and reduction in the apoptotic proteins expression. This knowledge may allow us to develop drugs that block cisplatin-induced apoptosis and minimize cisplatininduced necrosis. P0-0 (R0-7) Familial Parkinsonism with G209S LRRK2 mutation displays a susceptibility to the MPP + neurotoxin by an mtor-dependent autophagy Sokhna M.S. Yakhine Diop, José Manuel Bravo-San Pedro 2, Rubén Gómez-Sánchez 3, Elisa Pizarro-Estrella, Mario Rodríguez-Arribas, Ana Gómez-Martin 4, Ana Aiastui 5, Ana Gorostidi 5, Adolfo López de Munain 6, José Manuel Fuentes-Rodríguez, Rosa Ana González-Polo Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Caceres, ES, 2 Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Cáceres, ES. INSERM, U848. Institut Gustave Roussy. Université Paris Sud, Villejuif, Paris, FR, 3 Centro de Investigación Biomédica 30

Granada 204 Pósters en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, F. Enfermería y T.O., Universidad de Extremadura, Cáceres, ES. Department of Cell Biology, Center for Molecular Medicine, University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL, 4 Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departemento de Enfermería, Centro Universitario Plasencia, Universidad de Extremadura, Plasencia, ES, 5 Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture Plataform/Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia Institute, Donostia Universitary Hospital, San Sebastián, ES, 6 Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture Plataform/ Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia Institute, Donostia Universitary Hospital. Department of Neurology, Hospital Donostia. Ilundain Fundazioa, Department of Neurosciences, University of the Basque Country UPV-EHU, San Sebastián, ES Parkinson s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by mitochondrial dysfunction, oxidative stress and later neuronal death. Several genetics and environmental factors have been implicated in the pathogenesis of PD. MPP + is a neurotoxin widely used to induce parkinsonian cellular model, it is responsible for cellular damage at different levels, apoptotic death, depletion of mitochondrial potential membrane and deregulation of cellular recycling machinery. In this study, we characterized the MPP + -induced toxicity in fibroblasts from PD patients with G209S LRRK2 and control individuals without this mutation. Obtained results show that MPP + induces a mtor-dependent autophagy in both fibroblasts cells. Further, cell death to MPP + was higher in mutant fibroblasts which exhibited a basal level of mtor-independent autophagy due to the G209S LRRK2 mutation. Inhibition of autophagosome-lysosome fusion by Bafilomycin A exacerbated the response to MPP + exposure in both cell lines, but inhibition of early state autophagy by 3-methyladenine lessened this difference between both cell types. This finding confirms the important implication of the interaction of genetics and environmental factors in the PD etiology and may help to get a better understanding in the pathogenic mechanism of this disease. This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR0054); Instituto de Salud Carlos III (PI/00040, PI2/02280 and CB06/05/004). RA.G-P. was supported by a Miguel Servet research contract (Instituto de Salud Carlos III, Spain). A.A. was supported by ISCIII (CA00/0506; Ministerio de Economia y Competitividad) and Instituto Biodonostia and A.G was supported by the Ilundain Fundazioa. A.L.M. received research support by the Association Francaise contre les Myopathies (Ref. 2642), the Spanish Ministry of Health (FIS PS09-00660), the Ilundain Foundation, Isabel Gemio Foundation, Diputacion Foral de Gipuzkoa (DFG09/00), and SAIOTEK (SAIO2-PE2BN008). RAG-P received research support from Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain (PI/00040). JM. F received research support from the Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain, CIBERNED (CB06/05/004), Consejería, Economía, Comercio e Innovación Junta de Extremadura (GRU0054), Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain (PI2/02280). The authors also thank FUNDESALUD for helpful assistance. P0r- (R0-6) 2-phenylethynesulfonamide (PES) uncovers a non-necroptotic necrotic cell death regulated by oxidative stress and p53 Paolo Mattiolo, Ares Barbero-Farran, Víctor José Yuste 2, Jacint Boix, Judit Ribas Fortuny Departament de Medicina Experimental, Universitat de Lleida, Lleida, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, UAB, Campus de Bellaterra, ES 2-phenylethynesulfonamide (PES) or pifithrin-μ is a promising anticancer agent with preferential toxicity for cancer cells. The type of cell death and the molecular cascades activated by this compound are controversial. Here, we demonstrate PES elicits a caspase- and BAX/BAK-independent nonnecroptotic necrotic cell death, since it is not inhibited by Necrostatin-. This process is characterized by an early generation of reactive oxygen species (ROS) resulting in p53 up-regulation. Accordingly, thiolic antioxidants protect cells from PES-induced death. Furthermore, inhibiting the natural sources of glutathione with L-buthionine-sulfoximine (BSO) strongly synergizes with PES in triggering cytotoxicity. Genetically modified p53-null or p53 knocked-down cells show resistance to PESdriven necrosis. The predominant localization of p53 in chromatinenriched fractions added to the up-regulation of the p53-responsive gene p2, strongly suggest the involvement of a transcription-dependent p53 program. On the other hand, we report an augmented production of ROS in p53-positive cells that, added to the increased p53 content in response to PES-elicited ROS, suggests that p53 and ROS are mutually regulated in response to PES. In sum, p53 up-regulation by ROS triggers a positive feedback loop responsible of further increasing ROS production and reinforcing PES-driven non-necroptotic necrosis. P0-2 (R0-2) Influencia de FBWX7 en la adquisición de resistencia a paclitaxel en cáncer de mama Jessica Gasca Bellido, Rainiero Ávila Polo 2, Mª Luz Flores de Mera, Servando Giráldez 3, María Tortolero 3, Francisco Romero 3, Miguel A. Japón Rodríguez 4, Carmen Sáez Torres 4 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Rota, ES, 2 Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES, 3 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, Sevilla, ES, 4 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla y Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES Paclitaxel es un fármaco antimitótico que pertenece al grupo de los taxanos que se emplea en el tratamiento del cáncer metastásico de mama, aunque su utilidad es limitada debido a la aparición de resistencia a esta sustancia. La relación entre la parada de mitosis inducida por paclitaxel y la posterior supervivencia (o muerte) de la célula no se conoce completamente, aunque diversos estudios indican que podría estar implicado el sistema ubicuitina/ proteasoma (UPS) que controla el ciclo celular mediante degradación de diversos reguladores del ciclo. FBXW7 forma parte del complejo de la ubicuitín ligasa SCF FBXW7 y es responsable de la unión a los sustratos. Esta ligasa ubicuitina para su posterior degradación a oncoproteínas como c-myc, Ciclina E, Notch, c-jun y Mcl, entre otras. Se han encontrado mutaciones o pérdida de función de FBXW7 en numerosos cánceres, por lo que se considera generalmente que FBXW7 es un supresor tumoral. En este trabajo hemos evaluado el posible papel de FBXW7 en la adquisición de resistencia a taxanos en el cáncer de mama. Estudiamos los niveles de expresión de FBXW7 y de los sustratos Aurora A, Ciclina E y Mcl mediante análisis inmunohistoquímico en algunas líneas celulares y en 380 cánceres de mama observando que la disminución de expresión de FBXW7 se correlaciona estadísticamente con un aumento en la expresión de los sustratos estudiados, así como con el grado tumoral más agresivo. También estudiamos el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión en algunas líneas celulares confirmando la influencia de FBXW7 sobre los sustratos mencionados y su efecto en la muerte por apoptosis tras tratamiento con paclitaxel. Además, la sobreexpresión de FBXW7 en una línea celular resistente a paclitaxel derivada de células MDA-MB-468 provocó un aumento de la muerte celular y una clara disminución de la proteína anti-apoptótica Mcl tras el tratamiento con paclitaxel. Por lo tanto, nuestros datos parecen indicar que FBXW7 podría influir en la adquisición de la resistencia a taxanos principalmente a través de su papel en la regulación de Mcl. 3

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P0-3 (R0-5) La 2-deoxiglucosa y la privación de glucosa inducen diferentes formas de muerte celular Clara Lucía León-Annicchiarico, Silvia Ramírez-Peinado, Raffaella Iurlaro, Cristina Muñoz-Pinedo Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge IDIBELL, Barcelona, ES La 2-deoxiglucosa (2DG) es un medicamento ampliamente utilizado en la investigación básica y actualmente en ensayos clínicos como un inhibidor de la glicólisis, eficaz como agente antitumoral frente a tumores sólidos. Debido al efecto de la 2DG en ruta de la glicólisis, el principal efecto que se le atribuye es privar a las células de ATP. No obstante, hemos visto que el efecto tóxico está mediado por el estrés del Retículo Endoplasmático más que por el estrés bioenergético. Estudiamos los efectos de la inhibición de la glicólisis inducida por la 2DG y por la privación de glucosa en diferentes líneas celulares de sarcomas y observamos que ambos tratamientos promueven diferentes formas de muerte celular. En la línea celular de rabdomiosarcoma Rh4, ambos estímulos inducen estrés del retículo endoplasmático y en ambos casos el sirna de ATF4, una proteína involucrada en el estrés reticular, protege de la muerte celular. Además, ambos estímulos regulan de forma similar la expresión de Noxa y de las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2; especialmente con bajada de Mcl-. Sin embargo, la 2DG y la privación de glucosa promueven formas de muerte celular diferentes; la muerte celular por 2DG pudo ser prevenida por inhibidores de caspasas, mientras que la privación de glucosa indujo muerte celular independiente de caspasas. Éste tipo de necrosis no fue consecuencia de una caída en el ATP, sugiriendo un papel para una necrosis programada o necroptosis. Sin embargo, la necrostatina- o los antioxidantes no redujeron la muerte celular. Por el contrario, la Ciclosporina A, inhibidor del poro de transición de permeabilidad mitocondrial, protegió de la muerte inducida por la privación de glucosa. Por otro lado, encontramos que sólo las líneas celulares derivadas de los rabdomiosarcomas, fueron sensibles a la 2DG y a la privación de glucosa, mientras que líneas celulares de liposarcomas o leiomiosarcomas son sensibles a la falta de glucosa pero no a la 2DG. Nuestros resultados indican que el tratamiento con la 2DG no es análogo a la privación de glucosa y que la 2DG podría ser eficaz en el tratamiento de rabdomiosarcomas. P0r-4 (R0-8) Dissecting the molecular mechanism of cell death in transformed cells during photothermal therapy using gold nanoprisms Marta Pérez Hernández, Pablo del Pino 2, Scott G. Mitchell 3, Beatriz Pelaz 4, Eva M. Gálvez 5, Jesús M. de la Fuente 6, Julián Pardo 7 Instituto Universitario de Nanociencia de Aragón (INA), Universidad de Zaragoza. Aragon Health Research Institute (IIS Aragón), Edificio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon (CIBA), Zaragoza, ES, 2 Instituto Universitario de Nanociencia de Aragón (INA), Universidad de Zaragoza. Fundación Araid, Zaragoza, ES, 3 Instituto Universitario de Nanociencia de Aragon (INA), Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 4 Instituto de Nanociencia de Aragón, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 5 Instituto de Carboquímica, CSIC, Zaragoza, ES, 6 Instituto de Nanociencia de Aragón, Universidad de Zaragoza Fundación Araid, Zaragoza, ES, 7 Instituto de Nanociencia de Aragón, Universidad de Zaragoza. Fundación Araid. Aragon Health Research Institute (IIS Aragon), Edificio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon (CIBA), Zaragoza, ES Gold nanoparticles (NPs) are promising vehicles to specifically deliver drugs to cancer cells and in addition to their use in drug targeting, gold NPs can be used as heaters during photothermal therapy of solid carcinomas using near-infrared (NIR) laser light.[,2] We have previously shown that functionalization of gold nanoprisms (NPRs) with glucose selectively enhances their cellular uptake in transformed cells.[3] Here we reveal for the first time the molecular mechanism of apoptosis during photothermal therapy in transformed cells following irradiation with NIR laser light.[4] To this aim we have established conditions to readily induce apoptosis on mouse embryonic fibroblast (MEF) cells transformed with the SV40 virus and analyzed the mechanism of apoptosis using MEFs from different knock out mice, which are deficient in proteins involved in the different routes of apoptosis (Bak and Bax, Bid, caspase-3 or caspase-9). Our results show that hot NPRs activate the intrinsic mitochondrial pathway of apoptosis mediated by Bak and Bax through the activation of the BH3- only protein Bid and that apoptosis and cell death is dependent on the presence of both caspase-9 and caspase-3. Our findings demonstrate how the functionalization and dose of NPRs, as well as laser power density and irradiation time exposure, must be regulated to specifically induce apoptotic cell death. Moreover the molecular mechanism presented here may help to predict the efficacy of NP-based photothermal therapy to treat cancer patients. References [] B. Pelaz, V. Grazu, A. Ibarra, C. Magen, P. del Pino, J.M. de la Fuente. Langmuir 202; 28: 8965. [2] C. Bao, N. Beziere, P. del Pino, B. Pelaz, G. Estrada, F. Tian, V. Ntziachristos, J. M. de la Fuente and D. Cui. Small 202; 9: 68. [3] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, B. Pelaz, E. M. Galvez, J. M. de la Fuente, J. Pardo (under review). [4] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, S. G. Mitchell, B. Pelaz, E. M Gálvez, J. M. de la Fuente, Julián Pardo (under review). P0-5 New oleanolic acid derivatives, with different polarity, increase apoptotic effects in B6-F0, murine melanoma cells Fernando Jesús Reyes Zurita, Marta Medina ODonnell 2, Rosa Ferrer Martín, Eva Rufino Palomares, Amalia Pérez Jiménez, Leticia García Salguero, Pedro P. Medina, Samuel Martín Fonseca 2, Francisco Rivas 2, Andrés Parra 2, Juan Peragón 3, José Antonio Lupíañez Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science, University of Granada, Granada, ES, 2 Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, University of Granada, Granada, ES, 3 Depatment of Experimental Biology, Biochemistry Section, University of Jaen, Jaén, ES Oleanolic acid (3β-hydroxyolean-2-e-28-oic acid), a natural hydroxylated pentacyclic triterpene acid isolated from olive-pressing residues, has been investigated together with some its derivatives regarding the induction of apoptosis in B6-F0 melanoma cells. This study examines the response of B6-F0 murine melanoma cells to oleanolic acid and three derivatives with an increasing polarity (28-Benzyloleanolic acid, 3-Pthaloyl, 28-Benzylolanolic acid and 3-(3,3-Dimethylglutaryl), 28-Benzyloleanolic acid). The compounds tested induce citotoxicity with IC50 concentrations between 9.8 to 48.5 μg/ml in a increasing form, depending on the polarity of the compounds. These results shown that the three derivatives were more citotoxic that its precursor oleanolic acid. At these drugs concentrations, all the products tested, induced over 95% of apoptosis, measure by FACS analysis with annexine V FICT staining. Most of these compounds, which also exhibited anti-proliferative effects, generated mitochondrial disturbs, probably involving the activation of an intrinsic apoptotic route. These mitochondrial disturbs was confirmed by FACS analysis using rhodamine 23. Morphological changes including cell shrinkage, chromatin condensation, and loss of nuclear architecture were observed by Hoechst stained. These finding support a role of oleanolic acid derivatives as tumor suppressant and as possible new therapeutic tools for aberrant cell proliferation in skin and may be used as chemopreventives or chemotherapeutics in melanoma process development. 32

Granada 204 Pósters This study has been supported by the grants from Ministerio de Ciencia e Innovación (Feder-Interconecta Program and CTQ2009-3898) and the Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa (Junta de Andalucía) research groups CVI-57 and FQM-7372. P0-6 The activation of DFF40/CAD and the cytoplasmic release of nuclear histones during caspase-dependent apoptotic cell death Raquel Larramona-Arcas, Laura Martínez-Escardó, María Sánchez-Osuna, Víctor José Yuste Mateos Departamento de Bioquímica y Biología Molecular - Instituto de Neurociencias, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Barcelona, Barcelona, ES The activation of Caspase-Activated DNase (CAD) prompts to the cytoplasmic release of nucleosomes (DNA and histones). The inhibition of CAD blocks double-strand oligonucleosomal DNA fragmentation and histone release. Previous results obtained in our laboratory pointed to an unexpected apoptotic behavior in glioblastoma-derived cells, where histones release occurs in the absence of double-strand DNA fragmentation. Then, we took advantage of different human glioblastomaand neuroblastoma-derived cells, over-expressing or not human CAD. Only CAD over-expressing cells treated with an apoptotic insult, such as staurosporine, displayed oligonucleosomal DNA fragmentation during apoptosis. Then, we compared both, CAD over-expressing and empty vector-transfected cells, through Western blot. First, we determined the best condition to perform the subcellular fractionation with different detergents. The results obtained revealed a correlation between a high expression of CAD and the release of the histone core variant H2B in several cell lines, including glioblastoma-derived U87MG and neuroblastoma-derived IMR-5 cells. Moreover CAD influenced the internucleosomal histone H.2 variant release in glioblastoma-derived LN8 and IMR-5 but not in U87MG cells. Interestingly, CAD-overexpressing U87MG cells were the only CAD-transfected cells that remained unable to hydrolyze their DNA into oligonucleosome-sized pieces during apoptosis. Furthermore, a time course of staurosporine treatment in IMR-5 cells revealed that H.2 variant release occurred already at three hours after apoptotic insult. Supported by MINECO/FEDER Grant SAF202-3485 and Generalitat de Catalunya (2009SGR-346). This study corresponds to the work performed by R.L.-A. under the Master of Neurosciences program from UAB. P0-7 (R0-) Cellular senescence in tissue remodelling: from physiology to pathology Daniel Muñoz Espín, Manuel Serrano Marugán Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, ES Recent discoveries are re-defining our view of cellular senescence as a trigger of tissue remodeling that acts during normal embryonic development and upon tissue damage. In the case of developmental processes, abrogation of senescence is partially compensated by apoptosis but still results in detectable developmental abnormalities. To achieve tissue renewal, senescent cells arrest their own proliferation, recruit phagocytic immune cells, and promote the mobilization of nearby progenitor cells that repopulate the tissue. This sequence of events (senescence, followed by clearance and then regeneration) may not be efficiently completed in aged or pathological contexts, thereby resulting in the accumulation of senescent cells. Increasing evidence indicates that both pro-senescent therapies and anti-senescent therapies can be beneficial. In cancer and during active tissue repair, pro-senescent therapies contribute to minimize the damage by limiting proliferation and fibrosis, respectively. Conversely, anti-senescent therapies may help to eliminate post-repair senescent areas and recover tissue function. P02. Bases moleculares de la patología P02r- La quinasa humana VRK regula la estabilidad de los Cuerpos de Cajal protegiendo a Coilina de su degradación en el proteasoma Lara Cantarero Abad, Marta Sanz García, Pedro A. Lazo Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Los Cuerpos de Cajal (CB) son suborgánulos nucleares implicados en el procesamiento del RNA, importante en el proceso de splicing. El ensamblaje de los CB, junto con su proteína scaffold Coilina, se regula a través del ciclo celular. La quinasa humana VRK, la actividad de la cual también es regulada dependiendo del ciclo celular, interacciona y fosforila a Coilina en el residuo serina 84, regulando la estabilidad de los CB. Así, el silenciamiento de esta quinasa, o la falta de suero en el medio, inactivan a VRK causando una pérdida en la fosforilación de Coilina y provocando el desensamblaje de estos suborgánulos nucleares; efecto rescatado por una VRK activa pero no por la quinasa inactiva. La pérdida de fosforilación de Coilina y posterior desensamblaje de los CB, son recuperados por los inhibidores del proteasoma. La falta de VRK provoca la ubiquitinación, a través de la lisina 48, de Coilina en el núcleo. Este proceso es mediado en parte por Mdm2, y el exporte al citosol para su degradación en el proteasoma; de tal forma que este proceso se interrumpe al inhibir el exporte nuclear con LeptomicinaB. De este modo, VRK protege a Coilina de su degradación y es una quinasa esencial para el mantenimiento de la estructura de los Cuerpos de Cajal y su regulación en el ciclo celular. P02-2 Phosphorylation of mineralocorticoid receptor at residue S839 impairs aldosterone-dependent gene transactivation coupling in a dominant negative manner Ruben Jimenez-Canino, Miguel X. Fernandes, Teresa Giraldez, Diego Alvarez de la Rosa Department of Physiology and Centre for Biomedical Research of the Canary Islands (CIBICAN), University of La Laguna, La Laguna, ES The mineralocorticoid receptor (MR) is a member of the nuclear receptor family of transcription factors that transduces the biological effects of the steroid hormone aldosterone, including the regulation of transepithelial sodium reabsorption and blood pressure. Aldosterone interaction with MR ligand binding domain (LBD) is responsible for nuclear translocation, dimerization and gene transactivation. It has recently been demonstrated that phosphorylation of S843, a residue near the aldosterone binding pocket, inactivates human MR, presumably by reducing affinity for the hormone. In this work we examined the mechanisms involved in MR modulation by S843p. To that end we used mouse MR phosphomimetic mutant S839D (equivalent to S843 in human) cotransfected with wild type MR in different proportions in COS-7 cells. MR-S839D is inactive and significantly decreases wild type MR activity when both forms are coexpressed. Assuming that MR/MR-S839D dimer formation follows a binomial distribution, our results are consistent with a dominant negative role of MR-S839D in the dimer. Surprisingly, aldosterone is able to induce nuclear translocation of MR-S839D, although at a slower rate than wild type receptors. Therefore aldosterone is still able to bind to MR-S839D but it is inefficient for gene transactivation. Structure modeling of MR LBD and docking experiments show that S839D mutation or S839p produce the same effect, namely a small decrease in agonist docking energy. Taken together, these results suggest that the effect of S839p cannot be 33

Pósters XXXVII Congreso SEBBM fully explained by decreased aldosterone binding affinity and may imply a defect in transactivation coupling. P02m-3 Initial age-associated metabolic alterations in different adipose tissue depots: effect of caloric restriction Patricia Corrales-Cordón, Yurena Vivas-García, Cristina Martínez- García, Adriana Izquierdo Lahuerta, Carmen Martínez Martínez, Maria Jesús Obregón Perea 2, Manuel Ros Pérez, Gema Medina- Gómez Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, Madrid, ES Changes in the body composition such as high adiposity and sarcopeny occur during ageing. These changes are usually associated to metabolic alterations like insulin resistance, type 2 diabetes and metabolic syndrome. The fat tissue is not homogeneous and the distribution and function of the different deposits of white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT) change throughout life. In this study, we have studied different WAT and BAT depots during the first stage of ageing with the objective to detect the initial signals of alteration. Moreover, we have studied the effect of the long-term caloric restriction (CR) and its benefits. 3 and 2- month-old mice fed ad lib and 2-month-old mice fed ad lib with a 20% CR have been used. The older animals showed insulin resistance and lower adiponectin levels in plasma compared with the younger mice. We have studied expression of different lipid metabolism genes and their regulation in epididimal WAT (ewat), subcutaneous WAT (scwat) and BAT. In these initial stages of ageing, expression of Glut4, IRSs and lipogenesis and lipolysis genes were decreased in scwat of 2-month-old animals, but not in ewat. Although visceral WAT has been described as the most dangerous tissue from the metabolic point of view, our data could suggest an earlier metabolic alteration in scwat than in ewat, which were retrieved by longterm CR. In addition, functional markers of BAT (DIO2, LPL, PGCα) also showed changes in these first stages of ageing, Furthermore, UCP- expression was significantly lower in scwat of aged mice compared with younger mice, suggesting an age-related loss of swat browning. Our findings suggest that initial age-related metabolic alterations occur in scwat, where CR could attenuate them. Acknowledgements: MINECO (BFU202-33594), CAM (S200/BMD- 2423). P02-4 (R02-3) La expresión hepática de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) protege de la esteatosis, adiposidad y resistencia a la insulina inducida por dieta rica en grasa Daniel E. Francés, Omar Motiño 2, Águeda Fernández-González 3, Ana Fernández-Álvarez 4, Carme Cucarella 5, Rafael Mayoral 6, María Fernández-Velasco 7, Luis Castro- Sánchez 2, Lisardo Boscá 8, Cristina E. Carnovale, Marta Casado 9, Ángela M. Valverde 3, Paloma Martín-Sanz 8 Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET), Rosario, AR, 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, Madrid, ES, 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERdem), Madrid, ES, 4 Fundación Instituto Leloir, IIBBA-CONICET, Buenos Aires, AR, 5 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, 6 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd); Department of Medicine, University of California, Madrid, ES, 7 Instituto de Investigación Hospital Universitario La PAZ, IDIPAZ, Madrid, ES, 8 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Madrid, ES, 9 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC); Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Valencia, ES La resistencia a la insulina (RI) participa en la fisiopatología de enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes mellitus tipo 2 y la enfermedad de hígado graso no alcohólica. Además, la RI está asociada con un estado de inflamación crónica leve que contribuye significativamente a su desarrollo. Las ciclooxigenasas y 2 (COX- y COX-2) catalizan el primer paso en la biosíntesis de los prostanoides. COX- se expresa constitutivamente en diversos tejidos, mientras que la expresión de COX-2 es inducida por diferentes estímulos. Los hepatocitos adultos son incapaces de inducir la expresión de COX-2 independientemente de los factores proinflamatorios presentes. Se ha analizado el papel de la expresión hepática de COX-2 en ratones transgénicos (hcox-2-tg) en un modelo de RI y de alteración de la homeostasis energética inducido por una dieta rica en grasa. Nuestros resultados muestran que la expresión de COX-2 en el hepatocito protege frente a la RI, esteatosis hepática y obesidad, en parte debido a una mayor sensibilidad a la insulina, un aumento en la tolerancia a la glucosa, y de la relación adiponectina/leptina. Asimismo, se observó una disminución de la esteatosis hepática, adiposidad y en el área de los adipocitos, de los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres tanto hepáticos como plasmáticos, y de las citoquinas proinflamatorias. Los ratones hcox-2-tg exhibieron también un incremento en el gasto energético, inducción de la termogénesis y de los niveles de expresión de genes implicados en la oxidación de ácidos grasos, así como un aumento en la señalización de insulina hepática (fosforilación del receptor de insulina y AKT). Resultados similares se obtuvieron en líneas celulares hepáticas murinas y humanas que sobreexpresan COX-2. Nuestros datos demuestran que la expresión constitutiva de COX-2 en hepatocitos protege frente a la RI hepática, la adiposidad e inflamación en ratones hcox- 2-Tg sometidos a una dieta rica en grasa. P02r-5 Ethanol by activating the innate immune receptors TLR4, promotes neuroinflammation, myelin dysfunctions, synaptic alterations and epigenetic modifications in adolescent mice with binge ethanol drinking Jorge Montesinos Selfa, Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora, Ana Isabel Gil Tebar, Clara Mar Guarch Pérez, Consuelo Guerri Sirera Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Adolescence is a brain maturation period from childhood to adulthood. Plastic and dynamic processes occur in specific brain regions, such as the prefrontal cortex (PFC) in which overproduction of axons and synapses, followed by rapid pruning along with ongoing myelination of axons, enhances neuronal conduction and communication. We demonstrated that ethanol by activating the innate immune receptors toll-like receptor 4 (TLR4) induces neuroinflammation and brain damage. Considering that the developmental brain is vulnerable to the effects of ethanol, we investigate whether intermittent ethanol intoxication promotes TLR4-dependent proinflammatory processes, leading to myelin and synaptic dysfunctions and epigenetic alterations. For this aim, we used wild-type (WT) and TLR4 deficient (TLR4-/-) adolescent mice exposed intermittently to ethanol (3.0 g/kg) during 2 weeks. The levels of pro-inflammatory mediators as well as different myelin and synaptic proteins were assessed in the PFC 24h after the last ethanol administration. Our results demonstrate that binge ethanol treatment activated TLR4 pathway (MAPKs, p-p65) triggering the upregulation of several pro-inflammatory mediators (inos, COX-2), cytokines (IL-β, TNF-α) and chemokines (MCP, MIPα). Ethanol treatment also decreased myelin protein levels (PLP, CNPase, MAG, MBP, NG-2) and synaptic-related proteins levels (synapsin, syntaxin, SNAP-25) in PFC of 34

Granada 204 Pósters WT mice, while no differences were observed in TLR4-/- PFC. Electron microscopy studies showed that ethanol treatment damages myelin sheath and alters synaptic structure in WT PFC. Ethanol treatment also increased HAT activity, the levels of acetylated H3 and H4 and upregulated the expression of immediate-early-genes related to plasticity and drug addiction (bdnf, c-fos, egr, fosb) in a TLR4-dependent manner. These findings suggest that activation of TLR4 signaling by intermittent ethanol intoxication during adolescence alters synaptic plasticity, causes myelin and synaptic derangements and induces epigenetic modifications, that could be associated to addictive behaviour. Supported by SAF-202-33747 and ERAB (EA-3-08). P02r-6 The innate immune receptors TLR4 participate in ethanol-induced proteolytic dysfunctions in glial cells Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora, Consuelo Guerri Sirera Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Ethanol is a neurotoxic compound and its abuse induces brain damage and can lead to neurodegeneration. Ethanol triggers inflammatory processes in glial cells, upregulating cytokines and other inflammatory mediators through the activation of Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling. Recent evidence indicates the role of protein degradation pathways in neurodegeneration and in alcoholic liver disease, but how these processes affect the brain remains elusive. We have recently demonstrated that chronic ethanol consumption alters the two major protein degradation pathways, the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagylysosome pathway (ALP), in mouse brain, and that TLR4 participates in these proteolytic dysfunctions. With this study, we aim to evaluate the effect of an acute dose of ethanol (50 mm) on WT and TLR4-/- mice glial cells at different time points, through the use of techniques such as western blot, flow cytometry or confocal and electron microscopy. Our results show that a single dose of ethanol induces an overexpression of several autophagy markers (ATG2, LC3-II and CTSB). Ethanol also produces an increase in the number of autophagic vacuoles and lysosomes, which is accompanied by a basification of the lysosomal ph. These changes in the ALP could be in part due to a reduction of the phosphorylation levels of the autophagy inhibitor mtor. Ethanol also alters the UPS and induces the formation of the immunoproteasome, by promoting the expression of several of its inducible subunits (βi, β5i and PSME). Interestingly, only minor changes in the proteolytic pathways were found between control and ethanol-treated TLR4-/- mice glial cells. Together, these results indicate that a single dose of ethanol is capable of affecting proteolytic pathways in the brain in a TLR4-dependent manner. These findings could provide new insight into the mechanisms underlying ethanol-induced brain damage. Supported by SAF202-33747, PNSD, RTA-Network, RD2-0028-007. P02r-7 Disfunción OXPHOS y diferenciación celular Laura Llobet, Eldris Iglesias, Alba Pesini, Virginia Borobia, Sonia Emperador, Ester López-Gallardo, Julio Montoya, Eduardo Ruiz- Pesini 2 Universidad de Zaragoza - CIBERER, Zaragoza, ES, 2 Universidad de Zaragoza - CIBERER - ARAID, Zaragoza, ES Las líneas celulares transmitocondriales han sido un excelente modelo para el estudio de las mutaciones patológicas en el mtdna, ya que reproducen exactamente el ambiente genómico humano. Sin embargo presentan algunos inconvenientes como son la aneuploidía (por derivarse generalmente de líneas celulares tumorales) y la falta de capacidad de diferenciación. Estos problemas pueden ser soslayados utilizando células madre adultas, euploides y fácilmente diferenciables. Nosotros hemos estudiado las células madre derivadas del tejido adiposo, su conversión a adipocito y sus propiedades como célula diferenciada, prestando una especial atención a los cambios en parámetros mitocondriales. La dificultad en la preparación de estos modelos consiste en la generación del estado rho0, carente de mtdna, previo a la construcción del cíbrido. Mientras trabajamos en la resolución de este problema, podemos simular diferentes mutaciones en el mtdna, preferentemente en los genes para los RNA de transferencia, mediante el uso de distintos xenobióticos. Concretamente, hemos elegido el linezolid, un antibiótico de amplio espectro que se une a la subunidad grande ribosomal y ha demostrado ser un potente inhibidor de la transcripción mitocondrial. De esta manera, es posible analizar el efecto de una disfunción en la expresión de genes mitocondriales sobre la diferenciación celular y su función como célula madura. Financiación: Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0/00662 y PI/030). P02m-8 (R02-7) Potenciació n de la capacidad de quemar grasas del tejido adiposo marró n como terapia contra la obesidad y la diabetes de tipo 2 María Calderón-Domínguez, Raquel Fucho, Joan Francesc Mir, Minéia Weber, Anna Orozco, Dolors Serra, Laura Herrero Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona-IBUB, Universitat de Barcelona - CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición- CIBEROBN, Instituto de Salud Carlos III, Barcelona, ES En el 2009, cinco grupos de investigación independientes identificaron que el tejido adiposo marrón (TAM), que se pensaba exclusivo de roedores y neonatos, no sólo estaba presente sino también activo en humanos adultos. Curiosamente observaron que su actividad disminuía en pacientes obesos y diabéticos, lo que indica que este tejido participa en la termogénesis inducida, ya sea por el frío o por la dieta. Esto situó al TAM en el punto de mira, ya que cualquier estrategia capaz de eliminar el exceso de lípidos de la obesidad podría ser beneficioso para la salud. Por esta razón nos centramos en la oxidación de los ácidos grasos (FAO, fatty acid oxidation), y su enzima clave, la carnitina palmitoiltransferasa (CPT). En el presente trabajo proponemos que un aumento de la FAO en el TAM reduciría los niveles de los lípidos y mejoraría el fenotipo obeso y diabético. Para ello sobrexpresamos en una línea celular de adipocitos marrones la forma mutante permanentemente activa de la CPTIA, la CPTIAM, la cual es insensible a su inhibidor fisiológico, el malonil-coa. Observamos que los adipocitos marrones que sobreexpresan la CPTAM muestran un aumento en la FAO, en la expresión de la proteína UCP,y reduce el incremento del contenido de triglicéridos inducido por el palmitato. Además de recuperar los niveles de marcadores proinflamatorios y marcadores relacionados con el síndrome metabólico, en comparación con las células GFP control. En conclusión, hemos conseguido mejorar el fenotipo obeso y diabético a través del aumento de la FAO en nuestro modelo celular, con el propósito de dar un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de la diabetes inducida por la obesidad. P02-9 Increased serum- and glucocorticoidinducible kinase (SGK) activity potentiates mineralocorticoid/nacl-induced renal but not cardiac fibrosis Catalina Sierra Ramos, Guadalberto Hernández Hernández, Eduardo Salido 2, Diego Álvarez de la Rosa Department of Physiology, Centre for Biomedical Research of the Canary Islands-CIBICAN, University of La Laguna, La Laguna, ES, 2 Centre for Biomedical Research of the Canary Islands-CIBICAN - Centre for Biomedical Research on Rare Diseases-CIBERER, University of La Laguna, La Laguna, ES 35

Pósters XXXVII Congreso SEBBM The mineralocorticoids aldosterone and deoxycorticosterone acetate (DOCA) stimulate renal tubular salt reabsorption, increase salt appetite, induce extracellular volume expansion, and elevate blood pressure. Mineralocorticoid excess induces deleterious effects on cardiorenal function, including the development of fibrosis. The effects of mineralocorticoids on renal tubular Na + reabsorption and salt appetite involve the serum- and glucocorticoid-inducible kinase (SGK). The present experiments explored the involvement of excess SGK activity in the development of mineralocorticoid/nacl-induced cardiac and renal fibrosis. To this end, transgenic mice (Tg.SGK), made with a bacterial artificial chromosome containing the SGK gene with a point mutation rendering the kinase constitutively active, and their wild-type littermates were uninephrectomized, treated with DOCA and given % NaCl in the drinking water for 6 weeks. The treatment led to a significant increase in blood pressure in both genotypes, slightly more pronounced in Tg.SGK mice. Histology after 6 weeks treatment revealed marked glomerular, perivascular and tubulointerstitial fibrosis in the kidney cortex, which was significantly greater in Tg.SGK mice. In contrast, treated animals developed cardiac fibrosis without significant differences between genotypes. Enhanced SGK activity without DOCA/NaCl treatment did not produce fibrosis. Our results demonstrate that increased SGK, while not sufficient to induce fibrosis without added stimuli, plays a decisive role in tissue-specific mineralocorticoid/nacl-induced fibrosis. P02-0 (R02-) Una dieta rica en cacao atenúa la resistencia a la insulina en las ratas ZDF Isabel Cordero-Herrera, María Angeles Martín Arribas, Fernando Escrivá Pons 2, Carmen Alvarez Escolá 2, Luis Goya Suárez, Sonia Ramos Rivero Departamento de Metabolismo y Nutrición. Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC), Madrid, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM). CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES La resistencia a la insulina es una de las principales características de la diabetes tipo 2 (). El cacao presenta ciertos efectos antidiabéticos (2,3), pero aún no se conoce con exactitud el mecanismo molecular de acción por el cual ejerce dichas actividades beneficiosas sobre la señalización de la insulina en el hígado. El objetivo de este trabajo fue investigar el potencial preventivo de una dieta rica en cacao sobre la señalización de la insulina en una situación prediabética en el hígado de las ratas ZDF (4 semanas de vida). La dieta rica en cacao (0%) mejoró la hiperglucemia y la respuesta al test de tolerancia a la glucosa, a la vez que disminuyó el peso corporal. Además, el cacao previno el aumento de la fosforilación en Ser307 y Ser636/639 de IRS- respecto a los animales ZDF que recibían la dieta control, mostrando valores similares a los de las ratas control (ZLean). De manera similar, los animales alimentados con la dieta rica en cacao mostraron unos niveles de p-gsk3, p-gs y glucógeno comparables a los de las ratas ZLean. Por su parte, los valores de PEPCK, aumentados en las ratas ZDF, regresaron a niveles control en aquellos animales que recibían la dieta rica en cacao, mientras que GK y GLUT-2 no parecieron modificarse en ningún caso. Estos datos sugieren que una dieta rica en cacao podría mejorar la resistencia a la insulina al prevenir la atenuación de la señalización de la hormona que se produce en el hígado en la diabetes tipo 2. Bibliografía Klover & Mooney: Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 753-8. Cordero-Herrera et al.: Mol Nutr Food Res 203, 57: 974-85. Cordero-Herrera et al.: Food Chem Toxicol 204, 64: 0-9. Agradecimientos: AGL200-7579, CSD2007-00063. P02r- Identification of bone morphogenetic protein 9 (BMP9) as a novel fibrogenic factor José Manuel Muñoz Félix, Nuria Perretta-Tejedor, Cristina Cuesta, José Miguel López-Novoa, Sabine Bailly 2, Carlos Martínez-Salgado 3 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca, ES, 2 Inserm, U036 - Commissariat a` l Energie Atomique et aux Energies Alternatives, Université de Grenoble, Grenoble, FR, 3 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Tubulointerstitial fibrosis, a common endpoint of chronic kidney disease, is characterized by the presence of myofibroblasts and an excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins in the tubular interstitium. Transforming growth factor beta (TGF-β) is a cytokine with a relevant contribution to fibrotic development. We have previously observed an increased expression of the TGF-β type I receptor ALK in fibrotic kidneys after unilateral ureteral obstruction (UUO), and the bone morphogenetic protein-9 (BMP9) is a strong ligand for ALK in endothelial cells. Thus, we aim to identify the effect of BMP9 on ECM protein expression and its possible involvement in renal fibrosis development. We used mouse embryo fibroblasts (MEFs) stimulated with BMP9. We analyzed collagen I, fibronectin and connective tissue growth factor (CTGF) expressions; we evaluated expression of phosphorylated Smads (BMPs induced-smad/5/8) and TGF-β-induced Smad2/3. UUO was performed in BMP9 deficient mice and their respective controls, and renal tissue fibrosis was analyzed by Red Sirius and Masson s trichrome staining. BMP9 (20 ng/ml) induced an increase in collagen I, fibronectin and CTGF expression in MEFs, as well as an increase in Smad/5/8 phosphorylation normally induced through ALK/2/3/6 receptors- and in Smad2/3 phosphorylation induced by ALK4/5/7 receptors. Inhibition of both groups of receptors with SB43542 (ALK4/5/7 inhibitor) and dorsomorphin- (ALK/2/3/6 inhibitor) reduced BMP-9-induced ECM protein expression. Obstructed kidneys from Bmp9 -/- mice developed less renal fibrosis than their respective controls. Our data suggest that BMP9 regulates renal fibrosis stimulating ECM protein expression by MEFS, due to an activation of receptors that phosphorylate Smad/5/8 and Smad2/3 proteins. P02r-2 Depleción del DNA mitocondrial (mtdna) debida a una mutación en el gen MT-TW Sonia Emperador, Ester López-Gallardo, Cristina Ruiz-Ruiz 2, Alba Pesini 2, Maria Dolores Fuentes 2, Laura Llobet 2, Eldris Iglesias 2, Eduardo Ruiz-Pesini 3, Julio Montoya Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2 Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3 ARAID-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES Mutaciones en genes que codifican para trnas mitocondriales son responsables de causar un número importante de patologías en humanos. En este trabajo presentamos el caso de un niño con síndrome de Leigh en el que, mediante secuenciación del mtdna completo, encontramos una inserción de una timina en la posición 5537, que corresponde al gen MT- TW. Esta mutación había sido previamente descrita en otro paciente con enfermedad mitocondrial. Para confirmar el efecto funcional de esta mutación, construimos cíbridos transmitocondriales usando la línea rho0 de carcinoma de pulmón humano A549. En estos cíbridos observamos una caída en la actividad y cantidad del complejo respiratorio IV, disminución de la cantidad de ATP mitocondrial 36

Granada 204 Pósters y ausencia de síntesis mitocondrial de proteínas. De forma más llamativa, detectamos una pérdida completa del mtdna. Un hallazgo similar se había ya descrito en cíbridos NT2 portadores de la m.3243a>g en MT-TL. Nuestros resultados sugieren que mutaciones patológicas de genes que codifican trna mitocondriales, en fondos genéticos nucleares particulares, podrían llevar a depleción del mtdna. Por lo que quizás se deba secuenciar estos genes en los síndromes de depleción. Financiación: ISCIII; FIS (PI0-00662; PI -030); CIBERER. P02-3 Sistema OXPHOS, nucleótidos de pirimidina, y la enfermedad de Alzheimer Alba Pesini, Eldris Iglesias, Nuria Garrido 2, M. Pilar Bayona- Bafaluy 2, Laura Llobet, Sonia Emperador, Ester López-Gallardo, Antonio Galarreta 2, Julio Montoya, Eduardo Ruiz Pesini 2 Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2 Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva, clínicamente caracterizada por la pérdida de memoria y el declinar cognitivo. Los sellos histopatológicos de la enfermedad son el acúmulo de placas extracelulares de péptido beta-amiloide, los ovillos neurofibrilares intracelulares compuestos por la proteína tau hiperfosforilada, la pérdida de sinapsis y la degeneración neuronal. Una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) ha sido implicada en la patogénesis de AD. De hecho, la cadena transportadora de electrones podría tener un papel relevante en la formación de las membranas celulares y de las sinapsis entre las neuronas, ya que la cadena respiratoria participa en la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina, que son claves en la producción de fosfolípidos, principal compuesto de todas las membranas. Para estudiar cómo afectaría la disfunción en el sistema OXPHOS a la producción de neuritas y diferenciación neuronal, utilizamos la línea celular de neuroblastoma SK-N-BE(2)C. Cultivamos y diferenciamos esta línea celular en ausencia o presencia de azida sódica (NaN 3 ) o carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), que disminuirían o aumentarían, respectivamente, el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria y por lo tanto quizás podrían alterar negativa o positivamente la síntesis de nucleótidos de pirimidina. En un primer paso hemos puesto a punto las concentraciones de las drogas que afectan el consumo de oxígeno, pero no la viabilidad celular. Financiación: Instituto de Salud Carlos III [FIS-PI 0/00662 y PI /030], Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS), Asociación de Enfermos de Patología Mitocondrial (AEPMI) y Universidad de Zaragoza-Banco de Santander (UZ202-BIO-0). P02r-4 Efecto estimulador de la leptina sobre la producción de sialofosfoproteína dentinaria (DSSP) en la pulpa dental humana Jenifer Martin Gonzalez, Antonio Pérez-Pérez 2, Flora Sánchez Jiménez 2, Juan José Segura Egea, Víctor Sánchez Margalet 2 Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología, Universidad de Sevilla, sevilla, ES, 2 Departamento de Bioquímica, Biología molecular e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, sevilla, ES Objetivo: La leptina, un mediador de la respuesta inflamatoria, y su receptor (LEPR) se expresan en la pulpa dental humana. La sialofosfoproteina dentinaria (DSPP) es una proteína implicada en la odontogénesis y en la respuesta reparativa dentino-pulpar. Esta investigación tiene como objetivo describir la localización inmunohistoquímica de LEPR y estudiar el efecto de la leptina sobre la expresión de la sialofosfoproteina dentinaria (DSPP) por las células pulpares humanas. Metodología: Veinticinco muestras de pulpa dental humana se obtuvieron de terceros molares recién extraídos libres de caries y sin restauración. Las muestras de pulpa fueron procesadas y la mineralización producido por odontoblastos en respuesta a la leptina se determinó mediante el análisis de la expresión de DSPP por inmunoblot y por PCR a tiempo real (qrt- PCR). La localización de LEPR en la pulpa dental fue examinada por inmunohistoquímica usando anticuerpo monoclonal anti-lepr humano. Resultados: La immunoreactividad para los anticuerpos anti-lepr se localizó especialmente en el estrato odontoblástico y a nivel de la predentina. La leptina estimuló de forma dosis-dependiente la expresión de DSPP en la pulpa humana. El análisis del Western blot de las muestras de pulpa estimuladas con leptina reveló la presencia de una proteína de peso molecular aparente ~ 00 kda, correspondiente al peso molecular estimado de la DSPP. La expresión del ARNm de la DSPP se confirmó por análisis de qrt-pcr, y el tamaño de los fragmentos amplificados (280 pares de bases) fue confirmado por electroforesis en gel de agarosa. Conclusión: Por primera vez se ha demostrado que los odontoblastos humanos expresan el receptor de leptina (LEPR) y que la interacción de la leptina con este receptor estimula la producción por el odontoblasto de sialofosfoproteína dentinaria (DSPP). Estos hallazgos sugieren que la leptina juega un papel en la respuesta defensiva pulpar y en la dentinogénesis. P02-5 (R02-5) Obesity-related glycogen mishandling in human adipose tissue: a key feature of metabolic stress Sonia Fernández-Veledo, Victoria Ceperuelo-Mallafre, Xavier Duran, Kelly Roche, Catalina Núñez-Roa, Marta Montori-Grau 2, Lourdes Garrido-Sánchez 3, Francisco J. Tinahones 3, Anna Mª Gomez-Foix 2, Joan Vendrell Hospital Universitari de Tarragona Joan XXIII - IISPV - URV - CIBERDEM, Tarragona, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona-IBUB, Universitat de Barcelona - CIBERDEM, Barcelona, ES, 3 Hospital Universitario Virgen de la Victoria - CIBERObn, Malaga, ES Background: Obesity leads to excess lipid storage in adipocytes resulting in the derangement of carbohydrate metabolism. It is well-known that hepatic glycogen is increased under pathologic circumstances associated with obesity such as insulin resistance. Though at low levels, studies in murine models revealed that adipose tissue (AT) might contain glycogen stores. However, to date the physio(patho)logical role of glycogen metabolism in human adipose tissue remains unexplored. Methodology: Glycogen accumulation was studied in human adipocytes and adipose tissue from lean and obese patients by different methodological approaches (PAS, immunofluorescence and TEM). PTG, the only glycogenassociated regulatory subunit (PP-GTS) reported in murine adipocytes, was overexpressed by adenoviral transfection in human adipocytes to explore the metabolic effects of enforced glycogen deposition. Glycogen metabolism gene expression was analyzed in subcutaneous (SAT) and visceral (VAT) AT from lean and obese subjects in two independent cohorts. Results: Hypoxia, which has been related to obesity-related AT dysfunction, promotes glycogen accumulation in human adipocytes. Enforced glycogen deposition by PTG adenoviral overexpression, modified adipokine secretion and caused insulin resistance in human adipocytes. Human myocytes cultured with Ad-PTG adipocyte conditioned media also shown a decrease in insulin responsiveness. Clinical studies in two human independent cohorts revealed that obesity is associated with changes in AT glycogen metabolism gene expression being PPPR3E the most predominant PP- GTS isoform in human fat depots. An increased level of glycogen synthase protein expression that correlates with enhanced glycogen deposition was detected in SAT from obese patients. 37

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Conclusions: Increased glycogen deposition in AT in obesity modifies the endocrine function of human adipocytes and might contribute to obesityrelated comorbidities. P02-6 Influencia de xenobióticos ambientales en la neuropatía óptica hereditaria de Leber Ester Lopez Gallardo, Luis Diez 2, Sonia Emperador, Iñigo Martinez-Romero 2, Laura Llobet 2, Eldris Iglesias 2, Alba Pesini 2, Eduardo Ruiz-Pesini 2, Julio Montoya 2 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Zaragoza, ES, 2 Dto. Bioquímica y Biología Molecular- Facultad de Veterinaria-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES El genoma mitocondrial contiene 37 genes, todos ellos esenciales para el buen funcionamiento del sistema de fosforilación oxidativa. Mutaciones en estos genes pueden causan un déficit de energía y causar enfermedades mitocondriales. Los efectos y la severidad de las enfermedades mitocondriales pueden variar enormemente. Las mutaciones patológicas son usualmente heteroplásmicas mientras que los polimorfismos neutros son homoplásmicos. Sin embargo, hay algunas excepciones, por ejemplo, las mutaciones que causan LHON (Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber) son homoplásmicas en la mayoría de los casos. Esta enfermedad muestra una penetrancia incompleta, por ello, es importante investigar qué factores genéticos y/o ambientales modulan la expresión del fenotipo. En el presente trabajo hemos usado el modelo de cíbridos transmitocondriales portadores de una mutación causante de LHON (3460/ND) para estudiar la combinación de dicha mutación con varias xenobióticos (factores ambientales) y qué importancia puede tener en el desencadenamiento de la patología del paciente. Los resultados obtenidos muestran que dicha mutación en presencia de los xenobióticos analizados (rotenona, capsaicina, anonacina) muestra diferencias en la función mitocondrial. Financiación: Instituto de Salud Carlos III-FIS (PI0-00662; PI - 0230), Fundación ARAID-Programa de Apoyo a la I+D+I para jóvenes investigadores 200, y Centro de Investigación en Red en Enfermedades raras (CIBERER). CIBERER es una iniciativa de ISCIII. P02-7 AD057, a pyrrolidinedione fungal metabolite, inhibits angiogenesis by targeting the Akt signaling pathway Melissa García-Caballero, Librada Cañedo 2, Antonio Fernández- Medarde 2, Miguel Ángel Medina Torres 3, Ana R. Quesada 3 Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA (Biomedical Research Institute of Málaga), Málaga, ES, 2 Biomar Microbial Technologies, Parque Tecnológico de León, Armunia (León), ES, 3 Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA (Biomedical Research Institute of Málaga). Unidad 74, CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES In the course of a screening program for the inhibitors of angiogenesis from marine sources, AD057, a pyrrolidinedione fungal metabolite, was selected for its angiosupressive properties. AD057 inhibited the growth of endothelial and tumor cells in culture in the micromolar range. Our results show that subtoxic doses of this compound inhibit certain functions of endothelial cells, namely, differentiation, migration and proteolytic capability. Inhibition of the mentioned essential steps of in vitro angiogenesis is in agreement with the observed antiangiogenic activity, substantiated by using two in vivo angiogenesis models, the chorioallantoic membrane and the zebrafish embryo neovascularization assays, and by the ex vivo mouse aortic ring assay. Our data indicate that AD057 induces apoptosis in endothelial cells through chromatin condensation, DNA fragmentation, increases in the subg peak and caspase activation. The data shown here altogether indicate for the first time that AD057 displays antiangiogenic effects, both in vitro and in vivo, that are exerted partly by targeting the Akt signaling pathway in activated endothelial cells. The fact that these effects are carried out at lower concentrations than those required for other inhibitors of angiogenesis makes AD057 a new promising drug candidate for further evaluation in the treatment of cancer and other angiogenesis-related pathologies. Our experimental work is supported by grant P2-CTS-507 (Andalusian Government and FEDER) and funds from group BIO-267 (Andalusian Government). The CIBER de Enfermedades Raras is an initiative from the ISCIII (Spain). This communication has the support of a travel grant Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. P02r-8 Regulación de la expresión génica por Wnt3A en fibroblastos de colon humano Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González-Sancho Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES Las vías de señalización por factores Wnt son esenciales en muchos procesos del desarrollo humano, y también para mantener la homeostasis del tejido adulto. La vía Wnt/β-catenina o canónica es la mejor conocida, aunque también existen vías no canónicas, independientes de β-catenina. En el colon, la vía canónica tiene una importancia fundamental y aparece desregulada en la práctica totalidad de cánceres colorrectales. Los factores Wnt son secretados por los fibroblastos pericriptales y actúan sobre las células epiteliales de la mucosa colónica. Sin embargo, no se sabe si estos factores actúan también de forma autocrina sobre los propios fibroblastos que los secretan, alterando su patrón de expresión génica. Para intentar resolver esta incógnita, nuestro grupo se propuso estudiar el efecto de Wnt3A, que activa la vía canónica, sobre la línea de fibroblastos primarios de colon CCD8-Co. Para ello utilizamos una técnica de secuenciación masiva de alta resolución (RNAseq), seguida de un análisis bioinformático. El análisis estadístico nos proporcionó una lista de genes regulados diferencialmente, de los que una muestra ha sido validada mediante qpcr y western blot. Dos de los genes validados se regulan a tiempos cortos, lo que sugiere un posible mecanismo transcripcional directo. También aparecen genes que codifican proteínas de la propia vía Wnt/β-catenina, o muy relacionadas con ella. De esta lista se han seleccionado varios genes que serán sometidos a un estudio más profundo con el fin de analizar el mecanismo de su regulación por factores Wnt y el efecto de sus cambios de expresión sobre el fenotipo, proliferación o capacidad tumorogénica de los fibroblastos de colon. P02-9 Cocoa enriched-diet attenuates loss of beta cell mass and function in Zucker diabetic rats by preventing beta cell oxidative stress and apoptosis Elisa Fernández-Millán, Isabel Cordero-Herrera 2, Sonia Ramos 2, Fernando Escrivá 3, Carmen Alvarez 3, Luis Goya 2, María Angeles Martín 3 CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES, 2 Dpto. de Metab. y Nutr., ICTAN (CSIC), Madrid, ES, 3 Dpto. Bioq. y Biol. Mol. II, Fac. Farmacia, UCM - CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES Oxidative stress has been largely implicated in the pathogenesis of pancreatic beta cell failure observed in type 2 diabetes (T2D). Consequently, identification of natural antioxidant compounds that enhance or preserve 38

Granada 204 Pósters islet beta cell mass and function is considered an emerging strategy to prevent or treat T2D []. We have recently showed that flavanol epicatechin and microbial-derived flavonoid metabolites from cocoa may have antidiabetic potential by promoting survival and function of pancreatic beta cells in vitro [2]. However, it is unknown whether this effect can be achieved in vivo. Therefore, in this work we investigated the effect of a cocoa-rich diet preventing β-cell deterioration in an animal model of T2D and the mechanisms involved. Male Zucker diabetic (ZDF) rats were fed control or 0% cocoa enriched diets in the pre-diabetic state (from 6 to 4 weeks of life) and Zucker lean (ZL) rats were used as control. Glucose tolerance test (GTT), beta cell mass, beta cell apoptosis and pancreatic markers of apoptosis and oxidative stress were evaluated. Animals fed with cocoa rich diet improved fasting hyperglycemia, hyperinsulinemia and GTT. Besides, histopathological study of the pancreas of these animals indicated that cocoa feeding preserved beta cell mass and prevented beta cell apoptosis. Finally, we showed that cocoa diet enlarged the pancreatic concentration of enzymatic and non-enzymatic endogenous antioxidant defences preventing thus oxidative stress in ZDF rats. These findings provide the first in vivo evidence that a cocoa-rich diet may delay the development of T2D in the ZDF rat by preventing pancreatic oxidative stress and beta cell apoptosis. Therefore, cocoa flavonoids could be considered as candidates to ameliorate hyperglycemia and delay deterioration of beta cell mass and function in T2D. References [] Robertson, RP. Theraphy Discov Med 9:32-37 (200) [2] Fernández-Millán et al. Food Chem Toxicol 66:245-253 (204) Acknowledgments: Grants AGL200 7579, CSD2007-00063, BFU20-25420 from Ministerio de Economí a y Competitividad (MINECO) and CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabó licas Asociadas (CIBERDEM, ISCIII) Spain. P02r-20 DICKKOPF- (DKK-) reduce el potencial tumorogénico de células de sarcoma de Ewing Lorena Paule, Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González- Sancho Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES El sarcoma de Ewing es la segunda causa de cáncer de hueso en niños y adultos jóvenes. Se caracteriza por la presencia de translocaciones cromosómicas, que en aproximadamente el 90% de los casos ocurren entre los cromosomas y 22 y generan la proteína de fusión EWS/FLI, que es un factor de transcripción aberrante con propiedades oncogénicas. Los factores Wnt activan, entre otras, la vía de señalización Wnt/β-catenina que se encuentra desregulada en numerosos cánceres humanos. Nuestro grupo ha demostrado previamente que esta vía está constitutivamente inhibida en sarcoma de Ewing debido a la acción de EWS/FLI. Asimismo, la expresión de DICKKOPF- (DKK-), un inhibidor extracelular de la vía Wnt/βcatenina y a la vez gen diana de la misma, es inhibida transcripcionalmente por EWS/FLI. En este trabajo hemos reexpresado DKK- en cuatro líneas celulares de sarcoma de Ewing con el fin de determinar la relevancia funcional de su silenciamiento en esta neoplasia. Experimentos de proliferación y supervivencia usando MTS no han mostrado un efecto significativo de DKK- sobre el crecimiento y la sensibilidad a quimioterápicos (vincristina y doxorubicina, habituales en el tratamiento de este tumor) de las líneas A673, TC-7, A4573 y TTC-466 de sarcoma de Ewing. Por el contrario, experimentos en ratones inmunodeprimidos demostraron que la presencia de DKK- ralentiza el crecimiento de tumores generados por células A673 y TC-7. En consecuencia, para intentar determinar los genes responsables de este efecto antitumoral de DKK- hemos realizado un estudio transcriptómico, mediante RNAseq, que estamos analizando en la actualidad y que esperamos contribuya a esclarecer el mecanismo de acción de este supresor tumoral. P02-2 Las células madre neurales (hnsc) un modelo para el estudio del papel de los polimorfismos mitocondriales en la enfermedad de Parkinson Eldris Iglesias, Laura Llobet, Alba Pesini, Sonia Emperador, Ester López-Gallardo, Julio Montoya, Eduardo Ruiz-Pesini Universidad de Zaragoza-CIBERER, Zaragoza, ES La enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa causada por la destrucción de las neuronas dopaminérgicas. Muchos factores se han relacionado con esta enfermedad, tales como mutaciones en genes nucleares (ndna), algunos de los cuales están implicados en la replicación y expresión del DNA mitocondrial (mtdna), mutaciones directamente en el mtdna y, finalmente, la acción de diversos xenobióticos que causan la disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) muchos de cuyos componentes están codificados en el mtdna. Por lo tanto, el mtdna parece jugar un papel importante en la PD. El desarrollo de un modelo de células neuronales dopaminérgicas estable y fiable es especialmente necesario para el estudio de la patogénesis de esta enfermedad y el desarrollo de estrategias terapéuticas. Las células madre neurales (hnsc) constituyen células euploides con potencial para diferenciarse en neuronas dopaminérgicas. En este trabajo presentamos la caracterización genética de genes nucleares y mitocondriales asociados a PD y los cambios genéticos moleculares y bioquímicos que se producen tras la diferenciación a neuronas, en particular en relación al sistema OXPHOS. Financiación: ISCIII; FIS 0-00662, -030; CIBERER. P02r-22 Role of mitochondria ROS generation in ethanolinduced TLR4/NLRP3 inflammasome activation and cell death in astroglial cells Silvia Alfonso-Loeches, Juan Uneña, M Jose Morillo, Jorge Oliver-de la Cruz, Consuelo Guerri Sirera Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) are innate immunity sensors that provide an early/effective response to pathogenic or injury conditions. We have reported that ethanol-induced TLR4 activation triggers signaling inflammatory responses in glial cells, causing neuroinflammation and brain damage. However, it is uncertain if ethanol is able to activate NLRs /inflammasome in astroglial cells, which is the mechanism of activation, and whether there is crosstalk between both immune sensors in glial cells. Here we show that chronic ethanol treatment increases the co-localization of caspase- with GFAP+ cells, and upregulates IL-β and IL-8 in the frontal medial cortex in WT, but not in TLR4 knock-out mice. We further show that cultured cortical astrocytes expressed several inflammasomes (NLRP3, AIM2, NLRP and IPAF), although NLRP3 mrna is the predominant form. Ethanol, as ATP and LPS treatments, up-regulates NLRP3 expression, and causes caspase- cleavage and the release of IL-β and IL-8 in astrocytes supernatant. Ethanol-induced NLRP3/caspase- activation is mediated by mitochondrial (m) ROS generation because when using a specific mitochondria ROS scavenger, the mito-tempo (500 mm) or NLRP3 blocking peptide (4mg/ ml) or a specific caspase- inhibitor, Z-YVAD-FMK (0 mm), abrogates mros release and reduces the up-regulation of IL-β and IL-8 induced by ethanol or LPS or ATP. Confocal microscopy studies further confirm that ethanol, ATP or LPS promotes NLRP3/caspase- complex recruitment within the mitochondria to promote cell death by caspase--mediated pyroptosis, which accounts for 73 % of total cell death ( 22%) and the remaining ( 25%) die by caspase-3-dependent apoptosis. Suppression of the TLR4 function abrogates most ethanol effects on NLRP3 activation and reduces cell death. These findings suggest that NLRP3 participates, 39

Pósters XXXVII Congreso SEBBM in ethanol-induced neuroinflammation and highlight the NLRP3/TLR4 crosstalk in the neuropathological processes associated with alcohol abuse. Supported by SAF202-33747; RED-RTA, ERAB, EA 3 08. P02r-23 Role of the mineralocorticoid receptor in mouse skin development Julia Boix Tarín, Elena Carceller Zazo, Lisa Sevilla, Paloma Pérez Sánchez Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES The mineralocorticoid receptor (MR) is a transcription factor that plays a key role in ion and water homeostasis. Structurally and functionally it has a high similarity with the glucocorticoid (GC) receptor (GR). Both MR and GR are steroid ligand-dependent intracellular receptors that belong to the nuclear hormone receptor superfamily. MR can bind the natural ligand aldosterone and GCs with similar affinities. Given that endogenous GC plasma levels exceed those of aldosterone by 00-fold, one mechanism preventing continuous MR occupation by GCs is the enzyme β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (βhsd2). βhsd2 converts active GCs into inactive metabolites, unable to bind MR, thus favoring the Aldosterone-MR signaling pathway. It is known that GCs exert a critical role in skin function through GR. However, no much is known regarding MR in skin biology. Previous work demonstrated that the skin phenotype of mice overexpressing either MR or GR in epidermal keratinocytes was highly similar. Both transgenic mouse models featured atrophic skin, a reduced number of hair follicles, and impaired epidermal maturation, suggesting that MR may play a role in skin development, analogously to GR. We have analyzed MR expression during mouse skin development at the mrna and protein level. Our data showed a transient peak of MR expression around embryonic (E) day 6.5 (E6.5), which decreased thereafter. Since epidermal barrier formation starts at E6.5, the observed peak suggested a role for MR in this process. To evaluate the consequences of MR inactivation in developing skin, we generated MR knock-out mice using a strategy based upon generalized Cre-mediated recombination of MRloxP/loxP mice. We examined MR+/+, MR+/- and MR-/- mouse skin at different embryonic and early postnatal stages. Histopathological analysis of skin samples revealed no major defects of MR-/- mice but rather subtle differences in the expression of keratinocyte-specific markers. Collectively, our findings indicate that i) MR is expressed at relatively low levels during normal skin development, ii) its constitutive ablation does not have a major impact for skin function at the perinatal age, and iii) GR may functionally compensate for MR loss during mouse skin development. P02r-24 Effects of corticosteroids in keratinocytes in vivo and in vitro Elena Carceller Zazo, Julia Boix Tarín, Lisa Sevilla, Paloma Pérez Sánchez Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES Synthetic glucocorticoids (GCs) are effectively and largely used in therapy for skin inflammatory diseases, however, chronic treatments or high doses produce common undesirable side effects, such as skin atrophy. The biological and therapeutical effects of endogenous and synthetic GCs are mediated by binding to the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-dependent transcription factor of the nuclear hormone receptor superfamily. The mineralocorticoid receptor (MR) also belongs to this superfamily and can bind both mineralocorticoids and GCs with similar affinities. GR and MR regulate the gene expression through binding to identical DNA sequences located at regulatory regions of their target genes, making difficult to discriminate the specific actions of each receptor. The aim of this study was to analyze the effects of GR and MR agonists in keratinocytes by using in vitro and in vivo approaches. Cultured keratinocytes were treated with the synthetic GC analog dexamethasone (Dex) and the natural mineralocorticoid aldosterone (Aldo), individually or combined, to evaluate their effects on gene expression. The anti-inflammatory gene Tsc22d3/Gilz, a known GR- and MR-target in other cell types, was up-regulated to a similar extent by each ligand but the combined treatment showed no additive effects. We also analyzed the effects of Dex, Aldo or Dex plus Aldo after topical application to adult mouse dorsal skin for one week. Skin samples were analyzed by histopathology by hematoxilin/eosin staining and immunohistochemistry using specific epidermal markers. Whereas Dex treatment in mice resulted in epidermal thinning, as previously described, Aldo elicited no major effects. However, combined Dex plus Aldo treatment partially counteracted the Dex-induced epidermal hypoplasia. Since these approaches do not clarify which receptor is mediating Dex or Aldo effects, and to unequivocally elucidate the role of each of these transcription factors on keratinocyte function, we have performed experiments using GR- and MR- keratinocyte-specific knock-out mice and cell lines. P02-25 Generación de knock-outs de FKTN y FKRP en la línea muscular C2C2 de ratón mediante la tecnología TALEN para el estudio de distroglicanopatías Marcos Rubio Fernández, Madalina Raducu, Miriam Aza Carmona, Cristina Susín Lara, Lourdes Yuste Pérez, Laura Rodríguez Alonso, José Martín Nieto 2, Jesús Cruces Pinto Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, 2 Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Alicante, Alicante, ES Mutaciones en los genes FKTN (fukutin) y FKRP (fukutin-related protein), que codifican dos proteínas muy relacionadas, son causantes de un conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo denominadas actualmente como distrofias musculares-distroglicanopatías (MDDG, de sus siglas en inglés). La falta de función de estas proteínas conduce a la hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-dg). Esta proteína sirve de anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes órganos y tejidos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-dg sufre una importante y masiva O-glicosilación postraduccional en residuos de serina/treonina de su conocido dominio mucina, generando diferentes tipos de cadenas tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetil-galactosaminilglicanos. A través de estos residuos se realiza la interacción con proteínas de la MEC como laminina, agrina y perlecano, así como con las proteínas sinápticas neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta la fecha, la función de estas proteínas FKTN y FKRP en la O-glicosilación del α-dg sigue siendo desconocida. En un intento de elucidar sus funciones, hemos generado una serie de mutantes knock-out (KO), tanto para FKTN como para FKRP en la línea celular C2C2 de mioblastos de ratón, utilizando la tecnología TALEN (transcription activator-like effector endonuclease). Un número significativo de estos mutantes KO son defectivos en la O-glicosilación del α-dg, tras ser analizados mediante western blotting y citometría de flujo, utilizando anticuerpos contra las cadenas glicosílicas del α-dg. El objetivo final de este estudio es analizar mediante glicómica comparada los residuos glicosílicos afectados en el α-dg por la falta de función de ambas proteínas frente a la línea celular C2C2 silvestre. Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI2/057. 40

Granada 204 Pósters P02-26 Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin: pore formation and resealing of injured plasma membrane by endocytosis of the pore David González Bullón, Asier Etxaniz Iriondo, Kepa Belloso Uribe, Aitor Etxebarria Gallego, César Martín Plágaro, Helena Ostolaza Etxabe Departamento Bioquímica y Biología Molecular, Unidad de Biofísica (Centro Mixto, CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES The adenylate cyclase toxin (ACT), the causative agent of whooping cough in humans, is an essential virulence factor secreted by the Gram negative bacteria Bordetella pertussis. The toxin suppresses the bactericidal activities of phagocytic cells due to its capacity to rapidly convert cellular ATP into camp. This conversion is achieved by the translocation into the target cell cytosol of the toxin N-terminal catalytic domain (AC domain, aminoacids -400). Meanwhile, the toxin C-terminal domain (RTX domain, approximately the last 300 residues), which mediates toxin binding to the target cell membrane, remains in the cell membrane forming cation-selective pores, which permeabilize cell membranes perturbing ion homeostasis and inducing both haemolysis and cytolysis of nucleated cells. Here we provide evidence that ACT pores formed by the toxin C-terminal portion are internalized from the cell membrane. In sum, our findings uncover a linkage between cell permeabilisation by ACT and how cells protect themselves from a microbial toxin insult and may survive, and provide new valuable insights to the current understanding of ACT action on target cells. P02r-28 Asociación de polimorfismos de VAV2 y VAV3 con factores de riesgo cardiovascular inducidos por hipertensión y diabetes Nuria Perretta Tejedor, Cristina Cuesta 2, José Manuel Muñoz Félix 2, Luis García-Ortiz 3, Manuel A Gómez Marcos 3, José Ignacio Recio Rodríguez 3, Rogelio González-Sarmiento 4, José Miguel López- Novoa 2, Carlos Martínez-Salgado 5 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad de Salamanca, Salamanca, ES, 2 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES, 3 IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca - Unidad de Investigación, Centro de Salud La Alamedilla, Salamanca, ES, 4 Centro de Investigación del Cáncer, Universidad de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES, 5 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca - IECSCYL, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Hipertensión, diabetes y obesidad son factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, una de las principales causas de muerte en el mundo. Hay pocos datos sobre la influencia de polimorfismos genéticos en estas enfermedades. Los factores intercambiadores de guanina VAV2 y VAV3 juegan un papel importante en la homeostasis vascular in vivo. Por ello, hemos evaluado la asociación de los polimorfismos de VAV2 (rs 602990) y VAV3 (rs752853) con la predisposición al riesgo y daño cardiovascular inducido por hipertensión y diabetes. Hemos extraído DNA de sangre periférica de 384 pacientes (52 hipertensos, 66 diabéticos y 66 no diabéticos no hipertensos). Los polimorfismos fueron detectados mediante qpcr con sondas TaqMan. Hemos analizado en esos mismos pacientes la presión sistólica y diastólica, presión de pulso, glucemia basal, disfunción endotelial, retinopatía, hipertrofia ventricular izquierda y riesgo cardiovascular. El genotipo CT del polimorfismo de VAV3 Sher298Thr está asociado con un riesgo reducido de desarrollar hipertensión, diabetes, obesidad y daño cardiovascular (p=0.0, odds ratio (OR)=0.495, intervalo 0.33-0.784), y el genotipo TT de este polimorfismo está asociado con un incremento de la glucemia basal en pacientes no diabéticos y no fumadores (p=0.043, OR=3.700, intervalo.266-0.85). El polimorfismo de VAV2 Val584Met está asociado con un aumento de la presión de pulso en pacientes fumadores portadores del alelo TT (p=0.06, OR=5.538, intervalo.022-30.09) y con un riesgo reducido de desarrollar síndrome metabólico en pacientes no fumadores portadores del alelo TT (p=0.05, OR=0,408, intervalo 0.80-0.927). Nuestros resultados sugieren que el genotipo CT del polimorfismo de VAV3 Sher298Thr está relacionado con un riesgo reducido de desarrollar hipertensión, diabetes, obesidad y daño cardiovascular. Por otra parte, variantes polimórficas de los genes VAV2 y VAV3 parecen estar asociados con la presencia o ausencia de factores de riesgo cardiovascular inducidos por hipertensión o diabetes. P02-29 Estudio de expresión de marcadores proteicos de la EMT en líneas celulares de cáncer colorrectal Sara Fernández Mojón, Rubén López-Cortés, Laura Muinelo Romay 2, Emilio Gil Martín, Almudena Fernández Briera Grupo BB, Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2 Grupo de Oncología Médica Traslacional, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES La pérdida del fenotipo epitelial y la adquisición del mesenquimal, proceso conocido como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT), es un evento que lidera la progresión de los tumores epiteliales, otorgando a las células tumorales un aumento de movilidad y potencial invasivo. Son muchos los marcadores moleculares involucrados en este proceso, de entre los cuales, nuestro interés radica en los productos de la acción de la enzima α(,6)fucosiltransferasa [α(,6)ft], por su presumible implicación en la malignización del cáncer colorrectal (CCR). En este trabajo nos hemos propuesto monitorizar la expresión de varios marcadores proteicos de la EMT en un panel de líneas celulares de CCR; asimismo, hemos estudiado el efecto del silenciamiento del gen de la α(,6) FT (FUT8) en las líneas isogénicas Sw480 y Sw620. Una vez testado el éxito del silenciamiento por RT-qPCR, se ha procedido a valorar la expresión mediante western blot de los marcadores de la EMT seleccionados. Nuestra hipótesis reside en que la enzima α(,6)ft modula la expresión y grado de funcionalidad de ciertas proteínas de membrana vinculadas a la EMT y, por ende, la progresión maligna de los tumores. Las líneas Sw480 y Sw620 son un buen sistema modelo para testar esta hipótesis por su origen respectivo en un tumor primario y una lesión metastásica del mismo paciente. Los resultados preliminares apuntan a que no parece haber una correlación entre estos clásicos biomarcadores de la EMT y el grado de malignidad celular, lo que podría corresponderse con la posible heterogeneidad genotípica y mecanística de la carcinogénesis colorrectal. Estudio fi nanciado mediante el Contrato-Programa CN 20/024, Xunta de Galicia. P02-30 Análisis de posibles proteínas que interaccionan con la fukutina Marcos Rubio Fernández, Sandra Gutiérrez Vindel, Cristina Susín Lara, Lourdes Yuste Pérez, José Martín Nieto 2, Jesús Cruces Pinto Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, 2 Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Alicante, Alicante, ES 4

Pósters XXXVII Congreso SEBBM La fukutina, una proteína codificada por el gen FKTN, se ha relacionado con un conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo denominadas actualmente como distrofias musculares-distroglicanopatías (MDDG, de sus siglas en inglés). La falta de función de la fukutina conduce a la hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-dg). Esta proteína actúa como anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes tejidos y órganos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-dg sufre importantes y masivas O-glicosilaciones postraduccionales en residuos de serinas/treoninas de su conocido dominio mucina, generando diferentes tipos de cadenas tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetilgalactosaminilglicanos. A través de estos residuos se realiza la interacción con proteínas de la MEC como laminina, agrina y perlecano, así como con las proteínas sinápticas neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta la fecha, la función de la fukutina en la O-glicosilación del α-dg es desconocida. En un intento de elucidar su función, en este trabajo hemos procedido a sobreexpresar esta proteína en la línea celular humana HEK293T, purificarla y analizar mediante espectrometría de masas las proteínas que coeluyen con ella. Hemos seleccionado una serie de proteínas potencialmente interesantes, centrándonos preferentemente el estudio de la proteína CMAS (citidina monofosfo-n-ácido acetilneuramínico sintetasa). Esta enzima cataliza la síntesis de CMP-Neu5Ac, un sustrato utilizado por diferentes si aliltransferasas para la adición de ácido siálico, el cual está presente en muchas de las cadenas de O-glicanos del α-dg. Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI2/057. P02-3 (R02-4) Calpain-cathepsin crosstalk leads to photoreceptor cell death in an animal model of retinitis pigmentosa Alberto M. Hernández-Pinto, Natalia Rodríguez-Muela 2, Lucía García Ledo, Patricia Boya, Enrique J. de la Rosa Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES, 2 Harvard Department of Stem Cell & Regenerative Biology, Boston, US Retinitis pigmentosa (RP) comprises a large group of inherited retinal dystrophies that are clinically similar but genetically heterogeneous. At the cellular level, loss of photoreceptor cells is frequently found in association with the disease progression, and causes visual decline and blindness. The cellular changes leading to photoreceptor cell death in the retina of animal models, as well as of RP patients, are not well characterized. In this work, we have analyzed the order of events leading to photoreceptor death in the rd0 mouse, that carries a spontaneous mutation in the Pde6b gene coding a misfunctional rod-specific cgmp phosphodiesterase. As a consequence, intracellular cgmp levels are increased, inducing a sustained calcium influx through the cgmp-gated channels. In this study, we have measured the role of calcium influx in the activation of caspases, calpains, and cathepsin throughout the neurodegenerative process by flow cytometry, confocal microscopy and enzymatic assays. To determine the role of calcium and cgmp in the photoreceptor death, we have used a calcium ionophore (A2387) and a PDE6 inhibitor (zaprinast) to simulate the rd0 phenotype in C57bl/6 mice (WT) retinal explants. Rd0 retinas showed an early increase in the calcium levels followed by an over-activation of type 2-calpains without changes in the levels of its endogenous inhibitor calpastatin. Subsequently, exogenous activation of cathepsin B and Lysosomal DNAse was detected in the retinas, suggesting an impairment of the lysosomal system prior to cell death, measured by TUNEL staining. Retinas treated with Zaprinast or A2387 partially or totally mimicked this calcium-calpain-cathepsin pattern. Inhibition of calpains or cathepsins in specific stages of the degenerative process clearly rescued photoreceptors both in vitro andin vivo. Throughout all this process, caspases remained inactive, suggesting an alternative nonapoptotic pathway to cell death in this model of RP. P02-32 Desmosomal-plaque related genes and nonsmall-cell lung cancer: desciphering other cellular functions Joel Martín Padrón, Laura Boyero Corral 2, Miriam Yagüe Capilla 2, Pedro Medina Vico 2, Mª Esther Fárez Vidal 3 University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular Biology III - Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, Granada, ES, 2 University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular Biology I - Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, Granada, ES, 3 University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular Biology III, Granada, ES Despite advances in early detection and standard treatment, Non-Small- Cell Lung Cancer (NSCLC) is often diagnosed at an advanced stage and carries a poor prognosis. Greater knowledge of the molecular origins and progression of lung cancer may lead to improvements in the treatment and prevention of the disease. There is considerable evidence for the importance of desmosomes and their constituents in cancer. A role has been proposed for these adhesion genes in susceptibility to cancer and metastasis, and there is increasing evidence that the modulation of desmosomes is an important step in the initiation and invasiveness of human malignancies. In addition to the well-known structural role of desmosome genes, evidences such as their dual subcellular localization, the interaction with single-stranded DNA and translation initiation factors, etc. suggest there is a poorly understood role of these proteins in signaling pathways. PKP is up-regulated in primary Squamous-cell lung cancer (SCC) tissues suggesting a putative contribution in tumorigenesis. In order to gain greater insight into the multifuntional role of some desmosomal proteins in NSCLC tumours, we have investigated transient inhibition of the PKP desmosomal plaque protein in several SCC lines of lung cancer in order to unveil role of desmosomal-plaque proteins in NSCLC carcinogenesis. PKP knockdown suppressed proliferation, produced cell cycle arrest and an increment in apoptosis. Evidence suggests potential pro-oncogenic functions of PKP desmosomal-plaque protein, probably due to an unknown regulatory role in the nucleus, where it has also been found. P02-33 Perfil de MicroRNA en respuesta al tratamiento con doxorubicina en cáncer de mama Eduardo Tormo, Begoña Pineda, Eva Serna 2, Sandra Ballester, Octavio Burgués 3, Ana Lluch 4, Pilar Eroles Instituto de investigación INCLIVA, Valencia, ES, 2 Unidad Central de Investigación, Universidad de Valencia-INCLIVA, Valencia, ES, 3 Departamento de Patología, Hospital Clínico Universitario de Valencia, Valencia, ES, 4 Departamento de Hematología y Oncología, Hospital Clínico Universitario de Valencia, Valencia, ES Antecedentes: El tratamiento con quimioterapia es la norma en los cánceres de mama triple negativo (CMTN), un subgrupo de cáncer que carece de una diana específica. Se han observado claramente dos tipos de respuesta: respuesta patológica completa o recaída en los tres primeros años tras el tratamiento. Sin embargo, los mecanismos que conducen a estas respuestas, así como los marcadores que permitan la identificación y la diferenciación de estos grupos antes del tratamiento son desconocidos. Por otra parte, existen evidencias de una expresión aberrante de microrna en diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama. Los microrna, modulan la expresión de oncogenes y supresores de tumor y también están implicados en la promoción de resistencia a los medicamentos contra el cáncer. Objetivo: Estudiar los microrna que se expresan diferencialmente en respuesta al tratamiento con doxorubicina en líneas de células de cáncer de mama. Métodos: Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-23 y MDA- MB-468 (CMTN) y MCF7 (luminal-a) fueron expuestas a tratamiento con 42

Granada 204 Pósters doxorubicina. Se realizó un análisis de microarrays (GeneChip mirna 2.0 array) para identificar el conjunto de micrornas comúnmente modificados y aquellos regulados de forma diferencial. Los genes y las vías reguladas por estos microrna fueron analizados in silico. Resultados: Los análisis de PCA y Heat Maps mostraron 3 micrornas modificados en las tres líneas, 25 en CMTN y 69 en la línea luminal-a. Este patrón está relacionado con el subgrupo de cáncer de mama con más fuerza que con el tratamiento específico. Curiosamente, las hebras star de microrna fueron modificadas en un porcentaje muy alto en todos los grupos, y el análisis teórico de los genes diana reveló que los procesos y vías relacionadas con el cáncer fueron los más afectados. Entre las vías destacan: uniones adherentes, adhesión focal, ERBB, MAPK, PI3K y la vía WNT, y entre los procesos celulares: proliferación, supervivencia, angiogénesis, invasión y metástasis. Conclusión: El perfil de microrna en líneas celulares de cáncer de mama se modifica ampliamente por el tratamiento con doxorrubicina y las hebras star de los microrna juegan un papel fundamental. Los genes y las vías sobre las que actúan están relacionados con procesos de cáncer, por lo que estos microrna podrían ser relevantes en la respuesta al tratamiento y en el desarrollo de resistencias. P02-34 Differential localization of desmosomal plaquerelated proteins in non-small-cell-lung cancer Laura Boyero Corral, Mercedes Gómez-Morales 2, Joel Martín- Padrón, Pedro P. Medina, Esther Fárez-Vidal 3 Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, and Department of Biochemistry and Molecular Biology - School of Sciences - Granada University, Granada, ES, 2 Department of Pathology, School of Medicine, Granada University, Granada, ES, 3 Department of Biochemistry and Molecular Biology 3 and Immunology, School of Medicine, Granada University, Granada, ES Squamous cell carcinomas and adenocarcinomas are the most frequent forms of lung carcinoma, and have different prognoses and therapeutic approaches. During recent years, accumulating evidence has supported an important role for several junctional proteins in carcinogenesis, tumour invasion and metastasis. Contact between epithelial cells is mediated by several types of cell cell junction, which are composed of complex arrays of transmembrane and plaque proteins and are connected typically to cytoskeletal components. Desmosomes are cell cell complexes found primarily in epithelial tissues. Previously, our group showed differentially expressed gene sequences corresponding to severl desmosomal plaque-related proteins as a function of tumour type, stage and differentiation grade in non-small-cell-lung cancer (NSCLC). The staining pattern of some desmosomal proteins differed between squamous-cell carcinomas and adenocarcinomas. Expression of these proteins marked intercellular junctions that are characteristic of the squamous stratum of stratified flattened epithelium and of neoplasias with this type of differentiation. We observed more intense staining of these proteins in better differentiated areas. In order to gain greater insight into the specific function of some desmosomal proteins in NSCLC tumours, we have investigated the subcellular localization of one of these proteins in lung squamous-cell carcinomas by immunocytochemistry. PKP was localized on membrane and desmosomal plaque, and mainly on the nucleus of the cells. PKP knock-down caused specific inhibition of PKP on immunostained cells in comparison with scramble cells. These results may suggest other functions of PKP in cellular regulation and cancer. Our evidence indicates that PKP is a potential target for diagnosis and treatment of NSCLC. P02r-35 Interacción funcional entre las vías de TGF-β y HGF durante la transición epitelio-mesénquima en células progenitoras hepáticas María García-Álvaro, Laura Almalé, Annalisa Addante, Daniel Caballero, Celia Sequera, Héctor Romero, Jessica Segales 2, Carlos Sánchez 2, César Roncero, Margarita Fernández, Eduardo Rial 2, Isabel Fabregat 3, Blanca Herrera, Aránzazu Sánchez Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC) - Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 3 Laboratori d Oncologia Molecular, Universitat de Barcelona, Institut d Investigació Biomèdica de Bellvitge, Barcelona, ES Las células ovales son progenitores bipotenciales de hígado adulto que se expanden en situaciones de daño crónico y son responsables de la reparación del daño hepático. Sin embargo, se ha postulado que son el origen de un subgrupo de carcinomas hepatocelulares. Para comprender los mecanismos subyacentes a su conversión maligna, analizamos la potencial interacción entre las vías de TGF-β y HGF en el contexto de un proceso de EMT. Para ello, hemos utilizado un modelo in vitro de célula oval con un receptor Met inactivo (células Met -/- ) y su control (células Met flx/flx ). El fenotipo mesenquimal estable (post-emt) se obtuvo mediante tratamiento crónico con TGF-β. Las células ovales post-emt muestran una cinética de crecimiento similar a la de sus parentales, un fenotipo más inmaduro y una mayor capacidad migratoria/invasiva. Además, presentan alteraciones en la señalización disparada por TGF- β resistencia a la apoptosis y al estrés oxidativo inducidos por esta citoquina. Este fenotipo resistente está asociado a cambios significativos en el perfil de expresión de genes pro- y anti-oxidantes. Además, el perfil bioenergético muestra una disminución en el índice OCR/ECAR, sugiriendo la adquisición de un fenotipo más glicolítico. Curiosamente, la ausencia de Met resulta en un proceso de senescencia tras la inducción de EMT, lo que sugiere que Met es necesario para la expansión de estas células. Por otra parte, las células ovales post-emt presentan una señalización y respuesta al HGF alteradas. En conclusión, nuestros resultados muestran una profunda alteración en el fenotipo de la célula oval y sus propiedades funcionales después de la EMT inducida por TGF-β. Además, apuntan a una interacción funcional relevante entre las vías de HGF y TGF-β en este contexto. P02-36 El déficit de IGF-I predispone a la pérdida auditiva inducida por ruido Adelaida Celaya, Lourdes Rodríguez-de la Rosa, Julio Contreras 2, Isabel Varela-Nieto Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC- UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER, Madrid, ES, 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER - Facultad De Veterinaria, UCM, Madrid, ES La deficiencia del factor de crecimiento similar a insulina tipo I (IGF-I) causa sordera neurosensorial sindrómica en el hombre (ORPHA73272, OMIM608747), situación que se reproduce en ratones modificados genéticamente que no expresan este gen. El IGF-I es un agente neurotrófico durante el desarrollo y neuroprotector en el adulto. Los niveles de IGF-I circulante descienden de forma fisiológica con el envejecimiento lo que se ha asociado con deterioro cognitivo en el hombre. Nuestro objetivo ha sido estudiar si el déficit parcial en este factor predispone a la pérdida auditiva y los mecanismos moleculares responsables de la potencial respuesta agravada al daño. Para ello se ha estudiado la susceptibilidad de ratones Igf +/ y Igf +/+ al daño causado 43

Pósters XXXVII Congreso SEBBM por exposición excesiva al ruido a diferentes edades, utilizando técnicas neurofisiológicas (potenciales auditivos del tronco cerebral), morfológicas (histología coclear, cuantificación estereológica de células ciliadas) y moleculares (RT-qPCR, Western blotting). Los ratones de -3 meses de edad de ambos genotipos resultaron igualmente sensibles al daño, por el contrario los ratones Igf +/ de 6 meses de edad presentaron una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido que los ratones Igf +/+. Con respecto a los animales control, los ratones Igf +/ presentaron un incremento de umbrales auditivos acusado e irreversible, una mayor pérdida de células ciliadas, así como alteraciones en las principales vías de señalización del IGF-I y en la expresión génica de marcadores celulares y moleculares de neuroinflamación. En su conjunto los resultados sugieren una mayor activación de la respuesta inflamatoria tras el trauma acústico en la situación de déficit parcial en IGF-I. Estos resultados apoyan la idea de que bajos niveles de IGF-I predisponen a una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido y contribuyen a identificar las dianas moleculares que participan en este proceso. Así, las terapias basadas en IGF-I podrían contribuir a prevenir o mejorar la pérdida auditiva inducida por ruido. Agradecimientos: Este trabajo ha recibido el apoyo del SAF20-2439, de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña 202 y del proyecto AFHELO (FP7, European Union). LRR disfruta de contrato del CIBERER y AC de AFHELO. P02-37 (R02-8) Increased oxidative stress and impaired antioxidant response in Lafora disease Carlos Romá Mateo, Carmen Aguado 2, Jose Luis Garcia Gimenez 3, José Santiago Ibañez Cabellos 4, Marta Seco Cervera 3, Federico Pallardó 3, Erwin Knecht 2, Pascual Sanz 5 Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC) y CIBERER, Valencia, ES, 2 Centro de Investigación Principe Felipe y CIBERER, Valencia, ES, 3 FIHCUV-INCLIVA y CIBERER, Valencia, ES, 4 FIHCUV-INCLIVA y Sistemas Genómicos S.A, Valencia, ES, 5 Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC y CIBERER, Valencia, ES Lafora Disease (LD, OMIM 254780, ORPHA50) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by the presence of glycogenlike intracellular inclusions called Lafora bodies and caused, in the vast majority of cases, by mutations in either EPM2A or EPM2B genes, encoding respectively laforin and malin. In the last years, several reports have revealed molecular details of these two proteins and have identified several processes affected in LD, but the pathophysiology of the disease still remains largely unknown. Since autophagy impairment has been reported as a characteristic treat in both Lafora disease cell and animal models, and since there is a link between autophagy and mitochondrial performance, we sought to determine if mitochondrial function could be also altered in those models. Using fibroblasts from LD patients, deficient in laforin or malin, we found mitochondrial alterations, oxidative stress and a deficiency in antioxidant enzymes involved in the detoxification of reactive oxygen species (ROS). Similar results were obtained in brain tissue samples from transgenic mice deficient in either the EPM2A or EPM2B genes. Furthermore, in a proteomic analysis of brain tissue obtained from Epm2b-/- mice, we observed an increase in a modified form of peroxirredoxin-6, an antioxidant enzyme involved in other neurological pathologies, thus corroborating an alteration of the redox condition. These data support that oxidative stress produced by an increase in ROS production and an impairment of the antioxidant enzyme response to this stress play an important role in the development of LD. P02-38 (R02-2) Adipose tissue as a regulator of metabolic flexibility Sam Virtue Institute of Metabolic Science (IMS), Addenbrooke s Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK The focus of this talk is on how disruptions in the ability of organisms to appropriately store and release lipid can impact on whole organism metabolic health. Both healthy mice and humans preferentially use carbohydrate in the fed state and switch to utilising a greater degree of lipid in fasted state. The ability to perform the switch between utilising carbohydrate and lipid can be defined as metabolic flexibility. While metabolic flexibility has been extensively studied in humans, data from rodent models with alterations in metabolic flexibility are relatively rare. The transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (PPARγ) is essential for adipogenesis. PPARγ has been implicated in the regulation of both carbohydrate and lipid metabolism and is therefore an excellent candidate for controlling metabolic flexibility. PPARγ2 is the adipose tissue-specific isoform of PPARγ and has greater transcriptional activity than PPARγ. Despite the known role of PPARγ as a target for the thiazolidinedione class of anti-diabetic drugs, young mice (4 months of age) lacking PPARγ2 had surprisingly normal carbohydrate metabolism based on glucose and insulin tolerance tests. In this talk, data from mice lacking PPARγ2 will be used to demonstrate how reductions in metabolic flexibility can be detected in mice using indirect calorimetry. The lower metabolic flexibility of the PPARγ2 KO mouse indicated that these animals may have impaired lipid handling, a phenotype which was subsequently confirmed; with PPARγ2 KO mice having reduced rates of lipolysis, and dramatically reduced capacity for whole-organism lipid clearance. Finally, the relationship between reduced adipose tissue capacity for both lipid uptake and release and human metabolic health will be discussed. P02r-39 Generación de células madre pluripotentes inducidas (ipsc) para el estudio de enfermedades mitocondriales Teresa Galera Monge, Francisco Zurita Díaz, Cristina González Páramos, Rafael Garesse Alarcón, M. Esther Gallardo Pérez Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC - CIBERER, Madrid, ES Las enfermedades mitocondriales (EM) constituyen un amplio grupo de enfermedades genéticas multisistémicas cuyo nexo de unión es una disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa. La falta de modelos experimentales adecuados para el estudio de dichas enfermedades, ha dificultado el avance en el desarrollo de nuevas terapias. En este sentido, la reprogramación de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas (ipsc) mediante la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, OCT4, SOX2, KLF4 y c-myc, ha abierto enormes posibilidades. Por ello, el objetivo general de este trabajo ha consistido en la generación de ipsc a partir de fibroblastos de pacientes con EM para el estudio y tratamiento potencial de las mismas. Para este fin, hemos establecido una colección de fibroblastos procedentes de biopsias de piel de pacientes con EM e individuos sanos. A continuación, se han generado líneas de ipsc a partir de dichos fibroblastos mediante el uso de vectores retrovirales o métodos no integrativos tipo virus Sendai. Así, hemos generado 6 líneas de IPSC portadoras de distintas mutaciones en genes mitocondriales codificados en el DNA mitocondrial o nuclear asociadas a distintas EM: Síndrome de Leigh, atrofia óptica sindrómica y EM producidas por defectos de comunicación intergenómica. Actualmente, estamos realizando la confirmación, molecular y funcional, de la pluripotencia de las líneas generadas, para posteriormente, diferenciarlas y caracterizarlas en los tipos celulares diana. La disponibilidad de ipsc como modelo experimental 44

Granada 204 Pósters de las EM nos permitirá mejorar el conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos de estas enfermedades y podrá suponer la apertura de nuevas vías para la identificación de tratamientos farmacológicos y de terapia celular. P02-40 La leptina revierte parcialmente el efecto Warburg en la línea de cáncer de mama MCF-7 María del Mar Blanquer-Rosselló, Raquel García-Belmonte, Jordi Oliver, Pilar Roca, Adamo Valle Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional - IUNICS - Universitat de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES El efecto Warburg consiste en la preferencia de las células tumorales por el uso de la vía glucolítica en detrimento de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Al tratarse de una característica metabólica diferencial y dada su importancia para sostener el elevado anabolismo del tumor en crecimiento, la reprogramación metabólica se plantea como una diana interesante en la lucha contra el cáncer. La leptina es una hormona producida por el tejido adiposo blanco con una importante función en la homeostasia energética. Se ha observado que la leptina aumenta la proliferación y supervivencia de las células de cáncer de mama tanto in vitro como in vivo. No obstante, se desconoce la influencia que la leptina puede tener sobre el metabolismo de estas células. En este estudio nos planteamos evaluar la influencia de la leptina sobre el efecto Warburg en la línea de cáncer de mama MCF-7. Se analizó el consumo de oxígeno mediante un electrodo tipo Clark, la producción de lactato mediante un método enzimático y los niveles de ATP mediante luminometría en células tratadas con leptina en respuesta a distintas dosis de 2-deoxiglucosa y oligomicina. Se analizó también mediante western blot los niveles y el grado de fosforilación de la AMPK, proteína sensora del estado energético; y la actividad de la PDH mediante un ensayo enzimático con inmunocaptura. Los resultados indicaron que la leptina revierte parcialmente el efecto Warburg en las células MCF-7, induciendo un metabolismo más aeróbico y una mayor dependencia de la mitocondria para la síntesis de ATP. No obstante, las células con leptina mostraron una mayor capacidad para activar la glucólisis al inhibir la fosforilación oxidativa. Financiado por CAIB-FSE, ISCIII (PI2/0827) y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P02r-4 Mutaciones y polimorfismos mitocondriales en pacientes mexicanos con cáncer de próstata Victoria Edwina Campos García, Sandra Viridiana Salgado Hernández, Jorge Ramírez Salcedo 2, Patricia Ramírez Noguera 2, Sandra Díaz Barriga Arceo 2, Rosalba Bonilla Sánchez 3, Sergio Ureta Sánchez 4, José Francisco Montiel Sosa 2 B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlan Izcalli, MX, 2 PhD. en Ciencias Biomédicas, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, Distrito Federal, MX, 3 Q.F.B. Departamento de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlán Izcalli, MX, 4 MD. Médico Urólogo, Hospital Español, Distrito Federal, MX En México, el cáncer de próstata es un importante problema de salud pública con altos costes sociales, este tipo de neoplasia tiene una tasa de mortalidad anual de 2.57 por cada 00 mil hombres. Los factores predisponentes de dicha patología son la edad y antecedentes familiares positivos pero poco se sabe acerca de la etiología de la enfermedad. Se ha estudiado que las mutaciones a nivel ADN mitocondrial (ADNmt) en pacientes con cáncer de próstata (CaP), son prospectos a ser herramienta útil para la detección de la enfermedad. Actualmente en México no se había realizado una investigación profunda de las mutaciones en el mtdna asociadas al CaP. Analizamos tres muestras de tejido prostático obtenidos mediante una biopsia transrectal. Se amplificó todo el genoma mitocondrial mediante la técnica de PCR punto final, de una muestra; las demás muestras solo se amplificaron la región MT-ND5. Posteriormente se recurrió a la técnica de secuenciación bidireccional y finalmente se examinó la presencia de variantes de la secuencia entre el tejido sano y enfermo del mtdna. Sólo una muestra mostró dos mutaciones asociadas al CaP, en el locus MT-CO, alelo G626A produciendo un cambio de aminoácido de manera non-syn:a-t y en el locus MT-ND5, alelo C2705T cuyo cambio de aminoácido es syn:i-i. Esta misma muestra mostró mutaciones en el locus MT-ATP 6, alelo A9300G con un cambio de aminoácido non-syn:a-t asociada a la miopatìa y en el locus MT- RNR, alelo A663G con cambio de aminoácido 2S rrna relacionada al riesgo de arterioesclerosis coronaria. Dichas variaciones son las primera reportadas en México. Dicha investigación es apenas un preámbulo para entender el cáncer de próstata, su inicio, progreso y desarrollo de metástasis en pacientes mexicanos. P02-42 Metabolomic analysis of serum samples from diabetic patients with and without cardiovascular disease and control subjects Beatriz García-Fontana, Caridad Díaz Navarro 3, Pedro Rozas-Moreno 4, Olga Genilloud 3, Francisca Vicente Pérez 3, José Pérez del Palacio 3, Sonia Morales-Santana,2, Manuel Muñoz-Torres Unidad de Metabolismo Óseo-RETICEF, Servicio de Endocrinología, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2 Servicio de Proteómica, Fundación para la Inverstigación Biosanitaria de Andalucía Oriental Alejandro Otero FIBAO, Granada, ES, 3 Fundación MEDINA, Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos Innovadores en Andalucía - Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES, 4 Servicio de Endocrinología, Hospital General de Ciudad Real, Ciudad Real, ES Metabolomics is an emerging and powerful discipline that provides an accurate and dynamic image of the phenotype of mammalian systems through the study of endogenous and exogenous metabolites in cells, tissues and biofluids. The aim of this project is to analyze the metabolomic profiles obtained by mass spectrometry of serum samples from type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients with and without cardiovascular disease (CVD) and control subjects, in order to find new molecular pathophysiological processes related to the onset of disease as well as new biomarkers for CVD and diabetes. In this study we analyzed 9 serum samples from T2DM patients with CVD, 0 serum samples from T2DM patients without CVD and 0 serum samples from healthy subjects. These samples were analyzed by liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The raw LC-HRMS data were converted into mass peak lists which were compared across cromatographic runs and subjected to statistical analysis (t-test, fold change analysis, principal component analysis and partial least square-discriminant analysis). Thus, the peaks whose intensity levels vary significantly between different groups are detected. The principal component analysis (PCA) successfully clustered the samples according to the aforementioned groups. PCA loading plot revealed that phospholipids were the main discriminatory metabolites. The role of these molecules as biomarkers and their involvement in glucose and insulin pathways will also be discussed in this study. 45

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P02r-43 (R02-6) Dissecting the role of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis in mice Daniel Caballero Díaz, Judit López-Luque, Alba Marín-Martínez, Adoración Martinez-Palacián 2, María García-Álvaro 2, Annalisa Addante 2, María García-Bravo 3, Esther Grueso 4, Jose-Carlos Segovia 3, César Roncero 2, Margarita Fernández 2, Aránzazu Sanchez 2, Isabel Fabregat 5 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Barcelona, ES, 2 Dep. of Biochemistry and Molecular Biology II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos, IdISSC, Madrid, ES, 3 Cell Differentiation and Cytometry Unit - Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas- CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed Unit. CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, 4 Division of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE, 5 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of Barcelona, LHospitalet de Llobregat, ES Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers and its incidence is increasing. Hepatocarcinogenesis is a multistep process that involves genetic and environmental factors. It is necessary to elucidate the interaction and cross-regulation of these factors that synergistically contributes to HCC development. In HCC there is a disruption of the balance between cell death and survival signaling pathways. Different physiological pro-apoptotic molecules are down-regulated, or inactivated, due to an over-activation of anti-apoptotic signals that impairs their functions. At the same time, some pro-survival pathways are over-activated. One of these de-regulated survival signals is the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway. On the one hand, different EGF-like ligands are over-expressed in HCC, contributing to EGFR activation during HCC progression. On the other hand, it has been shown that human HCC tissues over-express EGF family receptors. To investigate the role of the EGFR in the process of hepatocarcinogenesis our group generated a transgenic mice that expressed specifically in hepatocytes a truncated form of the EGFR (Alb-ΔEGFR). These mice were treated with diethylnitrosamine (DEN) to induce liver tumorigenesis. By histological techniques the livers of the mice were analyzed at different times after treatment with DEN. Transgenic mice showed a delay in the appearance and in the growth of tumors, as well as less inflammation and less extracellular matrix deposition in liver parenchyma. The results suggest that the EGFR pathway plays an important role in the process of hepatocarcinogenesis. Further work is required to elucidate the molecular mechanisms by which EGF contributes to liver tumor cell growth and survival. P02r-44 Associating the decrease on neuronal viability induced by amyloid-beta -40 and -42 with reactive oxygen species production and the disregulation of the expression of synaptic proteins Marta Domínguez-Prieto, Ana Velasco, José M. Medina Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de Castilla y León), Salamanca, ES Amyloid-beta (Aβ) accumulation together with tau protein hyperphosphorylation are the main molecular events presumably responsible for neurodegeneration observed in Alzheimer s disease. In this work, we studied the effect of three Aβ peptides: Aβ 25-35, Aβ -40, Aβ -42, on cell viability and reactive oxygen species (ROS) production in rat neurons in primary culture. Our results showed that the three peptides significantly decreased neuronal viability, but only Aβ 25-35 and Aβ -42 produced a significant increase on ROS production. In addition, we performed immunohistochemistry against Aβ in order to observe its localization within the neuron, showing that the distribution pattern differed depending on the Aβ peptide, Aβ 25-35 being internalized into neurons but Aβ -40 and Aβ -42 remaining mostly outside the cells. In order to get inside the mechanism involved in the cell damage induced by Aβ peptides, we analized changes in the expression of synaptic proteins, such as synaptophysin, synaptotagmin and PSD-95, by western-blot. Our results showed the occurrence of a disregulation on the expression of these proteins. Since the changes in ROS production cannot fully explain the decrease on cell viability observed in our experiments, we propose that the disruption of synaptic structure must be involved in neuronal death induced by amyloid-beta. P02r-45 Bisphenol A exposure during adulthood alters the expression of tryptophan hydroxylase type II but not type I in the prefrontal cortex of rat: Possible alterations in local serotonin synthesis Beatriz Castro Bohórquez, Pilar Sánchez Medina, Jesús Manuel Torres De Pinedo, Esperanza Ortega Sánchez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e Inmunología, Universidad de Granada, Granada, ES Background: Bisphenol A (BPA) is able to produce neurological and behavioral dysfunctions by mechanisms that remains unknown. Serotonin (5-HT) system is essential for prefrontal cortex (PFC) function, an important area for cognitive control and complex behaviors. Alterations in precortical serotonergic signalling have been implicated in the pathogenesis of a wide range of neuropsychiatric disorders. Tryptophan hydroxylase (Tph), which is expressed as two isozymes (Tph and Tph2), catalyzes the rate-limiting step in 5-HT synthesis and is considered one of the leading target genes for psychiatric and behavioral disorders. Tph2 is specifically expressed in the brain, whereas Tph is responsible for 5-HT synthesis in peripheral tissues. Objective: Our objective was to evaluate the effects of adult exposure to BPA on precortical Tph isozymes expression. Methods: Adult male and female Wistar rats were inyected subcutaneously during 4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental Protection Agency (EPA) reference dose. At 30 min after the final administration, rats were euthanized and the brains were stored at -80 C until analysis. Quantitative RT-PCR was used to quantify mrna levels of Tph and Tph2 in the PFC. Protein levels were quantified by Western blot. Results: BPA increased mrna and protein levels of Tph2 in the PFC of both male and female rats. No significant differences in Tph expression were observed after BPA treatment. Conclusion: We demonstrated for the first time that BPA, at a dose considered safe by the EPA, modifies Tph2 expression in the PFC of adult rats. Consequently, local synthesis of 5-HT might be altered. Given the role of 5-HT in several psychopathologies, further studies will be required to determine the impact of this finding. P02-46 Dissecting the role of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the molecular mechanisms that control liver regeneration in mice Judit López-Luque, Adoración Martínez-Palacián 2, Eva Crosas- Molist, Joaquim Moreno-Càceres, Daniel Caballero-Díaz, María García-Bravo 3, Esther Grueso 4, Jose-Carlos Segovia 3, César Roncero 2, Margarita Fernández 2, Aránzazu Sánchez 2, Isabel Fabregat 5 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Hospitalet de Llobregat, ES, 2 Dep. of Biochemistry and Molecular Biology 46

Granada 204 Pósters II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos-IdISSC, Madrid, ES, 3 Cell Differentiation and Cytometry Unit. Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas- CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed Unit - CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, 4 Division of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE, 5 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of Barcelona, Barcelona, ES Liver regeneration (LR) is a very complex and well-orchestrated phenomenon. The proliferation of hepatocytes is the main mechanism during LR, in response to mitogenic signals. Among them, epidermal growth factor (EGF) and hepatocyte growth factor (HGF) play essential roles. However, additional studies are necessary to understand if EGF and HGF pathways compensate one to each other in some aspects or if, on the contrary, they play unique roles during LR. Moreover, Ttansforming growth factor-beta (TGF-β) is important at the end of LR as it inhibits proliferation and maintains the liver in its correct size. To elucidate the specific role of the EGFR pathway during LR after partial hepatectomy (PH) in mice, we have generated a transgenic mouse expressing a truncated form of the EGFR (Alb-ΔEGFR) specifically in hepatocytes. The regenerative process after 2/3 hepatectomy in transgenic mice (ΔEGFR) was compared with that of wt mice (WT). Lack of EGFR kinase activity correlated with a delay in proliferation in regenerating hepatocytes, coincident with a higher activation of the TGF-β pathway. ΔEGFR mice also showed higher basal inflammation and differences in lipid metabolic changes during LR, being not able to induce the transient lipid accumulation in hepatocytes which precedes the peak of the proliferative phase. In spite of this delay in proliferation, ΔEGFR mice fully regenerated the liver, which means that other signaling pathways can be compensating the lack of EGFR signaling. In this line of evidence, HGF levels and Met (HGF receptor) phosphorylation were higher in ΔEGFR animals after PH. In summary, EGF plays diverse roles in liver after PH, but attenuation of its signaling is not crucial for the final regeneration of the liver. P02-47 Identificación de una firma de mirna asociada a la recurrencia temprana en cáncer de mama Luís G. Pérez-Rivas, José M. Jerez 2, Rosario Carmona 3, Vanessa de Luque, Luís Vicioso 4, M Gonzalo Claros 3, Enrique Viguera 5, Bella Pajares, Alfonso Sánchez, Nuria Ribelles, Emilio Alba, José Lozano 6 Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina de Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 2 Dpto. Lenguajes y Ciencias de la Computación, Universidad de Málaga-UMA, Málaga, ES, 3 Plataforma Andaluza de Bioinformática, Universidad de Málaga-UMA, Málaga, ES, 4 Servicio de Anatomía Patológica, Instituto de Biomedicina de Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 5 Dpto de Biología Celular, Genética y Fisiología Animal, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 6 Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga-UMA, Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina de Málaga-IBIMA, Málaga, ES La aparición de metástasis es un evento frecuente en pacientes operadas de cáncer de mama y suele estar asociado a una mayor mortalidad. El análisis de largas series de pacientes con amplio seguimiento ha puesto de manifiesto que la probabilidad de recaída no es constante en el tiempo, sino que sigue un patrón bimodal con un primer pico de incidencia a los 8-24 meses tras la cirugía (recurrencia temprana), seguido de un segundo pico de menor magnitud a los 60 meses aprox. (recurrencia tardía); pasado este periodo, el riesgo de recaída disminuye drásticamente. Por tanto, son necesarios marcadores moleculares que permitan detectar con precisión aquellas pacientes que presentan mayor riesgo de recurrencia temprana y diferenciarlas de aquellas con menor probabilidad de desarrollar metástasis. Con este propósito, hemos analizado tumores procedentes de 7 pacientes operadas de cáncer de mama atendiendo a los patrones de expresión de 06 microrna (mirna), pequeñas moléculas de RNA implicadas en el control de la expresión génica y que suelen encontrarse desreguladas en varias enfermedades, incluyendo cáncer. Se ha identificado y validado un grupo de cinco mirna cuya expresión está disminuida en tumores de pacientes con recurrencia temprana y menor supervivencia libre de progresión. Notablemente, esta firma de mirna permite discriminar eficientemente entre pacientes con bajo y alto riesgo de recaída temprana. El análisis de posibles mrna dianas empleando la información existente en varias bases de datos públicas sugiere una relación entre estos cinco mirna y la capacidad proliferativa y pro-angiogénica del tumor. P02-48 Maslinic acid is able to inhibit the osteoblastogenesis and adipogenesis in two different cell lines Eva E. Rufino Palomares, Amalia Pérez-Jiménez 2, Fernando J. Reyes-Zurita, Leticia E. García-Salguero, Juan Peragón 3, Pedro P. Medina, José A Lupiáñez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Biomaslinic, Enterprise, S.L, Granada, ES, 3 Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES Maslinic acid (MA) is a pentacyclic triterpene acid widely present in dietary plants and especially abundant in olive fruit skins. Thecompound has attracted much interest owing to its provenpharmacologic safety and its many biologic activities, such asanti-inflammatory, antiviral, antioxidant and antidiabetogenic activities as well as anticancer and antiastrocytoma properties. Moreover, some studies showed that this compound increase growth performance in animals. In this study, the MA effects on adipogenesis and osteoblastogenesis was determined in order to analyze some of the most important parameters related to obesity and metabolic syndrome. Results obtained indicated that the MA had a significant inhibitory effect on adipogenesis in the model pre-3t3-l adipocytes. This result coincided with the antagonistic effect of the compound on PPARγ and increased Ca 2+ cytoplasmic levels in presence of MA.Taken together, these results suggest that this compound inhibits the formation of adipose tissue.furthermore, it was also observed that the MA slightly increased glucose uptake in preadipocytes 3T3-L. This suggests that this compound might exert a beneficial effect in states of insulin resistance or hyperglycemia. The results alsoshowed that MA, in human mesenchymal cells (hmscs) derived from bone marrow, inhibited the adipogenesis, confirming its potential as anti-obesity and remodeling of body fat composition agent. Parallel, osteoblastogenesis in hmsc cells was analyzed, finding a weak induction of molecular markers that may be indicative of that MA positively affect bone regeneration. This study has been supported by the Feder-Interconecta Program by means of an investigation contract between University of Granada Foundation, Bio-57 research group and Biomaslinic S.L. company. P02-49 Cambios en el reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S por poblaciones de herogeneidad genética creciente del ARN del virus de la hepatitis C Samuel Prieto Vega, Celia Perales 2, Sunnie R Thompson 3, Raquel Romero García 4, J.I. Esteban 5, Esteban Domingo 2, Jordi Gómez Castilla 6 Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC), Armilla, ES, 2 CBMSO Madrid, Madrid, ES, 3 Dpt. Microbiology UAB Alabama, 47

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Birmingham Alabama, US, 4 Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES, 5 Institut de Recerca Hospital Universitari Vall Hebron, Barcelona, ES, 6 Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC), CIBERehd, Armilla, ES La región genómica 5 del virus de la hepatitis C contiene una zona de unión al ribosoma. Este dominio y sus flancos son ricos en elementos estructurales (estructuras ª, 2ª y 3ª) identificados in vitro por factores bioquímicos y biofísicos: interacción con micro ARN hepático mir-22, sensibilidad a RNAsas dependientes de estructura (RNAsa III y P), luz UV-c. Se obtuvieron poblaciones heterogéneas de ARNin vitro por PCR mutagénica y transcripción in vitro y en un cultivo, creciendo el virus en presencia de ribavirina. Evaluamos el efecto de la variabilidad en poblaciones de ARN (HCV-540) y de heterogeneidad genética creciente, en los motivos simples a los distintos niveles estructurales y evaluamos los cambios en la unión al ribosoma. El efecto de la heterogeneidad poblacional en el reconocimiento de los distintos factores varió a los distintos niveles estructurales, siendo especialmente perjudicial para la unión a la secuencia de mir-22 (estructura ª) y en el procesamiento por la RNasa P en la estructura tipo trna (estructura 3ª). El efecto sobre la RNasa III que reconoce ARN de doble cadena (estructura 2ª), fue menor, pero permitió identificar un cambio conformacional inducido por el incremento mutacional, validado en geles nativos y con RNasas de simple y doble cadena T y V. Se evaluó la kd para la union de 40S a cada población de heterogeneidad creciente in vitro obteniendo una pérdida de la afinidad por la subunidad 40S de hasta 3 veces con el incremento de las mutaciones. En cultivo celular, con y sin ribavirina, la acción de la selección natural sobre este dominio esencial para el virus, fue la de un incremento de la afinidad a la subunidad ribosomal 40S. Concluimos que el reconocimiento molecular, in vitro, de las estructuras 2ª es más estable que en las estructuras ª y 3ª y el dominio complejo RBS es el más sensible al incremento en la tasa de mutación. En cultivo, el virus puede aprovechar el incremento en la tasa de mutación durante su replicación para facilitar la selección de mutantes más activos en dominios esenciales como el RBS. P02r-50 Epigenetic regulation in dilated cardiomyopathy Alicia González, Ileana B. González, Arturo Bujarrabal, Susana González Faculty of Medicine, University of Castilla-La Mancha, Ciudad Real, ES. Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC, Madrid, ES Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the most common forms of cardiomyopathy with an estimated prevalence of /2500. DCM is characterized by left ventricular enlargement (LVE) and systolic dysfunction with an ejection fraction <50%. This disease commonly results in congestive heart failure with signs and symptoms such as shortness of breath, edema and increased heart rate, leading to death. DCM is a common reason for heart transplantation in adults and children. The mortality remains high without effective treatments. Further analysis focusing on the development of cardiomyopathy are required in order to improve treatment approaches and prognosis. Recent studies in our group show that BMI protein, which belongs to the epigenetic regulator Polycomb group, seems to be involved in cardiomyopathy development. In order to study what happens at very early stages of the disease, we have generated mice with conditional deletion of BMI (cko Bmi) in heart. This cko Bmi mice has been obtained by crossing a cko Bmi fl/fl mouse with mice bearing different cardiac specific CRE, such as αmyh6-cre ERT, inducible in adult myocardium by tamoxifen administration. The present work focuses on the caracterization of early stages of BMI- mediated dilated cardiomyopathy and the elucidation of the most important genes and proteins involved in cardiac dysfunction and heart failure. P02-5 Utilización de ipsc como modelo de estudio de una nueva enfermedad rara Pilar Mollinedo Sedano, José Antonio López-Escamez 2, Silvia Torices del Val, Verónica Ramos-Mejía 2, Pedro J. Real-Luna 2, José Luis Fernández-Luna, Domingo Gonzalez-Lamuño 3 FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2 Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, Granada, ES, 3 Universidad de Cantabria, Santander, ES Las nuevas tecnologías de análisis genómico y los nuevos modelos de enfermedad mediante reprogramación celular están siendo de gran importancia en el estudio de las enfermedades raras. Si bien estas enfermedades son de baja prevalencia (menos de 5 casos por cada 0.000 personas), en su conjunto (más de 7000 patologías distintas) tienen una notable incidencia en la población (afectan al 7% de la población mundial). Nuestro grupo está estudiando el caso de una niña de 7 años con sospecha clínica de un síndrome de poliendocrinopatía autoinmune (síndrome APECED), asociado a mutaciones en el gen AIRE. Sin embargo, la ausencia de mutaciones en este gen y la identificación de un cuadro clínico más complejo con miopatía, infecciones intestinales recurrentes y alteraciones conductuales, indica una entidad patológica nueva. Mediante CGH array de alta resolución (400K) se ha identificado una duplicación bialélica de 4. Kb en el cromosoma 2 que incluye el gen LINC0035 (long intergenic nonprotein coding RNA, Gene ID: 246704), un potencial regulador transcripcional. Con el fin de profundizar en el estudio genético de esta patología analizamos el exoma completo de la paciente y de sus padres. Se aportarán datos sobre ambos estudios. Simultáneamente estamos desarrollando un modelo de enfermedad transduciendo células mononucleares de la paciente con vectores virales reprogramadores (ipsc,induced pluripotent stem cells). Estas ipsc se diferenciarán a distintos linajes celulares (músculo, linfocitos, epitelio, neuronas) con relevancia en la patología estudiada, con el fin de identificar alteraciones en el patrón de diferenciación o maduración celular que permitan explicar al menos parte del cuadro clínico de la paciente. Este modelo podría ser utilizado para el desarrollo de estrategias terapéuticas, tanto genéticas como farmacológicas. Presentaremos datos preliminares de este modelo celular. P02-52 Identificación de variantes génicas relevantes de la vía de NFκB y sus consecuencias funcionales en pacientes con artritis reumatoide Silvia Torices del Val, Ignacio Varela Egocheaga 2, Thaidy Moreno Rodríguez 2, Pilar Mollinedo Sedano, Alejandro Balsa Criado 3, Dora Pascual Salcedo 3, Lorena Álvarez Rodríguez, Marcos López Hoyos, José Luis Fernández Luna, Víctor Martínez Taboada FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2 IBBTEC, Universidad de Cantabria, Santander, ES, 3 Hospital La Paz, Madrid, ES NFκB es uno de los principales moduladores de las respuestas inmune e inflamatoria. Diversos estudios en pacientes con artritis reumatoide (AR) sugieren que NFκB es esencial para la expresión de citocinas proinflamatorias y de enzimas que promueven la destrucción articular. Nuestra hipótesis de trabajo es que pueden existir mutaciones en los principales genes involucrados en la regulación de NFκB que pueden tener consecuencias funcionales relevantes y por tanto asociarse bien con la susceptibilidad a padecer AR, o bien con el pronóstico de la enfermedad. Para comprobar esta hipótesis, hemos analizado por medio de técnicas de secuenciación de nueva generación 58 genes reguladores de la vía NFκB en 66 pacientes con AR y en 30 controles sanos, obteniendo un total de 942 variantes génicas. Seleccionamos trece de estas variantes, afectando a 0 genes (TLR0, TLR, TLR7, TLR8, NLRP7, NFκBIZ, NOD2, TNIP, TRIP6 y BCL0) de acuerdo a la presencia de diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia del polimorfismo entre la población control y los pacientes con AR, la frecuencia alélica de la mutación en la población 48

Granada 204 Pósters general, el impacto del polimorfismo a nivel de la proteína y la función reguladora que estos genes tienen en la ruta NFκB. Estas variantes fueron confirmadas en una cohorte de 400 pacientes con AR y 200 controles sanos mediante secuenciación masiva. A fin de determinar las posibles consecuencias funcionales de las variantes, se han comenzado estudios para determinar el nivel de actividad de NFκB mediante ensayos con luciferasa como gen reportero y expresión de citocinas pro-inflamatorias por PCR cuantitativa. Presentaremos datos preliminares sobre la posible participación de algunas de estas variantes génicas en el desarrollo o evolución de la artritis reumatoide. P02-53 Data mining en Drosophila para la identificación y caracterización de nuevos genes implicados en la biogénesis de la función OXPHOS Sara Palacios Zambrano, Ramiro Vicente, Paula Clemente Pérez, Susana Peralta, Lucía Echevarría, Rafael Garesse, Miguel Angel Fernández-Moreno Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Alcobendas, ES La mitocondria es un orgánulo celular de origen endosimbionte que juega un papel central en el metabolismo de la célula hospedadora destacando su implicación en: (i) la síntesis de la mayor parte de la energía (ATP) celular (ii) la regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), (iii) el control de la homeostasis del Ca 2+ intracelular y (iv) el control del proceso de muerte programada o apoptosis. Entre estas funciones, se considera la síntesis de ATP mediante el sistema cadena respiratoria (CR)/OXPHOS como la más relevante y cuya disfunción genera las denominadas enfermedades mitocondriales. El CR/OXPHOS está formado por numerosas subunidades estructurales, de las que 3 están codificadas en el propio genoma mitocondrial (mtdna) y más de 80 en el DNA nuclear. Para la biogénesis de este sistema se requieren, además, los elementos que las ensamblan y los numerosos componentes de la maquinaria de replicación y decodificación del genoma mitocondrial. Mutaciones en cualquiera de ellos pueden provocar defectos responsables de numerosas patologías denominadas enfermedades mitocondriales. En más de la mitad de las patologías mitocondriales de base genética se desconoce el gen o genes causantes. La identificación de genes no descritos implicados en defectos OXPHOS es uno de los retos actuales en este área. En este sentido, la utilización de Drosophila como modelo puede suponer una herramienta adicional para ello. Drosophila posee una molécula de mtdna similar a la de mamíferos y conserva los mismos elementos responsables de su replicación, transcripción, mantenimiento, etc. El rastreo de diferentes bases de datos nos han permitido identificar la presencia de genes esenciales para la función OXPHOS situados sobre bicistrones, es decir, codificados en un mismo mrna, recordando una organización procariota. Los ortólogos en mamíferos de algunos de esos genes han sido recientemente caracterizados en el laboratorio. Para caracterizar otros nuevos candidatos procederemos a utilizar aproximaciones de interferencia de RNA y de generación de knock-outs mediante el sistema CRISPR/Cas. P02-54 Los sistemas toxina-antitoxina controlan la infección por Salmonella typhimurium Damián Lobato Márquez, Inmaculada Moreno Córdoba, Viginia Figueroa 2, Francisco García del Portillo 2, Ramón Díaz Orejas Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC), Madrid, ES, 2 Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es una bacteria patógena intracelular Gram-negativa que puede persistir en el organismo infectado durante un período prolongado de tiempo. Es el agente causal de enfermedades humanas de diversa severidad, desde gastroenteritis hasta infección sistémica crónica. Como la mayoría de las bacterias, esta especie contiene en su genoma sistemas toxina-antitoxina (TA). Los sistemas TA son módulos formados, generalmente, por dos genes adyacentes, que están agrupados formando un operón. Uno de los genes codifica una antitoxina, que puede ser un RNA o una proteína, y el otro una toxina que es siempre una proteína estable capaz de interferir con la proliferación o viabilidad de la bacteria. La activación de estos sistemas está asociado a la respuesta a estrés, y más recientemente se ha visto que pueden favorecer la supervivencia del patógeno durante la infección. Nosotros hemos realizado una búsqueda sistemática y un análisis funcional de los sistemas TA de S. typhimurium, determinando que la mayoría de los sistemas TA identificados son funcionales. Además, hemos analizado, utilizando un modelo de infección de fibroblastos, el papel de estos sistemas en la persistencia intracelular. El análisis ha permitido identificar un subgrupo de sistemas TA que se expresan en la célula huésped y cuya presencia favorece la supervivencia y/o proliferación limitada de S. typhimurium en el interior de la célula infectada. Los datos demuestran un papel activo de un grupo de sistemas TA en la persistencia de Salmonella en fibroblastos infectados. P02-55 Expresión, caracterización enzimática e interés biomédico de la pirrolin 5-carboxilato sintetasa humana, una enzima clave en la biosíntesis de prolina y ornitina Juan Manuel Escamilla Honrubia, Clara Marco Marín, Nadine Gougeard 2, Vicente Rubio 3 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, 2 Centro para Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Raras CIBERER-ISCIII, Valencia, ES, 3 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER-ISCIII, Valencia, ES La -pirrolin-5-carboxilato sintetasa (P5CS) es un enzima bifuncional que cataliza los dos pasos iniciales de la biosíntesis de novo de prolina y ornitina (y a través de ornitina, arginina) en animales y plantas, siendo su déficit un error congénito transmitido con herencia recesiva en unos casos y dominante en otros. Con la finalidad de establecer las características bioquímicas y funcionales de esta enzima e intentar determinar su estructura, así como para explorar los efectos de las mutaciones clínicas, tratando de entender su dominancia o recesividad, hemos expresado la P5CS recombinante humana como proteína de fusión con MBP, de la que eliminamos luego la MBP por procedimientos estándar. Nuestro sistema de expresión usa baculovirus/células de insecto Sf9, no habiendo tenido éxito con sistemas de expresión bacteriana y escaso rendimiento con la expresión usando células HEK293. Hemos generado, estables y activas, las dos formas de splicing alternativo de la enzima, determinando las características cinéticas de sus dos reacciones parciales (glutamato 5-quinasa, G5K; y glutamil 5-fosfato reductasa, G5PR) y de la global, estudiando su grado de acoplamiento, y corroborando que sólo la isoforma más corta experimenta retroinhibición por ornitina. Probamos que la estructura cuaternaria de la enzima es hexamérica, de acuerdo con la dominancia negativa propuesta para explicar los casos de herencia dominante. Los ensayos con mutantes dominantes han demostrado tendencia a la rápida desagregación. Los experimentos cristalográficos no han generado por el momento resultados positivos. Ayudas Prometeo 2009/05 (Generalitat Valenciana) y BFU20-30407(MINECO). N. Gougeard es contratada CIBERER. 49

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P02-56 A novel liquid chromatography coupled with a tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method to assess LpxC inhibition Caridad Díaz Navarro, Victoria Knight-Connoni 2, Kevin Barry 2, Olga Genilloud, Francisca Vicente Pérez, José Pérez del Palacio Fundación MEDINA, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES, 2 Cubist, Lexington, MA, Lexington, US LpxC, an essential enzyme for lipid A biosynthesis in gram-negative bacteria, represents an attractive target for therapeutics. However, antibacterial drug discovery efforts focused on inhibitors of LpxC have found that the enzyme assay is not suitable for high-throughput screening using conventional technologies such as assays with radiolabeled substrates involving charcoal or TLC separation and fluorescence-based methods that detect the free amine in the reaction product by coupling to fluorescamine. These methods are cumbersome and vulnerable to false-positive hits due to fluorescence quenching. In this work we present a novel liquid chromatography coupled with a tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method which offers a fast, sensitive, and reliable alternative to the typical LpxC inhibition assay. It employs mass spectrometry to directly detect product with high sensitivity. Using this system, the data collected illustrate enzyme concentration linearity and standard kinetics for conditions used in screening for LpxC inhibitors. Additional validation experiments, such as DMSO tolerance and reference inhibitor (Chir90) testing, were also carried out successfully. This method represents the first communication of a methodology for the separation of the enzymatic reaction product by mean of conventional high pressure liquid chromatography (HPLC) which makes feasible the implementation of a screening for antibacterial inhibitors of the LpxC using a high-throughput mass spectrometry assay in many drug discovery setups. P02-57 El sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer y el envejecimiento Jorge de la Rosa, Carlos López-Otín 2, Juan Cadiñanos 3 Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias (IMOMA) - Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto Universitario de Oncología (IUOPA), Universidad de Oviedo, Oviedo, ES, 2 Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias (IMOMA), Oviedo, ES, 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto Universitario de Oncología (IUOPA), Universidad de Oviedo, Oviedo, ES Los avances producidos en los últimos años en torno al envejecimiento han sido favorecidos por el estudio de los denominados síndromes progeroides humanos, cuyos pacientes desarrollan de manera prematura y exacerbada múltiples alteraciones características de la edad avanzada. Las conocidas como laminopatías progeroides se engloban dentro de este grupo de patologías y, mayoritariamente, se deben a defectos en el procesamiento de la proteína de la envuelta nuclear, denominada lamina A. Esta proteína es sintetizada como un precursor, la prelamina A, que debe sufrir una serie de modificaciones post-traduccionales hasta dar lugar a la proteína madura. En la última etapa de su procesamiento interviene la proteasa Zmpste24, cuya participación se conoce desde hace más de una década gracias al trabajo del laboratorio de Carlos López-Otín, de la Universidad de Oviedo. Entonces, la generación de ratones deficientes en esta proteasa puso de manifiesto la incompatibilidad de los defectos en el sistema Zmpste24/prelamina A con el desarrollo normal del organismo. Más recientemente, estudios realizados por el mismo grupo con este modelo murino han permitido el desarrollo de nuevas terapias para combatir estas enfermedades. Dado que el envejecimiento y el cáncer son procesos íntimamente relacionados, el sistema Zmpste24/prelamina A podría estar también implicado en el desarrollo tumoral. Sin embargo, la corta esperanza de vida de los ratones deficientes en Zmpste24 en relación al tiempo de desarrollo de los procesos tumorales ha dificultado el abordaje de esta cuestión. El presente trabajo, surgido de la colaboración entre los laboratorios de López-Otín y Juan Cadiñanos, del Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias, y enmarcado dentro del proyecto de tesis doctoral de Jorge de la Rosa, ha permitido estudiar la implicación de este enzima y su sustrato en el cáncer. Para ello se generaron ratones mosaico de Zmpste24, en los que aproximadamente la mitad de las células del organismo carecen de esta proteasa y, por tanto, acumulan prelamina A. Sorprendentemente, estos ratones son fértiles y no experimentan síntomas de envejecimiento acelerado, pese a que las células con prelamina A persisten en proporciones similares a las células normales. En consecuencia, resultan prometedores tanto el desarrollo de terapias génicas y celulares como el suplemento de factores sistémicos para el tratamiento de estas enfermedades. Asimismo, la esperanza de vida normal de estos ratones permitió estudiar la relevancia del sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer. La aplicación de distintos protocolos de carcinogénesis en ratones mosaico y ratones control permitió observar que los primeros presentaban un menor número de tumores infiltrantes. Igualmente, el silenciamiento de ZMPSTE24 en distintas células tumorales humanas redujo significativamente su capacidad invasiva. Estos resultados sugieren por primera vez que la proteasa ZMPSTE24 podría ser una diana antitumoral. P03. Biología del desarrollo P03- Single-enhancer KO to study the formation of the epaxial musculature during mouse embryonic development Macarena López Mayorga, Natalia Moncaut 2, Maria Rosa Giráldez Perez, Lydia Teboul 3, Cristina Bernal Lozano, Ana Castro Cañal, Jaime Carvajal García-Valdecasas Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Sevilla, ES, 2 The Institute of Cancer Research, London, UK, 3 MRC-Harwell, Oxfordshire, UK The determination and specification of skeletal muscle in vertebrates is orchestrated by the myogenic regulatory factors Myf5, Mrf4, MyoD and Myogenin. Myf5 is the first to be expressed in the embryo, initiating and co-ordinating the myogenic cascade. In absence of Myf5, progenitors fail to be specified at the correct time but activation of MyoD rescues the phenotype and myogenesis progresses. Myf5/MyoD KO animals lack all skeletal muscles. Myf5 transcription is controlled by over 25 regulatory elements which drive expression in a specific spatiotemporal manner. Although their contribution to the expression pattern is well defined we still lack an understanding on the role of the different subpopulations of muscle progenitor cells. Furthermore, there is still no connection between the spatiotemporal activation of Myf5 and its function within a particular set of myogenic precursors. The Early Epaxial Enhancer (EEE) operates in the dermomyotomal dorsomedial lip and is the first enhancer to activate Myf5. In order to address these questions we have generated a new enhancerspecific KO strain in which the EEE has been targeted. By RNA-seq, we have identified three gene-networks that show clear differences between the WT and KO embryos; two of these networks are involved in myogenesis. qpcr has been used to validate the data and preliminary analyses of the expression patterns of some of the genes in these networks also confirms these findings. Crucially, we have crossed this new allele into the MyoD KO strain and show that in the absence of MyoD rescue, specific back muscles are lost or severely reduced, resulting in severe scoliosis of the spine. We are now in the process of identifying all the muscle groups that may be affected in this double KO as this will allow us to generate a map of the musculature that originates from the dorsomedial lip of the dermomyotome. 50

Granada 204 Pósters P03-2 Adhesion to the Fibronectin synergy site could be critical for platelet function María Benito Jardón, Joaquín Lilao Garzón, Mercedes Costell Rosselló Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universitat de Valencia, Burjassot, ES Fibronectin (FN) is a core component of many extracellular matrices (ECM) where it regulates a variety of cell activities through direct interactions with integrins. The fibrillar organization of FN precedes the assembly of other ECM proteins. FN fibrillogenesis is a cell driven process that requires integrins, which bind the RGD motif in the 0th type III module (FNIII0). The RGD motif can bind αvβ3 and α5β on mesenchymal cells and αiibβ3 integrins on platelets. While the RGD site is sufficient for αvβ3 to bind and assemble FN, it has been claimed that α5β also requires residues in the flanking module (FNIII9), called synergy site, for FN binding and fibrillogenesis. Aimed at studying the role of the synergy site in vivo, we generated a mouse strain in which key residues of the synergy site were mutated (FNSyn mice). Surprisingly, FNSyn mice are born without apparent phenotype indicating that this site is not essential for α5β binding during embryogenesis. However, a slight increase in the tail bleeding time and a pronounced delay in skin wound closure suggest a critical role of the synergy site for platelet and skin cell adhesion to FN. To eliminate a potential compensatory effect of αvβ3 integrins, we crossed the FNSyn mice with a mouse strain lacking the expression of β3 integrins. The β3 integrin-null mice suffer from a Glanzmann-like thrombasthenia, a bleeding disorder that was exacerbated in the double mutants. About 87% of β3 integrin-null mice are born and of those around 20% will die in the following weeks. However, when mice lack β3 integrins as well as the FN-synergy site the 96,2% succumb before E7.5 (5 mice analyzed at E7.5-P2) of severe hemorrhages and a failure to separate blood and lymphatic vessels. These findings demonstrate that β3 integrins only partially compensate the lack of a functional FN-synergy site. We are currently testing how the synergy site promotes adhesion and will discuss these results and the implications for human hemostasis at the meeting. P03-3 (R03-9-) Developmental origin of the coronary endothelium. Of elephants and blind men Ramón Muñoz-Chápuli Universidad de Málaga, Málaga, ES The developmental origin of the coronary endothelium has been the matter of a debate in recent years. The classical view of a sprouting of the coronary arteries from the aortic root was abolished 30 years ago by the evidence of a coronary ingrowth, i.e. a primary coronary capillary plexus appears in the subepicardium, surrounds the truncus arteriosus and finally connects with the aortic lumen. The question then was the origin of the subepicardial capillary plexus. Different hypothesis have been postulated to explain this origin, basically angioblasts migrating from the developing liver, outgrowth of the sinus venosus endocardium, angiogenesis from the ventricular endocardium or cells delaminating from the epicardium. This latter option has been particularly controversial, since experimental evidence has been provided either supporting or ruling out an epicardial contribution to the coronary endothelium. We have studied coronary development in a number of murine transgenic lines, and we have concluded that the embryonic and the neonatal coronary endothelium is a mosaic of endocardial-derived and epicardial-derived cells, in a ratio of about 3:, receiving later a postnatal contribution from circulating endothelial progenitors. As in the Indian story of the elephant and the blind men, different reports had detected only a part of the whole picture, attributing to the coronary endothelium a single origin. The endothelial developmental heterogeneity could be relevant in order to explain the existence of atherosclerotic lesion prone sites in the coronary arteries. P03-4 Dose dependent pitx2 loss of function impairs zfhx3, wnt8a and calcium handling; novel links to atrial arrhythmogenesis Estefanía Lozano-Velasco, Francisco Hernández-Torres, Jorge Domínguez Macías, Leif Hove-Madsen 2, Juan Cinca 3, Amelia Aránega Jiménez, Diego Franco Jaime Departamento Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2 CSIC-ICCC, Barcelona, ES, 3 Hospital Sant Pau, Barcelona, ES Atrial fibrillation (AF) is the most common cause of arrhythmogenesis in humans yet the genetic cause of AF remains elusive. Recent genome-wide association studies (GWAS) have reported risk variants in four distinct genetic loci (4q25, q2, 6q22 and 6q3) which have been associated with AF. Among them, the most significant are 4q25 risk variants, which are located in the vicinity of the PITX2 gene. Given the key developmental role of Pitx2 during cardiogenesis and particularly its role in pulmonary vein deployment, it has been postulated that Pitx2 dysfunction might be the molecular link to AF. Experimental evidences in distinct laboratories, including ours, have demonstrated that Pitx2 loss of function predisposes to atrial arrhythmogenesis. However, the molecular mechanisms driven by Pitx2 in this context remain somehow elusive, proposing either embryonic or mature gene expression defects. In order to get further insights into the molecular mechanisms driven by Pitx2 and their putative relation with novel AF GWAS associated genes, we have generated a new Pitx2 conditional mouse line, by intercrossing Sox2Cre and Pitx2floxed mice. Epiblast deletion of Pitx2 leads to the generation of heterozygous and systemic null Pitx2 null mutants, respectively. As expected, embryonic mortality and cardiac defects were similarly observed in Sox2CrePitx2 null mice as those previously reported for Pitx2 knock-out mice. Molecular analyses of the left atrial appendage in heterozygous Sox2CrePitx2 mice (20-30% reduction in Pitx2 expression) and atrialspecific NppaCrePitx2 null mice (60-70% reduction in Pitx2 expression) demonstrate that AF GWAS associated genes such as Zfhx3, Kcnn3 and Wnt8a are severely impaired while other such as Cav, Synpo2l or Prrx are not. Surprisingly, beta-adrenergic signaling is not altered in these models whereas multiple calcium handling genes such as Serca2a, calsequestrin, phospholamban are severely impaired in atrial-specific NppaCrePitx2 null mice but not in heterozygous Sox2CrePitx2 mice. Functional assessment of calcium handling further underscores these findings. Importantly, neither Zfhx3 nor Wnt8a gain-of-function or lossof-function experiments impairs Pitx2 expression, suggesting that Pitx2 is upstream of these genes. Furthermore, these data suggest a dose dependent relation between Pitx2 expression and the susceptibility to display basal or only inducible electrophysiological defects. We are currently studying the hierarchical between Pitx2, AF GWAS associated genes and calcium handling, as well as to putative involvement of post-transcriptional modulators such as micrornas. P03-5 (R03-9-6) Filopodia mediate Hedgehog transport and signalling Isabel Guerrero Vega CSIC - UAM, Madrid, ES The Hedgehog (Hh) signalling pathway is a highly conserved regulator of patterning during development and homeostatic events in adult organs. Hh also directs tissue-patterning acting as a morphogen. To signal in a concentration dependent manner requires a graded distribution of Hh from producer to receptive cells. During production, Hh undergoes two lipid modifications resulting in a highly hydrophobic molecule with a cholesterol tag at the C-terminal and a Palmitoylation at the N-terminal. Hh lipid modifications are needed to achieve a graded distribution, but constrains its extracellular movement, leading to debate about how Hh is transported to target cells. We show that Hh and most of the extracellular 5

Pósters XXXVII Congreso SEBBM components of the Hh signaling localize in filopodia-like structures or cytonemes arising at the basolateral side of Drosophila wing disc and abdomen epithelia. In vivo imaging, using actin reporters, and membrane markers, such as the CD4 or the Hh co-receptor Ihog fused to fluorescent tags, shows that these cytonemes are very dynamic and their extension correlates spatially and temporally with the formation of the Hh gradient. Mutant conditions for proteins required for actin dynamics affect both cytoneme formation and Hh gradient extension. In addition, in vivo vesicle-like structures are visualized moving along cytonemes in anterograde direction. Immunoelectron microscopy also shows Hh, the Hh co-receptor Ihog, and other Hh pathway components located in extracellular vesicles of heterogeneous size (ranging from 50 to 250 nm) at the Drosophila wing imaginal disc. These vesicles present Hh in the outer side of the double membrane. Biochemical characterization of the exosomal fraction of Drosophila cultured cells indicates the presence of active Hh and co-receptor Ihog together with exosome markers. Furthermore, RNA interference for genes necessary for production/ release of exovesicles has a direct effect over Hh secretion and signaling in vivo and in vitro, indicating that Hh is transported in bonafide exosomes. We propose that a Hh intracellular trafficking in the producing cells allows Hh to be released in exosomes and cytonemes. In our view this membrane anchored Hh dispersion could represent an advantage for a lipid-modified molecules to be spatially regulated to form a gradient. Furthermore, we show that this signaling mechanism based on cell-cell contact is similar to the synaptic process in neuronal cells. P03r-6 Caracterización del tejido linfoide asociado al intestino en ratones SAMP8 propensos al envejecimiento Alba Garcia-Just, Lluïsa Miró 2, Anna Pérez-Bosque, Concepció Amat, Miquel Moretó Departament de Fisiologia, Facultat de Farmàcia, Institut de Nutrició i Seguretat Alimentària, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES, 2 APC Europe, Granollers, Barcelona, ES El envejecimiento es un proceso caracterizado por un incremento de la susceptibilidad a determinadas enfermedades y patologías. En este sentido, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) tiene un papel fundamental en las funciones de barrera y de defensa frente a patógenos externos. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar el GALT en distintas etapas del desarrollo, en un modelo de ratones senescentes, para su utilización futura en estudios de los efectos de la dieta sobre indicadores mucosales (intestinales) de envejecimiento. Se han utilizado ratones propensos al envejecimiento de la cepa SAMP8 y resistentes al envejecimiento acelerado (SAMR). Se han obtenido los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) y las placas de Peyer (PP) del intestino delgado, a las 3 semanas, a los 4 y 9 meses. Se ha realizado el recuento linfocitario de los dos tejidos y la cuantificación de la actividad SA-β-galactosidasa (indicador de senescencia) por citometría de flujo. Los ratones SAMP8 presentan una disminución del peso de los GLM a los 4 y 9 meses, con una reducción significativa del número de leucocitos respecto a los SAMR (69% y 57%, respectivamente; p<0,05). En las PP, se observa una reducción del 35% (p<0,05) pero sólo a los 9 meses de edad. En ambos grupos, la actividad SA-β-galactosidasa de los linfocitos ganglionares aumenta con la edad, siendo mayor en los ratones SAMP8 que en los SAMR (p<0,05). Estos resultados demuestran que el envejecimiento se caracteriza por una inmunosupresión en el GALT, que podría explicar la mayor susceptibilidad a infecciones y patologías asociadas al envejecimiento. Asimismo estos resultados sugieren que los ratones SAMP8 son un buen modelo para el estudio de la senescencia. P03-7 (R03-9-3) Spiracle formation and tissue remodeling during Drosophila development: a vertex model approach Javier Argüello, Kai Dierkes, Arturo D Angelo, Jerome Solon Cell and Developmental Biology Group, Biomechanics of Morphogenesis, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona, ES Strong efforts are being made to understand how large-scale tissue movements emerge during morphogenesis. In this study, we analyze how the development of spiracles in embryos of the fruit fly Drosophilacould generate forces inducing tissue remodeling. High-resolution time-lapse movies of tomato-e-cadherin and histone-rfp expressing embryos show a simultaneous migration of spiracles and posterior epidermal cell layers toward the posterior part of the embryo. To explain the mechanics of this process, we discuss two different interplays of forces: (A) during its development, spiracles push the tissue; (B) the tissue is originally moving and pulls the spiracles. The dynamics of the system is computationally simulated under both conditions using a 2D vertex model that takes into account the surface elasticity of cells, contractility of the acto-myosin cortex and adhesion between neighbor cells, as well as the boundary conditions of pushing (A) or pulling (B). Tissue movements within the simulations of the two different cases (A and B) are then compared with the in vivo situation using Particle Image Velocimetry (PIV). We show meaningful differences between the simulations and the experimental evidences when the tissue is pulled, while the pushing boundary condition generates a general movement close to in vivo. Our work suggests that tissue flow is the consequence of pushing forces generated during the formation of spiracles in Drosophila. P03r-8 mirnas 22 and 32 are involved in morphine effects on cell proliferation through BDNF regulation Ada Jiménez González, Adrián García Concejo, Raquel E. Rodríguez Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES Morphine effects on cell proliferation in Central Nervous System (CNS) have been studied over the last years. It is known that this drug alters the proliferative cell expression patterns. In the present work, we have analyzed whether morphine is triggering these changes in zebrafish development through epigenetic factors such as mirnas 22 and 32 and their involvement on BDNF expression. These mirnas appear in the same genetic cluster and have important roles through different pathways on CNS development. To studied mirna 32 levels during zebrafish development, we performed qpcr in several developmental stages, finding an increase and decrease of its levels along the development. We also checked the effects of morphine and the involvement of mirna 32 in the opioid pathway by knocking down the mu opioid receptor, finding that the levels of mirna 32 changed between the control group and morphine treated embryos. These results indicate that morphine is triggering its proliferation effects through a different pathway than the one triggered by the mu receptor. Futhermore, when we studied mirna 32 in mirna 22 morphants we found an increase in these levels, which suggests that mirna 32 is trying to balance the absence of mirna 22. Besides, we have found changes in BDNF protein expression levels in morphine treated embryos and when the mu opioid receptor and mirna 22 were knocked down at 48 hpf. These results suggest that BDNF, an essential neurotrophin for the correct development of the CNS, has an important role in the mechanisms triggered by morphine, leading to a better understanding of the influence of morphine in the mechanisms of pain and addiction processes. 52

Granada 204 Pósters P03r-9 Changes in dopaminergic development in zebrafish embryos after morphine exposure mediated by mirna-22 and mirna-29a Adrián García Concejo, Ada Jiménez González, Raquel E. Rodríguez Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES Several studies have shown that the levels of expression of mirna-22 are modified after drug exposure, which may indicate a relation between this molecule and the appearance of tolerance. In addition, mir- 29a has been related to Notch signaling, which is known to mediate dopaminergic differentiation at the early stages of Central Nervous System development. We have performed a study of the expression levels of mir-22 during the normal development of zebrafish embryos, to determine the stages in which this mirna is more expressed. Our results have shown that after morphine exposure the levels of micrornas 29a and 22 are altered, pointing to a relation between these two molecules. To analyze a possible cross-talk between Notch and opioid signaling we used DAPT, an inhibitor of the metalloproteases needed to activate this pathway, and mindbomb mutants, where Notch pathway is disrupted, in addition to oprm morphants (lacking opioid signaling). Our results show that these two cascades are antagonic when influencing dopaminergic differentiation. Using a luciferase assay, we have also demonstrated, that mir-22 effectively represses oprm expression by interacting with the 3 UTR of the mrna. We hence proposed a mechanism by which morphine is regulating the expression of mu opioid receptor and inducing the appearance of tolerance. Finally, the expression patterns of some dopaminergic markers, such asth, pitx3 and nurr, were modified, leading to a totally new pattern of expression, with all these genes being expressed in the midline. The understanding of these mechanisms that involve both signaling pathways could lead to unravel the initial stages of the addictive process. P04. Biología molecular computacional P04- (R04-3) Predicted structure and function of divergent members of prokaryotic flavin adenine dinucleotide synthetase (FADS) proteins Inmaculada Yruela, Patricia Ferreira 2, Bruno Contreras-Moreira 3, Milagros Medina 2 Estación Experimental de Aula Dei, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (EEAD-CSIC), Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, ES, 3 Estación Experimental de Aula Dei, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (EEAD-CSIC), Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Fundación ARAID, Zaragoza, ES Flavin adenine dinucleotide synthetases (FADSs) are well-known as a group of prokaryotic bifunctional enzymes that carry out the dual functions of riboflavin phosphorylation to produce flavin mononucleotide (FMN) and its subsequent adenylylation to generate FAD (hereafter FADS-type I). An extensive bioinformatics survey using the available genomes in public databases revealed that certain gram-positive pathogenic bacteria (i.e. Listeria monocytonegens, Listeria welshimeri, Lactobacillus plantarum, Bacillus cytotoxicus) and plant chloroplasts contain also variants of FADS sequences, named FADS-type II and plant-like FADS, respectively. Both variants of FADS proteins constitute distinct evolutionary classes characterized by shorter and non-conserved C-terminal domains. The putative structures and functions of the C-terminal domains of the FADStype II from Listeria monocytonegens (LmFADS-typeII) and plant-like FADS from Glycine max. have been investigated. Previous results pointed out that the C-terminus domain of plant-like FADS proteins could contain a catalytic activity (i.e. hydrolase or phophatase), but different to that of their prokaryotic counterparts []. On the contrary, our recent investigations suggest that the C-terminus domain of LmFADS-type II might be related with the pathogenic activity of gram-positive bacteria, in particular with the defence of bacteria against the lytic action of host lysozimes [2]. This work is a contribution to our understanding of the evolutionary history of FADS enzymes. References [] I. Yruela, S. Arilla-Luna, M. Medina, B. Contreras-Moreira. Evolutionary divergence of chloroplast FAD synthetase proteins (200) BMC Evol. Biol. 0:3. [2] S. Leysen, L. Vanderkelen, S.D. Weeks, C.W. Michiels and S.V. Strelkov. Structural basis of bacterial defense against g-type lysozymebased innate immunity (203). Cell. Mol. Life Sci. 70:3-22. P04-2 (R04-5) Late-replicating heterochromatin fuels genome evolution Daniel Rico Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES Asynchronous DNA replication of the genome has been associated with different mutation rates and copy number variation (CNV) in human populations. The late replication is generally associated to heterochromatic regions that tend to suffer high replicative stress. CNVs typically involve intermediate to large regions, providing a potential substrate for the generation of new genes through gene duplication. We have elucidated the possible relevance of the association of CNV regions with later DNA replication times on gene birth and evolution. Our analyses show that most human genes duplicated in the Primate lineage are located in late replicating CNV regions. We have traced the relationship between replication timing and the evolutionary age of duplicated genes. Strikingly, we have found that the more recently a gene has been duplicated the later it is replicated in human and mouse cells. These results suggests that the currently active accumulation of CNVs in late replicating regions has being also persistently and extensively influencing genome evolution throughout animal history. We propose a new evolutionary model [] based on these observations in which chromatin structure and replication dynamics conditions gene birth and the rising of new protein functions. References [] Juan,D. Rico, D, et al. (203) Late-replicating CNVs as a source of new genes. Biol Open, 2, 402 4. P04-3 The human DNA damage response network database of proteins Eduardo Andrés León, Ildefonso Cases 2, Ana M. Rojas Mendoza Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocio/CSIC/Universidad de Sevilla - Computational Biology and Bioinformatics, Sevilla, ES, 2 Genomics and Bioinformatics Platform of Andalusia, Cartuja Scientific and Technology Park INSUR Building, Sevilla, ES The DNA damage response (DDR) is an essential signaling network that protects the integrity of the genome. This network is built upon a repertoire of distinct but often overlapping sub-networks, where sometimes the same components have different roles in precise spatial and temporal scenarios. Perturbations of this network produce genomic instability, which is 53

Pósters XXXVII Congreso SEBBM inherently related to aging (Fernandez-Capetillo 200), disease (Ciccia and Elledge 200), and cancer, reviewed in (Lukas, Lukas et al. 20). Despite its importance, evolutionary studies addressing the emergence of this network were restricted to few protein families (On, Xiong et al. 200). In this line, we have recently provided the largest systematic analyses of the human DDR network and have analysed its evolutionary properties (Arcas, Fernandez-Capetillo et al. 204). To complement this study, we have built a resource to explore these data, in an evolutionary context. From this database, it is possible to select genes according with its function in a particular pathway or network, according with post translational modifications (PTMs) where the gene acts as a target or a modifier and also by sequence similarity. When searching for PTMs, affected residues and links to Pubmed articles are provided. In this tool, it is easy to find DDR proteins that emerged at the same age, or involved in same networks/pathways, and also affected by similar PTM modifiers. When a DDR protein is selected, a detailed view displays information regarding its emergence and conservation across 47 species, the overall agreement with the taxonomic tree, and the position of a posttranslationaly modified residue in a structure when available. This resource is available at: http://ddr.cbbio.es. References Arcas, A., O. Fernandez-Capetillo, I. Cases and A. M. Rojas (204). Emergence and evolutionary analysis of the human DDR network: implications in comparative genomics and downstream analyses. Mol Biol Evol 3(4): 940-96. Ciccia, A. and S. J. Elledge (200). The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell 40(2): 79-204. Fernandez-Capetillo, O. (200). Intrauterine programming of ageing. EMBO Rep (): 32-36. Lukas, J., C. Lukas and J. Bartek (20). More than just a focus: The chromatin response to DNA damage and its role in genome integrity maintenance. Nat Cell Biol 3(0): 6-69. On, T., X. Xiong, S. Pu, A. Turinsky, Y. Gong, A. Emili, Z. Zhang, J. Greenblatt, S. J. Wodak and J. Parkinson (200). The evolutionary landscape of the chromatin modification machinery reveals lineage specific gains, expansions, and losses. Proteins 78(9): 2075-2089. P04-4 (R04-6) Bioinformatics approaches for personalized cancer therapy: from Pan-Cancer projects to Patient Derived Xenograft (PDX) models Elena Piñeiro-Yañez, Héctor Tejero, Javier Perales-Patón, Fátima Al-Shahrour Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES The dawn of the age of personalized cancer treatment provides the promise to identify the right drug for the individual that will greatly improve the patient s outcome. It is well known that cancer drugs work only in small subset of patients. For many of these agents, there are putative markers of response in the literature but very few are been used in clinical practice. More importantly, new anticancer agents are targeted to specific cancer genes and are expected to be effective only in tumors in which these genes are mutated or otherwise abnormal. The success of personalized treatment of cancer patients depends on matching the most effective therapeutic regimen with the characteristics of the individual patient, balancing benefit against risk of adverse events. The primary challenge in achieving this goal is the heterogeneity of the disease, recognizing that the majority of cancers are not single diseases but rather an array of disorders with distinct molecular mechanisms. High-throughput technologies such as next-generation sequencing have the capacity to dissect this heterogeneity and now doing an unbiased interrogation of the human genome, which allows strategies to search for novel, previously unsuspected, biomarkers of drug response and afford opportunities to match therapies with the characteristics of the individual patient s tumor. In our laboratory, we have focused on developing an integrative bioinformatics approach to demonstrate the value in integrating genomic and clinical data with available drugs, to refine and to improve therapeutic strategies for cancer patients. We present a multi-disciplinary integrative effort that will convert the information contained in multidimensional genomic data into useful biomarkers that can classify patient tumors by prognosis and to identify the drivers of tumor behavior that are optimal targets for therapy. P04-5 (R04-4) Full-LengtherNext: Una herramienta para caracterizar transcriptomas de organismos no modelo Pedro Seoane Zonjic, Noé Fernandez-Pozo, Darío Guerrero- Fernandez 2, Rocío Bautista 2, M. Gonzalo Claros Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 2 Plataforma Andaluza de Bioinformática, Centro de Supercomputación y Bioinfomática, Edificio de Bioinnovación, Universidad de Málaga, Málaga, ES Los estudios de transcriptomas ensamblados de novo en especies no modelo carecen de secuencias genómicas que sirvan de referencia para evaluar su calidad. Esta carencia impide, por ejemplo, distinguir con claridad entre un transcrito correcto y uno artefactual, y tampoco permite distinguir fácilmente entre polimorfismos y errores de ensamblaje. Por otro lado, sin una referencia, también resulta difícil determinar el mejor ensamblaje posible dentro de un conjunto dado, ni tampoco se puede saber con precisión el porcentaje de transcritos encontrados respecto al total de genes. Por otra parte, saber si se ha ensamblado un transcrito que puede codificar una proteína completa es muy útil para los trabajos de laboratorio posteriores. Por todo esto se ha desarrollado Full-LengtherNext con una arquitectura capaz de hacer frente con eficacia y de forma escalable los requisitos de análisis de posensamblaje de la NGS. Con este programa () se clasifican los transcritos entre secuencias completas, N- o C-terminales, e internas), (2) se reconstruye el marco abierto de lectura del transcrito y se corrigen los posibles cambios de fase debidos al ensamblaje, (3) se identifica el subconjunto de transcritos sin anotar que podrían codificar proteínas nuevas propias de la especie en estudio, (4) se extraen algunos posibles RNA no codificantes, (5) se comparan distintos ensamblajes de novo de un transcriptoma para seleccionar el mejor, (6) se obtiene el transcriptoma representativo más cercano al transcriptoma completo teórico del organismo de estudio. Este programa ya ha sido usado con éxito en los análisis de los transcriptomas de, por ejemplo, pino marítimo, olivo, lenguado común y lenguado senegalés. P04-6 (R04-2) Supercomputing methods for macromolecular crystallographic Ab Initio Phasing Isabel Usón Finkenzeller ICREA ; IBMB-CSIC, Barcelona, ES Crystallographic analysis does not produce a direct image as in microscopy, as only the diffracted intensities and not the phases of the scattered X-rays are physically measurable. So far, in spite of its being computationally very demanding, crystallography has largely turned its back on supercomputing. Our group develops and implements crystallographic phasing methods exploiting massive computing. ARCIMBOLDO: from atomic resolution phasing[] to a general ab initio structure solution overcoming previous size and resolution barriers. Our method enforces secondary structure rather than atomicity through a combination of location of model fragments (alpha-helices) with PHASER [2] and density modification with SHELXE [3]. The method has been 54

Granada 204 Pósters called after the Italian painter Arcimboldo [4], who composed portraits out of fruits and vegetables. While most collections of fragments remain a still-life, but some are correct enough for density modification to reveal the protein s portrait. BORGES takes the principle ones step further, by enforcing unspecific tertiary -rather tan secondary- structure. Like in Borges Library of Babel, the information we need is bound to be contained already in the PDB but how to exploiting this information while the structure is still unknown? Our characteristic vector (CV) formalism, developed to extract folds from the PDB allows detailed analysis of local folds. SUBIX: from a geometric solution of nucleic acids to the analysis and prediction of packing and the information derived from packing interactions. References [] Sheldrick, Hauptman, Weeks, Miller & Usón. International Tables for Macromolecular Crystallography vol. F, (eds., M.G. Rossmann and E. Arnold) 333 345 (Boston, 200). [2] McCoy, et al. J. Appl. Crystallogr. 40, 658 674 (2007). [3] Sheldrick. Z. Kristallogr. 27, 644 650 (2002). [4] Rodríguez, Grosse, Himmel, González, M de Ilarduya. Becker, Sheldrick & Usón Nature Meth. 6, 65 654 (2009). [5] Sammito, Millán, Rodríguez, M de Ilarduya, Meindl, De Marino, Petrillo, Buey, de Pereda, Zeth, Sheldrick & Usón. Nature Meth. 0, 099-0 (203). P04-7 (R04-7) The exocyst 3D architecture by live cell imaging in yeast cells Devos Damien CABD, Sevilla, ES The structural characterization of macromolecular complexes is central to understand the mechanism of action of these assemblies and to pursue in the search of new treatments for human diseases. Macromolecular complexes can be composed of proteins, DNA, lipid, or any other molecules and their combination. We use integrative structure modeling to solve the structure of macromolecular complexes with important function in a cell. In this talk, I will introduce a new method to solve the structure of multiprotein complexes. We used fluorescent microscopy in live cell to solve the structure of the exocyst. The structure reveals important structural, functional and evolutionary features of this important complex in the eukaryotic cell. This macromolecular modeling protocol has the potential to reveal important aspects of multi-component complexes. P04-8 (R04-) DNA: When computational chemistry meets computational biology Modesto Orozco Institut for Research in Biomedicine, Barcelona, ES DNA is the key molecule of life: an exquisite combination of chemical simplicity and biological richness that has fascinated generations of scientists. DNA is also the meeting point of chemistry and biology, and the discovery of the structure of the DNA fiber more than 50 years ago by Watson and Crick can be considered as the foundation of molecular biology. For a theoretician, DNA is one of the greatest challenges, and a textbook example of a multi-resolution and multi-physics problem. I will summarize in my talk how we can use theoretical methods based on solid physical principles to gain information on the biology of DNA, how computational chemistry meets computational biology, and how first principles can explain not only chromatin structure, but also functionality. P05. Biomembranas y bioenergética P05- Cross-talk between R53 methylation and S56 phosphorylation of the cardiac voltage-gated sodium channel Pedro Beltran Álvarez, Ferran Feixas 2, Sílvia Osuna 2, Ramon Brugada, Sara Pagans Institut Investigació Biomèdica de Girona Dr. Josep Trueta, Department of Medical Sciences School of Medicine, University of Girona, Girona, ES, 2 Institut de Química Computacional i Catàlisi (IQCC) and Departament de Química, Universitat de Girona, Campus Montilivi, Girona, ES Introduction: we have previously provided the first evidence of arginine methylation within the voltage-gated ion channel superfamily. R53, R526 and R680 in the alpha subunit of the cardiac voltage-gated sodium channel (Nav.5) were found mono- or dimethylated []. The functional relevance of Nav.5 arginine methylation is underscored by the fact that R53H, R526H and R680H are known Nav.5 mutations causing sudden cardiac death syndromes. Objectives of the current work: ) to describe the cross-talk between Nav.5 arginine methylation and phosphorylation; and 2) to describe regulation of arginine methylation by mutations in residues adjacent to R53 leading to cardiac disease. Results: methylation and phosphorylation reactions were done in vitro using PRMT3 and PKA, and synthetic peptides. Reactions were monitored by MALDI-TOF. Phosphorylation of S56 completely inhibited R53 methylation by PRMT3. Methylation of R53 reduced S56 phosphorylation rate by 4 orders of magnitude. Overall, our results suggest an interdependence of Nav.5 arginine methylation and phosphorylation [2]. The mutation G54C, which has been described in a patient with cardiac conduction disease, blocked R53 methylation by PRMT3, but did not change S56 phosphorylation rate in vitro. We speculate that G54C leads to S56 hyperphosphorylation due to blockade of R53 methylation in vivo. Conclusions: our work provides the first insights into how arginine methylation of voltage-gated ion channels is regulated, the first evidence of PKA inhibition by arginine methylation, and opens the door to pharmaceutical intervention to balance methylation-phosphorylation equilibria in Nav.5 cardiopathological states. References [] Beltran-Alvarez P, et al. J Proteome Res 20. [2] Beltran-Alvarez P, et al. In preparation. P05r-2 How redox proteins form transient complexes in photosynthesis and respiration Blas Moreno-Beltrán, Antonio Díaz-Quintana, Katiuska González- Arzola, Alejandra Guerra-Castellano, Adrián Velázquez-Campoy 2, Pedro M. Nieto 3, Marcellus Ubbink 4, Miguel A De la Rosa, Irene Díaz-Moreno Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3 Instituto de Investigaciones Químicas, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 4 Institute of Chemistry, Leiden University, Leiden, NL Protein complex formation is at least a two-step process in which the formation of a final, well-defined complex entails the initial formation of a dynamic encounter complex. The lifetime of the protein complex is determined by the dissociation rate. Highly transient complexes, with lifetimes on the order of milliseconds, exhibit moderate or low binding affinities, with dissociation constants in the mm mm range. Electron 55

Pósters XXXVII Congreso SEBBM transfer (ET) reactions mediated by soluble redox proteins exchanging electrons between large membrane complexes in photosynthesis and respiration are excellent examples of transient interactions. Here, experimental approaches based on dia and paramagnetic NMR spectroscopy are combined with NMR restraint- or charge-driven docking simulations to study the molecular recognition processes in ET complexes, using the cyanobacterial Cf-Cc 6 interaction in photosynthesis and the plant Cc -Cc adduct in respiration, as physiological model systems. Both ET ensembles exhibit optimal coupling between the redox centers although they might differ in their dynamic behavior. Needless to say that such an integrative methodology opens new perspectives in our understanding of the dynamic, transient adducts formed between proteins beyond the model systems herein analyzed. References Díaz-Moreno et al. (204) BBA Bioenergetics doi: 0.06/j. bbabio.204.03.009. Moreno-Beltrán et al. Under review. P05-3 Dos estrategias en la evolución de la transferencia de electrones al fotosistema I: diatomeas versus sistemas verdes Manuel Hervás, Pilar Bernal-Bayard, Fernando P. Molina-Heredia, Alejandro Torrado, José María Ortega, Leonor Puerto-Galán, Mercedes Roncel, José A. Navarro Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC, ciccartuja, Sevilla, ES En algas verdes unicelulares y cianobacterias, la plastocianina (Pc) y el citocromo c 6 (Cc 6 ) actúan como transportadores alternativos de electrones entre los complejos de membrana b 6 f y fotosistema I (PSI) en fotosíntesis. Sin embargo, en algas rojas y diatomeas el Cc 6 actúa en general como único transportador entre estos complejos. La reducción del PSI en eucariotas implica la formación de un complejo transitorio inicial, que tiene que reorganizarse hacia una configuración optimizada antes de la propia transferencia electrónica. Sin embargo, comparada con los sistemas verdes (algas y plantas), la diatomea Phaeodactylum presenta una menor eficiencia, tanto en la formación del complejo como en la transferencia en sí, debido a que la intensidad de la interacción electrostática entre el Cc 6 y el PSI está atenuada respecto a las fuertes propiedades electrostáticas de donadores y PSI en los sistemas verdes. El paso de reajuste implica un conjunto preciso y específico de interacciones, que se ven afectadas negativamente en reacciones cruzadas entre donadores y PSI de diatomeas, algas verdes y plantas. Nuestros análisis cinéticos y estructurales indican que la evolución en los dos grandes linajes fotosintéticos eucariotas implicó cambios paralelos y complementarios en los donadores y el PSI. En la línea evolutiva que conduce a las plantas superiores, una fuerte interacción electrostática determina un intercambio lento del donador, lo que limita la transferencia de electrones al fotosistema. En diatomeas, una interacción electrostática más débil facilita, sin embargo, un intercambio más rápido del Cc 6, para dejar así paso a la unión de una nueva molécula donadora. P05r-4 Membrane Association of Autophagy Proteins LC3, GABARAP and GATE-6 Zuriñe Antón*, Javier H. Hervás*, Ane Landajuela, L. Ruth Montes, José F. Rodríguez 2, Félix M. Goñi, Alicia Alonso Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2 Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid, ES Macroautophagy mediates the degradation of long-lived proteins and organelles through the de novo formation of double-membrane autophagosomes that sequester cytoplasm and deliver it to the vacuole/ lysosome. Approximately 20 Atg (autophagy-related) proteins have been identified in mammals that are essential in the initial stages of the preautophagosomal structure (PAS) formation and autophagosome elongation. Among them, the yeast ubiquitin-like system (Atg7, Atg3 and Atg8) is relatively well characterized. Several Atg8 homologues are known in mammals, divided into the LC3 and GABARAP/GATE-6 subfamilies. It has been shown that LC3 membrane association is mediated by the covalent attachment of LC3 to phosphatidylethanolamine (PE). The resulting lipidated protein then drives autophagosome maturation steps including cargo capture, growth and closure of the organelle, and lysosome targeting or recognition. This protein-lipid covalent binding is essential for autophagosome elongation, but its mechanism remains unknown. In the present study, we have focused on the molecular mechanisms by which LC3/GABARAP and GATE-6 conjugate with membranes leading to autophagosome elongation. With this purpose, we have performed experiments of protein-protein and protein-lipid interaction using model membranes such as SUV (small unilamellar vesicles), LUV (large unilamellar vesicles) and GUV (giant unilamellar vesicles). Both mammalian ubiquitin-like system and PE-maleimide conjugated human Atg8 homologs have been used. In order to obtain this information, circular dichroism spectroscopy, sucrose gradient floatation, protein-lipid overlay (lipid dot-blot), lipid monolayer experiments and vesicle aggregation measurements have been carried out. The various proteins interact in specific ways with membranes of different lipid compositions. *Both authors have contributed equally in this work. P05-5 Sphingosine induces the aggregation of imine-containing peroxidized vesicles Noemi Jimenez-Rojo, Ana R. Viguera, Alicia Alonso, Felix M. Goñi Unidad de Biofisica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES Lipid peroxidation plays a central role in the pathogenesis of many diseases like atherosclerosis and multiple sclerosis. We have analyzed the interaction of sphingosine with peroxidized bilayers in model membranes. Cu 2+ induced peroxidation was checked following UV absorbance at 245 nm, and also using the novel Avanti snoopers. Mass spectrometry confirms the oxidation of phospholipid unsaturated chains. Our results show that sphingosine causes aggregation of Cu 2+ - peroxidized vesicles. We observed that aggregation is facilitated by the presence of negativelycharged phospholipids in the membrane, and inhibited by anti-oxidants e.g. BHT. Interestingly, long-chain alkylamines (C8, C6) but not their shortchain analogues (C0, C6, C) can substitute sphingosine as promoters of vesicle aggregation. Furthermore, sphinganine but not sphingosine-- phosphate can mimic this effect. Formation of imines in the membrane upon peroxidation was detected by H-NMR and it appeared to be necessary for the aggregation effect. 3 P-NMR spectroscopy reveals that sphingosine facilitates formation of non-lamellar phase in parallel with vesicle aggregation. The data might suggest a role for sphingosine in the pathogenesis of atherosclerosis. P05r-6 Efecto dual de la secreción de cardiolipinas en el alveolo Alba de Lorenzo, Olga Cañadas 2, Belén García-Fojeda 2, Cristina Casals 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid - CIBER de Enfermedades Respiratorias, Madrid, ES La cardiolipina (CL) es un fosfolípido aniónico de las membranas de bacterias Gram negativas que también se encuentra en la membrana mitocondrial interna de células eucariotas y desempeña un papel clave para 56

Granada 204 Pósters la función e integridad estructural mitocondrial. Sin embargo, se ha descrito que en pacientes con neumonía se produce la liberación de cardiolipina mitocondrial al fluido alveolar, que puede alterar la función pulmonar []. Sin embargo, estudios recientes han indicado que fosfolípidos aniónicos podrían presentar una acción inmunomoduladora beneficiosa en el pulmón [2]. Nuestra hipótesis es que las CL liberadas al fluido alveolar en procesos infecciosos e inflamatorios podrían tener un efecto perjudicial o beneficioso en función de su concentración. Los objetivos de este estudio han sido: ) Estudiar el efecto de la CL humana `,3`-Bis-(,2-dilinolenil-sn-glicero-3-fosfo)-sn-glicerol [(8:2) 4 -CL] en la función tensoactiva del surfactante pulmonar; y 2) Determinar el umbral de concentración a partir del cual este lípido presenta un posible efecto en la respuesta inflamatoria de macrófagos al lipopolisacárido bacteriano (LPS). Los resultados indican que concentraciones de (8:2) 4 -CL superiores al 6% molar relativo a los fosfolípidos del surfactante (~ μmol/ml) alteran significativamente la actividad de adsorción interfacial del surfactante pulmonar. El mecanismo de inactivación reside en que (8:2) 4 -CL incrementa la fluidez de las membranas de surfactante como se demuestra por calorimetría diferencial de barrido y anisotropía de fluorescencia. En contraste, nuestros resultados indican que concentraciones muy bajas de cardiolipina (0.67 nmol/ml) bloquean la secreción de TNF-α, expresión de inos y la fosforilación de Akt, MAPKs e ikbα en macrófagos alveolares estimulados con LPS. Este efecto inmunomodulador de la cardiolipina sucede tanto a nivel extracelular como intracelular. En conjunto, los resultados indican que las cardiolipinas secretadas por el huésped en procesos infecciosos podrían tener una acción dual, beneficiosa o dañina para el huésped, en función de la concentración de este lípido en el fluido alveolar. Bibliografía [] Ray, N.B., L. Durairaj, B.B. Chen,., and R.K. Mallampalli. Dynamic regulation of cardiolipin by the lipid pump Atp8b determines the severity of lung injury in experimental pneumonia. Nat Med, 6(0): 20-7, 200. [2] Kuronuma K, Mitsuzawa H, Takeda K, Nishitani C, Chan ED, Kuroki Y, Nakamura M, Voelker DR. Anionic pulmonary surfactant phospholipids inhibit inflammatory responses from alveolar macrophages and U937 cells by binding the lipopolysaccharide-interacting proteins CD4 and MD-2. J Biol Chem. 284(38):25488-24500,2009. P05r-7 How phosphorylation affects Cytochrome c structure and function Alejandra Guerra-Castellano, Blas Moreno-Beltrán, Javier López- Prados 2, Francisco Rivero-Rodríguez, Pedro M. Nieto 2, Adrián Velázquez-Campoy 3, Antonio Díaz-Quintana, Miguel Ángel De la Rosa, Irene Díaz-Moreno Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2 Instituto de Investigaciones Químicas, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 3 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas complejos, BIFI, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES Post-translational modifications of proteins stand out as regulatory mechanisms for the majority cell metabolic processes. One of the most usual modifications is phosphorylation, which alters the physical features of proteins and affects their interactions with other proteins. Cytochrome c (Cc) phosphorylation relates to some pathological situations, such as ischemia or cancer []. Cc acts as an electron carrier in the mitochondria. Under oxidative stress conditions, it promotes Programmed Cell Death (PCD). Both functions are regulated by phosphorylation of the residues Thr, Ser and Tyr at positions 28, 47 and 48, respectively [2-4]. Since the specific Cc-phosphorylating kinases are still unknown, we have made three phosphomimetic mutations. Two of them replace Thr28 and Ser47 by Asp. To mimic Tyr48 phosphorylation, we resorted to the evolved trna technique by replacing the Tyr48-encoding triplet for an AMBER codon. Then, we incorporated a non-canonical amino acid (p-carboxymethyl-lphenylalanine, pcmf) that emulates phosphotyrosine, with the help of a trna specific for the AMBER stop codon. These mutations induce drastic changes not only on the redox potential, dynamics and stability of Cc, so affecting its biological function. References [] Hüttemann M et al. Adv. Exp. Med. Biol. (202) 748, 237-264. [2] Yu, H et al. Biochim. Biophys. Acta (2008) 777, 066-07. [3] García-Heredia, JM et al. J. Biol. Inorg. Chem. (20) 6, 55-68. [4] Zhao et al. Mol. Cell. Proteomics. (20) 0, -4. Work supported by JAE Programme (JaePre_20_0248), ESF 2007-203, Andalusian Government (CVI-BIO98), Ministry of Economy and Competitiveness (BFU2009-0790 and BFU202-3670), European Bio-NMR Project (202-203) BIO-NMR-0030 and the Centro de Investigación Tecnología e Innovación (CITIUS). P05-8 Amyloid-membrane interactions revealed by model lipid vesicles Cristina Fernández, Mercedes Jiménez, Germán Rivas, Rafael Giraldo Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES We have recently reported that engineering RepA-WH, a bacterial DNA-toggled protein conformational switch (dwh WH) sharing some analogies with nucleic acid-promoted PrP c PrP Sc replication [], constitutes a suitable synthetic model system to study protein amyloidosis in bacteria [2, 3]. Although amyloidogenesis has been the focus of intense research, the origin of the amyloid toxicity remains unclear. One proposed mechanism of cytotoxicity is lipid membrane permeabilization. In this work we have studied the aggregation of the bacterial RepA-WH prionoid in the presence of cytomimetic model systems (large and giant unilamellar lipid vesicles, LUVs, and GUVs respectively) [4]. Confocal microscopy images of protein encapsulated into GUVs show association and aggregation of the protein preferentially to lipid vesicles containing acidic phospholipids. We have also observed that RepA-WH elicits membrane disruption using a dye release assay on LUVs [5]. The extent of leakage was dependent on protein concentration.we have been able to directly measure the process of membrane permeation and leakage by time-elapsed imaging of dye filled GUVs upon the addition of protein. This process is fast and over the course of the experiment most of the vesicles remain intact, suggesting the assembly of defined pores by RepA-WH. This model system has allowed us to test several compounds that have been described to modulate amyloid formation. Knowledge of the effect of the RepA-WH prionoid on membrane integrity, will provide insight into the basis for cell death caused by amyloid proteins. References [] Silva et al. Trends Biochem. Sci. 2008; 33(3):32-40. [2] Giraldo, et al. Prion 20; 5:60-64. [3] Fernández-Tresguerres, et al. Mol Microbiol. 200; 77:456-469. [4] Butterfield and Lashuel. Angew Chem Int Ed. 200; 49:5628-5654. [5] van Rooijen, et al. Biochim. Biophys. Acta 2009;788:27-278. P05-9 Permeabilización de membranas fosfolipídicas por el lipopéptido liquenisina Antonio Ortiz, Jonathan R. Coronel, José A. Teruel, Francisco J. Aranda Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES Se ha aislado una liquenisina de los medios de cultivo de Bacillus licheniformis. Nuestra liquenisina consiste en un lipopéptido formado 57

Pósters XXXVII Congreso SEBBM fundamentalmente por una porción hidrofílica con un anillo peptídico de siete aminoácidos (Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Ile), y una porción hidrofóbica constituida por un β-hidroxiácido graso de 4-6 átomos de C. Esta estructura le confiere un marcado carácter anfipático. Se ha observado que liquenisina permeabiliza membranas modelo de POPC induciendo la liberación de la sonda fluorescente carboxifluoresceína. Esta acción está modulada por la composición de la membrana, tanto de fosfolípidos (como fosfatidiletanolamina), o esteroles como el colesterol. Estos efectos son evidentes a concentraciones bastante inferiores a la cmc, y sugieren la formación de estructuras agregadas del lipopéptido en la bicapa que podrían comportarse como poros de permeabilización selectiva. Por otra parte, en estudios con eritrocitos humanos se ha visto que liquenisina es capaz de causar la hemólisis, también a concentraciones por debajo de su cmc. A partir de estudios cinéticos comparativos, se ha observado que la salida de iones K + de los eritrocitos precede a la salida de la hemoglobina y, además, la hemólisis se puede evitar de modo eficaz mediante la adición a la solución externa de protectores osmóticos de tamaño igual o superior a 32 Å. Las evidencias indican que la hemólisis inducida por liquenisina sigue un mecanismo de tipo coloide-osmótico, que implica la formación de poros de membrana, en el sentido más amplio del término. Estos resultados ayudan a establecer una base molecular para la función biológica de liquenisina. P05r-0 (R05-4) Targeting myeloid cells with liposomal nanocarriers for therapeutic purposes Jon Ander Nieto-Garai, Susana Benet 2, Maria Pino 2, Eneritz Bilbao, Itziar Erkizia 2, Julia G. Prado 2, Javier Martinez-Picado 3, Nuria Izquierdo-Useros* 2, Maier Lorizate* Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2 AIDS Research Institute IrsiCaixa, Badalona, ES, 3 AIDS Research Institute IrsiCaixa and ICREA, Badalona, ES We have recently discovered the mechanism followed by HIV- to enter mature dendritic cells (mdcs) and infect bystander CD4 + T cells in lymphoid tissues, which relies on Siglec- (CD69) cell receptor recognition of sialyllactose exposed on HIV- membrane gangliosides. Here, we aimed to engineer stable nanoliposomes mimicking HIV- to target Siglec- expressed on mdcs and other myeloid cells for therapeutic compound delivery to key anatomical sanctuaries. Fluorescent POPC nanoliposomes were prepared with increasing concentrations of sialyllactose-containing gangliosides GM and GM3. Nanoliposomes stability assays and further characterization were performed using fluorimetric determination and quasi-elastic light scattering based size determination. Siglec-+ mdcs and activated monocytes were exposed to the same concentration of nanoliposomes and capture was analyzed with FACS or confocal microscopy. Statistical differences were determined using a paired t-test. Fluorescent nanoliposomes containing GM or GM3 specifically targeted mdcs and activated monocytes with equal efficiency as fluorescent HIV- viral like particles. Ganglioside nanoliposomes were retained within the same intracellular sac-like compartment where HIV- accumulates. Conversely, nanoliposomes devoid of gangliosides where not stored. An increase of the ganglioside content in the liposome formulation leads to an improved capture efficiency in a dose dependent manner. Nanoliposome specificity for Siglec- was demonstrated by blocking capture with two specific mabs against Siglec- (P.0007) or with soluble sialyllactose (P.004). We have developed a stable nanoliposome formulation with a potent and specific capacity to target Siglec- expressing myeloid cells. This technology could be crucial for delivering small therapeutic molecules to lymphoid tissues. Funding: amfar Mathilde Krim Fellowship 08676-55-RKRL. *Dual Seniorship P05- Short-chain sphingolipids preferentially insert into tumor cell membranes and promote chemotherapeutic drug uptake Dalila Ciceri, Lilia R. Pedrosa 2, Félix M. Goñi, Gerben A. Koning 2, F.-Xabier Contreras Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2 Laboratory Experimental Surgical Oncology Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus Medical Center, Rotterdam, NL Insufficient drug delivery into tumor cells severely limits the therapeutic efficacy of chemotherapy. Co-delivery of liposome-encapsulated drug and synthetic short-chain sphingolipids (SCS) greatly improves drug bioavailability by enhancing intracellular drug uptake. However, whether SCS insert preferentially into tumor cells and the molecular mechanisms used by those lipids to improve drug uptake is still mysterious. Here, we show that SCS have high affinity for tumor cells and that upon insertion those lipids have specific membrane remodeling activities that favor drug binding and uptake. We found in a set of in vivo experiments that external addition of new clickable SCS analogues either in free form or in a liposomal formulation show more affinity for tumor cells than for healthy ones. Furthermore, biophysical experiments show that SCS have membrane-remodeling properties. Transbilayer lipid distribution of lipids by SCS at one side of the membrane has been monitored using a pyr- SM analogue. External addition of SCS in organic solution to preformed plasma membrane like liposomes induces transbilayer lipid motion of pyr- SM within the membrane. Our results demonstrate how SCS are likely to function on drug delivery, preferentially inserting into tumor cells, and subsequently altering the biophysical features of cell membranes leading to transitory membrane packaging imperfections that trigger amphiphilic drug uptake. Our assays validate the usage of SCS in liposomal chemotherapy to promote cell-specific targeting, tumor cell membrane remodeling and finally drug release. P05-2 Gene knockout of the coupling proteins in pip50 and CloDF3 plasmids Itziar Alkorta, Marina Garcia-Moreno, Itxaso Álvarez-Rodríguez, Ines Probst 2, Christina Steck 2, Elisabeth Grohmann 2 University of the Basque Country, Department of Biochemistry and Molecular Biology (UPV/EHU) and Biophysics Unit (CSIC, UPV/ EHU), University of the Basque Country, Leioa, ES, 2 Albert-Ludwigs University Freiburg, Institute of Biology II, Microbiology, Freiburg, DE Type IV secretion systems (T4SSs) are bacterial multiprotein complexes specialised in the transfer of proteins or DNA-protein complexes across cell membranes. They are essential for conjugation, bacterial-induced tumour formation in plant cells, toxin secretion, cell-to-cell translocation of virulence factors, and intracellular activity of mammalian pathogens. By enabling conjugative DNA delivery, these systems contribute to the spread of antibiotic resistance genes among bacteria. The secretion substrates range from single-stranded DNA/ protein complexes to multicomponent toxins. They are assisted by integral membrane coupling factors, the multimeric type IV coupling proteins (T4CPs), which connect the macromolecular complexes to be transferred with the secretory conduit. Enterococcus faecalis and the other from CloDF3, a multi-resistance plasmid from Enterobacter cloacae. Knock-out of the T4CP gene of pip50 will be performed by a novel gene disruption method for E. faecalis. For pip50, the knock-out will be tested in conjugation assays with different E. faecalis strains, for CloDF3 between different E. coli strains. To exclude polar effects of the knock-out on downstream genes in the T4SS operon complementation will be performed by cloning the respective wild type gene in trans on a vector compatible with pip50 and CloDF3, respectively. 58

Granada 204 Pósters P05-3 Modulation of the plasma membrane localization and activation of PKCalpha by fatty acids treatment Senena Corbalan Garcia, Teresa Coronado-Parra, Dolores Perez- Sanchez, Ruben Lopez-Nicolas, Juan C Gomez-Fernandez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES Protein Kinase C (PKC) is a family of serine/threonine phosphotransferases that participate in a wide variety of cellular processes that are crucial in tumor progression. Among them, proliferation, migration, invasion and survival of cancer cells. Many studies have demonstrated these isoenzymes are involved in cancer due to changes in their expression and phosphorylation levels. Unfortunately, no specific PKC modulators to address the clinical needs have been found to date. In this work we studied the effect of several fatty acids (OA, DHA and EPA) on cell localization, migration and catalytic activation of PKCa. Both OA and DHA increased the catalytic activity of the enzyme. The use of several mutants that abolished the C2 or C domains function revealed that the C2 domain was essential for activation, while the C domain played a less relevant role. In cell experiments were performed in two breast cancer cell lines: one from adenocarcinoma non-invasive (MCF-7) and the other from a highly bone metastatic (MDA-MB-23). The three fatty acids induced the translocation of PKCa from the cytosol to the plasma membrane and increased its co-localization with actin filaments. In addition, we demonstrated that OA and DHA reduced the cell migration capacity and induced apoptosis in both cell lines, effects that increased when PKCa was down-regulated by specific sirna, suggesting that the enzyme plays critical roles in the migration and survival processes in breast cancer cells. P05-4 Two photon fluorescence microscopy of GUV discloses unprecedented liquid domain segregation behavior in cholesterol-enriched lipid bilayers Pablo Carravilla, Félix M. Goñi, José Luis Nieva, Jose Requejo- Isidro, Nerea Huarte Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES Fluorescence microscopy imaging of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) has been extensively used to investigate lateral segregation of liquid microdomains. However, the general application of this approach is hampered by artifactual light-induced domain formation. Here, we show that this problem can be circumvented by performing two photon fluorescence measurements of Laurdan-labeled GUVs, which also provide quantitative information on the level of molecular order in each domain by means of the Generalized Polarization function (GP). To explore domain segregation in the absence of photooxidation, we have determined Laurdan fluorescence and order degree in raft-standard ternary mixtures of egg sphingomyelin (esm)/ dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphocholine (DOPC)/cholesterol (Chol). Our most relevant observation is that lateral segregation into microscopic Lo-Ld domains is never observed with esm:chol mole ratios lower than. Below this ratio the membrane average order level depends mainly on the esm content and no co-existence is observed. In addition, by determining the order levels under coexistence conditions we infer that the maximum cholesterol content in Lo domains is attained with esm:chol ratios of ca. 2:. These observations point to esm as the main determinant of macroscopic lipid platform formation in these mixtures. P05-5 (R05-8) Perifosine modulates autophagy in human tumor cells José M Jiménez-López, Pablo Ríos-Marco, Marisol Fernández- Ortiz, Miguel García-González 2, Josefa L Segovia, Carmen Marco, María Paz Carrasco Jiménez Department of Biochemistry and Molecular Biology I. Faculty of Sciences. University of Granada, Granada, ES, 2 Universitary School La Inmaculada Concepción.University of Granada, Granada, ES Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of various cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines. APLs have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic, however their exact mechanisms of action on cell death and other inhibitory pathways are unknown. In this work, we show that perifosine, as representative APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3- II in HepG2 and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An increase in autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with both autophagy stimulation and block in the late stages of autophagy. To discriminate whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells resulted from induction of autophagy or decreased autophagic flux, we performed assays in the presence of chloroquine to block autophagy by inhibiting lysosomal proteases and preventing autophagosome-lysosome fusion. We observed that perifosine treatment produces an alteration in autophagic flux in both cell lines. We detected moreover that blockade of autophagy at the level of the autophagosome-lysosome fusion does not modify apoptotic cell death induced by perifosine in both cell lines. We conclude that modulation of autophagy process is emerging as new target for cancer therapy. This research was aided by the Junta de Andalucía (P-CVI-7859). P05-6 (R05-7) Pancreatic cancer cell glycosylation regulates cell adhesion and invasion through the modulation of α2β integrin and E-cadherin function Rosa Peracaula Miró, Sònia Bassagañas, Sandra Carvalho 2, Ana M. Dias 2, Joan Figueras 3, Marta Pérez-Garay, M. Rosa Ortiz 3, Celso A. Reis 2, Salomé S. Pinho 2 Universidad de Girona, Girona, ES, 2 Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto (IPATIMUP), Porto, PT, 3 Hospital Universitario Dr. Josep Trueta, Girona, ES In our previous studies we have described that ST3Gal III transfected pancreatic adenocarcinoma Capan- and MDAPanc-28 cells show increased membrane expression levels of sialyl-lewis x (SLe x ) along with a concomitant decrease in α2,6-sialic acid compared to control cells. Here we have addressed the role of this glycosylation pattern in the functional properties of two glycoproteins involved in the processes of cancer cell invasion and migration, α2β integrin, the main receptor for type collagen, and E-cadherin, responsible for cell-cell contacts and whose deregulation determines cell invasive capabilities. Our results demonstrate that ST3Gal III transfectants showed reduced cell-cell aggregation and increased invasive capacities. ST3Gal III transfected Capan- cells exhibited higher SLe x and lower α2,6-sialic acid content on the glycans of their α2β integrin molecules. As a consequence, higher phosphorylation of focal adhesion kinase tyrosine 397, which is recognized as one of the first steps of integrin-derived signaling pathways, was observed in these cells upon adhesion to type collagen. This molecular mechanism underlies the increased migration through collagen of these cells. In addition, the pancreatic adenocarcinoma cell lines as well as human pancreatic tumor tissues showed colocalization of SLe x and E-cadherin, which was higher in the ST3Gal III transfectants. In conclusion, changes in the sialylation pattern of α2β integrin and E-cadherin appear to influence the functional role of these two glycoproteins supporting the role of these glycans as an underlying mechanism regulating pancreatic cancer cell adhesion and invasion. 59

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P05-7 (R05-3) Translation of molecular geometry into membrane fission Anna Shnyrova, Eva Rodríguez Hortelano, Juha-Peka Mattila 2, Sandra L. Schmid 2, Sergey A. Akimov 3, Vadim A. Frolov 4 Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2 Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, US, 3 A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, RU, 4 Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco; IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Leioa, ES Membrane fission constitutes an essential part of the dynamic life of cellular membranes. Proteins implicated in this process are designed to promote high membrane curvature and localized rupture of the membrane monolayers, both hallmarks to membrane fission. The localized action of the fission proteins is almost without exceptions based upon the shallow membrane insertion (membrane wedging) resulting in disruption of the lipid monolayer continuity at protein length scale. Such deformation produced by an individual protein, however, is limited and do not spread far from the protein itself. Thus, larger-scale coordination of many deformations is needed in order to effectively remodel the lipid bilayer and induce its fission. We show here how protein complexes implement seemingly universal and topology independent strategy to coordinate their membrane-disrupting action during the fission process. Briefly, creation of a protein ring-like complex with membrane insertions leads to a local constriction of the membrane and to a coordinated membrane wedging, that decouple the membrane deformations on both sides of the ring. Consequently, ring-like rupture of one monolayer of the constricted membrane creates additional degree of freedom that critically helps the lipid bilayer to adapt to the geometry imposed by the constricting ring. As a result, critical membrane curvature stress can be translated into local destabilization of lipid monolayer (far from the ring, not at the ring) leading to nonleaky physiological fission. This boundary action might constitute a general principle of translation of molecular geometry of proteins into bulk membrane remodeling. Thus, the proposed mechanism can be crucially important for membrane biogenesis in cells. P05-8 Specific interaction with cardiolipin triggers functional activation of dynamin-related protein Itsasne Bustillo-Zabalbeitia, Sylvie Montessuit 2, Etienne Raemy 2, Gorka Basañez, Jean-Claude Martinou* 2, Oihana Terrones Urio* Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2 Department of Cell Biology, University of Geneva, Sciences III, Ginebra, CH Dynamin-Related Protein (Drp), a large GTPase of the dynamin superfamily, is required for mitochondrial fission in healthy and apoptotic cells. Drp activation is a complex process that involves translocation from the cytosol to the mitochondrial outer membrane (MOM) and assembly into rings/spirals at the MOM, leading to membrane constriction/division. Similar to dynamins, Drp contains GTPase (G), bundle signaling element (BSE) and stalk domains. However, instead of the lipid interacting Pleckstrin Homology (PH) domain present in the dynamins, Drp contains the so-called B insert or variable domain that has been suggested to play an important role in Drp regulation. Different proteins have been implicated in Drp recruitment to the MOM, although how MOM-localized Drp acquires its fully functional status remains poorly understood. We previously found that Drp can interact with pure lipid bilayers enriched in the mitochondrion-specific phospholipid cardiolipin (CL). Building on our previous study, we now explore the specificity and functional consequences of this interaction. We show that a four lysine module located within the B insert of Drp interacts preferentially with CL over other anionic lipids. This interaction dramatically enhances Drp oligomerization and assembly-stimulated GTP hydrolysis. Our results add significantly to a growing body of evidence indicating that CL is an important regulator of many essential mitochondrial functions. *Dual senior autorship. P05-9 Structure and lipid specificity support adaptation of pestivirus p7 C-terminal helix to permeabilizing secretory compartments Eneko Largo, Antonio Alcaraz 2, Nerea Huarte, Vicente M. Aguilella 2, Manuel V. Borca 3, José L. Nieva Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU) and Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Bilbao, ES, 2 Laboratory of Molecular Biophysics, Department of Physics, Universitat Jaume I, Castelló, ES, 3 Plum Island Animal Disease Center, Greenport, US Classical swine fever virus (CSFV) protein p7 possesses two hydrophobic domains intervened by a short polar loop, predicted to span the membrane as a helix-turn- helix hairpin. Here, we use a combined lipid monolayer, planar bilayer and vesicle analysis to characterize the insertion and permeabilization of membranes by constituent CSFV p7 helices. Structural data and the dependence on lipid composition of these processes support that the C-terminal helix is a poreforming protein adapted to permeabilizing membranes of the secretory compartments or mitochondria. Together with the observed ph-dependence and inhibition pattern, our data suggest that CSFV p7 relies on genus-specific structures-mechanisms to perform its viroporin function. P05-20 (R05-6) La proteína L-plastina está implicada en el reclutamiento de NKG2D a balsas lipídicas y en la migración de células NK mediada por NKG2D Esther Serrano Pertierra, Eva Cernuda-Morollón, Tomas Brdicka 2, Václav Horejsi 2, Carlos López-Larrea 3 Servicio Neurología, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, ES, 2 Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Praga, CZ, 3 Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, ES Las balsas de membrana son microdominios de la membrana plasmática que desempeñan múltiples funciones biológicas. La implicación de estas estructuras en la biología de células T, principalmente en la transducción de señales mediada por TCR, ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, se conoce menos sobre el papel de las balsas de membrana en la señalización por receptores de células NK. Hemos estudiado la distribución del receptor activador NKG2D en las balsas lipídicas mediante el aislamiento de DRM por gradiente de densidad de sacarosa o mediante fraccionamiento por solubilidad selectiva a beta-octilglucósido en la línea celular NKL. Hemos encontrado que el complejo NKG2D- DAP0 y pvav se reclutan a estas balsas tras la activación del receptor. El análisis proteómico cualitativo mostró que el citoesqueleto de actina está implicado en este proceso. En particular, hemos visto que la L-plastina, proteína que une filamentos de actina, juega un papel importante en el reclutamiento de NKG2D a las balsas lipídicas. Además, la activación del receptor inhibidor NKG2A afecta parcialmente el reclutamiento a estos dominios. Por otra parte, también hemos demostrado que la L-plastina participa en la inhibición mediada por NKG2D de la quimiotaxis de células NK. 60

Granada 204 Pósters P05-2 (R05-5) Dimerization of the transmembrane domain regulates the function of p75 neurotrophin receptor Irmina García-Carpio, Kirill Nadezhdin 2, Sergey Goncharuk 2, Konstantin Mineev 2, Eva Fernandez, Alexander Areseniev 2, Marçal Vilar Neurodegeneration Unit. UFIEC-ISCIII, Majadahonda, Madrid, ES, 2 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Moscú, RU p75 neurotrophin receptor (p75 NTR), is best known for its role in mediating neuronal cell death during development or after injury but it also regulates cell proliferation, axon guidance or survival. p75 forms disulphide-linked dimers through the Cys257 in the transmembrane domain and that it is essential for NGF mediated signaling. Here we demonstrate that p75 use two different interfaces of dimerization; one promoted by Cys257 and the other by a motif of the form AxxxG. Our functional and structural data reveals the key role that plays the Cys257 in p75 dimer assembly, redistribution and activation of the receptor. We propose the transmembrane domain of p75 as a new target domain to inhibit receptor function. P05-22 (R05-2) The multiple faces of caveolin in the endoplasmic reticulum: from fat storage to the integrity of mitochondria Albert Pol Sorolla IDIBAPS (CELLEX), Barcelona, ES La caveolina (CAV) es un componente esencial de las caveolas, invaginaciones ricas en colesterol de la membrana plasmática de la mayoría de nuestras células. Sin embargo, la función de las CAV no está restringida a la superficie celular, las CAV se asocian dinámicamente con orgánulos intracelulares como el retículo endoplasmático (RE), el aparato de Golgi, o los endosomas. Este transporte intracelular de CAV regula la distribución intracelular de lípidos, ya que las CAV unen colesterol y ácidos grasos con gran afinidad. En este contexto hemos demostrado dos funciones de CAV en el RE: i) regula los niveles de colesterol en las membranas mitocondriales, su fluidez y la eficiencia de la cadena respiratoria y ii) regula la acumulación de lípidos neutros en la bicapa del RE para generar los cuerpos lipídicos y proporcionar energía durante la regeneración del hígado. La ausencia de CAV provoca un desajuste en la distribución intracelular de lípidos con importantes consecuencias metabólicas y patológicas para células y animales. P05-23 Alteration of protein and lipid moieties in a dysfunctional lung surfactant from alveolar proteinosis Mercedes Echaide Torreguitar, Carolina Ballester Lopez, Jesus Perez-Gil Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES Pulmonary Alveolar Proteinosis (PAP) is a rare disease characterized by an accumulation of pulmonary surfactant at the alveoli and terminal airways. Several studies have shown that THIS pathology is associated with an excess of surfactant lipids and altered proteins. However, it is not clear how each of the surfactant components contribute the most to the dysfunctional behavior of this surfactant. In the current work, surfactant from a patient with Pulmonary Alveolar Proteinosis (P) has been analyzed and compared with respect to composition and functional behavior of porcine native surfactant (NS). Compositional analysis by Western Blot revealed the presence of surfactant protein aggregated forms. Moreover, the protein to phospholipid ratio was 26 times higher in P than in functional NS. An abnormal lipid composition was also detected by Thin Layer Chromatography and further analysis showed an excess of cholesterol, resulting in a cholesterol to phospholipid ratio 6 times higher than in NS. Functional analysis using the Captive Bubble Surfactometer (CBS) showed the incapacity of PAP surfactant films to reduce to low enough values the surface tension at the air-liquid interface. NS and P were subjected to a LH20 chromatography to obtain the protein, phospholipid and cholesterol fractions separately. Thus, different combinations of these fractions with the corresponding fractions of NS were analyzed in the CBS. The P Protein fraction reconstituted into NS lipids showed an inefficient adsorption and dynamic behavior, meaning that PAP-associated SP-B and SP-C were dysfunctional. On the other hand, the excess of cholesterol also showed a contribution to this impaired behavior, as seen in samples containing the fully active protein and phospholipid complements of NS but the altered neutral lipid fraction of P. The exacerbated amount of cholesterol in P surfactant likely alters the structure and mechanical properties of surfactant layers rendering them dysfunctional. P05-24 Molecular function of isolated Ca 2+ -dependent gating rings Roger Gimeno-Llobet, Teresa Giráldez Fernández Departamento de Ciencias Biomedicas, Facultad de Medicina, y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias (CIBICAN), Universidad de La Laguna, Tenerife, La Laguna, ES In some Ca 2+ - regulated ion channels and transporters, ion binding is sensed by a large C-terminal intracellular region, where eight Regulator of Conductance for K + (RCK) domains form a gating ring. In the large conductance Ca 2+ and voltage regulated channel (BK), it has been proposed that Ca 2+ binding expands the gating ring, and the large movement of the gating ring would physically pull and open the gate located at the pore domain. Calcium binding to this region reduces the energy required to open the channel, but the exact mechanism underlying this process is still uncertain. Using patch-clamp recordings and simultaneous measurements of fluorescence energy transfer between CFP and YFP variants of the green fluorescent protein, our group has shown that Ca 2+ binding produces large structural changes that are not obligatorily coupled to the opening of the pore of the BK channel (Miranda et al PNAS 203 0:527). These results are in contrast with structural studies of isolated gating rings, where large rearrangements are not observed after Ca 2+ binding. It is possible that the apparent discrepancy is due to involvement of other regions of the channel in the gating ring movement. We have now characterized the molecular function of isolated gating rings, using fluorescent fusion proteins expressed in mammalian cells. P05-25 (R05-) TRPA channels are membrane sensors of bacterial endotoxins Victor Meseguer, Yerandy Alpizar 2, Sendoa Tajada 3, Enoch Luis, Carlos Fernández-Peña, Tatiana Kichko 4, Peter Reeh 4, María Teresa Pérez-García 3, José Ramón López López 5, Thomas Voets 2, Carlos Belmonte, Karel Talavera 2, Félix Viana Instituto de Neurociencias de Alicante UMH-CSIC, San Juan de Alicante, ES, 2 KULeuven, Leuven, BE, 3 Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM), Universidad de Valladolid-CSIC, Valladolid, ES, 4 Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen-Nürnberg, DE, 5 Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM), Universidad de Valladolid- CSIC, Valladolid, ES TRPA is a member of the transient receptor potential (TRP) family of cationic channels, expressed in nociceptive sensory terminals of primary sensory neurons. TRPA shows polymodal activation by physical (e.g. temperature and mechanical stretch) and chemical stimuli. Recently, TRPA has emerged as a key chemosensor for many natural and industrial chemical irritants. In addition, TRPA responds to reactive oxygen species 6

Pósters XXXVII Congreso SEBBM and reactive aldehydes. Activation of TRPA produces pain, release of neuropeptides and inflammation. Gram(-) bacterial infections are generally accompanied by inflammation and pain. These symptoms are generally attributed to sensitization of nociceptors by inflammatory mediators released by immune cells (e.g. monocytes and macrophages) through activation of the Toll-like-receptor 4 (TLR4) signaling pathway by lipopolysaccharide (LPS), a toxic byproduct of bacterial lyses. Unexpectedly, we found that LPS exerts fast, membrane delimited, excitatory actions on TRPA. Activation of TRPA by different forms of LPS correlates with the structure of lipid A, the lipid component of the LPS moiety. Moreover, we found that pain and acute pathophysiological vascular reactions, including neurogenic inflammation (CGRP release) caused by LPS are primarily dependent on TRPA channel activation in nociceptor terminals. The identification of TRPA as molecular determinant of LPS effects opens novel avenues for the treatment of symptoms caused by Gram(-) bacterial infections and offers new insights into the pathogenesis of pain and neurovascular responses during bacterial infections. P05-26 Perifosine modulates autophagy in human tumor cells J.M. Jiménez-López, P. Ríos-Marco, M. Fernández-Ortiz, M. García-González 2, J.L. Segovia, C. Marco, M.P. Carrasco Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Faculty of Sciences, University of Granada, Granada, ES, 2 Universitary School La Inmaculada Concepción, University of Granada, Granada, ES Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of various cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines. APLs have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic, however their exact mechanisms of action on cell death and other inhibitory pathways are unknown. In this work, we show that perifosine, as representative APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3-II in HepG2 and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An increase in autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with both autophagy stimulation and block in the late stages of autophagy. To discriminate whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells resulted from induction of autophagy or decreased autophagic flux, we performed assays in the presence of chloroquine to block autophagy by inhibiting lysosomal proteases and preventing autophagosome-lysosome fusion. We observed that perifosine treatment produces an alteration in autophagic flux in both cell lines. We detected moreover that blockade of autophagy at the level of the autophagosome-lysosome fusion does not modify apoptotic cell death induced by perifosine in both cell lines. We conclude that modulation of autophagy process is emerging as new target for cancer therapy. This research was aided by the Junta de Andalucía (P-CVI-7859). P06. Bioquímica de la nutrición P06r- Las semillas de tomate: una fuente oculta de alérgenos Laura Martín-Pedraza, Miguel González 2, Juan Carlos López- Rodríguez, Eva Batanero, Rodrigo Barderas, Miguel Blanca 3, Rosalía Rodríguez, Mayte Villalba Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2 Laboratorio de Investigación, IBIMA, Hospital Regional Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES, 3 UGC Alergia, IBIMA, Hospital Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES La alergia a alimentos es un problema de salud en los países desarrollados que afecta a un 5% de la población. Provoca síntomas graves e inesperados y es causa frecuente de anafilaxia. En adultos los alimentos vegetales inducen el mayor número de reacciones de hipersensibilidad, y la mayoría de sus alérgenos pertenecen a unas pocas familias de proteínas, entre las que destacan las cupinas y las prolaminas. Algunos de los problemas diagnósticos de estas alergias radican en la presencia de alérgenos específicos en ciertas partes del fruto, como las semillas. El poder diagnóstico de estas moléculas se ve diluido cuando se utiliza el extracto completo, el cual es una mezcla compleja del fruto. Este es el caso de las semillas de tomate, que son una fuente rica en proteínas de reserva suponiendo un 80% del total. Los objetivos del presente trabajo son detectar los alérgenos reconocidos por las IgE de pacientes alérgicos a las semillas de tomate, con síntomas graves como anafilaxia o angioedema, o leves como urticaria o síndrome de alergia oral, e identificarlos mediante inmunodetecciones con anticuerpos policlonales y con sueros de pacientes. Los extractos se han cromatografiado en HPLC y los picos obtenidos se han analizado en PAGE-SDS mediante tinción con Azul de Coomassie y tras transferencia a membranas con sueros. La unión de IgE a una banda de 0 kda es mayoritaria en pacientes con síntomas graves de anafilaxia y angioedema, mientras que bandas de mayor masa molecular (35-60 kda) son asociadas a síntomas leves. El uso de extractos bien definidos de cada tejido y la identificación de los alérgenos implicados permitirá determinar el patrón de sensibilización de cada paciente con mayor precisión y evitar los falsos negativos que se obtienen en las pruebas cutáneas. P06r-2 (R06-4) Cardiotrophin- up-regulates apelin secretion and gene expression in 3T3-L adipocytes Miguel López Yoldi, Matilde Bustos 2, María Asunción Romero Lozano 2, J Alfredo Martínez, Jesús Prieto 2, María Jesús Moreno Aliaga Department of Nutrition, Food Science and Physiology, Centre for Nutrition Research, Faculty of Pharmacy, University of Navarra - CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III, Pamplona, ES, 2 Area of Hepatology and Gene Therapy, Center for Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra, Pamplona, ES Introduction: Cardiotrophin- (CT-) is a member of the IL-6 family of cytokines. A recent study of our group has revealed that CT- is a key regulator of glucose and lipid metabolism. Apelin is an adipokine that stimulates glucose utilization and insulin sensitivity in obese and insulinresistant mice. The aim of the present study was to analyze the potential effect of CT- on apelin production in adipocytes. Methods: Fully differentiated 3T3-L adipocytes were incubated with different concentrations (-40 ng/ml) of recombinant protein CT- (rct- ) or IL-6 (20 ng/ml) for 8 hours. Apelin mrna expression levels were determined by quantitative real-time PCR. The measurement of apelin secretion to the medium was quantified by ELISA. The phosphorylation levels of p-akt (Ser-473) and p-erk /2 (Thr 202/Tyr 204) as well as total AKT and ERK protein levels were analyzed by Western blot. Specific inhibitors were used to characterize if these pathways were involved in the actions of CT- on apelin production. Results: rct- treatment (8 h) significantly increased apelin gene expression and secretion in 3T3-L adipocytes in a concentration dependent manner. In parallel, rct- (20 ng/ml) induced the phosphorylation of ERK and AKT in adipocytes. Pre-treatment with the PI3K inhibitor, LY294002, completely blocked the stimulatory action of CT- on apelin gene expression. Conclusion: The present data demonstrate the ability of rct- to stimulate apelin synthesis and/or secretion in adipocytes and suggest that these effects are probably mediated by PI3K/AKT pathway. 62

Granada 204 Pósters P06-3 (R06-) Acción moduladora de marcadores cardiovasculares y de obesidad de café verde y yerba mate Laura Bravo Clemente, Sara Martínez López, Raquel Mateos, Beatriz Sarria ICTAN-CSIC, Madrid, ES El café es ampliamente consumido en todo el mundo, mientras que la yerba mate es muy popular en países Sudamericanos, aunque su consumo se está extendiendo. Ambas bebidas tienen un rico contenido en compuestos fenólicos derivados de los ácidos hidroxicinámicos, así como metilxantinas, siendo la cafeína la más abundante. El café verde presenta una mayor concentración de estos compuestos bioactivos en comparación con el clásico café tostado. En este estudio se quiso conocer los efectos en marcadores cardiovasculares y de obesidad del consumo regular de un producto de café mezcla de verde y tostado (35:65) y de yerba mate en una población normocolesterolémica (n=25) y otra hipercolesterolémica (HC, n=27). Se llevó a cabo un estudio cruzado, aleatorizado y controlado en hombres y mujeres de entre 8-45 años, no fumadores, no vegetarianos, con un IMC=8-25 kg/m 2, que tomaron el café, mate o agua (control) tres veces al día, durante 8 semanas, restringiéndose el consumo de ciertos alimentos ricos en polifenoles. Al principio y final de cada intervención se tomaron muestras de sangre y se controló la presión arterial (PA) y frecuencia cardiaca (FC), se hizo un estudio antropométrico y los participantes rellenaron un registro dietético de 72 horas y cuestionario de actividad física. Se analizó el perfil lipídico y la proteína C reactiva (PCR) mediante autoanalizadores, así como citoquinas pro- y anti-inflamatorias, quimioquinas, moléculas de adhesión, adipoquinas y hormonas mediante ensayos Multiplex. Los resultados se analizaron mediante un modelo general de medidas repetidas y test de Bonferroni dentro de cada grupo (SPSS, v. 9.0). Ambas bebidas, redujeron FC y PA, especialmente en los sujetos HC, en los que también se observó una disminución en los niveles de colesterol total, VLDL-C y triglicéridos. Tras la intervención con café los voluntarios disminuyeron su peso corporal, así como el porcentaje de grasa corporal (por bioimpedancia); con el mate se observaron las mismas tendencias aunque las diferencias no fueron significativas. Con ambas bebidas se observó una ligera menor ingesta de proteína y, en el caso del mate, también de grasas y energía. El consumo de café dio lugar a un descenso en los niveles de grelina, leptina, inhibidor de la activación de plasminógeno- (PAI-), resistina y PCR en ambos grupos de estudio. P06-5 (R06-7) Suplementación dietaria con aceite de rosa mosqueta (Rosa rubiginosa) y prevención de la esteatosis hepática inducida por una dieta alta en grasa: participación de PPAR-alfa y ACOX Gladys Tapia Opazo, Sergio Rodriguez, Gladys Tapia, Pamela Romanque Ulloa, Amanda Despessailles Tapia, Alejandra Espinosa Escalona 2, Camila Dossi Muñoz Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, CL, 2 Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, CL El elevado aporte dietario de ácidos grasos ω-6 en relación a los ácidos grasos ω-3, genera alteraciones en la salud cardiovascular y hepática, dentro de las patologías crónicas no transmisibles. Por otro lado, el pescado, rico en ácidos grasos ω-3, es de bajo consumo en Chile, siendo necesario buscar otras fuentes alternativas de estos ácidos grasos, como lo son aceites con un alto contenido del ácido alfa linolénico, precursor de los ácidos grasos ω-3, eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA). Tanto EPA como DHA son activadores del factor de transcripción PPAR-α, el cual regula la expresión del gen que codifica para la proteína prolipolítica, ACOX. Este trabajo evaluó la prevención de la esteatosis hepática mediante suplementación con aceite de rosa mosqueta (RM) rico en ácido alfa linolénico, que se biotransforma en EPA y DHA. Para ello, ratones macho C57BL/6J (n=5-9 por grupo experimental) fueron alimentados con una dieta: a) control (0% lípidos, 20% proteínas y 70% de carbohidratos) y b) alta en grasa (60% lípidos, 0% proteínas y 30% carbohidratos) con o sin suplementación dietaria diaria con aceite de RM (Coesam, Chile). La dieta y la suplementación con aceite de RM se mantuvieron por 2 semanas. Se determinó la esteatosis hepática (histología) y los niveles de PPAR-α (RT-PCR) y de ACOX (RT-PCR). Los resultados mostraron que los animales que fueron alimentados con dieta alta en grasa y suplementados con aceite de RM: i) presentaron una histología hepática normal y una disminución significativa en los niveles de esteatosis hepática evaluada por el porcentaje de células con gotas lipídicas, respecto al grupo que sólo recibió la dieta alta en grasa (ANOVA unifactorial, seguida del Test de Newman Keuls); y ii) disminuyeron en forma significativa el contenido de grasa abdominal, respecto a aquellos que sólo recibieron la dieta alta en grasa. La prevención de la esteatosis hepática se acompañó de un aumento en los niveles hepáticos del mrna de PPAR-α y ACOX. Se concluye que la administración dietaria de un aceite rico en ácido alfa linolénico previene la esteatosis hepática lo cual podría estar relacionado al aumento en los niveles de PPAR-α y de ACOX. FONDECYT 40547. P06-6 Efecto de la suplementación dietética con proteínas de plasma bovino en la prevención de alteraciones de la mucosa intestinal en un modelo de colitis Lluïsa Miró, Anna Pérez-Bosque 2, Mònica Maijó 2, Javier Polo, Miquel Moretó 2 APC Europe, Granollers, Barcelona, ES, 2 Departament de Fisiologia, Facultat de Farmàcia; Institut de Nutrició i Seguretat Alimentària, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES En estudios previos se ha demostrado que la suplementación dietética con proteínas plasmáticas reduce la respuesta inflamatoria intestinal en modelos de inflamación aguda. La mucosa intestinal contiene mucinas y TFF3, con funciones de protección y reparación tisular. El objetivo de este trabajo es analizar dichas variables en ratones KO que carecen del gen mdr- y desarrollan colitis de forma espontánea, y evaluar el efecto de la suplementación dietética con inmunoglobulinas de plasma bovino (IPB). Los ratones KO y los correspondientes controles recibieron una dieta control o bien una dieta suplementada con 2% IPB desde el día 2 (destete) hasta el día 56. Se realizó un estudio histológico para establecer el índice histopatológico así como el recuento de las células caliciformes de la mucosa del colon. También se determinó por RT-PCR la expresión de mucinas MUC y MUC4 (transmembrana), MUC2 (secretora) y del TFF3. Los ratones KO presentaron un mayor índice histopatológico que los controles y la suplementación con IPB redujo en parte estos efectos. En los animales KO se observó un aumento de la expresión de MUC4 (4 veces) y de MUC (6 veces, ambas P<0,05), menor expresión de MUC2 y TFF3, que se redujo en un 80% y un 50%, respectivamente (P<0,05) y un menor número de células caliciformes. La suplementación con IPB atenuó los cambios en la expresión de las mucinas transmembrana y del TFF3 sin modificar la MUC2 y restauró la población de células secretoras de moco. Los resultados indican que la suplementación con IPB restablece la función protectora de la mucosa intestinal, modulando la expresión de mucinas y reduciendo las alteraciones histológicas de la colitis. Financiado por el proyecto TRACE 2009 037 (Ministerio de Economía y Competitividad, España). 63

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P06r-7 Efecto del ácido maslínico, un triterpeno pentacíclico natural, sobre lesiones preneoplásicas inducidas en colon de rata Glòria Lozano-Mena, Marta Sánchez-González, M. Emília Juan, Joana M. Planas Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES El ácido maslínico es un triterpeno pentacíclico presente en distintos vegetales habituales en la dieta mediterránea. Estudios previos han demostrado su actividad antiproliferativa y proapoptótica en la línea celular de cáncer de colon HT-29. Con el fin de confirmar su actividad quimiopreventiva in vivo, se ha usado un modelo de cáncer de colon en rata inducido por,2-dimetilhidrazina (DMH). El agente carcinógeno se inyectó semanalmente por vía intraperitoneal (20 mg/kg), mientras que el ácido maslínico se administró por vía oral a las dosis 5, 0 y 25 mg/kg durante 49 días. El colon se dividió en los segmentos proximal, medial y distal, que se fijaron con formalina antes de la observación de lesiones preneoplásicas al microscopio óptico. La tinción de azul de metileno permitió el recuento de focos de criptas aberrantes (FCA), mientras que la tinción de diaminas y hierro/azul alciano se usó para el recuento de focos con depleción de mucinas (FDM), indicativas de un mayor grado de displasia. Además, se determinó la concentración de ácido maslínico en contenido de colon para establecer una correlación con el efecto observado. El ácido maslínico no redujo el número de FCA en colon total, que fue de 58±20, 89±5, 84±7 y 60±8 en los grupos DMH i DMH-ácido maslínico a las tres dosis, respectivamente. En todos los grupos se observó la misma distribución de FCA, siendo mayor en los segmentos medial y distal. Tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas en el recuento de FDM, que fue de 28±5, 33±6, 34±0 y 35±2 en colon total. En conclusión, el ácido maslínico a la tres dosis ensayadas no evita la aparición de lesiones preneoplásicas inducidas por DMH en ratas. Financiado por AGL2009-2866 del MEC y 2009-SGR-0047 de la Generalitat de Catalunya. P06-8 Preventive effect of low molecular-weight proanthocyanidins on metabolic syndrome parameters Zara Pons, Maria Margalef, Susana Suárez-García, Aleix Ribas-Latre, Francisca Isabel Bravo, Aïda Pascual-Serrano, Manuel Suarez, Cinta Bladé, Gerard Aragonès, Lluis Arola, Anna Arola-Arnal, Begoña Muguerza Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona, ES The importance of metabolic syndrome (MS) is rising due to its increasing prevalence worldwide. For that reason, a great effort is being directed to prevent the development of MS. In this regard, the use of functional foods is highly recommended. A good animal model to study MS is the cafeteria (CAF) fed rat, no only because it reproduces the MS but also because it shares the pathogenesis of the human disease. On the other hand, proanthocyanidins have been previously described to cause beneficial health effects in most of the components of MS and in cardiovascular risk factors. In this study, male wistar rats were fed CAF or standard (ST) diet for 2 weeks. Additionally, CAF fed rats were treated with different doses of low molecular weight grape seed proanthocyanidins extract (LM-GSPE) (25, 00 and 200 mg/kg/day; n=0) or vehicle, and the ST rats were given vehicle (n=0). Body weight, waist perimeter, blood pressure and food intake were measured weekly. Plasmatic parameters were checked at 7 th, 0 th and 2 th week of experiment. The animals fed with CAF diet presented raised body weight, waist perimeter and blood pressure compared to ST rats. LM-GSPE decreased blood pressure in a dose response manner. CAF treated rats had decreased body weight and waist perimeter at the 7 th and 8 th week of experiment at doses of 00 and 200 mg/kg/day. Differences in food and liquid intake were found for diet, but not due to treatment. Plasma triglycerides and total cholesterol were elevated in CAF rats compared to ST rats. A decrease in total cholesterol was found for the highest doses of LM-GSPE in 7 th and 0 th weeks and a decrease in plasma triglycerides with the lower doses at 2 th week was observed. Grape seed proanthocyanidins have a clear antihypertensive effect, preventing the rise of blood pressure due to the CAF diet. Body weight and waist perimeter were slightly modified by the treatments. In addition, a clear effect on plasma cholesterol was described. Therefore, LM-GSPE could be a promising candidate for functional foods due to the improvement observed in most of MS components. P06-9 Efectos de la suplementación prolongada con ácidos grasos omega-3 en un modelo de sordera progresiva Raquel Martínez Vega, Teresa Partearroyo 2, Néstor Vallecillo 3, Gregorio Varela-Moreiras 2, Isabel Varela-Nieto, María A. Pajares Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 76, CIBERER, Madrid, ES, 2 Departamento de Ciencias Farmacéuticas y de la Salud, Facultad de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Boadilla del Monte, Madrid, ES, 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 76, CIBERER, Madrid, ES Los ácidos grasos poli-insaturados omega-3 (PUFAs) son nutrientes muy conocidos por sus efectos beneficiosos en el desarrollo cognitivo y su mantenimiento, regulando la inflamación, el estrés oxidativo y la sensibilidad a insulina, entre otros parámetros asociados al envejecimiento (). Los niveles insuficientes de ácido docosahexaenóico (omega-3) se han asociado con trastornos neurológicos, vasculares, y con la pérdida auditiva asociada a la edad (ARHL) en el hombre (2). Se ha demostrado la existencia de una relación directa entre ARHL y niveles plasmáticos elevados de homocisteína (phcy)(3). Por el contrario, la relación entre ARHL y altos niveles plasmáticos de PUFAs resulta ser inversa (4). En el presente estudio hemos utilizado ratones C57BL/6J y una suplementación prolongada con omega-3 para evaluar su impacto en la capacidad auditiva, los niveles de Hcy, el estrés oxidativo y la inflamación. Ratones de dos meses de edad fueron alimentados con dieta control o suplementada con omega-3 durante 0 meses. La capacidad auditiva de los animales fue evaluada mensualmente mediante ABR y DPOAE, analizando sus umbrales auditivos. Se tomaron muestras de sangre para determinar concentraciones de phcy y ácido fólico por HPLC. La morfología coclear se evaluó mediante inmunohistoquímica y tinción con violeta de cresylo. Se analizaron marcadores de inflamación y estrés oxidativo mediante Western blotting y RT-qPCR. El grupo control mostró umbrales auditivos significativamente elevados en ABR (~25 db SPL) y menores amplitudes DPOAE a frecuencias medias-altas, cuando se comparó con el grupo que recibió omega-3. No se observaron diferencias histológicas entre los grupos, pero sí se detectaron niveles elevados de phcy (p=0.3) y disminuidos de ácido fólico sérico (p<0.05) en el grupo control comparado con el suplementado con omega-3. Los resultados obtenidos sugieren que la suplementación prolongada con omega-3 podría tener un efecto protector a largo plazo en el desarrollo de ARHL. Referencias [] Da Young Oh et al., Cell, 42(5):687-98, 200. [2] Bamini Gopinath et al., Am J Clin Nutr, 92(2):46-2, 200. [3] Bamini Gopinath et al., J Nutr, 40(8):469-74, 200. [4] Carla Dullemeijer et al., J Nutr Health Aging, 4(5):347-5, 200. Agradecimientos: Beca JAE, BFU2009-08977, SAF20-2439, FP7- AFHELO, FP7-AFHELO, FP7-TARGEAR y Lactalis-Puleva. 64

Granada 204 Pósters P06-0 (R06-5) Estudio farmacocinético del ácido maslínico, un componente bioactivo de Olea europea L. Marta Sánchez-González, Glòria Lozano-Mena, Tatiana Trebolento, Helena Colom 2, M. Emília Juan, Joana M. Planas Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES, 2 Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica, Barcelona, ES El ácido maslínico es un componente minoritario aislado de diferentes plantas y principalmente de las hojas y los frutos del olivo. Se han descrito sus efectos beneficiosos en modelos animales de cáncer, diabetes y cardiopatía pero se desconoce su biodisponibilidad oral. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es determinar los parámetros farmacocinéticos del ácido maslínico en rata tras su administración oral. Una dosis única de 50 mg/kg del compuesto fue administrada mediante sonda intragástrica a ratas Sprague-Dawley. Se obtuvieron muestras de sangre procedentes de la vena safena a 8 tiempos distintos durante 24 horas. El plasma se procesó siguiendo una doble extracción líquidolíquido con acetato de etilo antes de ser analizado por HPLC-MS. Mediante el software Winnonlin se realizó el análisis no compartimental y compartimental de las concentraciones plasmáticas de ácido maslínico vs tiempo, siendo el modelo bicompartimental el que mejor describió la farmacocinética oral del compuesto. La C max del ácido maslínico (4,82 μm) se alcanzó 49,90 min después de su administración. El AUC fue de 93,58 min μmol/l y el CL/F de 0,6 L/min/kg. Los V c /F y V p /F fueron de 3,02 y 30,56 L/kg, respectivamente. Por otro lado, la K 0 presentó un valor de 0,034 /min y la K 0 de 0,0088 /min. Los resultados obtenidos sugieren una absorción relativamente rápida con una buena distribución al compartimento periférico y una eliminación sostenida. En conclusión, las concentraciones plasmáticas de ácido maslínico tras su administración oral siguen una caída biexponencial con una constante de retorno limitada y una eliminación lenta del organismo. Estudio fi nanciado por los proyectos AGL2009-2866 del MCT y 2009- SGR-0047 de la Generalitat de Catalunya. P06- (R06-2) Efectos beneficiosos de ingredientes bioactivos sobre la hipertensión arterial Begoña Muguerza, Zara Pons, Cinta Bladé, Gerard Aragones, Manuel Suarez, Lluís Arola, Anna Arola-Arnal Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona, ES La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en el mundo y la hipertensión arterial es uno de sus principales factores de riesgo. Varios estudios han demostrado que el consumo de alimentos o ingredientes ricos en flavanoles, como el cacao o extracto de pepita de uva, mejoran la función endotelial y disminuyen la presión arterial. Diferentes mecanismos podrían justificar las propiedades antihipertensivas de los flavanoles. La vasodilatación ocasionada por estos compuestos se ha relacionado con la reducción del estrés oxidativo, con la producción de óxido nítrico (NO) y la inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA), clave para el control de la presión arterial. El cacao y el extracto de pepita de uva son productos ricos en flavanoles del tipo flavan-3-ol y proantocianidinas que han demostrado gran actividad antioxidante. Sin embargo, la concentración real de flavonoides que alcanzan los vasos sanguineos es tan baja que es poco probable que estos compuestos actúen por un mecanismo antioxidante directo y posiblemente otros mecanismos relacionados con interacciones específicas con proteínas o lípidos, serán responsables de sus efectos sobre la presión arterial. De hecho, el efecto antihipertensivo de los flavanoles se atribuye fundamentalmente, a un aumento en la disponibilidad de NO. Sin embargo, es posible que otros mecanismos de acción estén también implicados como la disminución de endothelina- o el aumento de prostaciclina. Además, se conoce que estos compuestos también pueden inhibir un gran número de enzimas, incluyendo la ECA, de promover la expresión de múltiples genes reguladores de la presión arterial y de afectar en diferentes niveles a las cascadas de señalización implicadas en el control de la presión arterial. P06-2 (R06-6) Apigenin K has intestinal anti-inflammatory effect in two experimental models of rat colitis Raquel González Pérez, Cristina Mascaraque Molina, María Dolores Suárez Ortega 2, Antonio Zarzuelo Zurita, Olga Martínez Augustin 2, Femín Sánchez de Medina López-Huertas Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, CIBERehd, UGR, Granada, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, CIBERehd, UGR, Granada, ES Background and objectives: Flavonoids are polyphenolic compounds which are widespread in nature and are consumed as part of the human diet in significant amounts. Many flavonoids have been studied for their intestinal antiinflammatory activity. The aim of this study was to test the intestinal anti-inflammatory activity of apigenin K, a soluble form of apigenin, in two models of rat colitis, the trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) model and the dextran sulfate (DSS) model. Methods: Apigenin K (3 mg/kg, p.o.) was administered as a pretreatment to rats with TNBS and DSS colitis and colonic status was checked 7 and 9 days after colitis induction, respectively, by macroscopic and biochemical examination. Results: Apigenin K pretreatment resulted in amelioration of the morphological signs and biochemical markers in the TNBS model. The results demonstrate a reduction in inflamed area of 2.4 cm compared with TNBS group, lower values of macroscopic damage (5.8±. vs 8.6±.4, p<0.05) and a slight decrease in the colonic weight/length ratio. Myeloperoxidase and alkaline phosphatase colonic activities were reduced by 34% (p<0,05) and 8%, respectively. Moreover, apigenin K also ameliorated morphological signs and biochemical markers in the DSS model, the comparable results. Thus macroscopic damage was significantly reduced (0.5±0.5 vs 2.±0.6, p<0.05) and the colonic weight/length ratio was lowered by approximately 0%. Colonic myeloperoxidase and alkaline phosphatase activities decreased 30% and 20%, respectively (p<0,05). Apigenin K treatment additionally reduced the colonic expression of ILβ, IL6, Foxp3, TLR2 and TGFβ compared with the TNBS group (p>0.05 for the latter two). Conclusions: Apigenin K has anti-inflammatory effects in two preclinical models of inflammatory bowel disease. This study was supported by grants of the Centre for Technological Industrial Development (CDTI) (CENIT SENIFOOD). P06-3 (R06-3) Pectinas, regulación del peso corporal y salud Ana María Rodríguez Guerrero, Francisco Javier García Carrizo, Catalina Picó Segura, Andreu Palou Oliver Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología (Universitat de les Illes Balears) y CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición, Palma de Mallorca, ES Recientemente, la composición de la microbiota intestinal ha emergido como factor crucial en la prevención de la obesidad (y sus complicaciones), a su vez fuertemente influenciada por la dieta. Numerosas investigaciones destacan el efecto de los prebióticos como moduladores de la microbiota, en un mejor funcionamiento metabólico y en la protección frente a la obesidad. Un tipo particular de prebióticos, utilizados de forma tradicional en alimentación, son las pectinas. 65

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Las pectinas son fibras hidrosolubles del tipo polisacáridos no-almidón sobre las que se ha probado su papel en la mejora del control de la glucemia y de los niveles de colesterol, aunque su posible papel en la protección frente a la obesidad y en otros aspectos relacionados con la salud metabólica está menos demostrado. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo de propensión a la obesidad: descendencia de ratas sometidas a restricción calórica moderada durante el embarazo, modelo más similar a la posible situación en humanos respecto de otros modelos más restrictivos. Hemos analizado el efecto protector de una suplementación moderada con pectinas altamente esterificadas de manzana desde el destete hasta la edad adulta bajo una dieta control o incluyendo un factor obesogénico más (dieta alta en sacarosa). Hemos comprobado que la suplementación con pectinas a largo plazo supone una protección significativa frente al desarrollo de adiposidad corporal, acompañada de un mejor perfil metabólico de parámetros circulantes y parámetros de expresión génica en tejidos clave. En definitiva, la suplementación de la dieta con pectinas se perfila como una posible herramienta eficaz en la prevención de la obesidad y en el mantenimiento de un perfil metabólico saludable. P06-4 Dietary squalene increases high density lipoprotein-cholesterol and paraoxonase and decreases oxidative stress in mice Clara Gabás-Rivera, Cristina Barranquero 2, Roberto Martínez- Beamonte, María Angeles Navarro-Ferrando, Joaquín Carlos Surra- Muñoz 3, Jesús de la Osada García 4 Departamento Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2 CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición, Instituto de Salud Carlos III, Zaragoza, ES, 3 Departamento de Producción Animal, Escuela Politécnica Superior de Huesca, Huesca, ES, 4 Departamento de Bioquímica y Biología molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES Background and Purpose: squalene, the main hydrocarbon in the unsaponifiable fraction of virgin olive oil, is involved in cholesterol synthesis and it has been reported to own antiatherosclerotic and antiesteatosic effects. However, the squalene s role on lipid plasma parameters and the influence of genotype on this effect need to be addressed. Experimental Approaches: three male mouse models (wild-type, Apoa- and Apoe- deficient) were fed chow semisynthetic diets enriched in squalene to provide a dose of g/kg during weeks. After this period, their plasma parameters and lipoprotein profiles were analyzed. Key Results: squalene administration at a dose of g/kg showed decreased reactive oxygen species in lipoprotein fractions independently of the animal background and caused an specific increase in high density lipoprotein (HDL)-cholesterol levels, accompanied by an increase in phosphatidylcholine and paraoxonase and no changes in apolipoproteins A and A4 in wild-type mice. In these mice, the cholesterol increase was due to its esterified form and associated with an increased hepatic expression of Lcat. These effects were not observed in absence of apolipoprotein A. The increases in HDL- paraoxonase were translated into decreased plasma malondialdehyde levels depending on the presence of Apolipoprotein A. Conclusions and Implications: dietary squalene promotes changes in HDL- cholesterol and paraoxonase and decreases reactive oxygen species in lipoproteins and plasma malondialdehyde levels, providing new benefits of its intake that might contribute to explain the properties of virgin olive oil, although the phenotype related to apolipoproteins A and E may be particularly relevant. P06m-5 Marcadores diagnósticos y pronósticos en la obesidad mórbida JR Muñoz-Rodríguez, E Salas, E Segura, M Sánchez, G López, M Palma, P Rozas, L Sáenz, A Agarrado, C González-Martín 2, G Casas, A León, J Martín, LF Alguacil 2 Hospital General Universitario de Ciudad Real, Ciudad Real, ES, 2 Hospital General Universitario de Ciudad Real, Universidad CEU San Pablo, Boadilla del Monte, Madrid, ES El objetivo de este estudio es evaluar la posible utilidad diagnóstica de diversos marcadores genéticos y bioquímicos en la obesidad mórbida, así como su valor pronóstico y predictivo de la respuesta personalizada a la cirugía bariátrica. Para el estudio bioquímico se seleccionaron 3 pacientes con obesidad mórbida (IMC>40 kg/m2) que fueron sometidos a cirugía bariátrica en el HGUCR y a los que se realizó un seguimiento de 2 meses. Se reclutó el mismo número de controles normopesos (IMC entre 8,5 y 24,9 kg/ m2) entre el personal del hospital procurando que las proporciones de edad y sexo resultaran homogéneas. Para los estudios genéticos se aumentó el número de pacientes a 74 y el de controles a 57. Como marcadores genéticos se midieron polimorfismos de genes relacionados con obesidad y trastornos de la conducta alimentaria (Bdnf, Cart, Ucp2, Fto, Adra2B y Pparg). Como marcadores bioquímicos se midieron neuropéptidos (BDNF y CART), hormonas (grelina, leptina, adiponectina, insulina) y citoquinas proinflamatorias (IL-6 y TNFα). El estudio genético mostró diferencias significativas entre controles y pacientes en las frecuencias de los polimorfismos rs9939609 y rs9939973 del gen Fto y rs782447 del gen Ucp2. Los niveles de IL-6 fueron superiores en pacientes respecto a los controles. Se detectó un descenso en BDNF un año después de la cirugía bariátrica en los pacientes intervenidos. El perfil hormonal, claramente distinto entre ambos grupos de inicio, se revirtió en los pacientes obesos intervenidos en lo que respecta a niveles de adiponectina, leptina e insulina. Los datos obtenidos, junto con otros estudios preclínicos y clínicos, sugieren que el análisis de los polimorfismos de Ucp2 y Fto, la citoquina IL-6, el perfil hormonal y el neuropéptido BDNF, pueden ser herramientas valiosas bien para definir diferentes endofenotipos de obesidad, bien para evaluar o predecir el resultado de los tratamientos contra la obesidad. Financiado por el Instituto de Salud Carlos III (FIS PI0/00440). Los autores agradecen a Dña Amelia González López su excelente asistencia técnica. P07. Bioquímica perinatal P07- (R07-3) Obesidad pregestacional. Consecuencias para la descendencia y papel del estrés oxidativo Martín Alcalá Díaz.Mor, Sonia Clapés 2, Victoria E: Bolado García, Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles, Franciasco Dasí 3, Guillermo Saez Tormo 4, María del Pilar Ramos Álvarez, Marta Viana Arribas Facultad de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Madrid, ES, 2 ICBP Victoria de Girón, La Habana, CU, 3 Fundación Investigación Clínico de Valencia, Instituto de Investigación Sanitaria-INCLIVA, Valencia, ES, 4 Dpto. de Bioquímica y Biol. Molecular-CIBEROBN, Facultad de Medicina - Servicio de Análisis Clínicos-CDB HGUV, Universidad de Valencia, Valencia, ES Llevamos a cabo un estudio en un modelo de rata gestante con obesidad inducida por dieta, donde existen claras alteraciones metabólicas, entre ellas una elevada resistencia a la insulina. Se observó un incremento en el porcentaje de malformaciones congénitas en el grupo de ratas obesas, 66

Granada 204 Pósters reducido tras la administración de vitamina E. Se observó un incremento en el estrés oxidativo materno (mayores niveles de daño oxidativo, tanto a proteínas (PAOP) como al ADN, no siendo así en lípidos). Las mayores concentraciones de PAOP y de 8-oxo-7,8-dihidro-2 -desoxiguanosina, se correlacionaron positivamente con el incremento en las malformaciones congénitas. Además, los sistemas antioxidantes, tanto lipofílicos (vitamina E en tejido adiposo visceral), como enzimáticos (CuZnSOD, MnSOD y GPx hepáticos) se encontraron disminuidos, confirmando así la situación de incrementado estrés oxidativo asociado a la obesidad. Además, la subunidad catalítica de la glutamato cisteína ligasa, enzima responsable de la síntesis del glutation, está incrementada en obesidad como consecuencia de la demanda de dicho antioxidante. P07-2 (R07-4) Early nutrition reprograms the hepatic circadian clock: Permanent deregulation of metabolism Cristina Garcia-Beltran, Sílvia Ribó, Susana Kalko 2, Antonio Fernández 3, Laura Martínez-Guinó, Judith Cebrià, Thais Pentinat, Débora Martínez, Carles Lerín, Mario Vallejo 3, Rubén Díaz, Josep Jiménez Chillarón Hospital Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, ES, 2 Hospital Clínic de Barcelona-IDIBAPS, Barcelona, ES, 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Madrid, ES Excessive caloric intake during early stages of development increases the risk of childhood obesity and predisposes individuals to develop late onset of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes. We have developed a mouse model of neonatal overfeeding (ON) by culling the offspring to 4 pups per dam during lactation. Control females nursed 8 pups during lactation (C). ON mice developed obesity, hyperglycaemia, insulin resistance and glucose intolerance with ageing. The liver was the tissue that contributed most prominently to the development of insulin resistance. In order to underpin molecular mechanisms of insulin resistance we analysed global gene expression profiling (Affymetrix) in livers from ON and C male mice. The Ontology with highest significance was the Circadian Rhythm. We next validated (qpcr) the candidate genes (Npas2, Per, Per3, Cry) in adult mice. Strikingly, changes in expression (Per, Cry2) were already present in livers from 5-day-old ON mice. This data suggests that altered expression of hepatic clock genes is established early in life and do not occur as a secondary event associated to the progressive development of obesity and/or insulin resistance. Circadian rhythms play a major role in orchestrating daily physiological functions, and disrupting the expression of clock genes evokes metabolic diseases. Thus, we tested whole-body metabolism by indirect calorimetry. We found that VO2, VCO2, energy expenditure or activity absolute values were similar between groups during both the light and dark cycles. In contrast, in agreement with alterations in the circadian rhythmicity, the diurnal decrease in respiratory exchange ratio (RER) cycling started significantly earlier in ON mice. Likewise, upon fasting, V02, VCO2, and energy expenditure remained higher in ON mice during the night cycle. Overall, we show that early malnutrition permanently reprograms the hepatic circadian clock. Such reprogramming induces a sustained feedback loop that may in turn influence the physiologic behaviour of mice leading, secondarily, to overall metabolic deregulation. P07-3 (R07-2) Papel de p53 en la obesidad y su posible implicación en la programación del metabolismo Ruben Nogueiras Pozo Universidad Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES p53 es un gen supresor tumoral que desempeña múltiples funciones biológicas, incluyendo la capacidad para modular el metabolismo a diferentes niveles, incluyendo acciones en la grasa, el hígado o el páncreas. En este sentido p53 parece estar involucrado en la programación metabólica de los islotes pancreáticos durante la maternidad. La función endógena de p53 parece estar afectada por los diferentes estadíos nutricionales y los animales modificados genéticamente en los que se altera la expresión de p53 presentan importantes cambios metabólicos. Además también se ha observado que la expresión de p53 en el sistema nervioso central regula la acción metabólica de algunas hormonas que afectan a la ingesta. Futuros estudios serán necesarios para corroborar si p53 podría ser utilizada como diana terapéutica. P07-4 (R07-5) La obesidad previa a la gestación induce alteraciones metabólicas en la placenta Mónica Diez-Hochleitner Ruiz, Julio Sevillano Fernández, Jimena Pita Santibáñez, María Haro García, Marta Viana Arribas, Gema Medina Gómez 2, M. Pilar Ramos Álvarez Bioquímica y Biología Molecular, Universidad CEU San Pablo, Madrid, ES, 2 Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES La prevalencia de la obesidad ha aumentado en los últimos años, por lo que la probabilidad de que una mujer presente obesidad o sobrepeso al inicio de la gestación es cada vez mayor. Por estudios epidemiológicos sabemos que la obesidad durante la gestación favorece un mayor riesgo de complicaciones del recién nacido en edad adulta, aunque no se conocen en detalle los mecanismos implicados. Por esta razón, quisimos estudiar si la obesidad previa a la gestación altera la homeostasis glucídica y lipídica de la madre. Un grupo de ratas wistar recibió una dieta moderada en grasa previamente a la gestación (Moderate Fat Diet, MFD), y en paralelo otro grupo recibió la dieta control (C). Tras 35 días con las dietas, la hembras MFD ya presentaban sobrepeso, hiperlipemia, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina. En este momento se cruzaron los animales y se estudiaron a día 20 de gestación. Las madres con la dieta MFD tuvieron fetos más pequeños que las controles, aunque no hubo diferencias en el peso de las placentas ni en su contenido de lípidos. Asimismo, en las placentas del grupo MFD la expresión de Glut- y Lipina-2 estaba aumentada mientras que la de la LPL se encontraba disminuida frente a las C. El estudio metabolómico de las placentas reveló un mayor contenido de metabolitos como carnitina, acetilcarnitina, cistationina y serina (todos ellos relacionados con el metabolismo de los lípidos y la glucosa) en las placentas del grupo de MFD respecto al C. Estos resultados permiten concluir que la obesidad presente antes de la gestación, promueve un mecanismo adaptativo que protege a la placenta frente a una posible lipotoxicidad, pero a pesar de ello existen alteraciones relacionadas con un aumento en la captación de glucosa y en el metabolismo de la cistationina que podrían tener consecuencias en el desarrollo del feto. Financiado con SAF200-9603 y CAM-BMD200-2423. P07-5 (R07-) Programación metabólica en el periodo prey post-natal de la predisposición a la obesidad en el adulto Catalina Picó, Andreu Palou CIBER Fisiología de la Obesidad y Nutrición y Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología (Universidad de las Islas Baleares), Palma de mallorca, ES Alrededor del 25% de los casos de obesidad en la edad adulta tienen su origen en las primeras etapas del desarrollo pre- y post-natal. Son períodos críticos en los que la restricción materna de alimentos y la presencia o no de determinados componentes de los mismos puede conducir a adaptaciones permanentes de procesos metabólicos responsables de estos problemas y, según los estudios en modelos animales, los efectos pueden ser diferentes dependiendo del sexo, del periodo de exposición y su severidad. Y pueden ser de signo opuesto dependiendo de si la restricción materna tienen lugar 67

Pósters XXXVII Congreso SEBBM en la gestación (propensión a la obesidad) o en la lactancia (resistencia a la obesidad). Entre los nutrientes que más influyen en la programación metabólica del control del peso corporal, en 2005 identificamos a la leptina, un componente normal de la leche materna y ausente en las fórmulas o preparados para lactantes, que debiera ser considerado un nutriente esencial durante el desarrollo perinatal, pues en esta etapa contribuye a la organización de los sistemas de control metabólico-alimentario que operarán el resto de la vida. Aquí resumiremos datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio que revelan la capacidad de la leptina para corregir desajustes de la programación metabólica del recién nacido debidos a la alimentación materna durante la gestación y que, de no corregirse conducen a alteraciones metabólicas en la base del síndrome metabólico y la obesidad. P08. Bioquímica y biología molecular de plantas P08- Análisis de la expresión de la oxidasa alternativa de girasol (Helianthus annuus L.) en relación con el estrés biótico causado por Plasmopara halstedii Theo Guerra Dug, Ana María Fernández Ocaña, José Rafael Pedrajas Cabrera 2, Raquel Valderrama Rodríguez 2, Juan Bautista Barroso Albarracín 2, María Victoria Gómez Rodríguez Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología. Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2 Departamento de Biología Experimental. Universidad de Jaén, Jaén, ES La oxidasa alternativa (AOX) es una proteína presente en plantas y otros organismos que forma parte de la cadena mitocondrial de transporte de electrones. AOX puede sustituir a la Citocromo c oxidasa como aceptor final de electrones, con la ventaja de ser insensible al cianuro si bien su actuación da lugar a un menor rendimiento en términos de ATP. Puesto que se ha descrito que AOX desempeña un importante papel frente al estrés oxidativo y nitrosativo derivado de condiciones adversas de tipo biótico y abiótico, se ha realizado un estudio preliminar acerca del papel que esta proteína pudiera tener en la interacción entre H. annuus y uno de sus más importantes patógenos (P. halstedii), así como de la posibilidad de que AOX pudiera formar parte de los mecanismos de defensa que el BTH, un inductor de resistencia sistémica adquirida (SAR), pudiera activar. Se han empleado dos líneas de girasol, una susceptible HA89 y otra resistente RHA274 y tanto a nivel de expresión como de cantidad de proteína. Los resultados obtenidos han mostrado la existencia de diferencias en la expresión de la AOX entre ambas líneas de girasol. Las plantas de la línea susceptible tienen distinto nivel de expresión de AOX que las de la línea resistente pero esa diferencia no parece estar relacionada con su resistencia o susceptibilidad a P. halstedii. La infección da lugar en las plantas susceptibles a un aumento de la cantidad de AOX, no debida a una mayor transcripción de los genes que codifican las dos isoformas, sino a una distinta regulación de la traducción y/o equilibrio en la síntesis/ degradación de la proteína. De nuestros resultados se deduce que si bien el BTH actúa como protector de la infección por P. halstedii, este efecto no está ligado a una activación de la expresión de los genes que codifican para las dos isoformas de la AOX ni tampoco al aumento de la cantidad de proteína. Las semillas de girasol fueron amablemente cedidas por el equipo del profesor Said Mouzeyar, Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand, Francia. Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO202-33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286). P08-2 (R08-) Reevaluating the involvement of plastidic phosphoglucose isomerase in starch biosynthesis in mesophyll cells Ángela Sánchez López, Abdellatif Bahaji, Francisco José Muñoz, Edurne Baroja-Fernández, Jun Li, Adriana Ricarte-Bermejo, Goizeder Almagro, Manuel Montero, Javier Pozueta-Romero Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), Nafarroa, ES It is widely assumed that the whole starch biosynthetic process occurring in leaf mesophyll cells resides exclusively in the chloroplast. According to this view, transitory starch is considered the end-product of a metabolic pathway involving plastidic phosphoglucomutase (ppgm), ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS) that is linked to the Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase (ppgi). In this work we isolated pgi-3, a mutant totally lacking ppgi activity as a consequence of aberrant splicing of intron 6 of the ppgi encoding gene, PGI. Starch content in pgi-3 leaves was ca. 0-5% of that of wild type (WT) leaves, which is similar to that of leaves of pgi-2, a T-DNA insertion ppgi null mutant. Unexpectedly, microscopy analyses revealed the presence of few starch granules per chloroplast in the mesophyll cells of pgi-2 and pgi-3 leaves. Both pgi-2 and pgi-3 leaves accumulated WT levels of the starch precursor molecule, ADP-glucose, and displayed reduced SS and high β-amylase activities. Moreover, the two pgi mutants displayed a slow growth phenotype and possessed reduced photosynthetic capacities when cultured under continuous light photoperiod. Importantly, pgi-2 and pgi-3 leaves accumulated high starch content when plants were cultured in the presence of elevated CO 2 concentration. Furthermore, introduction into pgi-2 and pgi-3 of a sex null mutation impeding β-amylase-mediated starch breakdown reverted the starch-deficient phenotype of pgi mesophyll cells. The overall data (a) show that mesophyll cells of ppgi null mutants accumulate starch, (b) provide strong evidence that the reduced starch content in pgi mesophyll cells is largely the consequence of combined factors including reduced photosynthetic capacity and pleiotropic changes in activities of enzymes directly linked to starch metabolism, (c) support the occurrence of important starch biosynthetic pathway(s) alternative to the classic Calvin- Benson cycle-ppgi-ppgm-agp-ss pathway, and (d) show that ppgi is an important determinant of both photosynthetic capacity and growth. P08-3 Análisis proteómico en plantas de Arabidopsis thaliana deficientes en las tiorredoxinas f y m plastidiales Juan Fernández Trijeque, José Antonio Rojas González, Antonio Jesús Serrato Recio, Mariam Sahrawy Barragan Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES La regulación redox es probablemente el mecanismo más utilizado por las plantas para controlar la activación de enzimas o la reducción de puentes disulfuro de proteínas implicadas en diversos procesos metabólicos o de desarrollo. Aunque existen distintas proteínas capaces de llevar a cabo intercambios tiol/disulfuro, las tiorredoxinas (Trx) son las responsables de muchos de las funciones que ocurren en plantas. Las Trx plastidiales de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) son el grupo más numeroso de la familia multigénica a la que pertenecen, en el cloroplasto se han descrito las Trx f, m, x, y. Hasta hace unos años se conocía la activación específica de la fructosa-,6-bisfosfatasa cloroplastídica por la Trx f y de la malato deshidrogenasa por la Trx m. Sin embargo el número de isoformas existentes para cada tipo, sugiere una gran diversidad funcional lo que conlleva la dificultad de asignar un papel fisiológico concreto a cada una de las Trxs. Para contribuir a la identificación de funciones específicas a las Trx f y m de Arabidopsis en este estudio hemos caracterizado las proteínas 68

Granada 204 Pósters diferencialmente expresados en mutantes de Arabidopsis deficientes ( knockout ) en las Trx f, f2, m, m2, m3 y m4, respectivamente. Extractos de proteínas fueron preparados para comparar las proteínas en plantas mutantes y silvestres usando la técnica de 2D-PAGE. Las proteínas diferencialmente expresadas fueron identificadas mediante MS-MS/MS (MALDITOF-TOF) en el Servicio de Proteómica (SCAI) de la Universidad de Córdoba. Los análisis muestran un total de 37 y 7 proteínas inhibidas y sobreexpresadas, respectivamente, en todos los mutantes. La clasificación de las proteínas por categorías funcionales indica que varios procesos de la planta están afectados, entre los cuales podemos destacar el transporte electrónico, la fotosíntesis y el Ciclo de Calvin, el ensamblaje de proteínas, y la síntesis de amino ácidos. Este estudio puede favorecer la asignación de acciones a algunas de Trx f y m analizadas. Agradecimientos: Este trabajo ha sido fi nanciado por el MICINN (BIO2009-7297), MINECO (BIO202-33292) y por la Junta de Andalucía (P07-CVI-02795, BIO54). P08-4 (R08-7) Reconocimiento molecular en la interacción de la NADPH-tiorredoxina-reductasa cloroplástica (NTRC) con 2-Cys peroxirredoxina José A. Navarro, Pilar Bernal-Bayard, Francisco J. Cejudo, Adrián Velázquez-Campoy 2, Manuel Hervás Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Sevilla, ES, 2 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, ES Las NADPH-tiorredoxina-reductasas (NTR) utilizan NADPH como fuente de electrones para la reducción de tiorredoxinas (Trx), en lo que conforma un sistema de regulación por oxidación-reducción de grupos disulfuro que controla múltiples procesos celulares. Las NTR contienen una flavina y un grupo disulfuro como cofactores, que operan como una cadena de transferencia intramolecular de electrones desde el NADPH al grupo disulfuro en el sitio activo. Además de las NTR estándar, las plantas poseen una NTR plastídica, llamada NTRC, con un dominio Trx fusionado a su extremo C-terminal. NTRC, entre otras funciones, actúa como un reductor de las 2-Cys peroxirredoxinas (2-Cys Prx), que controlan los niveles intracelulares de peróxido de hidrógeno, sin embargo, las características de la interacción entre ambas proteínas no se conoce. Hemos estudiado los procesos de reconocimiento molecular del sistema NTRC/2-Cys Prx mediante calorimetría de titulación isoterma, utilizando tanto proteínas nativas como los módulos NTR (NTR M ) y Trx (Trx M ) de NTRC, expresados separadamente. Las interacciones de NTRC, Trx M y NTR M con la 2-Cys Prx son similares en cuanto a afinidad, aunque diferentes en cuanto a la contribución entalpía/entropía. Nuestros datos sugieren que ambos módulos, NTR M y Trx M, contribuyen significativamente a la interacción de NTRC con la 2-Cys Prx, en concordancia con el modelo de interacción que hemos propuesto recientemente. Por el contrario, NTRC no interacciona con una Trx cloroplastídica de tipo x, debido a que la presencia del módulo Trx impide dicha interacción. Nuestros resultados ponen de manifiesto el conjunto preciso y definido de interacciones que determinan la especificidad del reconocimiento molecular en el sistema NTRC/2-Cys Prx de plantas. P08-5 (R08-2) Función y regulación de las estrigolactonas como fitohormonas y moléculas señal en la rizosfera Juan Antonio López Ráez, Rocío Torres Vera, Juan Manuel García Ramírez, Javier Rivero Bravo, Estefanía Berrio Pozo, María José Pozo Jiménez Estación Experimental del Zaidín, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES Las estrigolactonas (SL) son unas moléculas multifuncionales que están involucradas en diferentes procesos en las plantas, donde actúan hormonas y como moléculas señal en la rizosfera. Como fitohormonas, se ha propuesto que podrían jugar un papel como moduladores del desarrollo coordinado de raíces y parte aérea en respuesta a condiciones de estrés nutricional. De acuerdo con esta hipótesis, se ha demostrado que las SL están involucradas en la regulación de la arquitectura vegetal, formación de raíces adventicias, crecimiento secundario y desarrollo reproductivo. Además, nuevas funciones se están descubriendo continuamente. Como moléculas señal en la rizosfera, las SL favorecen el establecimiento de la simbiosis con ciertos hongos beneficiosos del suelo (simbiosis micorrícica arbuscular). Mediante el establecimiento de este tipo de simbiosis, las plantas son capaces de sobrevivir bajo diferentes condiciones de estrés. En la rizosfera, las SL también actúan como estimulantes de la germinación de plantas parásitas de la familia Orobancheaceae (malas hierbas), las cuales ocasionan grandes pérdidas a nivel agronómico. Debido a este papel dual de las SL en la rizosfera, se ha propuesto que las micorrizas también podrían ser utilizadas para el desarrollo de nuevas estrategias de biocontrol frente a este tipo de malas hierbas. En nuestro grupo de investigación, estamos interesados en estudiar cómo diferentes condiciones de estrés, tanto de tipo abiótico como biótico, afectan a la producción y regulación de SL, así como analizar cómo esto afecta a la formación de micorrizas y a la infección por plantas parásitas. Por otro lado, también estamos interesados en descubrir nuevas funciones de las SL, como por ejemplo su posible implicación en respuestas de defensa. P08-6 HPLC-MS/MS analyses show that leaves of the near-starchless aps and pgm mutants accumulate wild type levels of ADPglucose: further evidence for the occurrence of various important ADPglucose biosynthetic pathway(s) Miren Edurne Baroja Fernández, Abdellatif Bahaji, Ángela María Sánchez López, Francisco José Muñoz, Jun Li, Goizeder Almagro, Manuel Montero, Adriana Ricarte Bermejo, Pablo Pujol 2, Regina Galarza 2, Kentaro Kaneko 3, Kazusato Oikawa 3, Kaede Wada 3, Toshiaki Mitsui 3, Javier Pozueta Romero Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), Mutilva, Navarra, ES, 2 Servicio de Apoyo a la Investigación, Universidad Pública de Navarra, Pamplona, ES, 3 Department of Applied Biological Chemistry, Niigata University, Niigata, JP In leaves, it is widely assumed that starch is the end-product of a metabolic pathway exclusively taking place in the chloroplast that (a) involves plastidic phosphoglucomutase (ppgm), ADPglucose (ADPG) pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS), and (b) is linked to the Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase (ppgi). This view also implies that AGP is the sole enzyme producing the starch precursor molecule, ADPG. However, mounting evidence has been compiled pointing to the occurrence of important sources, other than the ppgi-ppgm-agp pathway, of ADPG. To further explore this possibility, in this work two independent laboratories have carried out HPLC-MS/ MS analyses of ADPG content in leaves of the near-starchless pgm and aps mutants impaired in ppgm and AGP, respectively, grown under two different culture conditions. We also measured the ADPG content in WT and aps leaves expressing in the plastid two different ADPG cleaving enzymes, and in apsleaves expressing in the plastid GlgC, a bacterial AGP. Furthermore, we measured the ADPG content in ss3/ ss4/aps mutants impaired in starch granule initiation and chloroplastic ADPG synthesis. We found that, irrespective of their starch contents, pgm and aps leaves, WT and aps leaves expressing in the plastid ADPG cleaving enzymes, and aps leaves expressing in the plastid GlgC accumulate WT ADPG content (0.3-0.9 nmol ADPG/g fresh weight). In clear contrast, ss3/ss4/aps leaves accumulated ca. 300 fold-more ADPG than WT leaves. The overall data further provide strong evidence that, in Arabidopsis leaves, (a) there are important ADPG biosynthetic 69

Pósters XXXVII Congreso SEBBM pathways, other than the ppgi-ppgm-agp pathway, (b) ppgm and AGP are major determinants of starch accumulation, but not of intracellular ADPG content, and (c) most of ADPG has an extraplastidial localization in WT leaves. microalga, desarrollando fitoplancton con alto contenido en péptidos antimicrobianos (AMP). La expresión del gen MitC se ha comprobado a nivel de mensajero y a nivel de síntesis de proteínas. El carácter antimicrobiano del fitoplancton obtenido está en estudio. P08-7 (R08-3) Interplay between SWR and NuA4 chromatin remodelling complexes in the control of flowering time Pedro Crevillén Lomas, Angeles Gómez-Zambrano, Alfonso Mouriz, Manuel Piñeiro, José A. Jarillo Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA), Pozuelo de Alarcón, ES Histone acetylation by the NuA4/Tip60 complex and histone H2A.Z deposition by the SWR/SRCAP complex are functionally linked chromatin modifications observed across eukaryotes, regulating multiple biological processes such as gene expression, heterochromatin boundary maintenance, and DNA repair. In our lab, we previously characterized a series of Arabidopsis thaliana early flowering mutants defining a major role for SWR-C in the regulation of flowering time, a key developmental process in the lifecycle of plants. We are currently focused on the YEATS domain protein YAF9/GAS4, a shared subunit between SWR and NuA4 complexes. There are only two Arabidopsis YEATS domain proteins: AtYAF9a and AtYAF9b. Atyaf9a KO allele displays an early flowering phenotype, as previously characterized SWR-C mutants. AtYAF9A binds to regulatory regions of master flowering genes altering their histone acetylation levels and H2A.Z dynamics. In addition to flowering time alterations, Atyaf9ayaf9b double mutant shows strong developmental phenotypic defects as well as misregulation of many genes. We have also isolated different mutant alleles for other NuA4 subunits and have generated double mutant combinations to uncover the possible existence of functional redundancy between homologues. We will present our current data and speculate about their role in regulating plant development. P08-8 Nuevas cepas de fitoplancton transgénico con componentes antimicrobianos para reforzar el sistema inmune innato de especies acuículas Marta Vila Spinola, Encarnación Díaz-Santos, Marta de la Vega Naranjo, Javier Vigara, Rosa León Bañares Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales, Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del Mar-CEIMAR, Huelva, ES El uso de antibióticos para prevenir enfermedades en muchas especies acuícolas es una práctica de riesgo que puede provocar la aparición de patógenos resistentes, además los antibióticos nos son efectivos frente a virus. La vacunación frente a enfermedades usuales puede hacerse en ejemplares de peces adultos, pero es imposible de aplicar a alevines o a otras especies acuícolas que carecen de un sistema inmune adaptativo, como los bivalvos. En estos casos es necesario desarrollar alternativas de compuestos antimicrobianos que refuercen el sistema inmunitario de los ejemplares cultivados y mejoren sus tasas de supervivencia. Los AMP son pequeños péptidos catiónicos que pueden inactivar a un amplio espectro de bacterias, hongos y parásitos patógenos, además de virus y que se encuentran muy conservados a lo largo de la evolución, lo que hace pensar que su papel dentro del sistema inmune innato debe de ser fundamental. En este trabajo hemos aislado el gen que codifica un pequeño péptido con características antimicrobianas (AMP) a partir de tejido de Mytilus galloprovincialis (mejillón), lo hemos clonado en el vector de expresión Phycogen high-expression vector para microalgas suministrado por la empresa Phycogenetics SL y lo hemos insertado en el genoma de una P08-9 Induction of bioflocculation in microalgae Encarnación Díaz Santos, Marta Vila Spínola, Marta De la Vega Naranjo, Rocío Rengel, Alicia Azogil, Rosa León Bañares, Javier Vigara Fernández Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES Harvesting of microalgae biomass is a critical step, which accounts for more than 30% of the total price of microalgal production. Reducing its cost is essential to make economically feasible the production of bulk products from microalgae, such as biodiesel which despite the enthusiasm generated, is far from being competitive. Autoaggregation of flocculent microalgae in response to stressing conditions is poorly understood, but it is a promising approach to induce the aggregation of microalgae into flocks and make microalgal harvesting a straightforward and cheap procedure. The effect of the flocculent yeast strainsaccharomyces bayanus var. uvarum and the flocculent microalgae Tetraselmis suecica on two chlorophytes: the model freshwater microalga Chlamydomonas reinhardtii and the novel marine microalgapicochlorum sp HM, was investigated. Both flocculent microorganisms had a positive effect on microalgal cell aggregation and improved flocculation efficiencies, which were considerably increased with addition of yeasts grown in anaerobic conditions. In order to gain more insights in the origin of microorganism-induced microalgal flocculation, proteins released into the culture medium by the flocculent yeastsaccharomyces bayanus var. uvarum were isolated and its ability to induce flocculation was tested. The most abundant of these proteins was identified as a protein like-glucanase and its addition in microalgal cultures caused an important improvement of the flocculation effectiveness. The study was completed evaluating the effect of some plant lectins on the chosen chlorophytes. P08-0 Promotion of Arabidopsis growth and flowering by Alternaria alternata volatile emissions is a photocontrolled process involving dramatic changes in the plant hormonome Jun Li, Nuria De Diego 2, Ángela María Sánchez-López, Abdellatif Bahaji, Francisco José Muñoz, Edurne Baroja-Fernández, Karel Dolezal 2, Lukas Spichal 2, Javier Pozueta-Romero Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), Mutilva, ES, 2 Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Department of Chemical Biology and Genetics, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, CZ Plants perceive biotic stimuli by recognizing different signaling substances originating from the interacting microorganisms. Some of them are volatile compounds. Volatile emissions from some rhizobacterial isolates promote growth in Arabidopsis by facilitating nutrient uptake, photosynthesis and defense responses, and by decreasing glucose sensing and ABA levels. Analyses of Arabidopsis mutants affected in hormone signaling have indicated possible involvement in the reaction to rhizobacterial volatiles. We found that the production of volatilespromoting plant growth is not restricted to some rhizobacteria, and that volatiles emitted by different microbial species ranging from Gram-negative and Gram-positive bacteria to different fungi (including plant pathogens and microbes normally not interacting with plants) promote both growth and accumulation of exceptionally high levels of starch in leaves of both mono- and di-cotyledonous plants. This phenomenon, initially designated as MIVOISAP (for MIcrobial VOlatiles Induced Starch 70

Granada 204 Pósters Accumulation Process), involves changes in the leaf transcriptome and metabolome. To better understand MIVOISAP, we analyzed the effect of volatiles emitted by Alternaria alternata on Arabidopsis development. We found that itsvolatiles induce rapid growth, development of secondary roots and initiation of the flowering. Using different mutants we also observed that MIVOISAP down-regulated genes involved in light signaling and in the main hormone synthesis and signaling. We also carried out high throughput analyses of hormone content in root and leaves of plants exposed to A. altertata volatile emissions. The overall data showed that MIVOISAP is a photocontrolled process involving dramatic changes in the hormonome of the both plant organs. This research was partially supported by the grants [BIO200-8239] from the Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Spain) and by Iden Biotechnology. A-M. S-L. acknowledges a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation as well as the Ministry of Education, Youth and Sports, Czech Republic (Grant L0204 from the National Program of Sustainability and Agricultural Research and project POST-UP, reg. No. CZ..07/2.3.00/30.0004). P08- (R08-5) PpNAC, posible candidato para articular la red transcripcional implicada en la síntesis de pared celular secundaria en pino M. Belén Pascual, Blanca Craven-Bartle, Francisco M Cánovas, Concepción Ávila Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de teatinos, Málaga, ES El conocimiento de las redes de regulación transcripcional que controlan procesos importantes en coníferas es muy limitado. Por ello, la identificación y caracterización funcional de factores de transcripción (TF) es esencial para comprender la regulación de genes implicados en procesos estrechamente ligados a la productividad forestal. El transcriptoma de P. pinaster contiene 877 TF distribuidos en 30 familias. Este número es similar al descrito en abeto blanco y menor al descrito en angiospermas (Canales y col. 204). Los factores de transcripción NAC constituyen una gran familia génica específica de las plantas. Usando la información disponible en la base de datos Sustainpine, hemos identificado 37 posibles genes NAC en pino. Los análisis filogenéticos y la identificación de motivos conservados con el programa MEME realizados en otras especies sugieren que genes relacionados estructuralmente podrían ejercer funciones similares (Shen y col. 2009). Según esto, hemos visto que PpNAC se agrupa en el mismo clado que NST, NST2 y SND de Arabidopsis, genes implicados en la formación de pared celular secundaria. Por tanto, PpNAC es un candidato interesante para estudiar la formación de madera en una especie forestal como el pino donde dicho proceso es de gran importancia económica. Ensayos de retraso en gel y estudios de expresión transitoria en protoplastos de pino se han utilizado con el objetivo de elucidar el papel de PpNAC en la red de regulación transcripcional que controla la formación de pared celular secundaria, así como el control sobre los factores R2R3-Myb, esenciales en el metabolismo de la fenilalanina y posterior síntesis de fenilpropanoides (Craven-Bartle y col. 203). Resultados preliminares apuntan a que PpNAC regula su propia expresión así como la expresión de factores Myb implicados en el proceso. Todo esto nos permite especular sobre su posible función como regulador río arriba de la biosíntesis de fenilalanina, el aminoácido precursor de la lignina. La obtención de líneas embriogénicas de pino sobreexpresoras de PpNAC y RNAi en curso, junto con su posterior caracterización, nos proporcionará la información necesaria para demostrar la implicación de este factor de transcripción en la síntesis de pared celular secundaria. Bibliografía Canales y col. 204. De novo assembly of maritime pine transcriptome: implications for forest breeding and biotechnology. Plant Biotechnology Journal 2: 286-299. Craven-Bartle y col. 203. A Myb transcription factor regulates genes of the phenylalanine pathway in maritime pine. The Plant Journal 74: 755-766. Shen y col. 2009. A Bioinformatic analysis of NAC genes for plant cell wall development in relation to lignocellulosic bioenergy production. Bioenergy Res 2: 27-232. P08-2 El herbicida auxínico ácido 2,4-diclorofenoxiacético induce alteraciones del citoesqueleto de actina por carbonilación y S-nitrosilación y afecta la dinámica de peroxisomas y mitocondrias Maria Rodríguez-Serrano, Diana M Pazmiño, Imogen Sparkes 2, Chris Hawes 2, Maria C Romero-Puertas, Luisa M Sandalio Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 School of Biological & Medical Sciences, Oxford Brookes University, oxford, UK El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es una auxina sintética utilizada como herbicida. Altas concentraciones de 2,4-D inducen malformaciones en hojas (epinastia) y tallosy muerte celular. En este trabajo se han estudiado losmecanismos moleculares implicados en la toxicidad del 2,4- D mediante el análisis de la producción de especies de oxígeno reactivo (ROS), óxido nítrico (NO) en plantas de Arabidopsis y su efecto sobre la estructura del citoesqueleto y la dinámica de peroxisomas y mitocondrias. La aplicación foliar de 2,4-D (23 mm) producía epinastia en hojas y este fenotipo podía prevenirse por pre-tratamiento con EDTA. El análisis de la acumulación de ROS mediante microscopía confocal mostró un incremento dependiente de 2,4-D del H 2 O 2 y O 2.- asociado a pequeños orgánulos, posiblemente peroxisomas y mitocondrias, mientras que la acumulación total de NO no se afectaba por el tratamiento. El análisis del citoesqueleto de actina mediante el uso de una línea de Arabidopsis FABD2-GFP mostró alteraciones el mismo dependientes del 2,4-D. El análisis de modificaciones postraduccionales de proteínas por carbonilación y S-nitrosilación demostró que la actina experimenta ambas modificaciones lo que afecta a su polimerización, tal como sugiere la relación de F-actin/G-actin. Estos efectos se reducían por el tratamiento con EDTA, que a su vez reducía la oxidación de proteínas y en particular de la actina. El 2,4-D también reducía la velocidad y desplazamiento de peroxisomas y mitocondrias, como consecuencia de las alteraciones observadas en el citoesqueleto. Para determinar la fuente de ROS implicada en este proceso, se analizó el fenotipo de distintos mutantes de Arabidospsis, entre ellos, las líneas deficientes en xantina deshidrogenasa y enacilcoa oxidasa que mostraron una reducción considerable de la epinastia.se ha analizado además la regulación de la epinastia por ABA, jasmónico y etileno. Los resultados obtenidos sugieren que la epinastia es el resultado de alteraciones del citoesqueleto de actina dependientes de ROS y NO. Trabajo fi nanciado por ERDF-BIO2008-04067 y BIO202-36742 del MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337). P08r-3 Modulación de la capacidad antioxidante del ciclo ascorbato-glutatión por modificaciones post-traduccionales mediadas por óxido nítrico Juan Carlos Begara-Morales, Beatriz Sánchez-Calvo, Mounira Chaki, Raquel Valderrama, Capilla Mata-Pérez, Javier López- Jaramillo 2, María N. Padilla, Alfonso Carreras, Francisco Javier Corpas 3, Juan Bautista Barroso Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad 7

Pósters XXXVII Congreso SEBBM de Jaén, Jaén, ES, 2 Instituto de Biotecnología, Departamento de Química Orgánica, Universidad de Granada, Granada, ES, 3 Grupo de Antioxidantes, Radicales Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología y Agroalimentación, Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de Plantas - Estación Esperimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES Las modificaciones post-traduccionales mediadas por óxido nítrico (MPT-NO), tales como nitración y S-nitrosilación, pueden modular la función de dianas proteicas []. Sin embargo, la información disponible sobre su efecto en la actividad y estructura de proteínas involucradas en sistemas antioxidantes es limitada. Por esta razón, se analizó el efecto de estas MPT-NO sobre las principales enzimas del ciclo ascorbatoglutatión, clave en la detoxificación y regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno en plantas [2]. En este estudio, se utilizaron diferentes proteínas recombinantes de guisante: Ascorbato peroxidasa citosólica (APX), monodeshidroascorbato reductasa peroxisomal (MDAR) y glutatión reductasa (GR) citosólica y cloroplastídica. Los resultados pusieron de manifiesto una regulación diferente de las enzimas del ciclo. En el caso de la APX disminuyó su actividad por nitración y aumentó por S-nitrosilación [3], mientras que las GR no se modificaron y la MDAR fue inhibida por ambas modificaciones. Además, en la APX se identificaron las dianas de estas MPT-NO y su implicación funcional. Finalmente, utilizando plantas de guisante sometidas a estrés salino se observó que la S-nitrosilación de APX ocurre in vivo y que aumenta durante esta situación de estrés [3]. En conclusión, se evidenció que el ciclo ascorbato-glutatión presenta regulación por NO, sugiriendo además una estrecha relación entre el metabolismo de NO y ROS en plantas. Referencias [] Corpas FJ et al. Plant Sci (20), 8:604-6. [2] Noctor and Foyer. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (998), 49:249-279. [3] Begara-Morales JC et al. J Exp Bot (204), 65:527-538. Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos BIO202-33904 y 2034R0569) y Junta de Andalucía (grupos BIO286 y BIO92). P08-4 Caracterización funcional de la quinasa CPK peroxisomal en respuesta a estrés biótico y abiótico en plantas de Arabidopsis Katiuska Cárdenas, María Rodríguez-Serrano, Adela Olmedilla Arnal, María C. Romero-Puertas, Luisa M. Sandalio Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Profesor Albareda, Granada, ES La modificación postraduccional de proteínas por fosforilación es uno de los mecanismos más comunes en la regulación de la actividad, localización subcelular y degradación de proteínas. Estos procesos están implicados en el reconocimiento de cambios en el entorno celular y en la regulación de la respuesta celular frente a factores bióticos y abióticos. Los peroxisomas son fuentes importantes de señales celulares como especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (ROS, RNS) y hormonas, y tienen un papel central en la regulación de procesos metabólicos esenciales para la célula y en la respuesta celular al estrés. La presencia de quinasas y fosfatasas en estos orgánulos ha sido recientemente demostrada, si bien sus proteínas diana y su función no han sido establecidas. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización de la quinasa de Arabidopsis thalina CPK en respuesta a estrés por metales (Cd y As), e infección por Pseudomonas syringae (Pst avrb). Para ello, se ha utilizado un mutante de Arabidopsis deficiente en esta proteína, cpk. En este mutante se ha analizado el fenotipo de la planta en respuesta a los estreses anteriormente mencionados, así como la ultraestructura de la hoja en respuesta al tratamiento con Cd. Para establecer posibles dianas de la CPK se ha analizado la actividad de proteínas peroxisomales que previamente se ha demostrado que pueden fosforilarse, la glicolato oxidasa, catalasa y superóxido dismutasa. También se ha analizado el papel de esta quinasa en la regulación de la acumulación de H 2 O 2 en respuesta al tratamiento con Cd. Los resultados obtenidos sugieren que la CPK podría regular la producción de H 2 O 2 procedente de la fotorrespiración en situaciones de estrés por Cd. En estas condiciones, las hojas de plantas cpk experimentan cambios importantes en la ultraestructura de la célula que afectan especialmente a los peroxisomas. Por el contrario, la deficiencia de CPK no afecta a la respuesta frente al As ni a la respuesta hipersensible frente a Pst avrb. Trabajo fi nanciado por ERDF-BIO2008-04067y BIO202-36742del MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337). P08-5 PpMyb23, un nuevo factor de transcripción Myb R2R3 de coníferas relacionado con el desarrollo de las acículas y el metabolismo de los flavonoides Jose M Granados, Marina Rueda-López, Mª Belén Pascual, Concepción Ávila, Francisco M Cánovas, Rafael A. Cañas Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos, Málaga, ES En un trabajo previo de nuestro laboratorio hemos caracterizado el metabolismo anual de las acículas de árboles adultos de Pinus pinaster (Aiton) en condiciones naturales mediante el análisis de redes de coexpresión de genes (WGCNA). Gracias a este análisis se pudo identificar un nuevo factor de transcripción Myb R2R3 de coníferas, que ha sido nombrado como PpMyb23, asociado al desarrollo de las acículas y al metabolismo de los flavonoides. El análisis de su secuencia muestra que no pertenece al Subgrupo 4 de factores Myb R2R3 que han sido propuestos como los principales responsables de la regulación del metabolismo de los flavonoides en coníferas (Bedon et al. 200). La caracterización de su expresión génica a lo largo del desarrollo plantular confirma que la acción de PpMyb23 se encuentra ligada a las acículas, probablemente en respuesta a las condiciones lumínicas. Como otros factores Myb R2R3 relacionados con el metabolismo de los flavonoides su expresión se modifica por metiljasmonato (MeJA). Bibliografía Bedon F, Bomal C, Caron S, Levasseur C, Boyle B, Mansfield SD, Schmidt A, Gershenzon J, Grima-Pettenati J, Séguin A, MacKay J. (200) Subgroup 4 R2R3-MYBs in conifer trees: gene family expansion and contribution to the isoprenoid- and flavonoid-oriented responses. J Exp Bot. 6(4): 3847-3864. P08-6 Respuesta antioxidante y fotosintética de la fanerógama marina Posidonia oceanica al estrés por deficiencia lumínica Anna Maria Ortolà Garcia Dpto. Producció Vegetal, Universitat Politècnica de València, València, ES La Posidonia oceanica (L.) Delile es una fanerógama marina endémica del mar Mediteráneo, en donde forma extensas praderas cuya distribución está estrechamente unida a la capacidad de penetración de la luz en el agua. Su ecosistema está reconocido por el European Habitats Directive (92/43/ CEE) como hábitat de interés prioritario. Actualmente las praderas litorales 72

Granada 204 Pósters están en regresión como consecuencia, entre otros factores, del incremento de la sedimentación y turbidez del agua por vertidos urbanos e industriales, que modifican las condiciones de iluminación de la columna de agua bajo la cual se asienta la pradera, generando una situación de estrés en la planta por la atenuación de la luz solar. En este trabajo se estudia la influencia de la deficiencia de luz en plantas de posidonia de praderas naturales situadas en la costa alicantina de Denia. Se analiza la respuesta antioxidante y fotosintética de plantas localizadas en praderas a 3 y a 9 metros de profundidad, de dos zonas con distinta calidad de agua, una en las inmediaciones del emisario submarino de aguas residuales de Denia y otra en un área alejada de su influencia. Se cuantifica el contenido en pigmentos fotosintéticos, carbohidratos solubles, sacarosa, almidón y la actividad del enzima sacarosa sintetasa (SS) para analizar la respuesta fotosintética. Se determina la actividad de los enzimas catalasa, superóxido dismutasa y ascorbato peróxidasa, y se miden los niveles de malondialdehido (MDA), como indicadores del estrés oxidativo. Los resultados obtenidos apuntan a una disminución de los carbohidratos y pigmentos fotosintéticos en la planta con el incremento de la profundidad y turbidez, y un aumento de la actividad de los enzimas antioxidantes, en respuesta al deterioro del funcionamiento fotosintético debido a la limitación de la luz solar. P08-7 Genes encoding beta-mannanases in Brachypodium distachyon seeds have a role not only in cell wall softening upon germination sensu stricto but also during post-germinative reserve mobilization Virginia Gonzáles-Calle, Raquel Iglesias Fernández, Victoria Llanos- Casado, Pilar Carbonero Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP) - Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria Universidad Politécnica de Madrid, Pozuelo de Alarcón (Madrid), ES Brachypodium distachyon seeds are characterized by presenting low levels of starch and high levels of (,3;,4) β-glucans in its endosperm cells besides having thick mannan-rich cell walls. Upon germination and subsequent reserve mobilization β-mannanase encoding genes are selectively induced. Endo-β-mannanases (EC 3.2..78) are hydrolytic enzymes that catalyze the cleavage of β(-4) bonds in the mannan polymer. In the genome of Brachypodium, the endo-β-mannanase (MAN) family is represented by six members. We have systematically explored the expression of the six MAN genes in different organs (leaves, roots, spikes, developing seeds) and we have found that in dry seeds BdMAN3 is the most highly expressed gene, but its expression decreases upon germination in aleurone while the other five are induced at 36 hours of imbibition. In the germinating embryo the most important genes are BdMAN2 and BdMAN6. In situ hybridization analysis shows that BdMAN2 and BdMAN6 transcripts accumulate in the coleorhiza while BdMAN3 is mainly expressed in the radicle tip. Difference in sequence and expression of the MAN gene family in Brachypodium distachyon and in other cereals, and their different putative functions in comparison to those reported in Arabidopsis thaliana [,2] that are mainly involved in germination sensu stricto, are discussed. References [] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Carbonero P, Matilla AJ (202) Softening-up mannan-rich cell walls. J. Exp. Botany 63: 3975-3988. [2] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Barrero-Sicilia C, Carbonero P, Matilla AJ (20) Three endo-β-mannanase genes expressed in the micropylar endosperm and in the radicle influence germination of Arabidopsis thaliana seeds. Planta 233: 25-36 P08r-8 Microbacterium sp. 3J reduces the expression of enzymes involved in ethylene pathway in roots of pepper plants under drought conditions Cristina García-Fontana, Juan Ignacio Vílchez, Jesús González- López, Maximino Manzanera Instituto del Agua, Universidad de Granada, Granada, ES Plant water deficit is one stress which has been extensively associated with elevated release of ethylene. The impact of water stress on ethylene synthesis is of interest because ethylene is responsible for senescence and abscission induced by water deficits. Some microorganisms present in the rhyzosphere protect plants from drought by interaction with the plant host. The interaction of these microorganisms, that we term Drought Plant Protecting Bacteria (DPPB), with the plant is translated in a reduction of the ethylene produced by the plant. We have isolated a Microbacterium sp. 3J strain that is desiccation tolerant soil bacterium and can interact with plants as DPPB. The inoculation of pepper plants with this strain reduced the ethylene produced by the plant and this in turn induced a marked delay in senescence. Here we used proteomic to compare plants inoculated with Microbacterium sp. 3J subjected to drying conditions with non-inoculated plants. Presence of the microorganism is translated in a reduction of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH). A dramatic reduction of SAHH could be translated in accumulation of SAH (S-Adenosylhomocysteine) and SAM (S-adnosylmethionine), a methyl donor for choline production, which is used for glycinebetaine production, a potent xeroprotectant produced in the chloroplast. SAHH also controls biological methylation reactions by mediating the intracellular SAH/ SAM ratio. DNA and protein methylation and demethylation play an important role in signal transduction. We do not discard additional signal transduction effects on other pathways to increase desiccation tolerance on the plant by the reduction in SAHH caused in presence of Microbacterium sp. 3J. P08-9 (R08-4) Differential analysis of root proteome obtained in microbe-plant interaction as a tool for identification of proteins involved in resistance to drought events in pepper plants Juan Ignacio Vílchez, Cristina García Fontana 2, Jesús González López, Maximino Manzanera Ruiz Universidad de Granada, Ogíjares, Granada, ES, 2 Instituto del Agua, Universidad de Granada, Granada, ES A collection of bacterial strains isolated in our laboratory, have been shown to reduce dehydration stress. These strains have also been shown to protect plants against abiotic stresses by colonizing the rhizosphere of various plant species, and promoting plant growth by reducing ethylene production via ACC-deaminase activity and by reducing the reduction of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH) of the plant 2. Apart from ethynele accumulation, drought also causes damages by accumulation of reactive oxygen species (ROS) 3. Preliminary investigation on the molecular basis of bacterial mediated drought stress alleviation was performed by examining the mrna levels of three important drought stress responsive genes, DREB2A, CAT, and DHN in inoculated plants by realtime quantitative polymerase chain reaction (qpcr)4. Here we describe the effect of Microbacterium sp. 3J over the plant under water stress at the proteomic level using two-dimensional electrophoresis assisted by PDQuest Basic 2D Gel Analysis software. Differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry Mass (MALDI TOF-TOF) let us identify a reduction in proteins such as disulfoxide isomerase, nucleoside diphosphate kinase, Glutathione S Transferase and Annexin, involved in response to oxidative stress. Likewise, a decrease in proteins involved in systemic resistance as chitinases and dehydrogenases was observed as well as in several proteins involved in the pathway of ethylene on plants such as 73

Pósters XXXVII Congreso SEBBM S adenosyl homocysteine hydrolase, response factor binding ethylene, beta subunit of succinyl CoA and Caffeoil CoA. P08-20 Identificación de genes de referencia para estudios de RT-qPCR en Pinus pinaster (Aiton) José M. Granados, Concepción Ávila, Francisco M. Cánovas, Rafael A. Cañas Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos, Málaga, ES La técnica de RT-qPCR es uno de los procedimientos experimentales más utilizados para el análisis de la expresión génica. El desarrollo experimental requiere la normalización de los resultados obtenidos mediante comparación con otros genes de referencia cuyos niveles de expresión sean uniformes en las condiciones estudiadas. En los primeros estudios realizados mediante esta técnica se usaron para la normalización genes implicados en el mantenimiento de funciones celulares básicas ( housekeeping genes ). Sin embargo, los niveles de expresión de dichos genes no son invariables y se requiere una verificación experimental preliminar para determinar qué genes resultan adecuados en cada organismo o tejido a estudiar. La falta de metodologías de trabajo estandarizadas ha provocado errores metodológicos y experimentales en la identificación de genes de referencia y en la aplicación de esta técnica que cuestionan los resultados obtenidos. Se han presentado diferentes propuestas para establecer una metodología experimental adecuada, siendo en estos momentos la más aceptada MIQE ( Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments ). El pino marítimo (Pinus pinaster Aiton) es una planta modelo de interés forestal en la que se están realizando avances en biología molecular. En el presente trabajo, hemos realizado la búsqueda de genes de referencia adecuados para la normalización de los datos de RT-qPCR tanto en acícula adulta de P. pinaster como en los primeros estadios de desarrollo plantular siguiendo las recomendaciones del MIQE. Nuestro objetivo es la obtención de resultados fiables y reproducibles en estudios de expresión génica en P. pinaster. P08r-2 Detección y formación endógena de ácidos grasos nitrados en el aceite de oliva Raquel Valderrama Rodríguez, Beatriz Sánchez-Calvo, Capilla Mata- Pérez, María N. Padilla, Juan C. Begara-Morales, Juan B. Barroso Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Jaén, Jaén, ES El óxido nítrico (NO) y especies de nitrógeno reactivo derivadas (RNS) reaccionan con ácidos grasos insaturados originando ácidos grasos nitrados (NO 2 FA). Estas moléculas se consideran novedosos mediadores de señalización celular que abarcan un amplio conjunto de respuestas celulares en sistemas animales, entre los que destacan una probada función anti-inflamatoria y beneficios a nivel de salud cardiovascular []. El aceite de oliva virgen extra (EVOO) es la fuente principal de los lípidos en la dieta mediterránea, y promueve respuestas anti-inflamatorias y beneficios clínicos a través de mecanismos pobremente definidos. El presente estudio evaluó mediante LC-MS/MS, el contenido endógeno de NO 2 FA, tanto en aceituna como en EVOO procedentes de tres variedades de la provincia de Jaén. Se observó la presencia de ácido nitro-linoleico conjugado (NO 2 - CLA) en los tres aceites ensayados. El carácter electrofílico de estos NO 2 FA fue confirmado por la detección HPLC-MS/MS [2] de niveles significativos de aductos de cisteína-proteína de ácido nitro-oleico (NO 2 - OA-cisteína) en el fruto. Además, la nitración de EVOO por nitritos en condiciones digestivas de acidez gástrica, reveló que el consumo humano de los EVOO origina un incremento de NO 2 -CLA y NO 2 -OA. Estos resultados identifican por primera vez NO 2 FA en plantas y sugieren que el consumo en la dieta y la generación fisiológica de estos lípidos electrófilos anti-inflamatorios contribuye a los beneficios fisiológicos de las dietas ricas en ácidos grasos insaturados. Bibliografía [] Freeman BA et al., J Biol Chem. (2008), 283(23):555-9. [2] Trostchansky A et al., Free Radic Biol Med. (2008), 44():887-96. Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO202-33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286). P08r-22 Bio-hydrogen production in the green algae Chlamydomonas: effect of H 2 partial pressure, acetate and oxygen Jose Luis Jurado Oller, David González Ballester, Aurora Galván Cejudo, Emilio Fernández Reyes Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Under anaerobic conditions, some unicellular algae and bacteria produce a hydrogenase enzyme able to produce hydrogen (H 2 ) in a reversible reaction. H 2 production in algae is a clean source of H 2 that can be potentially cheaper than any other way to produce H 2 and would also contribute to the capturing of atmospheric CO 2. Unfortunately, bio-h 2 production is a low efficiency process and two of the main limitations are: ) the high O 2 sensitivity (hydrogenases are inhibited by O 2 at transcriptional and post-translational level). 2) H 2 production is a transient process that do not last more than a few days. We have investigated different approaches to optimize the H 2 production in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. This alga is able to perform three different pathways to produce H 2. Two of them are linked to photosynthesis (PSII-dependent and PSII-independent pathways) and the main difference between these two pathways is the original source of electrons. In the PSII-dependent pathway, the electrons come from the photolysis of water at PSII level. Whereas in the PSII-independent pathway, the electrons come from starch degradation. A third pathway for H 2 production is also possible through fermentative pathways that use starch as electron donor. As starting point of our project we screened 22,000 insertional mutants for two different phenotypes: starch and photosynthetic mutants. Both phenotypes can have theoretically an impact in the H 2 production process. One photosynthetic deficient strain showed an improved H 2 production (PSII-linked) under low light conditions. The effect of the H 2 accumulation in the cultures headspace was also investigated. We found that H 2 partial pressure is an important factor that can inhibit the production. By aerating the cultures we have improved H 2 production by 0 times. Finally, we studied the effect of acetate in the culture media. Cultures that were supplemented with acetate can improve H 2 production by 2 times. Moreover, continuous supplementation with acetate can result in a sustained H 2 production. Altogether, our results show an optimization of the H 2 production process in Chlamydomonas by more than 60 times. P08-23 Autentificación de aceite de oliva mediante qpcr Sonia Ramos-Gómez, Natividad Ortega Santamaría, María D. Busto, David Palacios, Manuel Pérez-Mateos Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de Burgos, Burgos, ES El elevado valor nutricional del aceite de oliva puede verse reducido mediante adulteración con otros aceites vegetales. Este tipo de práctica 74

Granada 204 Pósters supone, además, importantes pérdidas económicas por lo que es necesario certificar la autenticidad del aceite de oliva. La elevada sensibilidad y fiabilidad de las técnicas basadas en ADN les han convertido en una herramienta básica en el control de calidad y seguridad alimentaria. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue determinar la aplicabilidad de métodos basados en ADN y PCR cuantitativa (qpcr) para la autentificación de aceite de oliva. Se analizaron mediante qpcr nueve sistemas de amplificación específicos para olivo: tres previamente publicados (PIP5, G29/72H y C4-80), y seis diseñados en este trabajo (ycf, clpp, Pre, PetN, post y 2post). La aplicabilidad de dichos sistemas se determinó mediante cuantificación de ADN de olivo, amplificación específica de olivo frente a otras especies oleaginosas, cuantificación de olivo en mezclas de ADN y amplificación de ADN de aceites de oliva. De los resultados obtenidos destacar que el sistema 2post no permitió cuantificar ADN de olivo, los sistemas ycf, clpp y PIP5 mostraron rangos de cuantificación limitados, y C4-80 no presentó especificidad. Por el contrario, el intervalo de cuantificación de G29/72H y PetN osciló entre 2,5 μg y 25 pg y entre 2,5 μg y 2,5 pg para Pre y post, mostrando especificidad para olivo frente a colza, girasol, soja y maíz. La especificidad relativa de G29/72H y post fue del 0,2% de ADN de olivo en ADN de sésamo, y del 0,% para Pre y PetN. Además, estos sistemas permitieron la detección de ADN extraído de aceites de oliva. No obstante, es necesario comprobar su especificidad en otros aceites vegetales y en alimentos elaborados. P08-24 Efecto sobre la fotosíntesis y la acumulación de azúcares en frutos de fresa (Fragaria x ananassa) de la reducción de los niveles de las isoformas cfbp y cyfbp de FBPasa Antonio Jesús Serrato Recio, José Antonio Rojas González, Juan Antonio García Gago 2, Fernando Pliego Alfaro 2, José Ángel Mercado Carmona 2, Mariam Sahrawy Barragán Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 Departamento de Biología Vegetal, IHSM-UMA-CSIC, Universidad de Málaga, Málaga, ES La fructosa-,6-bifosfatasa (FBPasa) juega un papel clave en la fijación del CO 2 atmosférico durante la fotosíntesis y en procesos gluconeogénicos, conociéndose tres isoformas, localizadas en el cloroplasto (cfbp y cfbp2) y el citosol (cyfbp). cfbp forma parte de las enzimas del ciclo de Calvin y contiene un lazo regulador que la hace dependiente del estado redox del cloroplasto, siendo regulada por tiorredoxina f. Sin embargo, al contrario que con cfbp, no se ha descrito ninguna regulación redox para cyfbp, la cual forma parte de la ruta de biosíntesis de sacarosa. A la isoforma cfbp2 todavía no se le ha asignado una función fisiológica definida, pudiendo participar en procesos relacionados con las otras dos isoformas, las cuales muestran un mayor nivel de expresión que cfbp2. La fresa (Fragaria x ananassa) es un cultivo estratégico para la agricultura española, siendo una de sus cualidades organolépticas más valoradas, por su contenido en sacarosa, el sabor dulce del fruto. Aunque en los estadíos iniciales tiene cierta capacidad fotosintética, la mayor parte de los azúcares acumulados en los frutos son transportados por el floema desde las hojas. Para determinar el papel de las FBPasas en el contenido final de sacarosa en fruto se realizaron construcciones antisentido para cfbp y sobre-expresoras para cyfbp con las que se transformaron plantas de fresa, obteniéndose una serie de líneas que contenían el marcador de selección. Estas líneas fueron analizadas mediante la técnica de westernblot para determinar el nivel de expresión de las dos isoformas estudiadas. Asimismo, se ha relacionado la capacidad fotosintética de estas líneas con el contenido en FBPasas de las hojas. Para la caracterización de los frutos de fresa se han analizado parámetros como el peso, la dureza o los grados Brix (directamente relacionados con el contenido en azúcares, principalmente la sacarosa). Agradecimientos: Este trabajo ha sido fi nanciado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO2009-7297) y por la Junta de Andalucía (P07- CVI-02795). P08-25 Respuesta antioxidante al estrés hídrico en plantas de sorgo Magaly Pérez Lara, Víctor Olalde Portugal, Silvia Edith Valdés Rodríguez CINVESTAV Irapuato, Irapuato, MX El sorgo es una planta gramínea que es capaz de tolerar el estrés por deficiencia de agua, por lo que diversos estudios se han enfocado en la respuesta bioquímica el estrés hídrico. Nuestro grupo de trabajo realizó un estudio de proteómica en hojas de sorgo, en respuesta al estrés hídrico, haciendo uso de electroforesis en geles de 2D y la Espetrometría de masas. Los resultados obtenidos indicaron que las proteínas que aumentan, en su mayoría están relacionadas con la respuesta antioxidante. Con el fin de validar los cambios observados en el estudio de proteómica, se planteó cuantificar la actividad antioxidante en hojas de plantas de sorgo (Sorghum vulgare var. BJ 83 Caloro) de 58 días después de la siembra, sometidas a estrés por deficiencia de agua, el cual consistió en someter a las plantas a un estrés gradual durante 7 días, llegando a suprimir el riego durante un día, mientras que el control estuvo bajo riego adecuado. En extractos de hoja de plantas control y sometidas a estrés hídrico, se evaluó la capacidad antioxidante y la relación glutatión oxidado/reducido, además se cuantificó la actividad de enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa y ascorbato peroxidasa. Los resultados obtenidos indican que hubo un aumento de estas actividades en las plantas que fueron sometidas a estrés hídrico, lo cual sugiere que esta actividad podría estar contribuyendo a la tolerancia al estrés. En este estudio se destaca la importancia de estas enzimas en la tolerancia al estrés hídrico estableciendo parámetros para cuantificar el nivel de estrés en plantas de sorgo, que podrían ser utilizados como referencia en otras especies de plantas con importancia económica y social. P08-26 (R08-6) La interrupción de la función de las fructosa-,6-bisfosfatasas cloroplastídica y citosólica induce cambios metabólicos que afecta todos los procesos en plantas de Arabidopsis thaliana José Antonio Rojas González, Antonio Jesús Serrato Recio, Ina Thormählen 2, Peter Geigenberger 2, Mariam Sahrawy Barragán Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Estación Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2 Ludwig-Maximilians- Universität München, Martinsried, DE Se han caracterizado tres mutantes de Arabidopsis thaliana con pérdida de función en las enzimas fructosa-,6-bisfosfatasa (FBPasas) citosólica (cyfbp) y cloroplastídica (cfbp) y de ambas (cyfbp cfbp). Debido al papel clave que ejerce la enzima plastidial en el Ciclo de Calvin, las plantas mutante cfbp presentan un tamaño más reducido en relación con el silvestre afectando especialmente la tasa fotosintética, estructura de la hoja, raíz y el desarrollo de la planta. Cuando se interrumpe la función de la isoforma citosólica en la síntesis de la sacarosa provoca un acumulo de almidón en los cloroplastos y contenido de sacarosa similar al silvestre. Interesante fue comprobar que el doble mutante cyfbp cfbp puede heredar las características de uno u otro parental, sin embargo el fenotipo es similar al del mutante cfbp. Los cambios fisiológicos inducidos por la pérdida de función de las FBPasas en cada uno de los mutantes podrían indicar modificaciones en varios procesos metabólicos importantes. Para estudiar el papel de ambas enzimas en la síntesis y distribución de azúcares en plantas se ha suministrado, a cada mutante, un aporte exógeno de azúcares (sacarosa, glucosa, fructosa, manitol, glucosa P, glucosa 6P, fructosa 6P y fructosa-,6-bisfosfato) observando en algunos casos la recuperación del fenotipo silvestre. Se han 75

Pósters XXXVII Congreso SEBBM determinado los contenidos en hexosas, sustrato, triosas fosfato y analizado los metabolitos en los tres mutantes mediante GS MS. Los resultados muestran que como respuesta a la falta de una o ambas FBPasas se produce un acumulo de sustrato y de triosas P. La pérdida de la enzima cloroplastídica cfbpasa provoca un significativo cambio en los niveles de los metabolitos pertenecientes a distintas categorías, azúcares, azúcares alcohol, aminos ácidos, ácidos orgánicos, antioxidantes, etc. Estos resultados sugieren que en el mutante cyfbp la planta reorganiza su metabolismo carbonado, mientras que en los mutantes cfbp y doble mutante, existe una respuesta general de la planta para evitar la situación extrema a la cual está sometida por la falta de aporte carbonado. BIO 202-33292. Junta de Andalucía BIO 54. P08-27 Arabidopsis mutants in the bhlh transcription factors SPEECHLESS and MUTE reveal transcriptional and functional features of stomataless plants in photosynthesis and secondary metabolites Marisa Pérez Bueno, Magdalena Triviño 2, Alberto de Marcos 2, Carmen Fenoll 2, Montaña Mena 2, Matilde Barón Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas - Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 Departamento de Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla la Mancha, Toledo, ES Stomata are microscopic valves formed by guard cell pairs in the epidermis of terrestrial plants. As they regulate gas exchange with the atmosphere, stomata are essential for CO 2 uptake and H 2 O loss, thus controlling photosynthesis, transpiration and leaf temperature. Plants dynamically regulate stomatal opening in response to environmental conditions; work in Arabidopsis during the last years has also established that stomata abundance is also regulated during leaf development through genetic networks whose molecular components have been partially unveiled. For instance, loss of function of the bhlh transcription factors SPCH and MUTE produces stomataless plants with very limited growth even in sucrose-supplemented medium. Using ATH Affymetrix microarrays we made hybridizations with RNA from wild-type Arabidopsis, spch-3 and mute-3 mutants and identified ca..800 differentially expressed transcripts (p-value with false discovery rate correction <0.05; ± 2 fold change) in three pairwise comparisons. Their functional classification identified major expression changes in key genes. The mutant transcriptomes predict a limited photosynthesis, but also important changes in secondary metabolism, cuticle and cell wall composition that might modify the permeability to gases of the mutant epidermes. The impact of the observed transcriptional changes in photosynthesis-related genes was examined in-situ by quenching analysis of chlorophyll fluorescence. Kinetic analyses of the red fluorescence emitted by chlorophyll estimate photosynthetic efficiency as well as mechanisms of energy dissipation indicative of stress. Blue and green fluorescence was used to estimate the accumulation of pigments and secondary metabolites suggested by the transcriptomic analysis. P08-28 Fluorescence and thermal imaging techniques allow detection of white root rot on leaves of avocado plants infected with Rosellinia necatrix prior to the development of symptoms Espen Granum, María Luisa Pérez Bueno, Claudia Calderón 2, Cayo Ramos 3, Antonio de Vicente 2, Francisco M. Cazorla 2, Matilde Barón Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada, ES, 2 Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora, Universidad de Málaga, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Campus de Teatinos, Málaga, ES, 3 Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora, Universidad de Málaga, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Área de Genética, Facultad de Ciencias, Campus de Teatinos, Málaga, ES One of the most important soilborne diseases affecting avocado (Persea americana Mill.) crops is white root rot, caused by the fungus Rosellinia necatrix. Moreover, this fungus is considered to be an emergent threat to crop plants worldwide. Imaging techniques applied to remote sensing are emerging as powerful tools to be used in crop protection. In this study we investigated the potential applications of imaging techniques, including chlorophyll fluorescence, blue-green fluorescence and thermography, in early detection of white root rot on leaves of infected avocado plants. The results show that changes in certain chlorophyll fluorescence parameters provide early indications of fungal infection prior to the development of visual symptoms in the aerial part of the plant. P09. Biotecnología molecular P09- Isolation and Identification of a new archaea strain in hypersaline waters Marta de la Vega Naranjo, Agustín García Barneto 2, José Ariza Carmona 2, Rosa León Bañares Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales, Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del Mar-CEIMAR, Huelva, ES, 2 Dpto. Ingeniería Química, Física- Química y Química Orgánica, Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experiementales, Universidad de Huelva, Huelva, ES An extremely halophilic archea was isolated from marine salt ponds at the Southwest of Spain. Analysis of its 6S rrna encoding gene showed that the isolated microorganism was phylogenetically related to species of the genus Halorubrum within the Halobacteriaceae family. Halorubrum cells were harvested by centrifugation and carotenoids were extracted with methanol. Carotenoids identification was performed by HPLC and confirmed by UPLC- MS. Results revealed that this Halorubrum strain produces as predominant carotenoid, bacterioruberin. This carotenoid is a dipolar C50 carotenoid with 4 hydroxyl substitutes. It shows the typical 3-finger UV-Vis spectra with absorption around 467, 497 and 53 nm and a molecular weight of 73. Its biosynthesis is described as the addition of an isoprenoid-c5 unit to each of the extremes of lycopene-c40, followed by the introduction of the 4 hydroxil groups. Bacterioruberin contains 3 pairs of conjugated double bonds, so it can be an effective hydroxyl free-radical scavenger; it can protect the halobacteria from fatal injury of oxidative damage under strong light, and resist oxidative DNA damage resulting from UV irradiation. This carotenoid could be very useful for practical applications and the extremely halophilic archeon could be considered as a prokaryotic candidate for the production of carotenoids. P09-2 (R09-7) Herramientas para el control de la expresión durante procesos de infección en patógenos y simbiontes Carlos Medina Morillas, Beatriz Mesa Pereira, Eva María Camacho Fernandez, Amando Flores Díaz, Irene Jiménez Guerrero 2, Francisco Javier López Baena 2, Eduardo Santero Santurino Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 2 Universidad de Sevilla, Sevilla, ES El estudio de las interacciones entre microorganismos y sus hospedadores presenta ciertas limitaciones que dificultan el seguimiento del proceso 76

Granada 204 Pósters de infección en el interior de los organismos superiores. La naturaleza del hospedador puede impedir la monitorización del microorganismo durante la infección, por lo que se hace necesario el uso de sistemas de microscopía adaptados a condiciones in vivo. Así mismo, el limitado número de herramientas que permiten el control de la expresión de genes involucrados en las interacciones bacteria-hospedador, restringe la posibilidad de activar o desactivar dichos genes en el momento o lugar deseados en el transcurso de la infección. En nuestro laboratorio hemos contribuido al desarrollo de un sistema de expresión de proteínas que responde a concentraciones permisivas de diferentes inductores como el salicilato, ácido acetil salicílico o 3-metil benzoato. Dicho sistema acopla dos reguladores transcripcionales que funcionan en cascada, el primero de los cuales controla la expresión del segundo que finalmente regula la expresión de genes heterólogos clonados bajo el control de un promotor inducible. Estos elementos proceden de distintas especies bacterianas, y han demostrado su eficiencia en la producción de proteínas heterólogas en diferentes microorganismos tanto patógenos de animales (Salmonella) como simbiontes de plantas (Sinorhizobium). Una de las características interesantes del sistema es que los inductores son capaces de difundir libremente entre los distintos tejidos del hospedador sin presentar toxicidad a las concentraciones ensayadas. Esta propiedad junto a una correcta monitorización del proceso infectivo, permite disparar la expresión de genes de interés en el momento deseado lo cual puede ser muy útil para comprender cuando y donde actúan los genes implicados en las interacciones tanto de bacterias patógenas como simbiontes con sus hospedadores respectivos. P09-3 (R09-) Herramientas biotecnológicas derivadas de virus de plantas José Antonio Darós Arnau Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC- Universidad Politécnica de Valencia), Valencia, ES Los virus que infectan plantas superiores son muy sencillos genéticamente. Sin embargo, sus pequeños genomas contienen información suficiente para completar complejos ciclos infecciosos que, además de la replicación, movimiento y transmisión del virus, incluyen la desactivación de las defensas de la planta. Estos pequeños genomas codifican un número limitado de proteínas que suelen ser multifuncionales y tener la capacidad de interaccionar, reclutar y subvertir la actividad de multitud de factores del huésped para que desarrollen diversos cometidos durante la infección. Los viroides son un caso extremo dentro de los agentes infecciosos de las plantas, puesto que son RNA capaces de replicarse y moverse por el huésped a pesar de no codificar ninguna proteína propia. La sencillez estructural y riqueza funcional de los virus y viroides de las plantas facilita el desarrollo de herramientas biotecnológicas basadas en elementos de su biología. En nuestras investigaciones recientes hemos desarrollado un vector viral desarmado, basado en el potyvirus del grabado del tabaco, de interés en ingeniería metabólica de plantas. El vector permite coexpresar simultáneamente varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares y en la misma localización subcelular. Así, la coexpresión de dos factores de transcripción de la ruta de biosíntesis de las antocianinas conlleva a la acumulación de niveles notables de estos compuestos antioxidantes en los tejidos de la planta invadidos por el vector. También hemos desarrollado un sistema para la producción de RNA recombinantes en Escherichia coli basado en la coexpresión de un RNA derivado del viroide latente de la berenjena junto con una proteína con la que éste interacciona durante la infección, la isoforma cloroplástica de la trna ligasa de berenjena. P09-4 (R09-3) Un insecticida natural interfiere con comportamientos bacterianos clave en procesos infectivos Isabel Mª López-Lara, Joaquina Nogales 2, Ángel Pech-Canul, Lydia Mª Bernabéu-Roda 2, Nieves Calatrava-Morales 2, José Olivares 2, Laura Álvarez 3, Otto Geiger, Mª José Soto Misffut 2 Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México-UNAM, Cuernavaca, MX, 2 Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 3 Centro de Investigaciones Químicas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos-UAEM, Cuernavaca, MX En Sinorhizobium meliloti, la pérdida de función del gen fadd que codifica una acil-coa ligasa específica de ácidos grasos de cadena larga, promueve movilidad swarming e interfiere con la capacidad de establecer simbiosis con alfalfa []. El análisis de extractos lipídicos de sobrenadantes de cultivo del mutante fadd y su cepa parental desveló la presencia en el mutante de dos compuestos que fueron identificados como 2-tridecanona (2-TDC) y dodecanal, ausentes en los sobrenadantes de la cepa silvestre. La aplicación de 2-TDC comercial en concentraciones micromolar induce movilidad en superficie de cepas de S. meliloti, favoreciendo tanto swarming como un desplazamiento independiente de flagelos. La 2-TDC se ha descrito como un insecticida natural producido por variedades silvestres de tomate [2] pero hasta ahora no se habían descrito sus efectos en bacterias. La 2-TDC afecta comportamientos en superficie de diversas bacterias: promueve swarming en los patovares tomato y syringae de Pseudomonas syringae, inhibe formación de biofilm en S. meliloti y P. syringae y es capaz de anular el swarming de Salmonella. Interesantemente, la aplicación de esta metilcetona interfiere con el establecimiento de 2 interacciones plantabacteria: la formación de nódulos en la simbiosis S. meliloti alfalfa, y el desarrollo de peca bacteriana en tomate, resultados con potencial biotecnológico. Bibliografía [] Soto et al. 2002. Mol. Microbiol. 43:37-382. [2] Williams et al. 980. Science 207:888-889. P09r-5 (R09-4) Physical and functional standardization of glycolytic modules for knocking-in novel metabolic capacities in Gram-negative bacteria Alberto Sánchez-Pascuala, Víctor de Lorenzo, Pablo I. Nikel Systems Biology Program, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Campus de Cantoblanco, Madrid, ES One key tenet of Synthetic Biology is the physical and functional modularization of the components of live systems for enabling their reuse in a different biological context. Because of their extant metabolic network, bacteria which are appealing for biotechnological processes (e.g., Pseudomonas putida KT2440) often show a non-optimal energetic yield that limit their efficiency under operation conditions. In order to overcome this state of affairs, we took the Escherichia coli s Embden-Meyerhof- Parnas pathway (one of the most efficient glycolytic pathways in terms of energy balance) as the starting point for improving sugar utilization in P. putida and other Gram-negative bacteria. To this end we engineered various genetic/biochemical modules that are composable and interchangeable by means of the format brought about by the Standard European Vector Architecture (SEVA; Silva-Rocha et al., 203, Nucleic Acids Res. 4: D666-D675). These designs considered [i] the distribution of a minimal set of relevant glycolytic genes from E. coli into two different catalytic blocks, [ii] the elimination of restriction enzyme targets in the genes, while maintaining the amino acid sequence of the polypeptides encoded, and [iii] the creation of independent enzymatic modules with corresponding DNA sequences flanked by appropriate restriction sites for easing their subsequent formatting with the SEVA rules. These genetic/biochemical 77

Pósters XXXVII Congreso SEBBM devices allow for the re-factoring of central pathways for C consumption in a variety of Gram-negative microorganisms, thereby increasing their energy balance and thus developing new-to-nature metabolic capabilities. P09r-6 (R09-5) Aptámeros de RNA para el estudio de la función del dominio CRE del genoma del virus de la hepatitis C Alba Fernández Sanlés, Beatriz Berzal Herranz, Pablo Ríos Marco, Alfredo Berzal Herranz, Cristina Romero López Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES La consecución del ciclo infectivo del virus de la hepatitis C (HCV) depende de varios dominios genómicos altamente conservados en estructura y secuencia, entre los que se encuentra la región CRE (cisacting replicating element). Este elemento, esencial para la replicación viral e implicado en la regulación de la traducción, se encuentra en el extremo 3 de la región codificante del genoma. Su estructura presenta tres dominios con estructura tallo lazo, denominados 5BSL3., 5BSL3.2 y 5BSL3.3, de los cuales los dos primeros son esenciales para la replicación y además el 5BSL3.2 es importante en la regulación de la traducción. Este dominio ejerce su función reguladora mediante la interacción con la proteína RNA polimerasa NS5B y con regiones distantes en el genoma como la región 3 UTR o el elemento IRES (internal ribosome entry site) localizado en la región 5 UTR. Dada su importancia funcional, se presenta como una potencial diana terapéutica. Los mejores candidatos para interferir con un elemento funcional estructural de RNA como el CRE son los aptámeros de RNA. Los aptámeros son oligonucleótidos que se unen específicamente a su diana dependiendo de su secuencia y estructura, de manera similar a los anticuerpos. Se obtienen mediante un proceso de selección in vitro conocido como SELEX. Hemos aislado una batería de aptámeros tras nueve rondas de selección y el análisis de sus secuencias ha permitido clasificarlos en cinco grupos definidos por un motivo común. Observamos que los motivos de secuencia cuya diana es 5BSL3.2 están presentes en los aptámeros que inhiben en mayor medida los niveles de RNA total (>80%) de un sistema replicativo subgenómino de HCV. Además, dichas secuencias consenso se encuentran en los lazos apicales de los aptámeros. Asimismo, los ensayos de unión de NS5B al genoma viral en presencia de los aptámeros muestran que aquellos que se unen al motivo 5BSL3.2 compiten por la unión de la polimerasa NS5B al extremo 3 del genoma. Los resultados obtenidos apoyan el potencial del elemento CRE como diana terapéutica, así como el potencial de los aptámeros de RNA como agentes antivirales. P09-7 Nanoparticles as protein carriers Juan Diego Unciti Broceta, Victoria Cano Cortés, María Paz Ruiz Blas, Juan Jose Díaz-Mochón, Rosario M. Sanchez-Martin Dpto. Química Orgánica y Farmacéutica, Universidad de Granada - Centro de Genómica e Investigación Oncológica-GENyO, Granada, ES The development of an efficient carrier system for delivery of functional proteins into cells, although a challenging area of research, is a key technology for the progress of research in the biological sciences and medicine. Recent examples include conjugation of proteins to cell penetrating peptides (CPP) such as those derived from HIV- TAT, profection by cationic lipids and the use of several nanodevices such as nanotubes or silica nanoparticles. Previously we have reported that aminofunctionalized, cross-linked polystyrene microspheres of highly defined sizes (200 nm 2 μm) are efficient cellular delivery devices that can enter a broad range of cell types including adherent, suspension and primary cells. These microspheres are inherently attractive as a carrier/delivery system due to their lack of toxicity and highly controllable cellular loading. Herein we present our last advances in the development of nanotechnologybased strategy for delivery of therapeutic proteins into cells. For this purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry, and basic molecular biology techniques has been optimized for the conjugation of proteins to nanoparticles. P09r-8 A SMART chemistry for liver injury diagnosis Antonio Delgado González, Mavys Tabraue Chávez 2, Rosario María Sánchez Martín 2, Salvatore Pernagallo 2, Juan José Díaz-Mochón 2 DestiNA Genomics Ltd y GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: Pfizer / University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, School of Pharmacy, University of Granada, Granada, ES, 2 DestiNA Genomics Ltd, Granada, ES Molecular diagnostics is the process of identifying genetic variants in biological samples. Testing for human diseases and illnesses, drug performance and toxicities, pathogenic bacteria and viruses has created an important, multi-billion and rapidly expanding global market. Molecular diagnostics is increasingly being used in the cost challenged medical health systems, animal health, food safety and pharmaceutical industries. The limitation to its use in clinical diagnosis has been cost, testing errors, and clinician conservatism. DestiNA Tecnology is unique and distinguishable from ALL existing enzymatic methods of nucleic acid analysis. It can be used to identify any known target nucleic acid sequences, including insertion and deletion mutations, as well as non-mutated nucleic acid sequences. DestiNA reagents can successfully be used on the major diagnostic platforms - fluorescence and colourimetric. This gives the technology a unique, powerful position versus current detection methods. In this study, DestiNA reagents are combined with two of the major diagnostic platforms - fluorescence and colourimetric - for developing novel tools for early detection and quantification of mirna-22 involved in human liver injury. The integration of these platforms with DestiNA reagents promises to transform and expand routine clinical diagnostic for liver injury with benefits in terms of result consistency, time, cost, and ease of use. P09r-9 Tumor-associated circulating micrornas detection by Chem-NAT M.A. Luque-González, M. Tabraue-Chávez 2, R.M. Sánchez-Martín, S. Pernagallo 2, J.J. Díaz-Mochón GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: Pfizer / University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, School of Pharmacy, University of Granada, Granada, ES, 2 DestiNA Genomica S.L, Granada, ES Among the advanced emerging nucleic acid detection (NAT) technologies, DestiNA Genomics has developed a unique chemistry approach for nucleic acid testing (Chem-NAT). DestiNA core technology takes advantage of dynamic chemistry for nucleic acid sequence specific recognition, using aldehyde-modified natural nucleobases (so called SMART nucleobases), and probes based on peptide nucleic acid (PNA) containing an abasic position (DestiNA probes), which can be made complementary to any target nucleic acid sequence [Bowler et al. in Angew. Chem. Int. Ed. 200]. In this study the unique DestiNA reagents are combined with Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) to rapidly identify tumor-associated circulating micrornas as biomarkers of cancer. This biological model represents the first step in developing novel suite assays for medical diagnostic field. Integration of DestiNA technology with MALDI-TOF MS brings a truly 78

Granada 204 Pósters innovative step forward for rapidly detects circulating micrornas with benefits in terms of result consistency, time, cost, and ease of use. With its potential PCR free approach, this tool promises to transform and expand routine clinical diagnostic testing and screening for tumor-associated circulating micrornas in the emerging companion diagnostics market. P09-0 Optimization of the E. coli biosynthesis of lycopene through mathematical modelling Nakens Núñez Martín, Julia Gallego 2, Manuel Cánovas 2, Néstor Torres Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y Genética. Facultad Biología, Universidad de La Laguna, San Cristobal de La Laguna, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus de Excelencia Internacional Regional Campus Mare Nostrum, Universidad de Murcia,, Murcia, ES Isoprenoids is an ubiquitous family of lipid compounds of industrial and commercial interest due to its key roles in cell signaling, pigmentation and defense among others. Currently the processes used to produce isoprenoids are based in their extraction from natural sources (mainly plants), but these processes show poor efficiency and sustainability. Thus their biosynthesis by microorganisms has since, long time ago be proposed as a more efficient, cheaper and sustainable alternative. However the bioengineering of this process have been halted by several factors. The first one is the complexity of the metabolic pathways involved in the biosynthesis of this family of secondary metabolites. All isoprenoids are built from a basic block, the Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) or its isomer, the Isopentenyl pyrophosphate (IPP). This five carbon structure is synthetized via two independent pathways, the mevalonate and non-mevalonate pathway. The latter one is of major interest from a biotechnological perspective since, in addition to its occurrence in chloroplasts and protozoa, it is also present in prokaryotic microorganisms. The goal of this project is to address the metabolic engineering of an E. coli strain in order to optimize the production of one member of the isoprenoid family, the lycopene. For this purpose we will built up a mathematical model of the non-mevalonate. The model will integrate the available information of the pathway network and regulatory features. Once it will be evaluate in terms of stability, robustness and reliably will be used to determine the changes, either in individual or group of enzymes or transport processes that should be modified in order to increase lycopene productivity while cell viability is guaranteed. Work funded by research grants from ACIISI, Ref No. ACIISI Project ProID 200/39 and Project BIO20-29233-C02-02 MINECO. IMBRAIN REF. FP7-REGPOT-202-CT202-3637-IMBRAIN. P09- Evaluación de la producción de galactooligosacáridos en variantes de beta galactosidasa de Kluyveromyces lactis Agustín Rico Díaz, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel Becerra Fernández Universidade da Coruña, A Coruña, ES La beta galactosidasa de Kluyveromyces lactis (Kl-β-gal) es una de las enzimas más usadas en la industria de alimentación, especialmente en la láctea. Aunque la enzima tiene muchas características interesantes como son su alta capacidad hidrolítica o su seguridad (es producida por un organismo generalmente reconocido como seguro), tiene la desventaja de ser bastante lábil a temperaturas altas. Esta característica limita su uso en aplicaciones industriales que necesitan llevarse a cabo a temperaturas moderadamente elevadas. Uno de los usos más extendidos y novedosos de las beta-galactosidasas es su utilización en la síntesis de galactooligosacaridos (GOS), derivados lácteos con propiedades prebióticas que son usados en la elaboración de ciertos alimentos funcionales. La enzima produce GOS mediante transgalactosilación, la cual se ve favorecida por altas concentraciones de lactosa. Teniendo en cuenta que la lactosa es bastante insoluble en agua, es necesario llevar a cabo la reacción a temperaturas elevadas, por lo que el uso de la Kl-β-gal se ve limitado. En este trabajo se compara la capacidad de síntesis de GOS entre la variante silvestre de la Kl-β-gal y una variante mutante de la misma obtenida mediante mutagénesis dirigida, la cual posee una estabilidad térmica mayor. P09-2 Novel conjugation approaches for delivery of nucleic acids mediated by nanoparticles Victoria Cano-Cortés, Juan Diego Unciti-Broceta, María Paz Ruiz- Blas, Juan José Díaz-Mochón GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: Pfizer / University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, School of Pharmacy, University of Granada, Granada, ES The efficient introduction and delivery of bioactive materials into cells (such as a drug, protein, nucleic acid, etc) to elicit, induce or control specific biological functions is of fundamental importance throughout many areas of biology and medicine. The ability to add a specific plasmidic DNA into cells to modify cellular function or to deliver RNA sequences into cells to silence a cellular function has significant applications in Biomedicine. However, their celular access can often be severely limited by properties such as solubility, charge or size. Several techniques for the delivery of these therapeutic molecules are in development such as cationic lipids, polymers and nanoparticles. However, due to certain issues (such as poor uptake efficiencies, major perturbations of cellular function or high cellular mortality) there is still a need to improve transfection efficiency for specific cell lines that are difficult to transfect. Herein we present our last advances in the development of nanotechnology-based transfection agents. For this purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry, and basic molecular biology techniques has been optimized for the conjugation of DNA to nanoparticles. P09-3 Biodiesel conversion of non-edible vegetable oils catalyzed by magnetic cross-linked enzyme aggregates of Candida antarctica lipase B Iraide Bejarano, Jone I. Otsoa-Txintxetru, Enrique A. Picó, Carmen López 2, María J. Llama, Juan L. Serra Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES, 2 Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES In the past years, first generation biodiesel was obtained by transesterification reaction with methanol of edible vegetable oil and animal fats. Second-generation biodiesel can be also produced from non-food crops such as non-edible vegetable oils. In this work magnetic cross-linked enzyme aggregates (mcleas) of the lipase B from Candida antarctica (CALB) were obtained by cross-linking covalently the insolubilized lipase to magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized with amine groups, using glutaraldehyde as cross-linking reagent. The resulting novel robust biocatalyst, denoted as mclea-calb, has been 79

Pósters XXXVII Congreso SEBBM used to catalyze the conversion to biodiesel of different non-edible vegetable oils. For this purpose the trans/esterification reaction catalyzed by mclea- CALB was assessed using different non-edible oils (waste-frying, unrefined soya, Jatropha and Cameline oils) in the presence o methanol, ethanol, 2-propanol and 2-butanol as alkyl-donors. Different alcohol:triglyceride molar ratios (:, 3:, 6:, 9: and 2:) were assayed at 30ºC in ml reaction mixture stirred by a rotatory mixer. Olive oil was used as control oil in all assays.finally, the reaction mixture was scaled up to 50 ml using control olive oil and methanol as substrates in a magnetic reactor (Carousel 2 Plus, Radleys, UK). The biodiesel conversion of oil to fatty acids methyl esters (FAMEs) was optimized using different amounts of mclea-calb and an alcohol:triglyceride molar ratio of 6:. The obtained FAMEs were analyzed by thin-layer chromatography (TLC) in Silica Gel G-60 plates after staining with Coomassie Blue. Then, digital images of plates were taken and analyzed using the TLC Analyzer software (available at: http://www.sciencebuddies.org/scienceresearch-papers/tlc_analyzer.shtml). Results were exported and integrated numerically in a spreadsheet to calculate the amount of FAMEs and triglycerides. Results obtained indicate that mclea-calb appears as a promising novel biocatalyst of interest to catalyze the production of second-generation biodiesel from waste-frying oil and other non-edible vegetable oils. Work supported by the MINECO (CTQ20-25052), the Basque Government (SAIOTEK S-PE2UN04) and UPV/EHU (GIU/25). P09-4 Inmovilización de la enzima β-galactosidasa de Aspergillus oryzae en membranas de quitosano Maria del Carmen Romero Cruz, Paulina Urrutia 2, Gonzalo Ruiz- Philippi 2, Carlos Vílchez Lobato, Javier Vigara Fernández, Lorena Wilson Soto 2 Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES, 2 Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica, Valparaiso, CL La inmovilización de biocatalizadores persigue la mejora de las prestaciones biotecnológicas de los mismos con idea de aumentar sus posibilidades de aplicación en los distintos campos de la industria productiva. El presente trabajo muestra un estudio de inmovilización de la β-galactosidasa (EC 3.2..23) del hongo Aspergillus oryzae utilizando membranas de quitosano activadas con glutaraldehído, que permite la inmovilización covalente de la enzima al soporte. En los estudios de optimización de la inmovilización, la actividad enzimática se cuantificó utilizando orto-nitrofenil-β-galactosido (ONPG) como sustrato. La activación de los grupos aminos del quitosano (xnh2) con glutaraldehído (GT) se optimizó a una relación de 0GT:NH2, obteniéndose un rendimiento de la inmovilización próximo al 55 %, frente al 20% obtenido con la relación GT:NH2. Para la carga enzimática utilizada se estableció un valor óptimo de 0 mg prot./g soporte, basada en un compromiso entre la actividad expresada y el rendimiento de la inmovilización. La membrana de quitosano activada se preparó a diferentes grosores (2; 2,5 y 4 mm) incrementándose 3,5 veces el rendimiento de la inmovilización para un grosor del 2 mm; el aumento del grosor provocó un aumento aparente de la constante de Michaelis para el ONPG, como consecuencia de restricciones difusionales. Independientemente del grosor utilizado, la inmovilización mejoró la estabilidad térmica de la enzima respecto al sistema libre. Como interés biotecnológico, la β-galactosidasa inmovilizada en membranas de quitosano puede utilizarse para diseñar un biosensor de lactosa, acoplando la membrana a un detector que permita cuantificar la glucosa resultante de la hidrólisis enzimática. Proyecto: ALGANAET (PIRSES-GA-20-29565). P09r-5 Stability and reutilization of magnetic biocatalyst (mcleas) for biodiesel production from microalgae oil Enrique Angulo Picó, Carmen López 2, Álvaro Cruz-Izquierdo, Teresa García-Bárcena, Noelia Villarroel, María J. Llama, Juan L. Serra Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES, 2 Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES Combinatorial approaches in enzyme immobilization are increasing in the design of novel robust immobilized biocatalysts. Catalytic functions may improve using cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) to obtain more stable catalysts. Moreover, magnetic nanoparticles (MNPs) are an attractive support for enzyme immobilization offering fast and simple recovery of the immobilized catalyst with a magnet. The lipase B from Candida antarctica (CALB) is one of the most used enzymes in organic chemistry, based on its broad specificity and high selectivity. Its capability to catalyze trans/esterification reactions makes it a very good alternative for biodiesel production. The aim of this work is to produce biodiesel by reactions of esterification catalyzed by magnetic CLEAs of CALB (mclea-calb), using either free fatty acids (FFA) or oils from the microalga Scenedesmus sp, as well as analyze the stability and possible reutilization of the biocatalyst for the synthetic purposes. The progress of reactions was assessed by high performance liquid chromatography (HPLC). Different experimental conditions such as type of alcohol, alcohol:ffa molar ratio, type of agitation, as well as different solvents were tested to find the best conditions for obtaining biodiesel in terms of reaction rates and conversion values. In addition, the stability of hydrolytic and biosynthetic activity of mcleas was tested after incubating the immobilized enzyme for 48 h in different organic solvents. Using mild conditions of temperature (30 C) and magnetic stirring, biodiesel conversion of oils up to 90% was obtained with methanol as alkyl-donor and t-butanol as solvent. The reutilization of mcleas was tested using two different types of stirring methods. After 50 consecutive cycles, the complete initial activity was maintained using mechanical stirring. Work supported by the MINECO (CTQ20-25052), Basque Government (SAIOTEK S-PE2UN04), UPV/EHU (GIU/25) and EU (Energreen Project EFA27/, POCTEFA). P09r-6 Magnetic cross-linked enzyme aggregates of Candida antarctica lipase B. Kinetic characterization and its use to obtain bioproducts Teresa García-Bárcena, Ane Quesada, Julen Díaz, Enrique A. Picó, Carmen López 2, María J. Llama, Juan L. Serra Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES, 2 Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU) - Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES The use of robust magnetic biocatalysts is nowadays a rapidly emerging area because the enzyme can be easily recovered from the reaction mixture and reused in several catalytic cycles. In this work cross-linked 80

Granada 204 Pósters enzyme aggregates (CLEAs) of the lipase B from Candida antarctica (CALB) have been covalently bound to magnetic nanoparticles (MNPs) of magnetite to obtain a novel robust biocatalyst denoted as mclea- CALB. In order to compare the behavior of this novel magnetically-separable biocatalyst to that of the soluble enzyme, the main structural and catalytic properties of mclea-calb have been studied. For this purpose the hydrolytic activity was assessed using the chromogenic substrate p-nitrophenyl acetate (pnpa) whereas the synthetic activity was evaluated by following the trans/esterification reaction to obtain either biodiesel (from free fatty acids or triglycerides with methanol) or biosurfactant (sucrose monopalmitate, SMP, from sucrose and vinyl palmitate). The effects of substrate concentration and temperature were studied in the case of the hydrolytic activity. In the other hand, the kinetics of mclea-calb to obtain fatty acid methyl esters (FAMEs) was studied using oleic, linoleic and linolenic acids at 30 C, and the values of kinetic parameters Km and Vm were determined. Also the kinetics of the transesterification reaction was followed using non-edible vegetable oils (unrefined soybean and jatropha oils) as well as olive oil as a control substrate. The effect of stirring on the hydrolytic and synthetic activity was followed using both mechanical (gyratory) and ultrasound (sonoreactor) agitation. Finally, the synthetic activity of mclea-calb to catalyze the synthesis of SMP was studied. The reaction was carried out at 60ºC with magnetic stirring using different amount of mcleas and substrates, in the presence of different organic solvents (DMSO, t-butanol and 2-methyl-2-butanol). These results indicate that mcleas of CALB can be envisaged as a promising novel biocatalyst of interest to catalyze both hydrolytic and transesterification reactions to obtain bioproducts. Work supported by the MINECO (CTQ20-25052), the Basque Government (SAIOTEK S-PE2UN04) and UPV/EHU (GIU/25). P09-7 DNA binding and hybridyzation on functionarized TiO 2 surfaces José Antonio Mas Gutiérrez, José Vicente Pérez-Girón 2, Ruy Sanz González 3, Miriam Jaafar Ruiz-Castellanos 4, Jens Jensen 5, Oscar de Luis Jiménez 6 Laboratorio de Genómica del Centro de Apoyo Tecnológico, Universidad Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES, 2 Emerging Viruses Department, Heinrich Pette Institute, Hamburg, DE, 3 CNR-IMM-MATIS, Catania, IT, 4 Departamento de Física de la Materia Condensada, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, Madrid, ES, 5 Thin Film Physics Division, Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, Linköping, SE, 6 Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES Titanium dioxide (TiO 2 ) is a versatile material with a wide range of technological applications. The physical and chemical properties of TiO 2 surfaces are influenced by morphology and crystallinity, among others. Preparing well-ordered functional structures of TiO 2, having highly active surface areas, is of great interest due to their potential application for biomaterials and biosensors. One way of fabricating regular micro- and nano-patterns is by ion-beam lithography (IBL), where a mask is used to harness an ion beam and define the structures. Energetic ion-beams induce localized material modifications in TiO 2, which is susceptible to chemical etching. In this way a well-defined pattern with interesting surface properties can be induced. The applied lithography method generates a permanent and well defined periodic structure of micrometre sized square holes having nanostructured TiO 2 surfaces, presenting different physical and chemical properties compared to the surrounding rutile single crystal surface. On the patterned substrates is possible to bind oligonucleotide molecules at the surfaces of the holes without the participation of intermediate molecules as binding functional groups. Here we describe the direct adsorption of DNA oligonucleotides after surface activation by UV irradiation. Effective DNA-TiO 2 surface binding was demonstrated after several astringent washes. We demonstrate also that fixed oligonucleotides are able to hybridize specifically to its corresponding antisense non-fixed oligonucleotide. These preliminary results allow us to propose TiO 2 as an adequate substrate for nanobiosensor applications based on nucleic acids sequence recognition. P09-8 Producción y caracterización de la enzima α-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae María E. Álvarez Cao, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel Becerra Fernández, María Isabel González Siso Universidade da Coruña, A Coruña, ES La α-galactosidasa de la levadura Saccharomyces cerevisiae (ScAGAL) es una glucósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis enzimática de residuos galactosa unidos por enlaces α-(,6) de galacto-oligosacáridos y galacto-mananos poliméricos. La ScAGAL presenta bajo coste de producción, gran estabilidad a temperatura ambiente y amplio rango de Tª y ph de trabajo que la identifican como una enzima robusta y de especial importancia en numerosas aplicaciones biotecnológicas que van desde la industria azucarera y la alimentación animal, pasando por la farmacéutica, hasta la producción de etanol o biodiesel acoplado a la degradación de diferentes materiales (melazas, derivados de legumbres). En este trabajo, el gen MEL que codifica para la ScAGAL fue clonado y expresado en la cepa S. cerevisiaebj3505 generando diferentes construcciones con el fin de favorecer la purificación y producción de la enzima. Además, la optimización de las condiciones de cultivo permitió mejorar la productividad obteniendo un incremento de hasta 0 veces más de enzima al aumentar la concentración de la fuente de carbono y la aireación del medio de cultivo, y hasta 30 veces más si se alarga el tiempo de cultivo hasta las 250 h. Por otro lado, la caracterización enzimática de la ScAGAL utilizando diferentes sustratos y su estudio comparativo con otras α-galactosidasas disponibles en el mercado, demuestra que la enzima hidroliza eficientemente los sustratos naturales melibiosa, rafinosa y estaquiosa pero no puede actuar directamente sobre galactomananos complejos, como el galactomanano de algarrobo, pudiendo hidrolizar los galactomano-oligosacáridos sintéticos, Gal Man 3 y Gal 3,4 Man 5, en combinación con la enzima ß-manosidasa. Estas ventajas permiten que la ScAGAL sea un buen candidato para su aplicación en la eliminación de oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO). P09-9 Identification of an inhibitory antibody for imaging active urokinase plasminogen activator (upa) Natalia Sevillano, Aaron M. LeBeau 2, Daniel R. Hostetter 3, Henry F. VanBrocklin 2, Charles S. Craik Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, San Francisco, US, 2 Center for Molecular and Functional Imaging, Department of Radiology and Biomedical Imaging, University of California San Francisco, San Francisco, US, 3 CytomX Therapeutics Inc, South San Francisco, US Increased proteolytic activity is a common characteristic of highly proliferative and invasive cancers. Proteases are involved in all stages of cancer and represent functional biomarkers that can be targeted to distinguish aggressive disease. Over-expression of the plasminogen activation system (PAS) which consists of the serine protease urokinase plasminogen activator (upa), the 8

Pósters XXXVII Congreso SEBBM upa receptor, upar, and upa inhibitor, PAI-, has been documented in a number of primary and metastatic cancers. The expression of the PAS directly correlates with cancers that are phenotypically aggressive, result in poor clinical prognosis, and quickly acquire drug resistance to first line therapies. Active upa is a functional biomarker of aggressive cancer that can be selectively targeted for preclinical imaging using an antagonistic molecular approach. Using a fully human naïve Fab phage-display library we have identified a human antibody (Fab U33) that selectively inhibits the active form of upa. This antibody targets and internalizes the active form of upa via a receptor mediated mechanism by mimicking the action of the endogenous inhibitor of upa, PAI-. We have used U33 labeled with fluorophores or radionuclides to non-invasively detect active upa in vivo in prostate cancer xenografts and in experimental metastasis models. P09-20 (R09-6) Evolución dirigida de una peroxigenasa inespecífica, un biocatalizador altamente promiscuo y selectivo Patricia Molina-Espeja, Eva Garcia-Ruiz 2, David Gonzalez-Perez, Miguel Alcalde Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2 Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Illinois en Urbana- Champaign, Urbana, Illinois, US Hace diez años, se descubrió en el hongo basidiomiceto Agrocybe aegerita una enzima capaz de catalizar actividades que engloban aquellas de la cloroperoxidasa de Caldaryomices fumago (CPO) y las de las monooxigenasas del citocromo P450 [,2]. Con el nombre de peroxigenasa inespecífica (unspecific peroxygenase, UPO, EC..2.), esta versátil enzima [3] ha demostrado suplir las carencias de las anteriores, con una elevada eficiencia y selectividad. La UPO es una enzima extracelular e independiente de cofactores como el NAD(P)H y otras enzimas auxiliares (sólo necesita H2O2 para trabajar), al contrario que las P450, lo que reduce el coste de su aplicación. Hemos sometido a esta peroxigenasa hemo-tiolada (cisteína como ligando axial) a evolución dirigida hacia expresión funcional en Saccharomyces cerevisiae [4]. Tras cinco ciclos, se obtuvo la variante PaDa-I, con unos niveles de secreción de ~8 mg/l. También ha sido sobre-expresada en Pichia pastoris, obteniendo ~230 mg/l (material sin publicar). En ambos casos, las propiedades y comportamiento son equivalentes a los de la enzima homóloga. Así, disponemos de una plataforma de fácil uso para continuar su mejora hacia aplicaciones de interés biotecnológico. En nuestro caso, estamos sometiendo a PaDa-I a evolución hacia mejora de su actividad hidroxilativa sobre naftaleno, en detrimento de su actividad oxidativa (material sin publicar). Esta última transforma el compuesto de interés, -naftol, en productos no deseados. La actividad oxidativa en la UPO parece estar muy relacionada con su estabilidad, pero los resultados obtenidos son esperanzadores, con una nueva variante que reduce cinco veces la actividad oxidativa (peroxidasa) manteniendo su capacidad de transferencia de oxígeno (actividad peroxigenasa). Bibliografía [] Ullrich R, Nüske J, Scheibner K, Spantzel J, Hofrichter M. Novel haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes aryl alcohols and aldehydes. Appl Environ Microb 2004; 70: 4575-8. [3] Hofrichter M and Ullrich R. Oxidations catalyzed by fungal peroxygenases. Curr Opin Chem Biol 204; 9: 6-25. P09-2 Identifying recombinant antibodies to conformational states of challenging protein targets Natalia Sevillano, JungMin Kim, Hai Ta, Kiment Verba 2, David Agard 2, John Gross, Yifan Cheng 2, Charles S. Craik Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, San Francisco, US, 2 Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco, San Francisco, US Monoclonal antibodies (mabs) are ubiquitous in biomedical research and medicine. Synthetic antibodies (recombinant antibodies, rabs) can be created in the laboratory, completely eliminating animals from the antibody-production process. rabs can be used in the same applications as traditional mabs such as western blotting, immunohistochemistry, FACs and immuno-precipitation experiments. They have several advantages over the traditional hybridoma-based antibodies, including control over the state of the antigen that allows identification of antibodies to conformational states of the antigen, rapid identification of antibody binders allowing automation for high throughput production and ability to develop antibodies to highly toxic or non-immunogenic proteins.a fully human naïve Fab phage-display library with a diversity of 4. x 00 was constructed by the Craik laboratory using methods previously described. We have optimized the protocols for phage display panning for fast verification of binders and initial characterization of the epitope by semi-quantitative and competitive ELISAs without the purification of the Fabs. Using these optimized protocols, we have successfully generated Fabs that are useful for structural analysis against a wide range of protein targets including proteases, membrane proteins and protein complexes. P09-22 Solid lipid nanoparticle composition is a key factor for the development of a suitable drug delivery system Lide Arana Urbieta, Félix María Goñi, Itziar Alkorta Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES Development of novel drug delivery systems for the treatment of complex diseases has become a big challenge for the last two decades. Many drugs present low water solubility, poor absortion or rapid elimination and suitable drug carriers are essential for the improvement of drug bioavailability. Nanotechnology has abruptly broadened the field of drug delivery systems and particularly, Solid Lipid Nanoparticles (SLN) have emerged as some of the most promising nanocarriers for controlled drug delivery. SLN have many advantages: they are able to incorporate hydrophilic and lipophilic drugs, they present no biotoxicity and their production can be easily scaled up. Due to their solid core, drug release is controlled and their size facilitates drug diffusion through some biological barriers. SLN composition must be carefully selected depending on targeted tissue and incorporated drug. In this work we have tested solid lipid nanoparticles (SLN) composed of long-chain fatty acids, Epikuron 200 (largely soy bean lecithin), and bile salts. A total of five different systems were prepared, and characterized by photon correlation spectroscopy, transmission electron microscopy, differential scanning calorimetry, and capacity to incorporate non-polar drugs. Our results suggest that SLN composition is essential for particle size, polidispersity and stability but not for drug incorporation efficiency. 82

Granada 204 Pósters P09-23 Hydrolysis of mcl-polyhydroxyalkanoates by immobilized depolymerase from Streptosporangium roseum Noelia Villarroel, Alba Álvarez, Teresa García-Bárcena, Enrique A. Picó, Carmen López 2, María J. Llama, Juan L. Serra Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES, 2 Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU) - IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Leioa, ES Over the past years, the use of plastics in packaging and other products has exacerbated the problem of disposal of solid waste. In response to the problem and harmful effects of the plastic waste on the environment, there is a considerable interest in the production of biodegradable plastics. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) provide a good fully degradable alternative to petrochemical plastics. Among PHAs, the medium-chain length ones (mcl-phas) are considered to be promising candidates for special bioplastic applications due to properties such as elasticity, hydrophobicity, low oxygen permeability, among others. At the same time, PHAs have an added interest as source of R-3- hydroxyalkanoic acids (R-HAs), the monomers that form the polymer, which are scaffolds as chiral starting materials in fine chemical, pharmaceutical and medical industries. Extracellular PHA depolymerases are enzymes capable of degrading PHAs available in the environment after the death or lysis of PHA-accumulating bacteria. In our laboratory a hypothetical protein with a putative extracellular mcl- PHA depolymerase activity from Streptosporangium roseum DSM4302 was cloned and expressed as a hexahistidine recombinant protein in cells of E. coli BL2 (DE3) and then purified by IMAC. Taking into account the advantages that the immobilization can offer with respect to the soluble enzyme in aspects such as stability or reutilization of biocatalyst, the aim of this work was to immobilize the recombinant protein testing different supports in order to obtain an efficient and robust biocatalyst to hydrolyze mcl-phas. For this purpose, hydrophobic adsorption to porous polypropylene (Accurel MP-000) and covalent linkage to magnetic nanoparticles (MNPs) were used. The biochemical properties of the resulting biocatalysts as well as their ability to catalyze the production of monomers or dimers of R-HAs in the hydrolytic reaction of PHAs were compared. Also, the biocatalysts were used for several consecutive hydrolytic cycles to demonstrate their possible reutilization in the hydrolytic reaction of mcl-pha which could allow a cost reduction in future bioprocesses. Work supported by the MINECO (CTQ20-25052), Basque Government (SAIOTEK S-PE2UN04) and UPV/EHU (GIU/25). NV was the recipient of a predoctoral scholarship from the Basque Government. P09-24 Screening mutant libraries of versatiles peroxidase from Pleurotus eryngii to enhance oxidative stability David Gonzalez-Perez, Eva Garcia-Ruiz 2, Bernardo J. Gómez Fernández, Francisco Javier Ruiz-Dueñas 3, Ángel T.Martinez 3, Miguel Alcalde Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, US, 3 Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES Versatile peroxidases (VP) are promiscuous biocatalyst with the highest fragility to peroxides reported yet due to sophisticate molecular architecture that includes three catalytic sites and several oxidation pathways. In this work, an evolved version of VP was subjected to a range of hybrid and evolutionary strategies in Saccharomyces cerevisiae to study the resistance to H 2 O 2. After 5 generations of random-, saturation- and domain- mutagenesis together with in vivo DNA recombination approaches, several structural determinants behind the oxidative destabilization of the enzyme were unmasked. To keep balance between activity and stability,selected beneficial mutations were further relocated in novel mutational environments by in vivo sequence blocks exchange promoting epistatic interactions. The best variant of this process accumulated 8 mutations that increased the half-life up to 30 min in the presence of 3,000 equivalents of H 2 O 2 and shifted 6ºC upwards the kinetic thermostability. Whilst the main heme domain was not significantly modified, mutations in the surroundings of the Mn 2+ binding pocket and the catalytic tryptophan decreased substrates affinities for both catalytic sites exerting a beneficial effect to the protein stabilization. Multiple structural alignment with other H 2 O 2 tolerant peroxidases addressed possible roles played by the new mutations in the overall oxidative damage process of the heme-peroxidase superfamily. P09r-25 Screening a glycosynthase library with an enzyme-independent assay based on a fluorescent sensor Hugo Aragunde Pazos, Estela Castilla, Eduardo Andrés, Xevi Biarnés, Antoni Planas Laboratory of Biochemistry, Bioengineering Department, Institut Quimic de Sarria, Universitat Ramon Llull, Barcelona, ES Glycosynthases have become efficient tools for the enzymatic synthesis of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They are engineered retaining glycosidases in which the hydrolase activity is abolished by mutation of the catalytic nucleophile but efficiently catalyze transglycosylation when using activated glycosyl fluoride donors with the opposite anomeric configuration to the substrate in the wild-type enzyme. Enzyme-directed evolution approaches are applied to improve the performance of current glycosynthases and engineer specificity for new substrates. However, simple and general screening methods are required since most of the reported assays are specific for each particular enzyme []. Only one universal screening method has been proposed, a ph-based assay that measures the hydrofluoric acid released as by-product of the glycosynthase reaction, being detected by color change of a ph-indicator [2]. However, it is not very reproducible and difficult to implement due to sample matrix variations. We have developed a new general screening assay independent of enzyme specificity for the screening of glycosynthase libraries [3]. This assay is based on the use of a chemical sensor to transduce fluoride concentration (by-product of all glycosynthase reactions using fluoride activated donors) into a fluorescence signal. We report here the application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus licheniformis,3-,4-β-glucanase. Beyond the expected mutations at the nucleophile, other variants have acquired glycosynthase activity. Surprisingly, an aspartic acid for glutamic acid replacement renders a highly active glycosynthase, but retaining low hydrolase activity. It appears to be an intermediate state between glycosyl hydrolase and glycosynthase [4]. References [] Roman K., Withers S.G. (200) Carbohydr. Res. 345, 272-279. [2] Ben-Davis A., Shoham G., Shoham Y. (2008) Chem. Biol. 5, 546-55. [3] Andrés E., Aragunde H., Planas A. (204) Biochem. J. 458, 355 363. [4] Aragunde H., Castilla E., Biarnés X., Faijes M., Planas A. (204) Carbohydr. Res. 389, 85-92. 83

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P09-26 Identification of reciprocal adhesion genes in pathogenic and nonpathogenic Pseudomonas Jesús de la Torre Zúñiga, Maria Antonia Molina Henares, Estrella Duque Martin de Oliva 2, Miguel Alaminos Mingorance 3, Manuel Espinosa Urgel, Amalia Roca 4, Patricia Bernal Guzman, Matilde Fernandez, Sophie de Bentzmann 5, Juan Luis Ramos Martin 2 Consejo Superior de Investigaciones Científicas-EEZ, Department of Environmental Protection, Granada, ES, 2 Abengoa Research, Department of Biotechnology, Campus Palmas Altas, Sevilla, ES, 3 Universidad de Granada, Facultad de Medicina, Department of Histology, Granada, ES, 4 Bio-Iliberis R&D, Granada, ES, 5 UPR CNRS 9027, Marseille, FR We used a combination of in silico and large-scale mutagenesis approaches to expand our current knowledge of the genetic determinants used by Pseudomonas putida KT2440 to attach to surfaces. We first identified in silico orthologs that have been annotated in Pseudomonas aeruginosa as potentially involved in attachment. In this search 67 pairedrelated genes of P. putida KT2440 and P. aeruginosa were identified as associated to adhesion. To test the potential role of the corresponding gene products in adhesion, 37 knock-out mutants of KT2440, available in the Pseudomonas Reference Culture Collection, were analyzed with regard to their ability to form biofilms in polystyrene microtiter plates; of these, 7 mutants were deficient in adhesion. Since mutants in all potential adhesion genes were not available, we generated a genomewide collection of mutants made of 5 360 independent mini-tn5 insertions and tested them for the formation of biofilm on polystyrene microtiter plates. Eighteen clones that exhibited a reduction of at least 3-fold in biofilm biomass formation were considered candidate mutants in adhesion determinants. DNA sequencing of the insertion site identified 5 other new genes involved in adhesion. Phenotypic characterization of the mutants showed that of the inactivated proteins were required for attachment to biotic surfaces too. This combined approach allowed us to identify new proteins with a role in P. putida adhesion, including the global regulator RpoN and GacS, the lectin-like protein LecA, PstS, and a protein of unknown function (PP633). The remaining mutants corresponded to functions known or predicted to participate in adhesion based on previous evidence, such as the large adhesion proteins LapA, LapF, and flagellar proteins. In silico analysis showed this set of genes to be well conserved in all sequenced P. putida strains, and that at least 9 reciprocal genes involved in attachment are shared by P. putida and P. aeruginosa. P09r-27 Inhibición de la adsorción de proteínas a superficies de sílice mediante el uso de polielectrolitos de alta densidad de carga Felipe Hornos Adán, Rocío Esquembre Tomé, Javier Gómez Pérez Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel Hernández), Elche, ES La adsorción es un proceso complejo que puede afectar a la estabilidad estructural de las proteínas dependiendo de factores tales como temperatura, ph o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida por la adsorción - desorción a superficies de vidrio o plástico y su potencial inmunogenicidad. Proponemos la utilización de polielectrolitos (PE) catiónicos de alta densidad de carga como medio eficaz para inhibir la adsorción de proteínas a superficies de sílice. En particular hemos estudiado la capacidad de inhibición de polielectrolitos basados en grupos amonio y en grupos amina de distinto peso molecular. Nuestros resultados indican que estos PE compiten de forma muy efectiva con la proteína por la superficie hidrofílica, no habiéndose observado una dependencia significativa en su capacidad de inhibición con el peso molecular. Incluso en condiciones de fuerza iónica elevada, donde las interacciones electrostáticas se ven minimizadas, mg de PE es capaz de provocar la desorción de 0.5 mg de lisozima previamente adsorbida sobre 0 mg de sílice contenidos en ml. Finalmente, la capacidad de prevenir la adsorción de proteínas a superficies de sílice mediante el recubrimiento previo de estas superficies con una monocapa de polielectrolito ha sido testada encontrándose que lavados sucesivos de la superficie tienen un efecto prácticamente despreciable sobre el nivel de recubrimiento de la superficie y, por tanto, sobre su protección frente a la adsorción proteica. P09-28 El receptor de productos avanzados de glicación (RAGE) como una diana para la generación de reactivos específicos de transfección de células eucariotas María Dolores Girón González, Fernando Hernández Mateo 2, Francisco Javier López-Jaramillo 2, Arturo Morales Portillo 2, Alfonso Salinas Castillo 3, Francisco Santoyo González 2, Rafael Salto González Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 3 Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES En las alteraciones a largo plazo de la diabetes y en la angiogénesis asociada con la metástasis tumoral, el receptor de productos avanzados de glicación (RAGE) tiene un papel esencial. Este receptor se sobre-expresa en los tejidos diana asociados a estas patologías y tras unirse a sus ligandos se internaliza. Esto hace que este receptor constituya una diana para el desarrollo de reactivos específicos de transfección. Así, derivados de polietilenimina (PEI 25 kda) y PAMAM-G2 se modificaron mediante la reacción de glicación no enzimática de Maillard para generar nuevos agentes de transfección irreversiblemente glicados capaces de unirse al RAGE. Estos reactivos así sintetizados mantienen la capacidad de unir DNA y protegerlo de la degradación por endonucleasas. Además, mientras que los reactivos glicados mostraron una baja capacidad de transfección en células CHO-k que no expresan RAGE, los compuestos glicados actuaron como eficientes reactivos de transfección en una línea celular CHO-k que expresa de manera recombinante el RAGE. La especificidad de estos reactivos quedo demostrada por el hecho de que la pre-incubación con albúmina glicada, el ligando natural del RAGE, o dansyl cadaverina, un inhibidor de la internalización del RAGE, bloquean la transfección mediada por los reactivos glicados. Los resultados obtenidos se han confirmado en las líneas celulares NRK y RAW264.7 que expresan de manera natural el receptor. Asimismo, los compuestos glicados retienen su eficiencia de transfección en presencia de suero y son capaces de promover la transfección in vivo en un modelo experimental en ratón. Por tanto, nuestros resultados muestran que la reacción de Maillard es un procedimiento simple y directo para la preparación de reactivos glicados de transfección específicos y que esta técnica es aplicable a otros reactivos de transfección que presenten grupos amino libres. En conclusión, las propiedades de estos compuestos son muy interesantes para su uso in vivo: la glicación confiere selectividad con un muy pequeño efecto sobre la toxicidad de los reactivos, mantienen su actividad en presencia de suero y utiliza una vía única de internalización mediada por receptores, con una alta eficiencia de transfección in vivoen ratón. Investigación subvencionada por el Proyecto CTQ20-29299-C02 (MEC). 84

Granada 204 Pósters P09-29 Adsorción de proteínas a superficies hidrofóbicas: caracterización termodinámica y estrategias de inhibición Rocío Esquembre Tomé, Felipe Hornos Adán, Javier Gómez Pérez Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel Hernández), Elche, ES La adsorción de proteínas a superficies hidrofóbicas es un proceso complejo que puede afectar la estabilidad estructural de las proteínas y su actividad biológica dependiendo de factores tales como temperatura, ph o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida por la adsorción - desorción a superficies de plástico y su potencial inmunogenicidad. Hemos caracterizado termodinámicamente la adsorción de la proteína modelo lisozima a partículas coloidales de látex (de diámetro menor de μm) e identificado sustancias que permiten la inhibición efectiva de dicho proceso. Dada su naturaleza apolar y la presencia de cargas en su superficie para asegurar su estabilidad coloidal (evitar su aglomeración), la energía libre de adsorción contiene tanto un componente electrostático como otro hidrofóbico. Nuestros resultados indican que la adsorción proteica presenta cooperatividad negativa debido a la repulsión electrostática entre moléculas individuales de proteína adsorbidas sobre la superficie hidrofóbica. Como consecuencia, el nivel de recubrimiento (y la afinidad aparente de la proteína por la superficie) es máximo a un ph cercano a su punto isoeléctrico disminuyendo a medida que aumenta la carga de la proteína. Mediante calorimetría isoterma de titulación hemos podido caracterizar termodinámicamente las contribuciones electrostáticas e hidrofóbicas del proceso de adsorción así como cuantificar su inhibición mediante surfactantes y polímeros hidrofílicos como el polivinilalcohol. P09-30 (R09-2) Visualizando ATP intracelular en células vivas Vicente González Charro, Iván López Montero Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES La molécula de ATP (adenosín trifosfato) es la principal fuente de energía necesaria para realizar trabajo biológico. La mayor parte de ATP se genera mediante el proceso de respiración mitocondrial. Se sabe que el ATP generado es transportado al citosol en contra de un gradiente de concentración, mediante el potencial de membrana actuando como fuerza motriz. Al mismo tiempo, el ADP se transporta activamente al interior de las mitocondrias, manteniendo su concentración citosólica muy baja. La relación de concentraciones de ATP:ADP en el citosol es del orden de 200:. Sin embargo no se conoce la distribución de ATP en los diferentes compartimentos intracelulares debido a que los métodos convencionales para la detección y cuantificación de ATP, basados en análisis de extractos celulares, sólo proporcionan niveles promediados de ATP. Por ello, la detección selectiva de ATP intracelular en células únicas vivas se ha convertido recientemente en un tema de investigación muy activo. El diseño de sensores específicos de ATP permitirá entender cómo se regula la concentración de ATP intracelular a nivel de célula única. En esta contribución se expondrán las diferentes aproximaciones, tanto químicas como biológicas, que se han realizado recientemente para monitorizar y visualizar los niveles de ATP en células individuales y en tiempo real. Además, se mostrarán resultados preliminares del uso de un sensor basado en rodamina tanto en células NIH3T3 como en sistemas de membrana artificiales. P09-3 Engineering biological approaches for antibiotic detection. A new microbial biosensor based on the Pseudomonas putida TtgR repressor Manuel Espinosa-Urgel, Luis Serrano 2, Juan Luis Ramos, Ana María Fernández-Escamilla Department of Environmental Protection, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 European Molecular Biology Laboratory and Centre for Genomic Regulation Systems Biology Research Unit, Barcelona, ES Environmental contamination by toxic organic compounds and antimicrobials is one of the causes for the recent surge of multidrug-resistant pathogenic bacteria. Monitoring contamination is therefore the first step in containment of antimicrobial resistance, and requires the development of simple, sensitive and quantitative tools that detect a broad spectrum of toxic compounds. The emerging approach for detecting toxic compounds is the rational design of microbial biosensors. In this study, we have engineered a new specific microbial biosensor based on the ttgr-regulated promoter which controls expression of the TtgABC extrusion efflux pump, coupled to a gfp reporter. The system was introduced in Pseudomonas putida DOT- TE, a strain characterized by its ability to survive in the presence of high concentrations of diverse organic compounds. This whole-cell biosensor is capable to detect a wide range of antibiotics, as well as organic compounds such as toluene or flavonoids. Our tool opens the possibility to screen a wide range of toxic compounds by altering the TtgR binding site to obtain specific versions of this biosensor oriented to sense specific compounds. P09-32 Análisis funcional de tres acil-coa sintetasas implicadas en la degradación de ácidos biliares en Pseudomonas putida DOC2 Álvaro Barrientos Castañeda, Estefanía Merino García, Joaquín Rodríguez Fernández, Esther Coto Alcaraz, Raquel Benavides Serrano, José María Luengo Rodríguez, Elías Rodríguez Olivera Dpto Biología Molecular, Universidad de León, León, ES Pseudomonas putida DOC2 es una g-proteobacteria aislada del medio ambiente por su capacidad para utilizar ácidos biliares y otros esteroides como única fuente de carbono. En el genoma de esta bacteria se han identificado cinco clusters de genes que codifican funciones implicadas con el catabolismo de estos compuestos (genes std). Tres de estos genes codifican posibles acil-coa sintetasas implicadas en la degradación de ácidos biliares (stda, stda2 y stda3). Se ha procedido a la mutación específica mediante deleción de cada uno de estos genes obteniéndose las cepas ΔstdA, ΔstdA2 y ΔstdA3. Dos de las cepas mutantes obtenidas, ΔstdA y ΔstdA2, resultaron incapaces de asimilar colato y otros ácidos biliares, no viéndose afectado el metabolismo de testosterona y 4-androsten-3,7-diona. Por el contrario, el tercer mutante, ΔstdA3, crecía con dificultad en cualquier medio en el que la fuente de carbono fuera un compuesto esteroideo. Cuando se cultivaron dichos mutantes en medios conteniendo colato como fuente de intermediarios metabólicos y con succinato como fuente de carbono para soportar el crecimiento bacteriano, el mutante ΔstdA acumulaba en los caldos de cultivo Δ /4-3-cetocolato y Δ,4-3-cetocolato, el mutante ΔstdA2 acumulaba 7α,2α-dihidroxi-3-oxopregna-,4-dien- 20-carboxilato (DHOPDC), y el mutante ΔstdA3 mostraba un bloqueo metabólico a nivel del 3aα-H-4α(3 propanoato)-7aβ-metilhexahidro-,5-indanodiona (HIP). Análisis bioquímicos posteriores demostraron que StdA cataliza la tioesterificación de colato, 3-cetocolato, Δ /4-3-cetocolato y Δ,4-3-cetocolato a sus respectivos derivados de CoA, la proteína StdA2 cataliza la transformación de DHOPDC a DHOPDC-CoA, mientras que la enzima StdA3 lleva a cabo la tioesterificación del HIP y/o sus derivados hidroxilados a sus tioésteres de coenzima A. 85

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P09-33 Comparative evaluation of the antitumor activity of new platinum based drugs on human adenocarcioma cell lines Enric Milà, Roldán Cortés, Margarita Crespo 2, Laia Davin 2, Raquel Martín 2, Josefina Quirante 3, Daniel Ruiz 3, Ramon Messeguer 4, Carme Calvis 4, Laura Baldomà 5, Josefa Badia 5, Marta Cascante Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Biology - IBUB, Universitat de Barcelona (UB), IDIBAPS, Unit Associated with CSIC, Barcelona, ES, 2 Departament de Química Inorgànica and IBUB, Facultat de Química, UB, Barcelona, ES, 3 Laboratori de Química Orgànica, Facultat de Farmàcia, UB, Barcelona, ES, 4 Biomed Division LEITAT Technological Center, Parc Científic de Barcelona, Barcelona, ES, 5 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Farmàcia, IBUB, UB, Barcelona, ES It is estimated that 50-70% of cancer patients are treated with platinum (II) drugs. Despite the therapeutic benefit of the approved platinum based drugs (cisplatin, carboplatinand Oxaliplatin), their efficacy is still limited due to side effects and resistances. Hence, great efforts have been undertaken to develop novel metal-based drugs. Over the last three decades thousands of Pt-containing compounds have been designed and tested, but just a few of them have entered clinical use (carboplatin, oxaliplatin and nedaplatin) or are in clinical trials. Despite the therapeutic benefit of the approved platinum drug, the efficacy of the treatments is still limited due to side effects and intrinsic and acquired resistances. It is believed that DNA isthe main target of platinum drug and that cisplatin and its analogues form an intrastrand d(gpg) adduct with platinum cross-linking N7 atoms of neighbour guanine residues of DNA. It has been also shown that carrier amine ligands of cisplatin analogues appear to modulate the antitumor properties of this class of drugs. Cyclometalating N-donor ligands may offer an alternative approach to give structures quite different from that of cisplatin and analogs, with the possibility that those could interact in a different way with DNA and consequently show a different spectrum of activity and toxicity profile. We have been recently involved in the synthesis of a novel class of seven-membered platinacycles, and the lack of information on the biological activity of these compounds prompted us to undertake the present study. P0. Estructura y función de proteínas P0- Effect of TIA- phosphorylation in dimerisation and stress granule formation Sofía Muñoz García-Mauriño, Isabel Cruz-Gallardo, Valentina Castelli, Antonio Díaz-Quintana, Myriam Gorospe 2, Jacqueline A. Wilce 3, Irene Díaz-Moreno Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla CSIC, Sevilla, ES, 2 Laboratory of Genetics, National Institute on Aging-Intramural Research Program, NIH, Baltimore, US, 3 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Victoria, AU TIA- (T-cell restricted Intracellular Antigen-) is an RNA-Binding Protein (RBP) that functions as a translational repressor, sequestering target mrna into stress granules (SG) upon cellular stress []. It has been shown that the deregulation of this system results in neurodegenerative diseases such as Alzheimer [2]. TIA- is constituted by three RNA Recognition Motifs (RRMs) and a Prion-Related Domain (PRD). Preliminary work using EMSA and Analytical Ultracentrifugation (AU) revealed that TIA- RRM2 has a high propensity to form dimers, while TIA- RRM23 or RRM3 alone behave as a stable monomer, in agreement with recent NMR relaxation measurements [3]. There is little known about the sequence of events that leads to SG formation but, in this work, we propose that the SG assembly by TIA- involves the nucleating trigger of dimerisation via RRM2. In addition, post-translational modifications of TIA- (such as phosphorylation that occurs in cells under stress) can also lead to the SG formation. Fas-Activated Serine/Threonine Kinase (FAST K) is known to interact with and phosphorylate TIA- [4,5]. The substitution of three serines at TIA- RRMs by either aspartic acid serving as a phosphoserine mimic or alanine that can no longer be phosphorylated helps to understand the structural effects of TIA- phosphorylation, as well as the TIA- capability of being phosphorylated by FAST K. In fact, we have explored how such Ser-by-Asp phosphomimetic mutants of TIA- trigger the conformational changes required for RRM dimerisation and TIA- protein self-association by combining Light Scattering and AU measurements with Molecular Dynamics simulations. Our hypothesis presents a novel paradigm for the field of neurodegenerative research suggesting that the SG nucleation can be initiated by TIA- RRM domains, rather than by the PRD module as is widely accepted. References [] Anderson P, Kedersha N. (2002) Visibly stressed: the role of eif2, TIA-, and stress granules in protein translation Cell Stress Chaperones 7: 23-22. [2] Wolozin, B. (202) Regulated protein aggregation: stress granules and neurodegeneration Mol Neurodegener.7: 56. [3] Wang I, Hennig J, Jagtap PK, Sonntag M, Valcárcel J, Sattler M. (204) Structure, dynamics and RNA binding of the multi-domain splicing factor TIA- Nucleic Acids Res. 42: 5949-5966. [4] Tian Q, Taupin J, Elledge S, Robertson M, Anderson P. (995) Fasactivated serine/threonine kinase (FAST) phosphorylates TIA- during Fas-mediated apoptosis J. Exp. Med. 82: 865-874. [5] Izquierdo, JM, Valcarcel J. (2007) Fas-activated serine/threonine kinase (FAST K) synergizes with TIA-/TIAR proteins to regulate Fas alternative splicing. J. Biol. Chem. 282: 539-543. P0-2 Nucleophosmin stabilization as a strategy to prevent its mislocalization in leukemia Sonia Bañuelos, Igor Arregi, María Sendino, Marián Alonso- Mariño, José Antonio Rodríguez 2, Jarl Underhaug 3, Aurora Martínez 3, Maria Ángeles Urbaneja Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, ES, 2 Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, Leioa, ES, 3 Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, NO Nucleophosmin (NPM) is a protein involved in ribosome biogenesis and other functions affecting cell proliferation. NPM is oligomeric and built of several domains: a compact, pentameric core, is connected through long and flexible linkers to small, helical C-terminal domains. Albeit continuously shuttling between nucleolus, nucleoplasm and cytoplasm, NPM is mostly enriched in nucleoli, which probably depends on its binding to G-rich sequences of nucleic acids. NPM deregulation has been related to different types of cancer; in particular, NPM is the most frequently mutated gene in acute myeloid leukemia (AML), and these mutations cause the aberrant localization of the protein to the cytoplasm. It has been shown that AML-related mutations confer NPM an additional NES (nuclear export sequence), and impair folding of the C-terminal domain (e.g., abolishing ability to bind nucleic acids and hence to the nucleolus), all in all displacing the protein to the cytoplasm. Therefore, AML can be regarded as a misfolding disease. The pharmacological chaperones approach is an interesting strategy to restore the conformational stability of misfolded proteins. Probing for changes in the thermal stability of NPM C-terminal domain, we have performed a high throughput screening of a natural compound library. 25 hits were found to increase the T m of 86

Granada 204 Pósters the domain by 6-2ºC. We have then tested the effect of some of these compounds on the subcellular localization of AML-like mutants in HeLa cells expressing fluorescent NPM constructs. One compound is able to partially restore nucleolar localization whereas another one alleviates the protein aggregation of misfolded mutants. We conclude that these compounds might help to promote native localization and functionality of mutant, oncogenic NPM. P0-3 Recognition of nucleophosmin by the export receptor Crm: deciphering the basis of aberrant traffic in leukemia Igor Arregi Vado, Marián Alonso-Mariño, José Antonio Rodríguez 2, María Ángeles Urbaneja, Sonia Bañuelos Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, ES, 2 Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal. Facultad de Ciencias, EHU/UPV, Leioa, ES Nucleophosmin (NPM) is a nucleolar protein involved in several functions impacting cell growth, such as the assembly and export of ribosomes from the nucleolus to the cytoplasm. NPM is an oligomeric, multidomain protein, built of a compact core, connected to C-terminal, globular domains through long, flexible linkers. Although NPM is normally enriched in nucleoli, its activities require continuous shuttling between nucleolus, nucleoplasm and cytoplasm. This traffic relies on different localization signals in the protein: NLS for import, Crm-dependent NES for export, and C-terminal domains for binding to nucleolar components. NPM deregulation has been related to different types of cancer; in particular, NPM gene is frequently mutated in acute myeloid leukemia (AML), correlating with an aberrant, cytoplasmic localization of the protein. It has been shown that AML-related mutations of NPM impair folding of the C-terminal domain, hampering attachment to the nucleolus, and confer an additional NES, both factors contributing to displacement of the protein to the cytoplasm. The molecular determinants of wild type NPM recognition by the export receptor Crm are not yet understood; on the other hand, the subcellular localization of mutant NPM in AML remains to be explained in terms of Crm binding properties. To better understand the determinants of NPM cellular traffic, both in physiological and pathological conditions, we are characterizing NPM recognition by Crm, and the effect of AML mutations on the interaction. We have observed that AML-related NPM mutants bind indeed with stronger avidity to Crm, explaining their unbalanced transport in leukemia. P0-4 Identifying protein-protein interaction inhibitors for NUPR, a key therapeutic target in pancreatic cancer María Arruebo, Ángel Lanas 2, José L. Neira 3, Juan L. Iovanna 4, Adrián Velázquez-Campoy 5, Olga Abián 6 IIS Aragón / Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud-IACS, Zaragoza, ES, 2 IIS Aragón, Universidad de Zaragoza, Servicio de Digestivo - Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández - Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza, Elche, ES, 4 Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM), INSERM U068, Marsella, FR, 5 BIFI - Universidad de Zaragoza - Fundación ARAID, Diputación General de Aragón, Zaragoza, ES, 6 IIS Aragón/Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (IACS) - BIFI - Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most common type of pancreatic cancer, is one of the most aggressive human cancers and worse prognosis because of its remarkable capacity for invasion and metastasis. PDAC exhibits an extremely low survival rate (<3-4% at 5 years), due to its difficult diagnosis in early stages, and its high resistance to chemotherapy and radiotherapy. Hence, there is an urgent need to develop new and effective therapies against this disease.protein NUPR (Nuclear Protein ), also known as p8, is a nuclear protein overexpressed in several types of human cancers (breast, thyroid, skin...), especially in PDAC, where NUPR is essential for the development and progression of the tumor. Several studies have shown that blocking NUPR expression in pancreatic cancer cells prevents the formation of tumors, thus, confirming its key role in PDAC. NUPR protein is a small (82 aminoacid residues), basic and multifunctional protein without stable secondary and tertiary structure, belonging to the groupof intrinsically disorderedproteins (IDP s). Its interaction with its different partners promotes the mutual stabilization of their structures in a particular conformation and the formation of fuzzy, but biologically active complex. NUPR fuzzy complexes are involved in the regulation of important cellular processes, such as transcription of genes, cellular cycle, or apoptosis. In our group, we have developed a new strategy for identifying compounds capable of blocking NUPR intracellular interactions. The in vitro selected compounds inhibited NUPR interactions with one of its cellular partners and efficiently blocked NUPR function in cell-based studies. Keywords: NUPR, PDAC, IDPs, Thermal stability, Structural characterization of proteins, HTS. P0-5 (R0-) Dissecting I-DmoI endonuclease catalysis live Rafael Molina Monterrubio, Stefano Stella 2, Pilar Redondo, Hansel Gomez 3, Maria Jose Marcaida 4, Modesto Orozco 3, Jesus Prieto, Guillermo Montoya 2 Structural Biology and Biocomputing Programme, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), Macromolecular Crystallography Group, Madrid, ES, 2 Structural Biology Group, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, DK, 3 Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona,Joint BSC-CRG-IRB Program in Computational Biology and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Barcelona, Barcelona, ES, 4 Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern, Bern, CH The enzymatic hydrolysis of a DNA phoshpodiester bond has been widely studied; however, the chemical reaction has not been directly observed. Here we watch the course of a double strand break generation by I-DmoI, a homing endonuclease. The catalysis of this enzyme family is similar to type II restriction enzymes, which are general tools in molecular biology and boosted the recombinant DNA technology. By using a dynamic crystallography approach we provide the first time-resolved view of a two-metal ion cleavage mechanism, a central reaction to modify and edit DNA. We developed a procedure to capture intermediates of the different catalytic steps allowing us to analyse and watch the reaction by freezing multiple stages. We observe the successive entrance of two metals involved in the reaction, and finally the arrival of a third metal in a central position of the active site. This metal plays a pivotal role triggering the consecutive digestion of the targeted phosphodiester bonds in the non-coding and coding strands. Finally, the central metal abandons its position after double strand break generating a 4bp DNA overhang. We solved more than 50 crystal structures to obtain key snapshots of different catalytic stages, showing the orchestrated conformational changes in the amino acids, nucleotides and metals during catalysis. Our work provides a live and visual proof of this key biological mechanism. 87

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P0-6 The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated factor p5paf is an intrinsically disordered protein with non-random structural preferences at sites of interaction with other proteins Alfredo De Biasio, Alain Ibáñez de Opakua, Tiago N. Cordeiro 2, Maider Villate, Nekane Merino, Nathalie Sibille 2, Moreno Lelli 3, Tammo Diercks, Pau Bernadó 2, Francisco J Blanco 4 CIC biogune, Derio, ES, 2 Centre de Biochimie Structurale, Montpellier, FR, 3 Institut de Sciences Analytiques, Villeurbanne, FR, 4 IKERBASQUE, Bilbao, ES We present the first structural characterization of the p5paf protein showing that it is monomeric and intrinsically disordered in solution but with non-random conformational preferences at sites of proteinprotein interactions. The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated factor p5paf is a 2 kda nuclear protein that acts as a regulator of DNA repair during DNA replication. The p5paf gene is overexpressed in several types of human cancer. The nearly complete NMR backbone assignment of p5paf allowed us to measure 86 N-HN residual dipolar couplings (RDCs). Our RDC analysis reveals non-random conformational preferences in distinct regions, including the PCNA-interacting protein motif (PIP-box) and the KEN-box (recognized by the ubiquitin ligase that targets p5paf for degradation). In accordance with these findings, the analysis of the 5N R2 relaxation rates shows a relatively reduced mobility for the residues in these regions. The agreement between the experimental small angle X-ray scattering curve of p5paf and that computed from a statistical coil ensemble corrected for the presence of local secondary structural elements further validates our structural model for p5paf. The coincidence of these transiently structured regions with protein-protein interaction and post-translational modification sites suggests a possible role for these structures as molecular recognition elements for p5paf. P0-7 (R0-2) Structural basis of regulation and oligomerization of human cystathionine β-synthase, the central enzyme of transsulfuration June Ereño Orbea CICBiogune, Derio, ES Cystathionine β-synthase (CBS) controls the flux of sulfur from methionine to cysteine, a precursor of glutathione, taurine, and H 2 S. CBS condenses serine and homocysteine to cystathionine with the help of three cofactors, heme, pyridoxal-5 -phosphate, and S-adenosyl-L-methionine. Inherited deficiency of CBS activity causes homocystinuria, the most frequent disorder of sulfur metabolism. We present the structure of the human enzyme, discuss the unique arrangement of the CBS domains in the C-terminal region, and propose how they interact with the catalytic core of the complementary subunit to regulate access to the catalytic site. This arrangement clearly contrasts with other proteins containing the CBS domain including the recent Drosophila melanogaster CBS structure. The absence of large conformational changes and the crystal structure of the partially activated pathogenic D444N mutant suggest that the rotation of CBS motifs and relaxation of loops delineating the entrance to the catalytic site represent the most likely molecular mechanism of CBS activation by S-adenosyl-L-methionine. Moreover, our data suggest how tetramers, the native quaternary structure of the mammalian CBS enzymes, are formed. Because of its central role in transsulfuration, redox status, and H 2 S biogenesis, CBS represents a very attractive therapeutic target. The availability of the structure will help us understand the pathogenicity of the numerous missense mutations causing inherited homocystinuria and will allow the rational design of compounds modulating CBS activity. P0-8 (R0-3) Instruct: infraestructura europea para biología estructural Carlos Oscar Sorzano Sánchez, José María Carazo 2 Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, ES, 2 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, ES La biología estructural proporciona información muy valiosa sobre los mecanismos biológicos implicados en el funcionamiento fisiológico y patológico de las células. La obtención de información experimental de alta calidad depende en gran medida del acceso a infraestructuras de última generación para el análisis de estructuras biológicas desde resolución celular a resolución atómica utilizando cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, tomografía electrónica, así como otras técnicas biofísicas y bioquímicas. Instruct es una infraestructura europea cuyo objetivo es proporcionar acceso mediante un proceso de revisión por pares a un amplio abanico de técnicas para el estudio estructural. Instruct tiene un modelo de nodos con un nodo central. El nodo central coordina actividades como decisiones estratégicas, acceso al portal web, cursos, colaboraciones con la industria mientras que los nodos nacionales coordinan el acceso de los usuarios de ese país. En esta charla se expondrán los recursos disponibles a través de Instruct así como el proceso para solicitarlos. P0r-9 The interaction of TIA- with C-rich RNA sequences is driven by its ph-dependent RRM3 domain Isabel Cruz-Gallardo, Jesús Angulo 2, Myriam Gorospe 3, B. Göran Karlsson 4, Jacqueline A. Wilce 5, Miguel A. De la Rosa, Irene Díaz- Moreno Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2 School of Pharmacy, University of East Anglia - Norwich Research Park, Norwich, UK, 3 Laboratory of Genetics, National Institute on Aging-Intramural Research Program, NIH, Baltimore, US, 4 Swedish NMR Centre, University of Gothenburg, Gothenburg, SE, 5 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Victoria, AU T-cell intracellular antigen- (TIA-) is a key RNA binding protein that regulates critical events in cell physiology by the regulation of pre-mrna splicing and mrna translation [, 2]. It possesses three RNA recognition motifs (RRM) along with a glutamine-rich domain, with the central domains (RRM2 and RRM3) acting as RNA binding platforms. While RRM2 domain is primarily responsible for the RNA interaction, the RRM3 contribution to the RNA binding, as well as its targets sequences, are still unknown. Here we combine Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Surface Plasmon Resonance (SPR) and pull-down assays to elucidate the sequence specificity of TIA- RRM3 [3]. We demonstrate that RRM3 significantly binds to those oligonucleotides enriched with cytosines. Notably, in combination with RRM2 or in the context of the full length protein, the RRM3 domain enhances the binding to C-rich sequences. In addition, the binding of RRM3 to RNA is modified by ph conditions, having a significant effect on the overall interaction of TIA- protein [4]. Our findings provide a new insight into the role of RRM3 in regulating TIA- binding to C-rich stretches, abundant at the 5 TOPs (5 Terminal Oligopyrimidine Tracts) of translationally-repressed mrnas under stress situations [5]. References [] Förch et al. (2000). Mol Cell, 6: 089-098. [2] Mazan-Mamczarz et al. (2006). Mol Cell Biol, 26: 276-2727. [3] Cruz-Gallardo, I. et al. (204) RNA Biol,. [4] Cruz-Gallardo, I. et al. (203). J Biol Chem, 288: 20896-20907. [5] Damgaard and Lykke-Andersen. (20) Genes Dev, 25: 2057-2068. 88

Granada 204 Pósters Acknowledgements: Andalusian Government (P07-CVI-02896, P08- CVI-3876, P-CVI-726 and BIO98); Bio-NMR Research Infrastructure co-funded by EC (FP7/2007-203, grant agreement 2686 and BIO- NMR-0090); NMR services at the Centro de Investigación Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). P0-0 (R0-6) Structural basis for the recruitment and activation of the Legionella phospholipase VipD by the host GTPase Rab5 Maria Lucas, Andrew H. Gaspar 2, Chiara Pallara 3, Ander Vidaurrazaga, Adriana L. Rojas, Matthias P. Machner 2, Aitor Hierro CIC biogune, Derio, ES, 2 Cell Biology and Metabolism Program, National Institute of Health, Bethesda, US, 3 Barcelona Supercomputing Center, Barcelona, ES A challenge for microbial pathogens is to assure that their translocated effector proteins modulate only the correct host cell compartment during infection. The Legionella pneumophila effector protein VipD localizes to early endosomal membranes and alters their lipid and protein composition, thereby protecting the pathogen from endosomal fusion. This process requires the phospholipase A (PLA) activity of VipD that is triggered specifically upon binding to the host cell GTPase Rab5, a key regulator of endosomes. Here, we present the crystal structure of VipD in complex with constitutively active Rab5 and reveal the molecular mechanism underlying PLA activation. An active site-obstructing loop that originates from the C-terminal domain of VipD is repositioned upon Rab5 binding, thereby exposing the catalytic pocket within the N-terminal PLA domain. Substitution of amino acid residues located within the VipD- Rab5 interface prevented PLA activation and caused a failure of VipD mutant proteins to target to Rab5-enriched endosomal structures within cells. Experimental and computational analyses confirmed an extended VipDbinding interface on Rab5 that explains why this L. pneumophila effector can compete with cellular ligands for Rab5 binding. Together, our data explain how the catalytic activity within microbial effectors can be precisely linked to their subcellular localization. P0r- Electrostatic effects in the folding of the SH3 domain of the c-src tyrosine kinase: phdependence in 3D-domain swapping and amyloid formation Julio Luis Bacarizo Roa, Ana Cámara Artigas, Sergio Martínez Rodríguez 2, José Luis Neira Faleiro 3, José Manuel Martín García, Montserrat Andújar Sánchez, Emilia Ortíz Salmerón Universidad de Almería, Aguadulce, ES, 2 Universidad de Granada, Almería, ES, 3 Universidad Miguel Hernández, Elche, ES The SH3 domain of the c-src tyrosine kinase (c-src-sh3) aggregates to form intertwined dimers and amyloid fibrils at mild acidic phs. In this work, we show that a single mutation of residue Gln28 of this SH3 domain has a significant effect on: (i) its thermal stability; and (ii) its propensity to form amyloid fibrils; the Gln28Glu mutant forms amyloid fibrils at neutral ph but not at mild acidic ph, while Gln28Lys and Gln28Arg mutants do not form these aggregates under any of the conditions assayed. We have also solved the crystallographic structures of the wild-type (WT) and Gln28Glu, Gln28Lys and Gln28Arg mutants from crystals obtained at different phs. At ph 5.0, crystals belong to the hexagonal space group P6522 and the asymmetric unit is formed by a chain of the protomer of the c-src-sh3 domain in an open conformation. At ph 7.0, crystals belong to the orthorhombic space group P222, with two molecules at the asymmetric unit showing the characteristic fold of the SH3 domain. Analysis of these crystallographic structures shows that the residue at position 28 is connected to Glu06 at the diverging β-turn through a cluster of water molecules. Changes in this hydrogen-bond network leads to the displacement of the c-src-sh3 distal loop, also resulting in conformational changes of Leu00 that might be related to the binding of proline rich motifs. Our findings show that electrostatic interactions and solvation of the residues close to the folding nucleation site of the c-src-sh3 domain might play an important role during folding reaction and amyloid fibril formation. Acknowledgements: This research was funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness and FEDER (EU) [BIO2009-326-C02-0/02 BIO202-39922-C02-0/02, CTQ203-4493 and CSD2008-00005], Andalusian and Valentian Regional Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and P0-CVI-595; Prometeo 203/08]. Data collection was supported by European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, France) [BAG proposals MX-406 and MX-54] and ALBA (Barcelona, Spain) [proposals 20200072 and 20200378]. This work has been performed by members of the research groups BIO-328 Protein Structures of the Andalusian Regional Government (Spain). We thank the staff at the ID4-4 beamline of the ESRF (Grenoble, France) and specially we would also like to thank the beam line XALOC from the Spanish Synchrotron Radiation Facility ALBA and Jordi Juanhuix, Jordi Benach and Fernando Gil for their assistance in the measurement of the crystals. P0r-2 Structural approaches on YIH: a protein involved in protein synthesis control under stravation conditions Sara Zamora Caballero, Jerónimo Bravo Sicilia, Bertrand Séraphin 2 Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES, 2 IGBMC, Illkirch, FR Protein synthesis is an essential and complex process that is susceptible to different environmental situations. One of them might be the accumulation of uncharged trnas due to starvation, leading to the activation of a cell response that affects general protein synthesis. The proposed mechanism requires GCN2 binding to GCN, being this interaction mediated by the GCN2 RWD domain. Once these two proteins have interacted, the complex binds to the ribosome, what is essential for the detection of empty trnas; since GCN is thought to facilitate the transfer of uncharged trnas from the ribosome to the histidyl trna synthetase like domain of Gcn2. This signal activates the kinase domain of GCN2, leading EIF2α phosphorylation, which promotes the translation of some determinant transcription activators of amino acid biosynthetic genes and also represses general protein synthesis. YIH (yeast IMPACT homolog ) also contains a RWD domain that interacts with GCN through the same region as GCN2, thus competing with GCN2 for GCN binding and down-regulating GCN2 activation. Our aim is to elucidate the crystal structure of the YIH-GCN complex. Here we present the crystallization trials of this complex and also, the C-terminal structure of a fungi YIH homolog. This C-terminal belongs to the UPF 0029 group in Pfam with unknown functions described. It is conserved in both procariotes and eucariotes. This domain is organized as beta-alpha-beta-beta-alpha-beta, similar to a ferredoxin like domain. P0r-3 Melanocortin receptor (MCR) variants and human pigmentation phenotypes. Characterization of a MCR mutant from a family with hypopigmentation of skin and hair Julia Sirés-Campos, Marta Abrisqueta González, Celia Jiménez- Cervantes, José Carlos García-Borrón Martínez, Conchi Olivares Sánchez Universidad de Murcia, Murcia, ES Melanocortin receptor (MCR) is a Gs protein-coupled receptor (GPCR) expressed on the surface of melanocytes and crucial for the 89

Pósters XXXVII Congreso SEBBM regulation of its proliferation and function. Upon binding melanocortins, MCR activates the camp pathway, ultimately leading to synthesis of photoprotective eumelanins. Conversely, defective signaling is associated with pheomelanogenesis. MCR gene is highly polymorphic and differences in signaling by MCR variants result in diverse human skin pigmentation and skin cancer susceptibility. The MCR is sevenpass integral transmembrane protein with the canonical GPCRs structure. The C-terminal domain may play an important role in receptor trafficking, functional coupling and regulation of signaling. We have analyzed for function a new natural nonsense mutation resulting in the premature truncation of the C-terminal tail. This p.y298* mutation was found in human family with hypopigmentation. Deletion of the complete cytoplasmic C-terminus in the mutant protein reduced functional coupling to the camp pathway to almost undetectable levels. The residual activity was lower for p.y298* than for most hypomorphic red hair color-associated alleles. The electrophoretic pattern was similar for the p.y298* and wildtype proteins, indicative of comparable posttranslational processing and oligomerization. Significant expression of the p.y298* variant on the cell surface was detected by ELISA in nonpermeabilized heterologous cells and confirmed by confocal microscopy, thus challenging the current view of the role of the MCR C-terminus in forward trafficking through the biosynthetic-secretory pathway. However, the intracellular half-life of the p.y298* mutant in transiently transfected cells was shorter, compared with wildtype, suggesting sensitivity to proteolytic digestion and a faster turnover. P0r-4 Structural characterization of the β-propeller domain of Erb, an essential protein in eukaryotic ribosome biogenesis Marcin Wegrecki, Jerónimo Bravo Instituto de Biomedicina de Valencia - CSIC, Valencia, ES Erb (Bop in mammals) is a eukaryotic protein essential in ribosome biogenesis. Altogether with Nop7 and Ytm it forms a stable complex that participates in early steps of rrna processing and is necessary for the proper maturation of the 60S ribosomal subunit although its exact implication in the process remains unknown. The amino terminal part of Erb harbors a poorly characterized domain (BopNt) which is directly responsible for its function and binding to Nop7, whereas the carboxyterminus of the protein contains a big β-propeller domain that is formed by seven WD repeats. It has been postulated that this C-terminal region is not directly involved in the main function of the protein during 60S synthesis; nevertheless it is well conserved within the Erb/Bop family and provides an extensive surface for possible protein-protein and protein- RNA interactions. In total, 22 pre-ribosomal factors contain a β-propeller domain in their structure indicating that it is one of the most common folds that maintain the complex network of interactions required for the 60S assembly. Here we present the crystal structure of the β-propeller domain of Erb from Saccharomyces cerevisiae at.6å (residues 47-807) that was obtained as a result of random proteolysis event during crystallization trials of Erb/Nop7 dimer. The structural information allowed us to exactly define the boundaries of the domain and to describe its particular features, being the presence of a long insertion within the second WD repeat the most distinctive characteristic. This additional segment forms a protrusion on the surface of the propeller and may play an important role in peptide binding. We conclude that the proper folding of the insertion is determined by the neighboring blades of the propeller. The analysis of the electrostatic surface and conserved hot-spot residues allows us to predict the patches that might be involved in protein-protein interactions. At last, we show that the propeller binds to RNA through a defined surface that can be saturated. P0-5 Estudio estructural de dutpasas diméricas virales Elisa Maiques, Jordi Donderis, Ilty Mehmedov, María Angeles Tormo-Más 2, María García 2, José R. Penadés 3, Alberto Marina Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, 2 Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA-IVIA), Segorbe, ES, 3 Institute of Infection, Immunity, and Inflammation, College of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Las dutpasas (Dut) son enzimas presentes en todos los organismos, responsables de mantener los niveles celulares de dutp bajos, al hidrolizar este nucleótido a dump y pirofosfato. Según su estado de oligomerización, las Dut se clasifican en tres grupos, monoméricas, diméricas y triméricas. Tanto las Dut monoméricas como las triméricas, a pesar de no tener una elevada homología a nivel de secuencia, presentan un plegamiento similar formado por hojas betas que generan un centro activo común. En cambio, las Dut diméricas son proteínas cuya estructura secundaria está formada por α-hélices, por tanto, con un plegamiento diferente al de las otras Dut. Además, las propiedades bioquímicas de las enzimas pertenecientes a este grupo también difieren de otras Dut, siendo capaces de hidrolizar tanto dutp como dudp. Aunque las Dut diméricas son un grupo menor dentro de la familia, son las que presentan patógenos como Leishmania major, Trypanosoma cruzi y Campylobacter jejuni. Diferentes bacteriófagos de Staphylococcus aureus presentan este tipo de Dut diméricas, mientras que otros presentan las más predominantes Dut triméricas. Las Dut triméricas han sido ampliamente caracterizadas a nivel estructural, habiendo estructuras de todos los reinos, desde virus hasta el hombre, incluyendo Dut de fagos de S. aureus, donde nuestro grupo ha contribuido de forma importante. Por el contrario, la caracterización estructural de Dut diméricas se reduce a pocos ejemplos. En esta comunicación presentaremos trabajo reciente del laboratorio que nos ha permitido resolver la estructura tridimensional de 3 Dut diméricas de diferentes fagos S. aureus, ϕdi, ϕo y ϕ55, en sus formas Apo y unidas a dumpnpp. La comparación de estas estructuras entre sí, y con los pocos ejemplos depositados en el PDB, nos han permitido delimitar un módulo mínimo compuesto por 4 α-hélices implicadas en el reconocimiento e hidrólisis del nucleótido. A este núcleo básico se suman múltiples inserciones variables en secuencia y tamaño cuya implicación en la catálisis y/o otras funciones será discutida en la presentación. P0-6 Structural and dynamic study of the response regulator CheY3 from the R. sphaeroides chemotaxis network Lorena Varela, Christian Bell, Judith Armitage, Christina Redfield Universidad de Oxford, Oxford, UK The process by which bacteria bias their motility, enabling them to move towards favourable chemical stimuli and away from unfavourable ones, is known as chemotaxis. The chemotaxis signalling network of E. coli. depends on autophosphorylation of a histidine protein kinase (HPK) in response to a signal from a sensor domain, with subsequent transfer of the phosphoryl group to an aspartate on response regulator (RR) proteins that bind to the flagellar motor and alter its rotation. CheY is a simple 4kDa single domain RR that is conserved across motile species. It is formed by 5 alpha-helices and 5 beta-strands surrounding a conserved phosphoryl accepting aspartate residue, and once phosphorylated diffuses to the flagellar motor, binding to its FliM component to cause switching of rotational direction and, hence, a change from smooth-swimming to tumbling. The photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides has multiple chemosensory pathways formed by homologues of the E. coli chemosensory 90

Granada 204 Pósters proteins. It has six homologues of the response regulator CheY and they all have different effects on chemotaxis. In this work we have used solution-state NMR methods to answer important questions about the structure, dynamics and function of the 6 highly homologous CheYs from R. sphaeroides. We have performed a detailed study on how conditions (Mg +2 and BeF 3 concentrations, ph) affect the structure and function of the CheY3 protein. Under conditions where CheY3 is inactive (no BeF 3 bound) and at low ph we have detected one minor and one major protein conformation and upon ph increase these populations are inverted and finally only one species is present. We have observed that only at high ph is Mg +2 required for the protein to bind BeF 3, a phosphorylation mimic, and the affinity for Mg +2 is considerably higher than at low ph. We have evidence for the presence of two binding sites for Mg +2, one with very high affinity and one with lower affinity locatedclose to the BeF 3 binding site. We have also investigated backbone dynamics of the inactive and active forms of CheY3 using heteronuclear NOE experiments and no significant differences have been observed suggesting that the flexibility of both conformations is similar. Finally, we have assigned the backbone resonances of CheY3 in their inactive and active states using tripleresonance NMR methods and information about secondary structure has been obtained from the analysis of H, 3 C and 5 N chemical shifts using TALOS as well as CD experiments. P0-7 Biophysical characterization of the L-isoaspartyl O-methyltransferase from Escherichia coli Emilio José González Ramirez, Sergio Martínez-Rodriguez 2, Emilia Ortiz-Salmerón, Montserrat Andújar-Sánchez, Ana Cámara-Artigas Departamento de Química y Física, Escuela Politécnica y Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Almería, Almería, ES, 2 Departamento de Química y Física, Universidad de Granada, Granada, ES The protein L-isoaspartyl O-methyltransferase (PIMT) is a highly conserved enzyme found in a wide diversity of organisms, including plants, insects, bacteria, and mammals. Its function is to recognize L-Isoaspartyl residues in proteins and revert to L-aspartyl residues. This action takes places by the transfer of a methyl group from S-adenosyl-Lmethionine (AdoMet) to the α-carboxyl of the L-isoaspartyl group, which forms a succinimide, and subsequent hydrolysis converts a fraction of these residues to aspartyls [].There are several studies on E.coli PIMT (EC-PIMT) functional features, but the knowledge about its biophysical behavior is scarce. We have performed a biophysical characterization of this enzyme by using spectroscopic techniques. Our results shows that E.Coli PIMT is monomeric in all the range of ph assayed (2-2) and protein concentration (-0 mg ml-) at temperatures below 45 o C. We have also characterized the stability of the protein by means of fluorescence emission. Our results show that the protein denaturizes at urea concentrations higher than 2.5 M. Acknowledgment: This research was funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness and FEDER (EU) [BIO202-39922-C02-0/02], Andalusian Regional Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and P0- CVI-595]. This work has been performed by members of the research groups BIO-328 Protein Structures of the Andalusian Regional Government (Spain). References [] Fang, P., Li, X., Wang, J., Xing, L., Gao, Y., Niu, L., Teng, M., (200) Crystal Structure of the Protein L-Isoaspartyl Methyltransferase from Escherichia coli. Cell Biochem Biophys 58, 63 67. P0-8 Characterization of canine adipose derived mesenchymal stem cell population: expression of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 Guillermo Mejías Martínez, Leticia G. León 2, Maria Luisa Fermín 3, Elena Merino, Cristina Fragío 3, Elisabeth Kremmer 4, Concepción Tejero Ortego Department of Biochemistry and Molecular Biology IV, Veterinary Faculty (UCM), Madrid, ES, 2 Center of Biomedical Investigations from Canarias (CIBICAN) - Institute of Biomedical Technologies (ITB) (ULL), La Laguna, ES, 3 Department of Animal Medicine and Surgery, Veterinary Faculty (UCM), Madrid, ES, 4 Institut für Immunologie, GSF-Forschungszentrum Umwelt und Gesundheit, München, DE Adult mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells able to differentiate into adipogenic, condrogenic and osteogenic lineages. Initially MSC source has been bone marrow, however currently adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) has been shown as an interesting alternative source, making these cells particularly attractive for therapeutic exploitation.the aim of this work was to develop an easy-to-use protocol to isolate and characterize canine MSCs from adipose tissue. In addition, considering the role of MMP-2 and MMP-9 in migration and facilitating homing to the injured tissue, a study of its expression has been done. Peritoneal fat was obtained from clinically healthy bitches at the time of elective ovariohysterectomy, digested with collagenase I and then isolated by centrifugation and filtration. cmscs were cultured in IMDM medium at 7000 cell/cm 2 with 0% dog serum at 38ºC, 5% CO 2 and 90% air humidity. In vitro growth is exponential until 25-30 days, and doubling time of all samples studied remains constant throughout -4th passages. Dot plot of stained cmsc after incubation with primary antibodies reveal that these cells had positive results for CD90 and negative for CD34, CD45 and MHC-II. Gelatin zymografy reveal the expression of MMP-2 and MMP-9. In conclusion, we have isolated and characterized a canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells population. As far as we know, we provided the first evidence that canine mesenchymal derived adipose cells constitutively express MMP-2 and MMP-9. Further investigations on cmsc differentiation into specific tissues may lead to the development of novel therapeutic strategies to target specific diseases. P0r-9 Inhibition of Type IV secretion ATPase TrwD by unsaturated fatty acids as a potential tool to prevent wide spread dissemination of antibiotic resistance genes Yolanda García Cazorla, Jorge Ripoll Rozada 2, Cristina Machón 3, María Getino, Fernando de la Cruz, Elena Cabezón, Ignacio Arechaga Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, e Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC), CSIC-UC-IDICAN, Santander, ES, 2 Instituto de Biología Molecular e Celular (IBMC), Porto, PT, 3 Instituto de Investigación Biomédica- IRB, Barcelona, ES Antibiotic resistance has become a major health issue []. Unfortunately, the development of new antibiotics is being very slow and expensive and we are running out of weapons to fight against the appearance of multi-resistant bugs. Bacterial conjugation is the main mechanism for the wide spread dissemination of antibiotic resistance genes and, therefore, the search of specific inhibitors of conjugation (COINs) could become a brand new strategy in this warfare. In the search of potential COINs, previous studies have reported that unsaturated fatty acids (ufas) were able to inhibit conjugation [2]. Based on these studies we have looked for the molecular targets of these compounds and we have found that the Type IV secretion ATPase TrwD is inhibited 9

Pósters XXXVII Congreso SEBBM by linoleic acid and 2-alkynoic fatty acids, such as the 2-hexadecynoic acid. These two ufas compounds were the most effective inhibitors in R388 plasmid conjugation [3]. The inhibitory effect is specific for the traffic ATPase TrwD, as the remaining ATPases of the Type IV secretion system are unaffected by both ufas and 2-AFAs. We have characterized the inhibition mechanism and we have found that in both cases it is a non-competitive inhibition, as the affinities for the substrate (ATP) and product (ADP) are not altered in the presence of the fatty acids. Altogether, these results could open new avenues in the development of new strategies to prevent the dissemination of antibiotic resistance genes. References [] Sommer M.O. (204). Microbiology: Barriers to the spread of resistance. Nature. Doi: 0.038. [2] Fernandez-Lopez R. et al. (2005) Unsaturated fatty acids are inhibitors of bacterialconjugation. Microbiology. 5, 357 3526. [3] Getino M. et al. (204) 2-alkynoic fatty acids as chemically stable conjugation inhibitors. (Submitted) P0-20 A triple mutant of human, Mn(II)-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase (ADPRibase-Mn) displays cyclic ADP-ribose (cadpr) phosphohydrolase as its major activity Iralis López-Villamizar, Alicia Cabezas, José Canales, Ascensión Fernández, Rosa María Pinto, João Meireles Ribeiro, Joaquim Rui Rodrigues 2, María Jesús Costas, José Carlos Cameselle Grupo de Enzimología, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Extremadura, Badajoz, ES, 2 Escola Superior de Tecnologia e Gestão, Instituto Politécnico de Leiria, Leiria, PT ADPRibase-Mn (EC 3.6..53) belongs to the metallo-dependent phosphatases superfamily, where it forms a family of its own (SCOP2 ID 4002589). Rat and human ADPRibase-Mn hydrolyze ADP-ribose (A), CDP-choline (B) and 2,3 -camp (C) with decreasing efficiencies (kcat/km). They also display a unique cadpr phosphohydrolase activity much less efficient than the activities on the other substrates [- 3]. Zebrafish ADPRibase-Mn has similar specificity but is inactive on cadpr [3]. Mutagenesis of human ADPRibase-Mn showed that Phe 37 is a determinant of the preference for A, due to a hydrophobic interaction with the nitrogenous base, not evident with B, C or cadpr in docking simulations. The F37A mutant exhibited, versus the wild type, a 50- fold decrease of efficiency on A, much less marked (only 3-5 fold) on B, C and cadpr. The double mutant F37A+L96F showed stronger decreases of efficiency on A, B and C, but not on cadpr. In contrast, the C253A mutation had a weak stimulatory effect with A, Band C, much stronger with cadpr. Finally, the triple mutant F37A+L96F+C253A was preferentially active on cadpr. While the wild-type is 50-, 40- or 6-fold more efficient on A, B or C than on cadpr, the triple mutant was 2.9-,.3- or 7.2-fold more efficient on cadpr than on A, B or C. The change of specificity included, in absolute terms, a 7-fold increase of the cadpr phosphohydrolase efficiency over the wild type. Further mutagenesis could perhaps generate an even more specific cadpr phosphohydrolase. References [] Canales et al., 2008, Biochem. J. 43, 03. [2] Canales et al., 2009, FEBS Lett. 583, 593. [3] Rodrigues et al., 202, PloS ONE 7, e42249. Support: Gobierno de Extremadura and FEDER (GR033). P0-2 Tyrosinase-catalyzed hydroxylation of hydroquinone, a depigmenting agent, to hydroxyhydroquinone: a kinetic study María del Mar García Molina, Jose Luis Munoz-Munoz 2, Miguel Angel Maria Solano 2, Jose Berna, Francisco Garcia-Canovas 2 Universidad de Murcia, Albatera, ES, 2 Universidad de Murcia - Grupo GENZ, Murcia, ES Hydroquinone (HQ) is used as a depigmenting agent. In this work we demonstrate that tyrosinase hydroxylates HQ to 2-hydroxyhydroquinone (HHQ). Oxy-tyrosinase hydroxylates HQ to HHQ forming the complex met-tyrosinase-hhq, which can evolve in two different ways, forming deoxy-tyrosinase and p-hydroxy-o-quinone, which rapidly isomerizes to 2-hydroxy-p-benzoquinone or on the other way generating mettyrosinase and HHQ. In the latter case, HHQ is rapidly oxidized by oxygen to generate 2-hydroxy-p-benzoquinone, and therefore, it cannot close the enzyme catalytic cycle for the lack of reductant (HHQ). However, in the presence of hydrogen peroxide, met-tyrosinase (inactive on hydroquinone) is transformed into oxy-tyrosinase, which is active on HQ. Similarly, in the presence of ascorbic acid, HQ is transformed into 2-hydroxy-p-benzoquinone by the action of tyrosinase; however, in this case, ascorbic acid reduces met-tyrosinase to deoxy-tyrosinase, which after binding to oxygen, originates oxy-tyrosinase. This enzymatic form is now capable of reacting with HQ to generate p-hydroxy-o-quinone, which rapidly isomerizes to 2-hydroxy-p-benzoquinone. The formation of HHQ during the action of tyrosinase on HQ is demonstrated by means of high performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC- MS) by using hydrogen peroxide and high ascorbic acid concentrations. We propose a kinetic mechanism for the tyrosinase oxidation of HQ which allows us the kinetic characterization of the process. A possible explanation of the cytotoxic effect of HQ is discussed. P0-22 Crystallographic structure of the first WW domain of Human YAP2 isoform Ana Camara-Artigas, Julio Bacarizo, Sergio Martínez-Rodríguez 2 Department of Chemistry and Physics, University of Almería, Agrifood Campus of International Excellence (ceia3), Almería, ES, 2 Department of Physical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, Granada, ES The WW domain is a small modular domain (approximately 35-40 residues) that takes its name from the presence of two highly conserved tryptophan residues. These domains were first identified in the Yes tyrosine kinase Associated Protein (YAP), and since their discovery they became focus of attention as they have been related to several important human diseases such as Cancer, the Liddle s syndrome, Alzhehimer s, Huntington s and viral diseases. Two major isoforms of YAP have been described in human tissues, namely YAP and YAP2, containing one and two WW domains, respectively. Up to date, most of the available WW domain structures have been obtained in solution by NMR techniques, and very few structures of WW domains have been solved by X-ray diffraction. These domains show an intrinsic conformational flexibility which difficult the formation of crystal contacts and, therefore, their crystallization. We have solved the first crystallographic structure of the first WW domain of the h-yap2 at.6 Å resolution in its apo form. The high quality of the data allowed us to model residues 65-208. The Ramachandran plot shows 00% of the residues in the preferred regions. The interactions that stabilize this minimal modular domain have been analyzed, showing that besides Trp77, which together with Pro202 and Phe89 form an aromatic cluster in the hydrophobic core of the protein, some salt-bridges might play a key role in their folding reaction. Furthermore, this structure allows us to explore for the first time the conformational changes that take place in this domain upon binding of Proline Rich Motifs. 92

Granada 204 Pósters P0r-23 (R0-5) A common signalosome for programmed cell death in humans and plants Katiuska González-Arzola, Jonathan Martínez-Fábregas, Antonio Díaz-Quintana, Simon Janocha 2, Rita Bernhardt 2, Adrián Velázquez-Campoy 3, Irene Díaz-Moreno, Miguel Ángel De la Rosa Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2 Institut für Biochemie, Universität des Saarlandes, Campus B2.2, Saarbrücken, DE, 3 Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems (BIFI), Joint-Unit IQFR-CSIC-BIFI, Department of Biochemistry and Molecular and Cell Biology, University of Zaragoza, Zaragoza, ES Programmed cell death (PCD) is a fundamental event for the development of multicellular organisms. In mammalian cells, early events in PCD involve the release of cytochrome c (Cc) from mitochondria to the cytoplasm to act at the first stages of the apoptotic process, playing a key role in assembling the apoptosome. In plants, PCD is part of a general process named hypersensitive response, where Cc is also released into the cytosol but its role in PCD remains veiled. Such highly conserved cytoplasmic location of Cc upon apoptotic stimuli lead to think of a common link for PCD in evolutionarily distant species, like humans and plants. To better understand the role of Cc in the onset of PCD in both humans and plants, a proteomic approach based on affinity chromatography with Cc as bait was used. Upon combining this approach and Bimolecular Fluorescence Complementation (BIFC), a total of 8 human and 9 plant new proteins interacting with Cc under PCD were found [,2]. These new PCD Cc-partners are involved in protein folding, translational regulation, oxidative stress, DNA damage, energetic and mrna metabolism. Strikingly, some of the novel human Cc-targets are closely related to those for plant Cc, indicating that the evolutionarily well-conserved cytosolic Cc appearing in organism from plant to mammals- interact with a wide range of targets on PCD. Modeling of the complexes between human and plant Cc with its counterparts shows how the heme crevice of Cc takes part of the complex interface in agreement with the vast majority of known redox adducts of Cc. However, in contrast to the high turnover rate of the mitochondrial Cc redox adducts, those occurring under PCD lead to the formation of rather stable nucleo-cytoplasmic ensembles, as inferred from Surface Plasmon Resonance (SPR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) measurements. On the basis of these findings, we suggest that human and plant Cc interacts with pro-survival, anti-apoptotic proteins after its release into the cytoplasm. Then, Cc may interfere with cell survival pathways and unlock PCD in order to prevent the spatial and temporal co-existence of antagonist signals. References [] Martínez-Fábregas, J. et al. (203). Mol. Cell. Proteomics, 2: 3666-3676. [2] Martínez-Fábregas, J. et al. (204). Mol. Cell. Proteomics, doi:0.074/ mcp.m3.034322. P0-24 Assessing the performance of ancestral protein reconstruction Sergio Martínez-Rodríguez, Valeria Alejandra Risso, José Manuel Sánchez-Ruiz Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES Ancestral sequence reconstruction is a protein engineering methodology exploiting natural sequence diversity to obtain protein variants with enhanced characteristics [], and has also been suggested to allow inferring features of the physical environment in which ancient organisms evolved [2]. After successful evaluation of this approach for the design of resurrected Precambrian β-lactamases [3], we wanted to further confirm the performance of this evolutionary phylogeny method analyzing the properties of additional resurrected ancestral β-lactamases standing in the evolutionary path among Firmicutes and Actinobacteria phyla, encoding proteins dating back between ~.4 and ~2.9 billion years (Gyr). This alternative evolutionary reconstruction also produced β-lactamases with higher in vitro denaturation temperatures (~25 C) and higher substrate promiscuity than modern β-lactamases. In vivo studies showed that the resurrected enzymes provided actual Escherichia coli cells with higher resistance to different third-generation antibiotics, providing us with plausible evolutionary scenarios for actual microorganisms antibiotic resistance. Our results reinforce the virtues of ancestral protein reconstruction as a biotechnological cornerstone for the molecular design of engineered enzymes. Furthermore, our denaturation experiments suggest a different evolutionary environment for ancestral Gram-positive bacteria, in full agreement with the inferred colonization of land environments by Actinobacteria/Firmicutes at some point at the end of the Archean period [4]. References [] Cole MF, Gaucher EA. Utilizing natural diversity to evolve protein function: applications towards thermostability. Curr Opin Chem Biol. (20) 5(3):399-406. [2] Gaucher EA, Thomson JM, Burgan MF, Benner SA. Inferring the palaeoenvironment of ancient bacteria on the basis of resurrected proteins. Nature (2003) 425(6955):285-288. [3] Risso VA, Gavira JA, Mejia-Carmona DF, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz JM. Hyperstability and substrate promiscuity in laboratory resurrections of Precambrian β-lactamases. J Am Chem Soc. (203) 35(8):2899-902. [4] Battistuzzi FU, Hedges SB. A major clade of prokaryotes with ancient adaptations to life on land. Mol Biol Evol (2009) 26(2):335-343. P0r-25 Caracterización físico-química y funcional del citocromo c 6-3 de la cianobacteria Nostoc sp. PCC 79 Alejandro Torrado Maya, Leonor Puerto-Galán, Manuel Hervás, Jose A. Navarro, Fernando Publio Molina-Heredia Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC, ciccartuja, Sevilla, ES En cianobacterias, las cadenas de transporte de electrones fotosintética y respiratoria están localizadas en el mismo compartimento celular y comparten algunos componentes, como son la plastocianina (Pc) o el citocromo (Cit) c 6 y el complejo b 6 -f. Se ha propuesto que en estos organismos el Cit c 6 y la Pc podrían transportar los electrones alternativamente desde el complejo b 6 -f al Fotosistema I (PSI) o a la Cit c oxidasa. Además de Cit c 6 y Pc, en cianobacterias se han encontrado otros posibles transportadores solubles de electrones, localizados en el lumen tilacoidal, cuya función aún no ha sido bien establecida, como son el Cit c 6-2 y el Cit c M. A partir de un análisis de secuencias génicas en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, hemos encontrado otra proteína que podría intervenir en estos procesos: el Cit c6-3. En estos organismos, la fijación de nitrógeno atmosférico se produce en unas células especializadas denominadas heterocistos. En estas células, debido a que la nitrogenasa se inhibe por O 2, la tasa respiratoria es muy alta, con el fin de crear un ambiente anoxigénico. En este trabajo hemos abordado la caracterización físico-química y el análisis funcional del Cit c 6-3. Esta proteína no es capaz de interaccionar eficientemente con el PSI, por lo que no parece actuar en fotosíntesis. En cambio, sí reduce específicamente a determinadas oxidasas terminales en los heterocistos, por lo que proponemos que podría tener un papel relevante en respiración. 93

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P0-26 Structural and thermodynamic characterization of the interaction between viral late domains and their cellular targets Pedro Buzón, Manuel Iglesias-Bexiga, Francisco Castillo, Andrés Palencia, Maria J. Macias 2, Francisco Blanco 3, Ana Camara- Artigas 4, Irene Luque Department of Physical Chemistry, University of Granada, Granada, ES, 2 Structural and Computational Biology Programme, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, ES, 3 Structural Biology Unit, CIC biogune, Parque tecnológico de Bizkaia, Deiro, ES, 4 Department of Physical Chemistry, Biochemistry and Inorganic Chemistry, University of Almería, Almería, ES Many viruses encode a late budding domain (L-domain) in their sequence. These L-domains usually contain highly conserved motifs known to mediate cellular protein-protein interactions, such as PPXY and PTAP. These motifs are essential for the recruitment of the cellular machinery sequestered by the virus for replication inside the infected cell. The budding process, which is mediated by the ubiquitin-proteasome system, has been proposed as a potential target to inhibit viral replication. We present here a structural and thermodynamic characterization of the interactions between a set of peptide ligands corresponding to L-domains sequences from different viruses (including Ebola, HTLV-, Rabies, Marburg and HIV- ) and their cellular targets (the UEV domain of htsg0 and the WW domains of hnedd4) aimed at understanding the molecular determinants of binding affinity and specificity in these systems. Our work reveals that the establishment of networks of water-mediated hydrogen bonds at the binding interface and the reorganization of the conformational distribution in both protein and ligand upon complex formation are important features determining the thermodynamic signature of these interactions, that need to be taken into account for a full understanding of these systems. The work presented suggests that combining a detailed structural and thermodynamic analysis with screening and molecular biology techniques can provide very valuable information for the design of specific and high affinitty inhibitors as potential broad spectrum antivirals. P0-27 Structural insights into the Ca +2 and PI(4,5)P2 binding modes of the C2 domains of rabphilin 3A and synaptotagmin María Dolores Pérez Sánchez, Teresa Coronado-Parra 2, Jaime Guillén 2, Juan C. Gómez-Fernández 2, Nuria Verdaguer 3, Senena Corbalán-García Dpto. Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de Murcia, Jumilla, ES, 2 Dpto de Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de Murcia, Murca, ES, 3 Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES Proteins containing C2 domains are the sensors for Ca +2 in myriad of secretory pathways. Here, we have determined the structure of this domain in complex with PI(4,5)P 2 and IP 3 at resolutions of.75 and.9 Å, respectively, unveiling that the polybasic cluster formed by strands β3- β4 is involved in the interation with the phosphoinositides. A comparative study demonstrates that the C2A domain is highly specific for PI(4,5)P 2 / PI(3,4,5)P 3, whereas the C2B domain cannot discrimiate among sny of the diphosphorylated forms. Structural comparisons between C2A domains of rabphilin 3A and synaptotagmin indicated the presence of a key glutamic residue in the polybasic cluster of synaptotagmin that abolishes the interaction with PI(4,5)P 2. Together, these results provide a structural explanation for the ability of different C2 domains to pull plasma and vesicle membranes close together in a Ca +2 -dependent manner and reveal how this family of proteins can use subtle structural changes to modulate their sensivity and specificity to various cellular signals. P0-28 Estudio estructural y funcional de la fosfatasa MG207 de Mycoplasma genitalium Patricia Casino Ferrando, Ana M. Martínez Martínez Mariscal 2, Alberto Marina 3, Jaume Piñol 2, Ignacio Fita Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, 2 Departamento de Bioquímica i Biología Molecular, Institut de Biotecnología i Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra- Barcelona, ES, 3 Departmento de genómica y proteómica, Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES Mycoplasma genitalium es una bacteria parasitaria con genoma mínimo (~580Kb) implicada en infecciones urogenitales, del endometrio y síndrome pélvico inflamatorio; carece de pared celular y por tanto no es sensible a antibióticos que bloquean la síntesis de ésta como la penicilina y los betalactámicos []. La movilidad de estas bacterias se realiza por deslizamiento gracias a una membrana que sobresale del polo de la bacteria llamada organela terminal y que está implicada en adherencia celular. En Mycoplasma pneumoniae, se ha correlacionado la función quinasa/ fosfatasa con la movilidad, de forma que mutaciones en la serín/treonina prkc (MPN248) y su fosfatasa prpc (MPN247) producen cambios en la movilidad así como cambios en el patrón de fosforilación de proteínas de la organela terminal, HMW y HMW2 [2]. Acorde al tamaño de su genoma, M. genitalium contiene muy pocas proteínas señalizadoras y tan sólo cuatro ORFs han sido anotadas como fosfatasas, la proteína fosfatasa 2C (MG_08), dos serine/treonín fostatasas (MG_207 y MG_246) y la pirofosfatasa inorgánica (MG_35). Recientemente, se demostró in vivo que la fosfatasa MG_207 estaba implicada en virulencia, ya que la cepa knockout en MG_207 era menos virulenta, su adherencia a células eucarióticas era menor y presentaba un patrón de proteínas fosforiladas diferente a la silvestre [3]. Con el fin de caracterizar la fosfatasa MG207 hemos obtenido, por cristalografía, su estructura tridimensional que muestra un plegamiento a/β característico de fosfodiesterasas, además el estudio funcional demuestra que MG207 presenta tanto actividad fosfatasa como fosfodiesterasa. En el centro activo se observó la presencia de dos metales y un sulfato y hemos confirmado que las actividades fosfatasa y fosfodiesterasa son modulables dependiendo de la presencia de cationes divalentes, siendo los metales de transición Mn 2+, Ni 2+ y Fe 2+ quienes especialmente activan esta enzima. Bibliografía [] Anagrius C, Loré B, Jensen JS. Treatment of Mycoplasma genitalium. Observations from a Swedish STD clinic. PLoS One. 203;8(4):e648. [2] Page CA, Krause DC. Protein kinase/phosphatase function correlates with gliding motility in Mycoplasma pneumonia. J Bacteriol. 203:750-7. [3] Martinez MA, Das K, Saikolappan S, Materon LA, Dhandayuthapani S. A serine/threonine phosphatase encoded by MG_207 of Mycoplasma genitalium is critical for its virulence. BMC Microbiol. 203;3:44. P0-29 Biogénesis de ribosomas, the Backstage Gisela Pöll, Shuang Li, Uli Ohmayer, Thomas Hierlmeier, Philipp Milkereit, Jorge Pérez-Fernández Universität Regensburg, Biochemie-Zentrum Regensburg (BZR), Lehrstuhl Biochemie III, Regensburg, DE La biogénesis de ribosomas es un proceso celular que implica el procesamiento y plegamiento de los RNA ribosómicos y la incorporación de las proteínas ribosómicas. Dicho proceso es facilitado, en organismos eucariotas, por la acción de más de 50 proteínas conocidas como factores de ensamblaje. Algunos de estos factores, denominados Utp, son capaces de formar subcomplejos proteicos (UTP), que participan como entidades independientes en la biogénesis de la subunidad menor del ribosoma (40S). Dos de estos subcomplejos, tutp/utp A y UTP B participan en las primeras etapas del ensamblaje y procesamiento del RNA ribosómico. 94

Granada 204 Pósters Actualmente, se conoce la composición proteica de tutp/utp A y UTP B y su arquitectura ha sido analizada hasta ahora en base a las interacciones binarias proteína-proteína. En este trabajo presentamos una caracterización bioquímica detallada de la arquitectura de los subcomplejos tutp/utp A y UTP B. Los resultados obtenidos indican la completa reconstitución in vitro de tutp y UTP B. Además, proporcionan evidencias bioquímicas sobre la existencia de complejos binarios, ternarios o de grado superior, en consonancia con las interacciones binarias previamente descritas. Por último, los resultados sugieren que los diferentes complejos proteicos obtenidos constituyen diferentes módulos de tutp y UTP B y proporcionan un nuevo punto de vista sobre intermediarios de ensamblaje o desensamblaje de los subcomplejos UTP. P0-30 N-terminal protein tails act as aggregation protective entropic bristles: the SUMO case Patrizia Marinelli, Ricardo Graña-Montes, David Reverter, Salvador Ventura Universitat Autónoma de Barcelona, Barcelona, ES The formation of β-sheet enriched amyloid fibrils constitutes the hallmark of many diseases but is also an intrinsic property of polypeptide chains in general, because the formation of compact globular proteins comes at the expense of an inherent sequential aggregation propensity. In this context, identification of strategies that enable proteins to remain functional and soluble in the cell has become a central issue in chemical biology. We show here, using human SUMO proteins as a model system, that the recurrent presence of disordered tails flanking globular domains might constitute yet another of these protective strategies. These short, disordered, and highly soluble protein segments would act as intramolecular entropic bristles, reducing the overall protein intrinsic aggregation propensity and favoring thus the attainment and maintenance of functional conformations. P0-3 Directed evolution of acyltransferases for triglyceride production in E. coli Omar Santín, Gabriel Moncalián IBBTEC, Universidad de Cantabria, Santander, ES Wax ester synthase/diacylglicerol acyltransferase (WS/DGAT) is a family of enzymes able to perform the esterification of diacylglycerol or fatty alcohols and acyl-coa to produce triglycerides (TAGs) or wax esters, respectively. Both products can be easily transformed onto biodiesel. Although the specificity determinants of substrate recognition are still unknown and there is no crystal structure solved from any bacterial WS/ DGATs, we recently published a study where we used limited proteolysis and directed mutagenesis approaches to identify key folding domains and motifs critical for the catalysis. We have also recently patented a diacylglycerol acyltransferase (tdgat) (ES20200967) from the thermophilic organism Thermomonospora curvata that is able to produce TAGs and waxes in E. coli. We have used this system for TAG production in E.coli, but we believe it can be significantly improved through directed evolution of tdgat. Thus, the main goal of our work is to enhance TAG production in E. coli by directed evolution. Moreover, this work will provide us some information about the amino acids residues involved in substrate recognition. For this purpose we have developed a direct evolution protocol where we constructed mutant libraries by mutagenic PCR in order to obtain variants of the protein. Using Nile Red, a fluorescent dye that binds to neutral lipids we can select different variants of tdgat through a high throughput selection system based on fluorimetry and flow cytometry. Mutants carrying interesting phenotypes are further selected and sequenced. This way we were able to detect mutations that lead to a 2-fold increase in the TAG production. P0-32 Structural insights into the human Sigma- Receptor Chaperone structure and interactions Jose Luis Ortega Roldan, Felipe Ossa, Nader Amin, Jason Schnell Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK The Sigma- Receptor (SR) is a ligand-regulated membrane protein chaperone involved in the ER stress response. SR activity is implicated in diseases of the central nervous system including amnesia, schizophrenia, depression, Alzheimer s disease, and addiction. SR has been shown previously to regulate the Hsp70 BiP and the IP3R calcium channel through a C-terminal domain. It also binds and is regulated by a large number of small molecules such us psychostimulants (cocaine, methamphetamine and DMT), antidepressants, antipsychotics and steroids. We have developed methods for bacterial expression and reconstitution of the chaperone domain and a truncation construct lacking the first transmembrane domain (TM) of human SR into DPC:DPPC mixed micelles that enable its study by solution NMR spectroscopy. SR is found to contain a first TM, two helices in the cytosolic loop, followed by the second TM and a juxtaposed helix, a largely dynamic region and a structured, helical C-terminal region that encompasses a membrane associated domain containing four helices. The helical region at residues ~98-206 is strongly amphipathic and proposed to anchor the chaperone domain to micelles and membranes. Three of the helices in the C- terminal region closely correspond to previously identified cholesterol and drug recognition sites. Moreover, we show experimentally using chemical shifts, spin relaxation and H/D exchange that the second TM, whose position hasn t been predicted accurately, spans the residues 89 to and includes the entire Sterol Binding Domain Like (SBD), partially responsible for drug binding. In addition, we show that the chaperone domain interacts with full- length BiP or the isolated nucleotide binding domain (NBD) of BiP, but not the substrate binding domain, suggesting that the NBD is sufficient for SR interactions. These results, that constitute the first structural information obtained for this protein and its interactions, advance our understanding of SR and are likely to be useful in refining models of the SR drug binding sites. P0-33 Conformational distribution of the SH3-SH2 Tandem of the Abl kinase and its modulation by intramolecular interactions Carles Corbi-Verge, Fabrizio Marinelli 2, Ana Zafra Ruano, Javier Ruiz-Sanz, Irene Luque-Fernández, José D. Faraldo-Gómez 2 Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Max Planck Institute of Biophysics, Theoretical Molecular Biophysics Group, Frankfurt, DE Tyrosine kinases are involved in a wide variety of key signaling processes and are therefore tightly regulated by the cell. Indeed, numerous pathologies, ranging from cancer to neurodegeneration, result from or are associated with deficiencies in kinase regulation. Consequently, these enzymes are a prominent target for novel pharmacological strategies against human disease. This study focuses on Abl, which is one of the most ubiquitously conserved tyrosine kinases. Abl is present in all metazoa, where it plays an essential role in processes as diverse as cytoskeleton reorganization, DNA repair, and regulation of apoptosis. Accordingly, when constitutively active forms of Abl are present in normal cells, these are transformed into cancer cells. For example, in human white-blood cells, a chromosomal abnormality leads to the fusion of the bcr and abl genes, which together encode for a cytoplasm-targeted, deregulated form of Abl; Bcr-Abl interferes with the cell cycle, resulting in uncontrolled cell proliferation, and is the principal cause of chronic myeloid leukemia (CML). 95

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Regulation of Abl can be thought as a reversible equilibrium whereby the SH3, SH2 and catalytic domains are either dissociated or self-assembled in one or more configurations. External factors, such as competing interactions involving one or both regulatory domains, will bias this equilibrium in one or other direction. For Abl in particular, the significance of this mechanism is underscored by the fact that mutations that impair the correct assembly of the autoinhibited complex, either in the SH3-SH2 tandem or in the domain-domain linkers, confer CML cells with resistance against inhibitory drugs designed to target the catalytic domain of the Bcr-Abl oncogene. This outcome has prompted considerable interest in the mechanisms of allosteric regulation of Abl and other tyrosine kinases, and in the development of compounds designed to interfere with these mechanisms. In this study, we use molecular simulations, free-energy calculations and differential scanning calorimetry to study the determining factors of a necessary step in the assembly of the autoinhibited form of Abl, namely the organization of the SH3 and SH2 domains into a conformation conducive to its association with the SH2-kinase linker. Our results show that the conformational dynamics of the Abl SH3-SH2 tandem are clearly distinct from those of Src and related kinases. This finding enables us to reconcile seemingly contradictory structural and biophysical data on the mechanism of Abl regulation. Finally, we also examine the impact of activating mutations within the SH3-SH2 unit, particularly in the short connector between the domains. P0r-34 ER targeting of COPI vesicles involves cargo recognition by tethering factors Ana María Pérez-Linero, Javier Manzano-López, Marcos Cámara- Donoso, Manuel Muñiz Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Vesicular transport through the eukaryotic secretory pathway is essential for cellular function. This process depends on cytosolic coat proteins that form vesicles from a donor compartment and ensure their correct docking and fusion with the acceptor compartment trough interaction with tethering factors. Specifically, the Dsl tethering complex tethers Golgiderived COPI retrograde transport vesicles to the endoplasmic reticulum (ER) membrane. In this study, we found that the Dsl complex interacts physically with the p24 proteins, which are type I transmembrane proteins assembled into heteromeric complexes. The p24 complex is an abundant cargo passenger of COPI vesicles that facilitates COPI vesicle budding by stabilizing the COPI coat onto the Golgi membrane. By using genetic analysis we also show that the Dsl and p24 complexes interact functionally. Indeed, the phenotypic characterization of double mutants indicates that the Dsl-p24 physical interaction is required for an efficient COPI vesicle tethering to the ER. Therefore, our results strongly suggest that a specialized cargo like the p24 complex could promote the Golgito-ER retrograde transport by coupling both budding and tethering events of COPI vesicles. P0r-35 Study of the Caspase-9/PP2AC α interaction in the apoptotic pathway as a potential target for cancer therapy Leticia Domínguez Berrocal, Angelita Rebollo 2, Jerónimo Bravo Sicilia Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, 2 INSERM UMRS 945, Hôpital Pitié Salpêtrière, Université Pierre et Marie Curie, París, FR Apoptosis is the process of programmed cell death induced in damaged, unnecessary or dangerous cells to signal macrophages to engulf and degrade their corpses. This key mechanism is found to be altered in most types of cancer. The apoptotic machinery depends on a family of proteases called caspases, whose activation irreversibly triggers cell death. Caspase-9 is an initiator caspase that generates the active forms of Caspase-3 and Caspase-7 by limited proteolysis, and thereby transmits the apoptotic signal to the execution phase. PP2A is a serine/threonine phosphatase critical to physiological processes, including apoptosis, inducing cell death either by dephosphorylating proteins or by its own inhibition. Cell penetrating peptides are molecules that can translocate into cells without causing membrane damage. Based on the characterization of the region responsible for the interaction, we developed cell penetrating fusion peptides specifically designed to disrupt the Caspase-9/PP2AC α binding. Using these peptides, we performed the biophysical and biochemical characterization of the interaction, showing a direct association between Caspase-9 and PP2AC α. We are also evaluating the therapeutical potential of these peptides to induce Caspase-9 dependent apoptosis. P0-36 Mutational studies on ancestral proteins Fadia Manssour, Valeria A Risso, Alvaro Inglés-Prieto, Raquel Godoy-Ruiz 2, Jose A Gavira 3, Beatriz Ibarra-Molero, Jose M Sanchez-Ruiz Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, Maryland, US, 3 Laboratorio de Estudios Cristalográficos, Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (Consejo Superior de Investigaciones Científicas- Universidad de Granada), Armilla, Granada, ES We have carried out an extensive mutational analysis of two thioredoxins: a laboratory resurrection of a protein of the last common bacterial ancestor (LBCA thioredoxin), an organism estimated to have lived about 4 billion years ago, and one of its modern descendant (E. coli thioredoxin). Both proteins share the same overall 3D-structure but show only 55% sequence identity[-2]. A total of 25 variants involving exchanges between highly similar amino acids (E/D, I/V)[3-4] were purified and their thermal stabilities were investigated by Differential Scanning Calorimetry. Surprisingly, our results indicate a significant correlation between the mutation effects on the ancestral and modern backgrounds suggesting a conservation of protein mutational energetics over billions of years. References [] Ingles-Prieto A, Ibarra-Molero B, Delgado-Delgado A, Perez- Jimenez R, Fernandez JM, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz JM, Gavira A (203) Conservation of protein structure over four billion years. Structure2:690-697. [2] Perez-Jimenez R, Ingles-Prieto A, Zhao AM, Sanchez-Romero I, Alegre-Cebollada J, Kosuri P, Garcia.Manyes S, Kappock TJ, Tanokura M, Holmgren A, Sanchez-Ruiz JM (20) Single-molecule paleoenzymology probes the chemistry of resurrected enzymes. Nat Struct Mol Biol 8:592-596. [3] Godoy-Ruiz R, Perez-Jimenez R, Ibarra-Molero B and Sanchez-Ruiz JM. Relation between protein stability, evolution and structure, as probed by carboxylic acid mutations. J Mol Biol 336:33-38. [4] Godoy-Ruiz R, Perez-Jimenez R, Ibarra-Molero B and Sanchez-Ruiz JM. A stability pattern of protein hydrophobic mutations that reflects evolutionary structural optimitzation. Biophys J 89:3320-333. 96

Granada 204 Pósters P0r-37 Structure and function study of the complex that synthesizes S-adenosylmethionine Ben Murray, Svetlana Antonyuk 2, Alberto Marina 3, Sebastiaan Van Liempd 4, Shelly Lu 5, Jose Mato 4, Samar Hasnain 2, Adriana Rojas 3 Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology, Faculty of Health and life sciences, University of Liverpool & Structural biology unit, CIC biogune, Parque Tecnoloico de Bizkaia, Derio, ES, 2 Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology, Faculty of Health and life sciences, University of Liverpool, Liverpool, UK, 3 Structural Biology Unit, CIC biogune, Parque tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 4 Metabolomics Unit, CIC biogune, Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 5 Division of Gastroenterology and Liver Diseases, USC Research center for Liver Disease, USC-UCLA Research center for ALPD and Cirrhosis, Keck Scool of medicine, Los Angeles, US S-Adenosylmethionine (SAMe) is the principal methyl donor of the cell and is synthesized via an ATP-driven process by methionine adenosyltransferase (MAT) enzymes. It is tightly linked with cell proliferation in liver and colon cancer. In humans, there are three genes, mata, mat2a and mat2b, which encode MAT enzymes. mat2a and mat2b transcribe MATα2 and MATβ enzyme subunits, respectively, with catalytic and regulatory roles. The MATα2β complex is expressed in nearly all tissues and is thought to be essential in providing the necessary SAMe flux for methylation of DNA and various proteins including histones. In human hepatocellular carcinoma mat2a and mat2b genes are upregulated, highlighting the importance of the MATα2β complex in liver disease. The individual subunits have been structurally characterized but the nature of the complex has remained elusive despite its existence having been postulated for more than 20 years and the observation that MATβ is often colocalized with MATα2. Though SAMe can be produced by MAT(α2) 4 alone, our work shows that the V max of the MATα2β complex is three- to fourfold higher depending on the variants of MATβ that participate in complex formation. Using X-ray crystallography and solution X-ray scattering, the first structures are provided of this 258 kda functional complex both in crystals and solution with an unexpected stoichiometry of 4α2 and 2βV2 subunits. It is demonstrated that the N-terminal regulates the activity of the complex and it is shown that complex formation takes place surprisingly via the C-terminal of MATβV2 that buries itself in a tunnel created at the interface of the MAT(α2) 2. The structural data suggest a unique mechanism of regulation and provide a gateway for structure-based drug design in anticancer therapies. P0-38 The misfolding behaviour of PSD95-PDZ3 is modified by extra-domain structures and posttranslational modifications Javier Murciano Calles, Marta Marin-Argany 2, Eva S. Cobos, Sandra Villegas 2, Jose C. Martinez Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Departament de Bioquimica i Biologia Molecular, Facultat de Biociencies, Universitat Autonoma de Barcelona, Barcelona, ES Post-translational modifications located out from the binding pocket of the third PDZ domain of PSD95 (PDZ3) regulate binding affinity and specificity through an intra-domain electrostatic network. Such residues involve some charged residues in the b2 b3 loop (were a succinimide modification occurs) and the a3 helix (an extra-structural element that links the PDZ3 domain with the following SH3 domain in PSD95, and contains the phosphorylation target Tyr397). We have shown that these structural elements and their related posttranslational modifications also influence the folding/misfolding pathway of PDZ3, by using site-directed mutagenesis combined with calorimetry and spectroscopy. We have found that, although all the assayed mutations generate proteins more prone to aggregation than the wild-type PDZ3, those directly affecting the a3 helix increase the population of the DSC-detected intermediate state and the misfolding kinetics, by organizing the supramacromolecular structures at the expense of the two b-sheets present in the PDZ3 fold. However, those mutations affecting the b2 b3 loop, included into the proneto-aggregation region composed by a single b-sheet comprising b2 to b4 chains, stabilize the trimeric intermediate previously shown in the wild-type PDZ3 and slow-down aggregation. These results strongly suggest that the a3 helix protects to some extent the PDZ3 domain core from misfolding. This might well constitute the first example where an extra-element, intended to link the PDZ3 domain to the following SH3 in PSD95 and in other members of the MAGUK family, not only regulates the binding abilities of this domain but it also protects PDZ3 from misfolding and aggregation. P0-39 A functional amyloid assembly controls plasmid DNA replication in bacteria María Moreno del Álamo, Fátima Gasset-Rosa, Susana Moreno- Díaz de la Espina, Elena Fernández-Tresguerres, Rudi Lurz 2, Rafael Giraldo Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES, 2 Max Plant Institute for Molecular Genetics, Berlin, DE DNA replication is tightly regulated to constrain the genetic material within strict spatiotemporal boundaries and copy numbers. In some plasmids from Gram-negative bacteria, two circular DNA molecules associate ( handcuff ) their replication origins (ori) through a nucleoprotein assembly with an oligomer of a plasmid-encoded replication protein (Rep) at its core. Handcuffing thus hampers new replication rounds and determines plasmid incompatibility []. The WH domain in the RepA protein of the Pseudomonas pps0 plasmid, besides its contributions to transcriptional repression of repa gene and to plasmid DNA replication initiation by the full length protein [2], assembles into amyloid fibers upon binding to DNA in vitro [3] and causes an amyloid proteinopathy when overexpressed in Escherichia coli [4,5]. We have developed a monoclonal antibody (B3h7) specific for an amyloid oligomeric conformation of RepA-WH which has revealed here that the handcuffed RepA assemblies are amyloid by nature. RepA amyloids are found both in handcuffed complexes reconstructed in vitro and inside the nucleoid of bacterial cells, where plasmids with low copy numbers are known to cluster for partition and DNA-promoted RepA-WH amyloidogenesis actually occurs. A stable amyloid core would thus provide the basis for the previously reported requirement of molecular chaperones in dismantling handcuffs to allow for further replication rounds. RepA is a versatile DNA binding manifold, whose abilities, beyond transcriptional auto-repression and plasmid replication initiation, now also include the assembly of a replication inhibitory functional amyloid. References [] Giraldo R and Fernández-Tresguerres ME (2004). Plasmid 52(2): 69-83. [2] Gasset-Rosa F, et al. (2008). Mol Microbiol 68(3): 560-572. [3] Giraldo R (2007). Proc Natl Acad Sci USA 04: 7388-93. [4] Fernández-Tresguerres ME, et al. (200). Mol Microbiol 77: 456-69. [5] Gasset-Rosa F, et al. (204). Mol Microbiol 9(6):070-087 P0-40 Characterization of specific amino acid changes in rhodopsin as putative positively selected sites in visual pigment evolution Miguel Antonio Fernández Sampedro, Sundaramoorthy Srinivasan, Eva Ramon Portés, Pere Garriga Solé Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa (Barcelona), ES Rhodopsin has highly conserved motifs throughout vertebrate species, but there are differences at variable sites in residues shared among 97

Pósters XXXVII Congreso SEBBM lower mammals (monotreme) and the therian mammals. The shared residues among monotreme and, reptile and amphibian rhodopsins, include amino acids at positions 7, 8, 3, 225, 346 and 348, which are not shared with therian. Moreover, a Bayes empirical approach predicts several positively selected sites in the therian branch: Phe37, Gln225 and Ile290 at the transmembrane helices of the receptor; Phe- 3 at the N terminus; and Ser343, Ser344 and Ala346 at the C terminus of the protein. Here, we have expressed, purified and functionally characterized three of these rhodopsin changes: F3M, Q225R and A346S. We find that Q225R and A346S mutants have a wild type-like behaviour upon photobleaching/acidification and Western blot analysis and metarhodopsin II decay rates but show different hydroxylamine reactivity. Both Q225R and A346S mutants show increased reactivity to hydroxylamine, reflecting lower conformational stability as observed for echidna (most basal mammals) rhodopsins. We observe a lower Gt activation rate for Q225R which can be explained because the mutation is located close to the third intracellular loop important for Gt binding. A346S shows increased Gt activation rate that could be related to the evolutionary loss of an extra phosphorylation place at the C terminal tail of rhodopsin. In contrast, the extracellular F3M mutant could not bind retinal and showed a clearly different electrophoretic pattern. We could restore chromophore binding, for F3M, by adding a cysteine pair (N2C/D282C) that forms a stabilizing disulfide bond. This result reveals the importance of the N-terminal domain of rhodopsin in visual pigment evolution. P0-4 Different retinal binding modes to visual pigments suggest mechanism for Fine- Tuning GPCR-ligand interactions Sundaramoorthy Srinivasan, Miguel Fernandez, Eva Ramon, Pere Garriga Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa, ES Cone opsins are G-protein coupled receptors localized in cone photoreceptor cells of the retina. These receptors are activated by light and mediate the complex process of color vision. These visual pigments are heptahelical transmembrane proteins, bound to a light sensitive chromophore, - cis -retinal (CR) through a protonated Schiff base (SB) linkage at K32. Red and green opsin pigments show 95% sequence identity and they share a similarly biophysical and biochemical properties, yet the possible structural differences between each other are unclear. In order that to study human red and green cone pigments were expressed in COS- cells, regenerated with CR and purified using immunochromatography. Were analyzed the purified pigments using UV-vis and fluorescence spectroscopies in the dark state and after photoactivation. Ligand binding was measured by using the analog 9-cis-retinal (9CR) in addition to CR. The results of the regeneration experiments with the photoactivated receptors show that green cone opsin can not form a pigment in the visible region of the spectrum when regenerated with CR but it can band with a visible form 9CR. The acidification of the sample regenerated CR showed increased absorption at 440nm suggesting the formation of unprotonated SB linkage activated between CR and green opsin. In contrast, activated red cone opsin exhibits the formation with protonated SB both retinals. These that results suggest the difference in aminoacid sequence between green and red opsins not only contributes to their spectral sensitivity but also modulates ligand binding after photoactivation. Identified the molecular interactions these details contributing differences in ligand binding can be a model for fine-tuning of ligand- receptor of other members of the GPCR superfamily. P0-42 Binding of activators to the kinase unit of AMPK: theoretical study of the activation mechanism Gleiciane Leal Moraes, Carolina Estarellas, Ana Castro 2, Axel Bidon-Chanal, F. Javier Luque Departamento de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Santa Coloma de Gramanet, ES, 2 Instituto de Química Médica, CSIC, Madrid, ES Mammalian AMP-activated protein kinase (AMPK) is a serine/threonine protein kinase that acts as a key sensor of cellular energy status. Its primary function it to sense changes in the intracellular level of ATP and to couple the changes in ATP to phosphorylation of downstream substrates, leading to an increase in the rate of pathways producing ATP and/or a decrease in the rate of ATP-consuming processes. Its function in the homeostasis of cellular energy confers AMPK a major role in numerous metabolic disorders, such as type 2 diabetes, obesity and cancer. This explains the progressive interest in AMPK as a therapeutic target. AMPK is a heterotrimer composed of three different subunits: alpha, beta and gamma. The alpha subunit carries the catalytic function and contains a kinase domain at the N-terminus of the protein followed by an autoinhibitory domain and a C-terminal domain required for interaction with the beta subunit. The AMPK activity is regulated by several mechanisms, including a number of indirect activators of AMPK (such as metformin, rosiglitazone and resveratrol), an direct activators, such as compound A-769662. Some of these activators show a clear specificity for a particular AMPK subunit, which opens they way to design and discover new compounds that could activate AMPK in some tissues but not in others, minimizing in this way the putative negative effects of the activation of AMPK at whole body level. Up to now, the mechanism exerted by direct activators remained unknown. Very recently, two X-ray structures showing the binding of direct AMPK activators have been reported. This study reports the results of molecular dynamics simulates carried out to gain insight into the mechanism of AMPK activation by A-769662. P0r-43 Macromolecular crowding modulates the interaction of DnaK with its functional partners Garbiñe Celaya, Ianire Martin, Alejandra Aguado, Yovana Cabrera, Fernando Moro, Arturo Muga Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, ES Hsp70 proteins are central components of the cellular network of molecular chaperones and they assist a broad range of physiological processes, such as folding and assembly of newly synthesized proteins or refolding of misfolded and aggregated proteins. DnaK (Hsp70) of E. coli is an allosteric chaperone that has a nucleotide binding domain (NBD), that binds and hydrolyzes ATP, a substrate binding domain (SBD) and a linker that connects both domains. DnaK, together with the cochaperone DnaJ (Hsp40) and the nucleotide exchange factor GrpE, forms the chaperone system that is able to avoid aggregation of partially unfolded protein conformations and to remodel and reactivate some protein aggregates by itself or cooperating with other chaperone systems, such as ClpB (Hsp00). DnaJ and GrpE regulate the functional cycle of DnaK, which is based on a complex allosterical interdomain communication that promotes transition between two main DnaK conformations that differ in substrate affinity; when DnaK binds ATP, the linker promotes the tethering of both domains and it acquires an open conformation with lower affinity. Binding of substrates and DnaJ induces ATP hydrolysis and DnaK acquires a conformation recognizable by GrpE, where the two domains separate and behave independently. In this ADP-bound state, the SBD adopts a closed conformation that tightly binds substrates. The sequential association reactions that occur during the functional cycle of the chaperone system have been characterized under dilute experimental 98

Granada 204 Pósters conditions, despite the fact that in the intracellular medium the equilibrium and transition rates between different protein conformations are most likely affected by volume exclusion arising from macromolecular crowding. We have studied the effect of crowding on the conformational properties, ATPase and chaperone activities of the DnaK system. Our data show that crowding regulates in a temperature dependent manner the affinity of DnaK for DnaJ, but not for GrpE. The most relevant DnaJ domain regulating this interaction is the disordered G/F rich region that can be recognized by DnaK as a pseudosubstrate at low temperatures. Excluded volume conditions also allow ClpB to compete with GrpE for binding to the same DnaK region. This competition directs DnaK to reactivate stable protein aggregates, interacting with ClpB, or to remodel substrate proteins, interacting with GrpE. Therefore, crowding modulates the interaction of DnaK with specific protein partners. P0-44 Aminooxi análogos de histidina: una posible estrategia para modular la histidina descarboxilasa humana Francisca María Sánchez Jiménez, Rosario Castro Oropeza, Almudena Pino Ángeles, Maximilian A. Khomutov 2, José Luis Urdiales Ruiz, Alexander Khomutov 2 Dept. Biología Molecular y Bioquímica. Universidad de Málaga- Unidad 74 CIBERER, Campus Andalucía Tech, Málaga, ES, 2 Instituto de Biología Molecular Engelhardt, Moscú, RU La histamina (Hia) es una amina biógena implicada en procesos fisiológicos esenciales (respuesta inmune, neurotransmisión, entre otros). El desequilibrio de su metabolismo juega un destacado papel en muchas patologías. El control de los efectos adversos de Hia se ejerce únicamente modulando sus receptores (H R-H 4 R). En células humanas, Hia se sintetiza por descarboxilación de la L-His, en la reacción dependiente de piridoxal 5-fosfato (PLP) que cataliza la histidina descarboxilasa (HDC, EC 4...22). La baja tasa de expresión y la inestabilidad de HDC han dificultado su caracterización estructural y funcional, y por tanto el desarrollo de estrategias basadas en su inhibición. Nuestra experiencia derivada de estudios in silico (modelado y dinámica molecular) y experimentales con HDC, nos permitió abordar la búsqueda de nuevas posibilidades. Mediante tecnología de barrido virtual dedujimos que un inhibidor competitivo efectivo debería ser aquel capaz de enlazarse eficientemente con el PLP formando una estructura similar al intermediario PLP-substrato. Debería también conservar el grupo imidazol para reforzar la afinidad por el sitio catalítico. Ambas características podían conseguirse utilizando el compuesto 4(5)-aminooximetilimidazol (O-IMHA). Esta hipótesis se ha contrastado experimentalmente sobre extractos de HDC humana purificada. Hemos comprobado que O-IMHA es capaz de formar una PLP-oxima en el centro catalítico de la enzima humana. Los resultados indican que O-IMHA puede constituir una cabeza de síntesis prometedora de inhibidores de HDC. Aprovechando el conocimiento actual sobre la estructura de la enzima proponemos las configuraciones más probables del aducto en el sitio catalítico y podremos desarrollar nuevos derivados con potencial traslacional. SAF20-2658 y CVI-06585. CIBERER (ISCIII). P0r-45 Golgi assembly depends on vesicle tethering mediated by cooperation of ER cargo receptors Javier Manzano-López, Ana María Pérez-Linero, Laura Ojeda- Márquez, Marcos Cámara-Donoso, Manuel Muñiz Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Endoplasmic reticulum (ER) cargo receptors are major transmembrane constituents of the early secretory pathway that continuously cycle between the ER and Golgi apparatus. They function individually to mediate selective incorporation of specific cargo proteins into ER-derived vesicles by linking the cargo with the COPII coat. Here, we show that cargo receptors also interact with each other to form a High-Molecular-Weight complex at the level of the ER exit sites. We also found that this complex is required for de novo assembly of the cis-golgi compartment by promoting COPII vesicle tethering. Our results suggest that, in addition to their individual function in selective ER export, cargo receptors cooperate to maintain the structural and functional homeostasis of the early secretory pathway by forming a multi-protein platform that stabilizes the COPII coat onto the vesicle membrane and thereby ensures correct functioning of tethering factors. P0-46 Unraveling GPCR-Zinc interactions and its role in depression Mercè Tena Campos, Xiaoyun Dong, Diana Rivera Rodríguez, Eva Ramon Portes, Pere Garriga Solé Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa, ES Zinc supplementation has been widely reported to improve treatment against major depressive disorder. It is also well known that G-protein-coupled receptor (GPCRs) are involved in this disorder, among these 5-HT A, GalR and GPR39, all three potentially connected to zinc modulation. Our work has been focused on the study and characterization of these receptors and its relationships with zinc both in vitro and in cell culture. To this aim, we have designed a strategy to purify the receptors in a conformationally active state. We have used receptors tagged with the monoclonal D4 antibody epitope, and employed ligand assisted purification. We have purified all three receptors properly folded, active and in a monomeric state as shown by native gel electrophoresis. In the case of GPR39, it is still under debate whether zinc is the orthosteric ligand or not, but it is clear that there is an interaction between the receptor and the metal ion. According to our results, the receptor appears to be purified bound to zinc, even when cell culture and purification media are not supplemented with the cation, meaning that there is a specific interaction between zinc and GPR39 under physiological conditions. This interaction is confirmed by Trp fluorescence increase upon EDTA addition to a GPR39 purified sample. 5-HT A, GalR have been described to heterodimerize triggering a nonphysiological state that would underly depression. Using FRET we have demonstrated that zinc is able to disrupt this interaction. Both purified receptors are analyzed by surface plasmon resonance in order to determine the kinetics of this interaction. Further investigations should be carried out to fully uncover the relationships between these receptors, zinc and major depressive disorder. P0-47 Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, endonucleasa IV y uracil DNA glicosilasa forman parte de un complejo proteico implicado en mantener la integridad del genoma en E. coli Maria Alexandra Cañas Pacheco, Laura Aguilera Gil, Elaine Ferreira Melo, Carina S. Alvarez, Rosa Giménez Claudio, Josefa Badía Palacin, Laura Baldomà Llavinés Departamento de Bioquimica i Bilogia Molecular, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona. Institut de Biomedicina de la UB (IBUB), Barcelona, ES Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es una proteína multifuncional. A parte de su función en la glicolisis presenta otras actividades. Estudios previos realizados por nuestro grupo con mutantes gapa y células silenciadas con RNA antisentido sugerían la implicación 99

Pósters XXXVII Congreso SEBBM funcional de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli. Las células deficientes en GAPDH presentan menor supervivencia que las células control frente al tratamiento con agentes genotóxicos, así como un mayor número de centros apurínicos/apirimidínicos (centros AP) espontáneos en su genoma. En este estudio se han realizado ensayos pull down seguidos de Western blot con varias proteínas de los sistemas de reparación del DNA. Los resultados muestran interacción de GAPDH con: (i) SSB (single strand DNA binding protein), proteína esencial en los procesos de reparación por recombinación homóloga y respuesta SOS (ii) endonucleasa Endo IV, implicada en la reparación de centros AP y (iii) uracil DNA glicosilasa (UDG) que genera un centro AP al eliminar el uracilo presente en el DNA. El estudio de estas interacciones en mutantes deficientes en estas proteínas indica que GAPDH, EndoIV y UDG forman parte de un complejo de reparación de DNA en E. coli. La morfología filamentosa observada en cepas silenciadas o deficientes en GAPDH a las 3 horas de recuperación después de un tratamiento con bleomicina o agentes alquilantes es compatible con la inhibición de la división celular por acúmulo de lesiones no reparadas en el genoma y confirma la implicación de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli. P0-48 Docosahexaenoic acid effect on the conformational stability of the rhodopsin mutants G90V and N55K associated with retinitis pigmentosa Xiaoyun Dong, Eva Ramon Portes, Pere Garriga Sole Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa, ES Rhodopsin is a prototypical seven-transmembrane helix receptor belonging to the G-protein coupled receptor (GPCR) superfamily. It functions as a visual photoreceptor and serves as the photosensitive pigment for scotopic vision under dim light conditions. As a GPCR, its structural and functional features are modulated by lipids. Docosahexaenoic acid (DHA) provides a physiologically relevant milieu for stabilizing rhodopsin but the Influence of DHA on rhodopsin mutants conformational properties have not been previously explored. We have studied the structural features of two thermosensitive mutants, G90V and N55K, which are associated with the retinal degenerative disease retinitis pigmentosa and show thermal unstability when solubilized in the classical neutral detergent dodecyl maltoside (DM). We have used,2-didocosa-hexaenoyl--sn-glycero-3-phosphocholine (DDHA-PC) liposomes for reconstituting the purified rhodopsin mutants. G90V mutant reconstituted in DDHA-PC liposomes showed a 4-fold thermal stability increase than in DM. In turn, N55K mutant showed a slight increase on its thermal stability under the same conditions. The active conformation metarhodopsin II decayed faster, as measured by retinal release fluorescence spectroscopic measurements, for both mutants in DDHA-PC liposomes compared with DM. DDHA-PC liposomes also preserved G90V and N55K opsin conformations allowing more efficient binding of exogenously added -cis-retinal ligand. DDHA-PC liposomes provide an environment can preserve the conformation of the pathogenic mutations by providing higher thermal stability when compared with the DM-purified receptors. These effects highlight the potential stabilizing role of DHA on the structural features of rhodopsin mutants associated with retinal disease. P0-49 N-terminal acetylation of α-synuclein decreaces the population of partially folded oligomers and reduces amyloid aggregation David Ruzafa Ruiz, Yuriko Hernández G. 2, Giovanni Bisello 2, Bertrand Morel 3, Francisco Conejero-Lara 4 Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Dipartimento di Science del Farmaco, Università degli Studi di Padova, Padova, IT, 3 Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES, 4 Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES Parkinson s disease is a neurodegenerative disorder with a high impact in our society. This is one of several diseases related to the oligomerization and aggregation of α-synuclein (αsyn). The interaction of αsyn with surfactants, lipids and membranes appears to play a key role in its physiological function. The αsyn found in cells presents a posttranscriptional modification consisting of the acetylation of its N-terminus, which appears to affect its behavior and therefore also its function. Sodium dodecyl sulfate (SDS) has been widely used as a simple model for membrane environment and has been reported to accelerate amyloid fibrillation of αsyn in vitro. In this study, we compared N-acetylated and unacetylated αsyn in their mode of interaction with SDS and related their different properties with their amyloidogenic propensity. We found that in the presence of sub-cmc concentrations of SDS αsyn forms SDSassociated partially folded oligomers. These oligomers appear to constitute optimal species for spontaneous and efficient formation of amyloid nuclei, which further drive rapid, lag-free amyloid fibrillation. N-acetylation reduces the extent of αsyn oligomerization favoring its interaction with micelles, thereby reducing the rate of formation of amyloid nuclei. P0-5 El dominio β-hairpin, implicación en el proceso señalizador de dutpasas triméricas Jorge Donderis Martínez, Elisa Maiques, Ilty Mehemedov, María Ángeles Tormo Más 2, María García Caballer 2, José Penadés 3, Alberto Marina Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC, Valencia, ES, 2 Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, CITA-IVIA, Segorbe, ES, 3 Institute of Infection, Immunity, and Inflammation, College of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Las dutpasas (DUT) son enzimas presentes en todos los organismos que hidrolizan el dutp a dump y pirofosfato inorgánico. Diversos trabajos han descrito la actividad señalizadora de las DUT independientemente de su actividad catalítica, como es el caso de la DUT monomérica del Epstein-Barr virus, capaz de inducir la expresión de citoquinas proinflamatorias, o la DUT trimérica de la rata que une a PPARα y regula la expresión génica mediada por el complejo PPARα-RXR; o, recientemente nuestro grupo demostró que en Staphylococcus aureus las DUT triméricas de bacteriófagos podían inducir la transferencia horizontal de islas de patogenicidad (SaPI) en estas bacterias [,2]. La movilidad de las SaPI depende de la unión de la DUT a la proteína Stl que reprime la isla. Dicha unión está vinculada a una conformación catalíticamente activa de la DUT además de la presencia de un dominio extra de entre 20-30 residuos muy variable en secuencia y longitud entre las diferentes DUT fágicas. Para comprender mejor la capacidad señalizadora de estas proteínas, en este trabajo hemos resuelto la estructura tridimensional de 3 DUT con capacidad inductora de las SaPI de diferentes fagos. Sorprendentemente, comparando estas estructuras, junto con la DUT del fago 80α, previamente resuelta por nuestro grupo, observamos que dentro de este dominio extra no conservado a nivel de secuencia, existe una región central de 9 residuos que ocupa una disposición espacial idéntica en todas ellas así como la misma conformación, un β-hairpin, pese a la diversidad de la secuencia. Nuestros estudios mutacionales muestran que este motivo estructural juega un papel clave en el reconocimiento de la proteína Stl y por lo tanto en la actividad señalizadora de estas DUT. Bibliografía [] Penadés et al., 203. dutpases, the unexplored family of signalling molecules. Curr. Opin. Microbiol. 6, 63 70. [2] Tormo-Más et al., 203. Phage dutpases Control Transfer of Virulence Genes by a Proto-Oncogenic G Protein-like Mechanism. Mol. Cell 49, 947-958. 00

Granada 204 Pósters P0-52 Investigando la función de CutA en bacterias: estudios estructurales y funcionales Lorena Tremino-Agulló, Javier Espinosa 2, Carles Palanca, Asunción Contreras 2, Vicente Rubio Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER- ISCIII, Valencia, ES, 2 División de Genética, Universidad de Alicante, Alicante, ES Nuestro laboratorio ha aclarado sobre base estructural la función de la proteína PII, señalizador homotrimérico de 2 residuos, muy conservado y ampliamente distribuido, que interacciona con enzimas, canales y reguladores de expresión génica. Ahora intentamos lo mismo con la proteína CutA, de secuencia aparentemente no homóloga a PII, también homotrimérica, de 2 residuos, muy conservada y ampliamente distribuida. Su nombre se debe a que su gen se identificó en una región de dos genes de E.coli cuya deleción sensibilizaba a cobre, sin evidencia sólida de su implicación en protección a metales. Suponiéndole una función señalizadora análoga a la de PII, realizamos un estudio de doble híbrido en levadura con una librería del genoma y de candidatos prometedores de la cianobacteria Synechococcus elongatus, el mismo organismo y estrategia que llevaron a identificar las dianas de PII. Los resultados con CutA, presentados aquí, han sido poco informativos. También presentaremos la estructura cristalina de CutA de S. elongatus a 2 Å de resolución, esencialmente idéntica a la de PII excepto por faltar los largos lazos flexibles T, sin que hayamos tenido éxito en generar estructura de complejos con metales de esta proteína. Finalmente, presentaremos experimentos en que reconsideramos desde el inicio la funcionalidad de CutA, utilizando un mutante nulo de E. coli, exclusivo de CutA, en el que investigamos la sensibilidad a metales y otras características fenotípicas. Confiamos en que estos experimentos proporcionen información funcional sólida sobre el papel de CutA y sobre las razones de su amplia distribución y alta conservación. Financiado por ayudas Prometeo 2009/05 (Generalitat Valenciana) y BFU20-30407 (MINECO). L. Tremino becaria FPI del MINECO. P0-53 (R0-4) Crystal structures of human carbamoyl phosphate synthetase (CPS) shed light on domains functions, substrate tunnels and allosteric activation, and allow rationalization of inborn CPS deficiency Sergio de Cima Martín, Luis Mariano Polo, Carmen Díez- Fernandez, Javier Cervera, Ignacio Fita 2, Vicente Rubio Instituto de Biomedicina de Valencia of the CSIC, and Group 739 of the Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Raras-CIBERER del Instituto de Salud Carlos III, Valencia, ES, 2 Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC), Barcelona, ES CPS is a large six-domain protein that constitutes the first step of the urea cycle: the synthesis of carbamoyl phosphate from bicarbonate, ammonia and two ATP molecules. A paramount feature of this enzyme is its absolute requirement for N-acetyl-L-glutamate (NAG), an allosteric activator without which it is inactive. The report of CPS regulation by lysine deacylation by NAD-dependent sirtuin 5 connected the urea cycle with the age-control machinery (Nakagawa et al. Cell 2009; 37:560). CPS deficiency (CPSD) is an inborn disorder that cause severe neonatal hyperammonemia leading to mental retardation or even to death. More than 300 mutations have been reported in CPSD patients, of which the majority are missense mutations showing little recurrence and having unproven disease-causing potential. The structure of the E. coli homologous CPS has been known for >5 years, but differences with CPS (40% identity; use of glutamine instead of ammonia; insensitivity to NAG) rendered essential to obtain the structure of CPS for proper understanding of its functioning, and for evaluating disease causation by CPSD mutations. Using a baculovirus/insect cell system we have finally succeeded in producing recombinant human CPS in large amount and pure form, allowing us to experimentally examine the effects of reported mutations and ascertain its disease-causing potential (Díez-Fernández et al. Human Mut 203; 34:49). In addition we have determined the structure of CPS, in both apo and ligand-bound (NAG and ADP/Pi) forms. The liganded structure revealed how NAG binds in a pocket of the C-terminal domain and has identified elements stabilized by ADP binding and conformational changes that lead to define the carbamate tunnel, which in the apo form is heavily branched and open to the environment. Our structures decipher the CPS inability to use glutamine and reveal a potential channel for ammonia intake. Furthermore, they help rationalize the disease-causing role of most clinical CPS mutations. Supported by Fundación Alicia Koplowitz and Valencian (Prometeo 2009/05) and Spanish (BFU20-30407; FPU to CD-F) governments. P0-54 Unveiling the mechanism of transcriptional auto-regulation of pard system Srdja Drakulic, Ana María Hernández-Arriaga, Carlos Fernández- Tornero, Ramón Díaz Orejas Centro de Investigaciones Biológicas (CIB/CSIC), Madrid, ES Survival of extrachromosomal genetic material in bacterial population involves the activity of toxin-antitoxin systems (TA). In particular, the maintenance of R plasmid requires the employment of three stability systems: para, parb and pard. The focus of our work is on the pard system, a type II toxin-antitoxin system, consisting of stable protein toxin Kid, a ribonuclease which activity leads to cell growth arrest, and of proteolyses prone Kis antitoxin, which through protein-protein interactions abolishes the toxic effect of Kid. Interestingly, pard operon exhibits a transcriptional auto-regulation. Depending on their relative molar ratio and the presence of promoter DNA, Kis and Kid form differentially sized complexes, with variable capacity of pard operon transcriptional regulation.our preliminary results indicate that KisKid complexes coexist with RNAP at the promoter, raising questions of how KisKid system and RNAP interact, and how would this lead to pard operon s transcription decrease. In order to provide the answers to previously raised questions, we have combined structural, in a first place negative-staining EM, with biochemical/functional analysis of the RNAP core-enzyme (subunits composition: α, β, β, γ, ω), RNAP core in complex with the sigma70 factor (RNAP holoenzyme), KisKid repressor with its promoter DNA (PO), and RNAP holoenzyme:kiskid:po complex. The 3DEM structure of the repressor-dna complex indicates that two KisKid-heterooctamers, bound respectively at the operator sites I and II, establish protein-protein interactions to form a supercomplex in which the RNAP binding site seems to be exposed through the extensive DNA bending. Our current work is dedicated to the determination of the structural and biochemical properties of the RNAP holoenzyme-kiskid- DNA complex, with the goal of deciphering the transcriptional regulation mechanism of the KisKid repressor complex on the pard system. P0-55 The why of linkers in structural biology: the case of Galectin-4 Mónica Álvarez Pérez, Eliza Buzamet, Rubén M. Buey 2, Sabine Vértesy 3, J. Fernando Díaz 2, Sabine André 3, Hans-Joachim Gabius 3, Margarita Menéndez, Dolores Solís Instituto de Química Física Rocasolano, CSIC and Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias- CIBERES, Madrid, ES, 2 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 3 Institut für Physiologische Chemie,Tierärztliche Fakultät, LMU München, Munich, DE Cell surface glycans are versatile biochemical signals decoded and translated into responses by endogenous lectins []. Among them, the members of the 0

Pósters XXXVII Congreso SEBBM galectin family with ability to crosslink glycans of cellular glycoconjugates fulfil special tasks, e.g. in growth control and glycoprotein routing as galectin-4 (Gal-4) does [2, 3]. To address the issue on the functional significance of the 42-amino-acid linker connecting the two lectin domains, we engineered variants and performed structural analysis in solution. Analytical ultracentrifugation and gel filtration revealed an impact of linker truncation on quaternary structure, further studied by additional variants. This type of structural analysis was flanked by precipitation analysis with a pan-galectin counterreceptor, i.e. the glycoprotein asialofetuin. The obtained results disclose new information on linker presence and encourage respective analysis using this strategy on homodimeric Gal-, engineered to have the Gal-4 linker, and the chimera-type Gal-3. References [] Gabius et al. (20) From lectin structure to functional glycomics: principles of the sugar code. TIBS 36, 298-36. [2] Ledeen et al. (202) Beyond glycoproteins as galectin counterreceptors: tumor-effector T cell growth control via ganglioside GM. Ann N Y Acad Sci 253, 206-22. [3] Velasco et al. (203) Neuronal galectin-4 is required for axon growth and for the organization of axonal membrane L delivery and clustering. J Neurochem 25, 49-62. P0-56 Tubulin dimer dissociation by chaperones TBCE and TBCB is a mechanically driven process Gerardo Carranza, Marina Serna 2, Jaime Martín-Benito 3, Jose María Valpuesta 3, Juan Carlos Zabala Universidad de Cantabria, Santander, ES, 2 Imperial College, London, UK, 3 Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES A group of molecular chaperones termed tubulin cofactors (TBCs) participate in tubulin proteostasis inside the cell playing an important role in the spatial and temporal regulation of the microtubule cytoskeleton. While tubulin heterodimer formation is well characterized, its dissociation pathway is not well understood. In the study reported here we showed the structural determination by electron microscopy and image processing of the complex between human TBCE, TBCB and α-tubulin (αeb), which is formed upon dissociation of the αβtubulin heterodimer by both chaperones, as well as its interpretation through the molecular fitting of the atomic structures of the protein domains. Docking of the atomic structures of the different domains of the three proteins, including the UBL domain of TBCE, solved in this study by X-ray crystallography, has allowed us to construct an atomic model of the αeb complex with important functional consequences regarding the molecular mechanism of the tubulin dimer dissociation by both tubulin cofactors. This process, which is not energy-dependent, takes place through the distortion of the α/β-tubulin interface caused by a steric clash between the TBCE CAP- Gly and LRR domains and β-tubulin. Finally, the protruding arrangement of both UBL domains in the αeb complex suggests a direct interaction of this complex with the proteasome, mediating α-tubulin degradation. P0-57 Insights into the human carboxypeptidase D structure deduced from single-particle electron microscopy Javier Garcia Pardo, Sebastian Tanco, Pablo Gallego, Daniela Lufrano 2, David Reverter, José L. Carrascosa 3, Julia Lorenzo, Francesc X. Avilès Institut de Biotecnologia i Biomedicina and Departament de Bioquimica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, ES, 2 Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, AR, 3 Department of Macromolecular Structure, Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Cienfícas-CSIC, Madrid, ES Carboxypeptidase D (CPD) is a 80 kda membrane-bound metallocarboxypeptidase that contains three carboxypeptidase (CP) domains. The biological function of this enzyme is not well known but it is thought to participate in the maturation of hormones and other bioactive peptides in the trans-golgi network and functions as a docking receptor for duck hepatitis B virus. Only the first and second domains have detectable carboxypeptidase activity whereas the third domain seems to be implicated in the virus recognition. Previous reports described the three-dimensional structures of the first and second CP domains solved by X-ray crystallography. Nonetheless, nothing is known about the three dimensional structure of the full-length enzyme and the implications for its biological function. To study the structure of full-length human CPD we cloned, recombinantly expressed and purified a soluble form of this enzyme, lacking the transmembrane domain. For this purpose we used a mammalian cell-based expression system that allows us to purify milligrams of soluble and active human CPD. The oligomeric state of the enzyme was determined by molecular exclusion chromatography and dynamic light scattering (DLS), showing that the protein self-associates to a homotrimeric complex with a molecular weight of approximately 450 kda. The CPD trimeric complex was stable up to M salt concentrations, suggesting that complex association is driven by hydrophobic interactions. By single particle EM reconstructions we confirmed the trimeric native state of this soluble human CPD enzyme. In the trimer each CPD monomer has almost triangular appearance with dimensions of approximately 80 x 80 Å. The oligomeric structure has a 3-fold rotational symmetry with a high structural flexibility. Finally, using the interactions observed in the tridimensional structure of duck CPD dii previously solved, we propose a three-dimensional structure model of human CPD to explain the obtained single particle EM 2D reconstructions. P0-58 La asociación de las GTPasas pequeñas RagA y Rab3 al motor de dineína tiene lugar a través de su unión a DYNLT Javier Merino Gracia, Ruth A. Valero 2, Mª Flor García-Mayoral 3, Marta Bruix 3, Ignacio Rodríguez-Crespo 2 Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 3 Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, Madrid, ES Las cadenas ligeras de dineína, DYNLT, DYNLL y DYNLRB, son pequeñas proteínas diméricas que forman parte del motor de dineína, una estructura macromolecular de ~.2 MDa encargada del transporte retrógrado por los microtúbulos. Estas tres cadenas se asocian al extremo N-terminal de la cadena intermedia de dineína, DYNCI. Aunque DYNLT y DYNLL no son homólogas entre sí, adoptan un plegamiento casi idéntico, con láminas beta antiparalelas como superficies de unión del dímero, flanqueada por dos alfa hélices en cada monómero. Para DYNLL se ha descrito su asociación a numerosas proteínas celulares y virales que poseen una de las dos secuencias consenso de unión: KSTQT y KDTGIQVDR, las cuales adoptan una disposición de cadena beta que se inserta de forma antiparalela en el homodímero previamente formado. Sin embargo, DYNLL posee un único sitio de unión para polipéptidos, implicando que si se asocia a la cadena intermedia de dineína no puede unirse simultáneamente a una proteína diana. Nuestro trabajo muestra que DYNLT, al contrario que DYNLL, funciona como una proteína de acoplamiento de proteínas diana al motor de dineína, presentando dos sitios de unión. RagA y Rab3D son dos pequeñas GTPasas que se asocian con DYNLT. Por medio de dobles híbridos de levaduras y 02

Granada 204 Pósters mutagénesis dirigida de las GTPasas, hemos identificado el sitio de unión de DYNLT, y los requerimientos de la secuencia para la interacción. Con técnicas de NMR hemos localizado los aminoácidos de DYNLT implicados en la unión a la cadena intermedia de dineína y los implicados en su unión a las GTPasas pequeñas. En experimentos de inmunoprecipitación hemos confirmado que DYNLT funciona como proteína puente capaz de asociar RagA y Rab3D a microtúbulos. Así, establecemos un modelo que describe un nuevo mecanismo de asociación de proteínas al motor de dineína, para su transporte por los microtúbulos. P0-59 La pérdida funcional de VAMP2 en células plasmáticas humanas provoca una disminución de la secreción de inmunoglobulinas Laura Gómez Jaramillo, Raquel Romero García, Ana B. Ramos Amaya, Gema Jiménez Gómez, José A. Brieva, Antonio Campos Caro Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES Objetivo: Las células plasmáticas (CP) son células secretoras por excelencia que presentan una maquinaria exocítica muy desarrollada, donde se engloban las proteínas SNARE. Estas participan en todo proceso de fusión de membrana que tenga lugar en la célula, gracias a la formación de un complejo constituido por tres miembros, uno de cada una de las tres familias descritas de estas proteínas; SNAP25, Syntaxinas y VAMP. Resultados previos implican a SNAP-23 y STX4 en la secreción de Igs. El objeto de este estudio es definir qué miembro de la familia VAMP completa el complejo que lleva a cabo la secreción de Ig en CPs humanas. Metodología: Usamos la línea celular U266. Caracterizamos la expresión y distribución de VAMP2 mediante ensayos de western blot e inmunofluorescencia, respectivamente. Como estudios de pérdida de función realizamos tres estrategias; ) Silenciamos su expresión con ARNi, 2) Sobreexpresamos la cadena ligera de la toxina tetánica, neurotoxina que degrada VAMP2 y VAMP3 pero no afecta a la integridad de los demás miembros de la familia y 3) Expresamos varias construcciones de VAMP2 que consisten en distintas deleciones del fragmento transmembrana de la proteína con el fin de que compitan con la forma normal endógena provocando la formación de complejos no funcionales. En los sobrenadantes resultantes de todos estos ensayos hemos medido la secreción de IgE mediante ELISA. Resultados: La disminución de los niveles de VAMP2 o su pérdida de función en las células provoca una disminución en la secreción de Igs. El mismo efecto observamos cuando introducimos en la célula la proteína VAMP2 delecionada en el fragmento trasmembrana que se distribuye deslocalizada por todo el citoplasma. Además observamos que las vesículas que transportan la IgE en células U266 colocalizan parcialmente con VAMP2. Conclusión: VAMP2 es un claro candidato a ser el tercer SNARE que, junto con SNAP23 y STX4, forman el complejo que lleva a cabo la secreción de Igs en CP. Si bien, la disminución es parcial, indicando que existen otras proteínas SNARE o reguladoras implicadas en dicho proceso. P0-60 Synthesis of polymeric dyes through oxidative cross-coupling by directed laccase evolution Ana Isabel Vicente Martín, Susana Camarero Fernández 2, Miguel Alcalde Galeote Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES Fungal laccases (EC.0.3.2) are blue-multicopper containing enzymes capable of oxidizing phenols, polyphenols, aromatic amines and many other compounds with the concomitant reduction of molecular oxygen to water. The versatility of these enzymes can be expanded by the use of redox mediators (from natural or synthetic origin) thereby finding plenty of applications ranging from bioremediation to novel green processes. Besides, fungal laccases are capable to promote complex hetero-polymerizations of great significance for the synthesis of dyes []. The present work describes a laboratory evolution protocol to engineer efficient fungal laccases for the synthesis of polymeric dyes. The departure point for this study was the laccase IG-88 mutant from of Myceliophthora thermophila, which was previously evolved through 2 rounds of directed evolution for secretion in yeast, organic co-solvent tolerance and alkalophilicity [2-4]. With the help of a HTS-assay based on the oxidative cross-coupling (heterocoupling N-C) of 2,5-diaminobenzenesulfonic acid (2,5-DABSA) and policatechol, laccase mutant libraries were screened and new variants with improved turnover rates under operational conditions (alkaline ph, high temperature) were identified. P. Genómica y proteómica P- (R-) Where proteomics is the approach in basic and translational plant research, but how? Jesus V. Jorrin Novo Agroforestry and Plant Biochemistry and Proteomics; Dpt. of Biochemistry and Molecular Biology, Córdoba, ES Biological investigation and knowledge at the molecular level, whether the experimental systems are plants or other living organisms, models or orphans, is based and the result of data generated by the use of different and complementary methodological approaches. Historically we moved from the classical and in vitrotechniques (e.g. protein chemistry/biochemistry) to the in vivo and the most recent holistic, omics, ones (e.g. proteomics), that with mathematical and bioinformatics tools build the so-called Systems biology. Nowadays, biological research should not be just the result of data accumulation and blind acceptance of the huge amount of data generated by the potent omics equipment s and algorithms, as the result of that could be, in the best of the cases, merely descriptive and speculative. As indicated in the title of this presentation, and based on my own research experience and the current literature, it is pretended to discuss how is or could be the contribution of proteomics to the knowledge in these living organisms. Why, when, and how to use proteomics should be the questions to be answered. Finally, the challenges, power and limitations of the approach will be evaluated. P-2 (R-2) La proteína quinasa DYRKA regula transcripción vía su reclutamiento a promotores Susana de la Luna ICREA y Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES DYRKA es una proteína quinasa que participa en procesos celulares relacionados con proliferación, diferenciación y supervivencia. La actividad biológica de esta quinasa es extremadamente dependiente de la dosis génica ya que su sobreexpresión se ha asociado a alteraciones del neurodesarrollo asociadas al síndrome de Down, mientras que mutaciones en uno de los alelos del gen codificante son responsables de un nuevo síndrome asociado al locus MRD7 (Mental Retardation Autosomal Dominant 7). DYRKA está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de células de mamífero, si bien la mayoría de sus actividades nucleares pueden ser explicadas por fosforilaciones que ocurren en el citosol. Estas observaciones han planteado dudas sobre si esta quinasa posee funciones específicamente nucleares. Mediante una aproximación proteómica no sesgada, hemos identificado que la fracción nuclear de DYRKA interacciona con componentes de la maquinaria basal de transcripción. El análisis a nivel genómico de la presencia de DYRKA en cromatina, mediante experimentos de ChIP-Seq, ha revelado que la quinasa es reclutada a regiones proximales de promotores dependientes 03

Pósters XXXVII Congreso SEBBM de la RNA polimerasa II caracterizados por la presencia de una secuencia palindrómica muy conservada, y enriquecidos en categorías funcionales relacionadas con traducción y procesamiento de RNA. La presencia de DYRKA en genes dependientes de la RNA polimerasa III también ha sido detectada. Nuestros datos indican que la expresión de un grupo de genes diana, dentro de estas categorías, depende de la actividad quinasa de DYRKA. Además, la reducción en los niveles de DYRKA provoca una reducción en el tamaño de las células. Los resultados permiten proponer un modelo por el que DYRKA podría regular directamente la expresión de genes diana mediante la fosforilación, en regiones reguladoras promotoras, de diferentes componentes de la maquinaria basal de la transcripción, contribuyendo a la coregulación de programas de expresión implicados en la homeostasis celular. P-3 Caracterización de la expresión de haptoglobina en cáncer colorrectal Óscar Mariño Crespo, Elisa Cuevas Álvarez 2, Emilio Gil Martín, Almudena Fernández Briera Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2 Servicio de Anatomía Patológica, Complejo Hospitalario Universitario de Ourense, Ourense, ES La haptoglobina (Hp) es una proteína de fase aguda conocida por unir hemoglobina durante la hemólisis, evitando así la pérdida de hierro y el daño renal. En un estudio reciente detectamos esta proteína en especímenes de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) como potencial portadora de CDw75, un epitopo glucídico relacionado con la progresión de esta neoplasia. Para proseguir con este trabajo nos hemos propuesto certificar la expresión de la Hp en CCR mediante un estudio inmunohistoquímico utilizando especímenes de tejido sano y tumoral (2 y 55, respectivamente). Además, hemos pretendido caracterizar su expresión y relación con el CDw75 mediante western blot de fracciones enriquecidas en proteínas citosólicas o de membrana procedentes de especímenes de tejido sano y tumoral de algunos de los pacientes empleados en el estudio histológico. Ninguno de los especímenes de tejido sano analizados por inmunohistoquímica presentó expresión de Hp, mientras que en el tejido tumoral únicamente se detectó en 9 de los 55 ensayados (6 %). Cuando estaba presente, la Hp apareció de forma tenue, focal y restringida a las células del epitelio glandular. Además, hemos comprobado que la expresión de esta proteína se asocia significativamente con la edad del paciente, el estadio de Dukes y la presencia de metástasis. Mediante western blot hemos acreditado la presencia preferencial de la Hp en la fracción citosólica y comprobado que su patrón de bandas coincide en masa con el del epitopo CDw75. Por otro lado, no parece haber diferencias de expresión de la Hp entre el tejido sano y el tumoral. Estudio fi nanciado mediante el Contrato-Programa CN 20/024, Xunta de Galicia. P-4 Nueva función del GEF C3G como regulador del secretoma plaquetario: implicación en la patología trombótica Víctor Martín Granado, Sara Gutiérrez Herrero, Sara Alonso Alvarez 2, Sara Ortiz Rivero, José Ramón González Porras 2, Neibla Priego Bendeck 3, Almudena Porras Gallo 3, Carmen Guerrero Arroyo Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES, 2 Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES, 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap, una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Específicamente, la isoforma Rapb participa en aspecto críticos de la función plaquetaria a través de la activación de la integrina αiibβ3. Además, se sabe que C3G juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como in vivo, a través de la activación de Rapb. En base a todo esto, nuestra hipótesis es que C3G puede influir en la secreción durante la activación plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones transgénicos para C3G (tgc3g) y C3GΔCat (un mutante con deleción del dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que las plaquetas tgc3g secretaron mayor cantidad que los controles, mientras que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad. El perfil de secreción proteica de las plaquetas tgc3g también fue diferente al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas diferencialmente secretadas por las plaquetas tgc3g se encontraban apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fibrinógeno, αhemoglobina y trombospondina-, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fisio-patológicos, especialmente en el contexto de patologías trombóticas. P-5 Efecto del clima en las comunidades bacterianas asociadas al suelo rizosférico en el Parque Nacional de Sierra Nevada Javier Pascual, Silvia Blanco, Juan Luis Ramos 2, Pieter van Dillewijn Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES Teniendo en cuenta que los microorganismos presentes en el suelo, y especialmente en el suelo asociado a las raíces de las plantas, la rizosfera, ejercen un papel clave en la dinámica y el funcionamiento de los ecosistemas, es necesario conocer cómo las comunidades bacterianas se ven influenciadas por los cambios climáticos que se producen en el medio ambiente. Uno de los lugares que puede ser utilizado como modelo para evaluar el efecto del clima es el Parque Nacional de Sierra Nevada, debido a la clara estratificación termoclimática que existe en el macizo montañoso. El objetivo del presente trabajo ha consistido en el análisis de la diversidad taxonómica y funcional de las comunidades bacterianas asociadas a la rizosfera del tomillo salsero (Thymus zygis L.) y al suelo suelto, presente en diferentes pisos termoclimáticos de dos regiones de Sierra Nevada, Capileira y Puerto de la Ragua. Para llevar a cabo el estudio se ha analizado el ADN metagenómico de las comunidades bacterianas presentes en las diferentes muestras de suelo: (i) la diversidad taxonómica se ha analizado mediante pirosecuenciación de amplicones del gen ARNr 6S, mientras que (ii) la diversidad funcional se ha estudiado utilizando GeoChips. Los resultados obtenidos hasta la fecha muestran que el clima ejerce un papel clave en la estructura y funcionalidad de las comunidades bacterianas del suelo. Este trabajo forma parte de un estudio más amplio donde se analizará a su vez la dinámica de las comunidades bacterianas a escala temporal. Pr-6 Análisis transcriptómico mediante RNA-seq de genes de respuesta a ácido linolénico implicados en situaciones de estrés abiótico en Arabidopsis Capilla Mata Pérez, Beatriz Sánchez-Calvo, Juan Carlos Begara- Morales, María N Padilla-Serrano, Raquel Valderrama, Francisco Luque 2, Ana Fernández-Ocaña, Francisco J Corpas 3, Juan B Barroso Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad 04

Granada 204 Pósters de Jaén, Jaén, ES, 2 Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES, 3 Grupo de Antioxidantes, Radicales Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología y Agroalimentación, Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de Plantas, Estación Esperimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES El ácido linolénico (LnA) es un ácido graso poliinsaturado esencial de la serie omega-3, precursor de la fitohormona Ácido Jasmónico (JA), implicada en diversas situaciones de estrés abiótico que cursan con la sobreproducción de especies de oxígeno reactivo (ROS) [,2]. Con el objetivo de tener un conocimiento más amplio acerca de los genes implicados en la respuesta a LnA, se realizó un análisis transcriptómico en cultivos celulares de A. thaliana, mediante la tecnología de secuenciación a gran escala Illumina-mRNA-Seq. Se analizó el comportamiento de genes que responden a la señalización por LnA implicados en la generación de un fenómeno de estrés oxidativo durante situaciones de estrés abiótico, identificándose un total de 3275 genes que respondían a LnA. La mayoría estaban relacionados con la ruta biosintética del JA, como la Lipoxigenasa (LOX) o Aleno Óxido Ciclasa (AOC) [3]. Sin embargo, una parte importante de ellos estaba relacionada con el mecanismo de respuesta frente a diversas situaciones de estrés abiótico, como la galactinol sintasa (GOLS), diferentes enzimas detoxificadoras de grupos carbonilo y diferentes deshidrogenasas. En definitiva, el análisis funcional mediante tecnología RNA-seq permite ampliar nuestro conocimiento sobre la conexión de ROS y la ruta de señalización del JA, evidenciando que una parte significativa de estos genes codifica proteínas relacionadas con la respuesta de la planta a diferentes situaciones de estrés y estímulos abióticos. Bibliografía [] Suza WP et al. (200) Plant Physiol Biochem 48:337-50. [2] Hu X et al. (2009) Plant Signal Behav 4:696-7. [3] Wasternack C, Hause B (203) Ann Bot. Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos BIO202-33904, AGR-6374, AGR-6038, 2034R0569) y Junta de Andalucía (grupos BIO286 y BIO92). P-7 (R-4) MicroRNAs in tumor development Pedro Medina Vico Universidad de Granada, Granada, ES MiRNAs are a class of small RNA molecules that regulate gene expression at the posttranscriptional level. Initially discovered in Caenorhabditis elegans, they were considered an oddity of nematodes until it was realized that some of them were phylogenetically conserved in a wide variety of animals including humans. Today, mirnas are increasingly seen as important regulators of gene expression, ushering in a renewed appreciation of the regulative capabilities of ncrna. At the cellular level, mirnas are significant in the establishment and maintenance of cell identity. Aberrant levels of mirnas often result in loss of differentiation, a hallmark of cancer. Not surprisingly, therefore, dysfunctions of the mirna pathway affect many cellular processes that are routinely altered in cancer, such as differentiation, proliferation, apoptosis, metastasis, and senescence. Although the mirna era started only a few years ago, it has brought great promise for diagnosis, prognosis, and therapy of cancer. The quick development of powerful techniques such as mirna microarrays, short- RNA deep sequencing, specific quantitative polymerase chain reaction (PCR) of mirnas, and antisense technologies is expected to have a significant impact on clinical oncology in the next decade. P-8 Búsqueda de termoenzimas hidrolíticas en una metagenoteca de aguas termales Juan José Escuder Rodríguez, Kamila Knapik, María Isabel González Siso, Manuel Becerra Fernández Universidad de A Coruña, A Coruña, ES La metagenómica funcional, es decir, el estudio del genoma colectivo de una comunidad microbiana presente en una muestra ambiental, es una poderosa herramienta para explotar la gran diversidad de microorganismos no cultivables en la búsqueda de nuevas enzimas con aplicación industrial. La técnica se basa en la extracción del material genético presente en la muestra ambiental y su clonación en un hospedador heterólogo para la obtención de una biblioteca metagenómica (metagenoteca) en la que identificar actividades enzimáticas de interés añadiendo los sustratos adecuados al medio de cultivo. Esta metodología, en comparación con la metagenómica basada en secuencia, permite encontrar nuevos productos génicos que no presentan homología significativa con las secuencias conocidas y depositadas en las bases de datos. Determinados procesos industriales se llevan a cabo en condiciones adversas para la mayoría de microorganismos, tales como elevadas temperaturas, ph extremo, alta salinidad o alta concentración de solventes. En este sentido, es común la búsqueda de enzimas procedentes de comunidades microbianas de ambientes extremos, en los que se dan condiciones similares. En este trabajo se ha construido una metagenoteca a partir de una muestra de aguas termales para la búsqueda de enzimas hidrolíticas estables a elevadas temperaturas. Debido a que los fenómenos de transcripción, traducción, plegamiento y secreción del producto génico pueden ser incorrectos al emplear como hospedador la bacteria mesófila Escherichia coli, se ha empleado un vector lanzadera que permite la transferencia de la metagenoteca a la bacteria termófila Thermus thermophilus para incrementar los productos génicos detectables. Pm-9 Identificación de biomarcadores y nuevas proteínas relacionadas con la enfermedad aterosclerótica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 Beatriz García-Fontana, Sonia Morales-Santana 2, Victoria Longobardo 3, Antonia García-Martín, Rebeca Reyes-García, Pedro Rozas-Moreno 4, José Antonio García-Salcedo 5, Manuel Muñoz- Torres Unidad de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de Endocrinología, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2 Unidad de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de Endocrinología, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario San Cecilio - Servicio de Proteómica, Fundación para la Investigación Biosanitaria de Andalucía Oriental -Alejandro Otero- (FIBAO), Granada, ES, 3 Servicio de Proteómica, Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra (CSIC), Granada, ES, 4 Servicio de Endocrinología, Hospital General de Ciudad Real, Ciudad Real, ES, 5 Unidad de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, ES La prevalencia de diabetes mellitus está aumentando rápidamente alcanzando proporciones epidémicas. Esta enfermedad se asocia a numerosas complicaciones, siendo la enfermedad aterosclerótica (EA) una de las más relevantes debido a su morbimortalidad. Por ello, la identificación precoz de pacientes diabéticos con alto riesgo de padecer EA es relevante para reducir el impacto de esta enfermedad y sus complicaciones. El objetivo de este estudio fue comparar el proteoma sérico de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2) con o sin EA con el de sujetos sanos para identificar biomarcadores o proteínas esenciales que intervengan en la patogénesis de la DM2 y la EA. 05

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Se realizó un estudio proteómico incluyendo 8 hombres divididos en tres grupos: i) 6 pacientes con DM2 y EA, ii) 6 pacientes con DM2 sin EA; iii) 6 controles sanos. Se realizó una depleción proteica de las 4 proteínas mayoritarias para mejorar la sensibilidad de detección en suero. Los perfiles proteicos fueron separados mediante 2D-DIGE y las imágenes obtenidas fueron analizadas mediante el software específico DeCyder 7.0. Las proteínas expresadas diferencialmente se identificaron por espectrometría de masas-masas (MALDI TOF-TOF) o cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Nuestros resultados muestran una sobreexpresión de la proteína de unión a retinol plasmático (RBP) y de la glutation peroxidasa 3 (GPx -3) y una disminución de los niveles séricos de Transtirretina (TTR) en pacientes con DM2 y EA en comparación con pacientes diabéticos sin EA y controles sanos. El análisis proteómico revela cambios en proteínas relacionadas con procesos inflamatorios en pacientes con DM2 y EA sugiriendo que el proceso inflamatorio juega un papel muy importante en el desarrollo de complicaciones vasculares en la DM2. Estas proteínas podrían actuar como biomarcadores o dianas terapéuticas de la enfermedad aterosclerótica en pacientes con DM2 mejorando la supervivencia de estos pacientes. Pr-0 (R-5) Fucosylation increase in α- acid glycoprotein (AGP) in pancreatic cancer Meritxell Balmaña, Estela Giménez 2, Ángel Puerta 3, Esther Llop, Carme de Bolós 4, Sílvia Barrabés, Mercedes de Frutos 3, Rosa Peracaula Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology, University of Girona, Girona, ES, 2 Department of Analytical Chemistry, University of Barcelona, Barcelona, ES, 3 Institute of Organic Chemistry (CSIC), Madrid, ES, 4 Institute Hospital del Mar of Medical Investigations (IMIM), Barcelona, ES Pancreatic cancer (PDAC) is the fourth leading cause of cancer death []. Its low survival rate (around 5% in 5 years) is due to the intrinsic aggressiveness of this tumour and also to a late diagnosis. The only biomarker available for PDAC is CA9-9, but it is currently only used to monitor the pathology because of its false positive results. Previously, our group performed N-glycan analysis of major serum acute phase proteins, including α- acid glycoprotein (AGP), in pancreatic cancer, chronic pancreatitis and healthy control sera and concluded that increase in core fucosylation in AGP could be cancer associated [2]. In this study, AGP from serum samples from a larger cohort (N=3) was purified using an anti-agp immunoaffinity column. Different ELISAs using specific fucose recognizing lectins and antibodies against fucosylated epitopes were performed to determine differences in AGP glycoepitopes between the groups. In addition, relative quantitation of AGP glycosylation variants by stable isotope labelling of AGP released N-glycans was carried out using [2C]/[3C] aniline and ZIC-HILIC-ESI-TOF-MS [3]. Furthermore, AGP isoforms were analysed by capillary electrophoresis (CE-UV) [4]. An increase in fucosylation levels using Aleuria aurantia lectin was found in PDAC patients compared to chronic pancreatitis and healthy controls and this increase was more marked in the advanced PDACs. The sialofucosylated antigen (sialyl-lewis x) also tended to be increased in the AGP of the PDAC group. Complementarily, MS results showed an increase in the levels of certain fucosylated glycan structures between chronic pancreatitis and PDAC. Moreover, significantly different profiles by CE-UV, which separates AGP isoforms, were obtained between AGP from controls and PDACs. Altogether these results suggest that AGP fucosylation levels could be useful as a PDAC marker. References: [] Siegel R, et al. CA Cancer J Clin 204. [2] Sarrats A, et al. Proteomics Clin Appl 200. [3] Gimenez E, et al. Anal Bioanal Chem 203. [4] Puerta A, et al. Methods Mol Biol 203. P- Identificación de proteínas celulares de unión al elemento CRE del genoma del virus de la hepatitis C Pablo Ríos Marco, Cristina Romero López, Alba Fernández Sanlés, Alfredo Berzal-Herranz Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Armilla, ES El genoma del virus de la hepatitis C (HCV) es un RNA monocatenario de polaridad positiva con una longitud aproximada de 9,6 Kb. Existen diversos dominios estructurales en su genoma que destacan por su capacidad para regular procesos esenciales para el virus tales como su traducción y replicación. Dos de estos dominios son el lugar de entrada interna del ribosoma (IRES) o la región 3 X-tail, situados en las regiones no traducibles 5 UTR y 3 UTR respectivamente. Otro dominio de gran interés en el genoma del virus es el denominado cis-replicating element (CRE), presente en el extremo 3 de la región codificante del virus. CRE tiene capacidad de interactuar con IRES o 3 X-tail y así regular cambios necesarios entre las etapas de traducción y replicación del ciclo infectivo del virus. En este trabajo hemos tratado de identificar proteínas celulares que muestren asociación con el elemento CRE y puedan afectar a su interacción con otros dominios del genoma viral. Así, experimentos de incubación del fragmento CRE con lisados celulares en condiciones de competición con IRES, con el propio CRE o con un RNA no relacionado, fueron utilizados para demostrar la especificidad de unión de CRE a proteínas celulares. Las proteínas obtenidas tras los ensayos de pull-down se analizaron mediante electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) D y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Estas técnicas nos han permitido identificar un conjunto de proteínas que interactúan con la región CRE del HCV entre las que destacan miembros de la familia hnrnp, tubulinas, helicasas y factores relacionados con la traducción. Asimismo, ensayos de unión de CRE a subunidades ribosomales demuestran que CRE se une específicamente a la subunidad 40S. Todos estos resultados son de gran importancia para investigar la relación de CRE con diferentes factores celulares y otros dominios del virus y así poder comprender cómo dichas interacciones afectan a procesos biológicos del virus. P-2 Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp en el proteoma hepático del lenguado senegalés (Solea senegalensis) cultivado a diferentes densidades de biomasa Juan Jurado, Tránsito García-García, Miguel Ángel Moríñigo 2, María José Prieto-Álamo Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES, 2 Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES La introducción de nuevas especies es uno de los desafíos pendientes para desarrollar una acuicultura productiva, viable y sostenible. En este sentido, el lenguado senegalés (Solea senegalensis) es una especie con alto potencial en la acuicultura marina española. Sin embargo, la escasez de herramientas veterinarias constituye una seria limitación para la implantación del cultivo intensivo del lenguado, muy susceptible a patologías infecciosas por Photobacterium, Vibrio y Tenacibaculum, sobre todo cuando se cultiva a densidades elevadas de biomasa. Los probióticos (PB) constituyen una opción interesante ya que en los peces aumentan tanto la eficiencia de la alimentación como la resistencia a las enfermedades y a otras situaciones de estrés. Con el objeto de investigar las bases moleculares de este efecto beneficioso a nivel de expresión de proteínas, en este trabajo hemos estudiado el efecto del PB Shewanella putrefaciens Pdp en el proteoma hepático del lenguado senegalés cultivado a dos densidades diferentes: (i) densidad normal (DN: 7 Kg/m2), y (ii) densidad alta (DA: 30 Kg/m2). Este estudio se llevó a cabo mediante la separación de proteínas por electroforesis bidimensional en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 06

Granada 204 Pósters (2-DE) utilizando tiras de amplio rango de ph (3-NL). Las proteínas diferencialmente expresadas se identificaron mediante el uso combinado de huella peptídica y espectrometría de masas en tandem (PMF + MS/MS). El tratamiento de los peces con el PB provocó cambios en la expresión de 6 proteínas a DN y de 2 a DA de cultivo. Por otra parte, el estrés generado por el cultivo de los peces a DA en ausencia de PB, afectó a la expresión de proteínas, produciendo mayoritariamente incrementos de expresión. Por el contrario, en presencia de PB, la DA provocó principalmente disminuciones de expresión. Entre las proteínas afectadas, hay proteínas implicadas en el metabolismo de glúcidos (PGAM, GAPDH y F6P), en el metabolismo de aminoácidos y proteínas (LAP, PHGDH, FAAA, y SPYA), en la detoxificación de xenobióticos (GSTR y GSTT) o en el transporte de hierro (TF). Financiación: AGL20-3038-CO3-03. P-3 Nueva función del GEF C3G como regulador del secretoma plaquetario: implicación en la patología trombótica Victor Martin Granado, Sara Gutiérrez Herrero, Sara Alonso Alvarez 2, Sara Ortiz Rivero, José Ramón González Porras 2, Neibla Priego Bendeck 3, Almudena Porras Gallo 3, Carmen Guerrero Arroyo Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES, 2 Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES, 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap, una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Específicamente, la isoforma Rapb participa en aspectos críticos de la función plaquetaria a través de la activación de la integrina αiibβ3. Además, se sabe que C3G juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como in vivo, a través de la activación de Rapb. En base a todo esto, nuestra hipótesis es que C3G puede influir en la secreción durante la activación plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones transgénicos para C3G (tgc3g) y C3GΔCat (un mutante con deleción del dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que las plaquetas tgc3g secretaron mayor cantidad que los controles, mientras que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad. El perfil de secreción proteica de las plaquetas tgc3g también fue diferente al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas diferencialmente secretadas por las plaquetas tgc3g se encontraban apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fibrinógeno, αhemoglobina y trombospondina-, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fisio-patológicos, especialmente en el contexto de patologías trombóticas. P-4 Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp sobre la expresión transcripcional del lenguado senegalés (Solea senegalensis) en respuesta a factores de estrés fisiopatológico María-José Prieto-Álamo, Laura Maldonado-Escudero, Silvana T Tapia-Paniagua 2, Miguel Ángel Moríñigo 2, Juan Jurado Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, Cordoba, ES, 2 Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES El cultivo del lenguado senegalés (Solea senegalensis), un organismo no modelo de interés para la acuicultura española, se ve dificultado por su susceptibilidad a diversas patologías y situaciones de estrés, sobre todo cuando se cultiva a altas densidades de biomasa, condiciones necesarias para la rentabilidad de las explotaciones. Actualmente, la acuicultura europea carece de herramientas veterinarias suficientes lo que supone una limitación para el desarrollo de este sector. Los probióticos son una opción interesante ya que parecen aumentar la eficiencia de la alimentación, la tolerancia a situaciones de estrés, y la resistencia a enfermedades. El análisis de los patrones de expresión transcripcional aporta una valiosa información sobre el funcionamiento coordinado de los genes en respuesta a distintas variables. Hemos analizado, mediante qrt-pcr en tiempo real, los perfiles hepáticos de expresión transcripcional de S. senegalensis, en respuesta a estrés por sobrepoblación y a una infección por bacterias del genero Vibrio. En ambos casos se ha investigado el efecto del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp. Se han cuantificado 28 transcritos que codifican proteínas implicadas en la respuesta inmune, respuesta a estrés, metabolismo central y crecimiento, y proteasas relacionadas con varios procesos biológicos. Los resultados muestran que los lenguados cultivados a alta densidad presentan niveles disminuidos de varios transcritos de la respuesta inmune, lo que explicaría su mayor susceptibilidad a sufrir infecciones. Por el contrario la infección indujo la expresión de la mayoría de los genes relacionados con la respuesta inmune. En las condiciones analizadas, el probiótico no tuvo un efecto apreciable sobre los cambios de expresión debidos a la sobrepoblación, pero produjo una mayor resistencia a la infección en estos lenguados, lo que se relaciona con la recuperación de niveles normales de los transcritos de la respuesta inmune. Los resultados respaldan el efecto beneficioso de S. putrefaciens Pdp como tratamiento profiláctico en situaciones de susceptibilidad a patógenos durante el cultivo del lenguado. Financiación: AGL20-3038-CO3-03. P-5 itraq analysis of hepatic proteins in free-living Mus spretus mice to assess the contamination status of areas surrounding Doñana National Park Nieves Abril Díaz, Eduardo Chicano-Galvez, Carmen Michán Doña, Carmen Pueyo de la Cuesta, Juan López-Barea Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Doñana National Park (DNP), a Biosphere Reserve located at SW Spain, includes some of the most environmentally valuable ecosystems in Europe. Nevertheless, DNP is threatened by pesticides, metals and contaminants carried out by local streams and Guadalquivir River. A follow-up study started by combining conventional biomarkers and 2-DE proteomic approaches that resolved near 3,000 protein spots. Based on these pioneering studies, we have combined several omics approaches for the identification of molecular biomarkers of pollution exposure, using the aboriginal species Mus spretus as bioindicator. This mouse is phyllogenetically related to Mus musculus, thus facilitating the use of its gene/protein sequence databases for massive identification of proteins and transcripts with altered expression. Here we report the results of a second generation proteomic study in free-living M. spretus from neighboring areas of Doñana National Park (DNP) with different pollution levels. Liver proteins from mice captured at the Matochal rice fields (MAT), the Rocina stream (ROC), two sites of the Partido streams (PAR, AJO) and the reference site Lucio del Palacio (LP), were labeled with itraq-8plex tags to quantify differentially expressed proteins. A previous isoelectric focusing step was included to improve separation of the highly complex peptide mixture. Mass spectrometry was carried out in a LTQ Orbitrap system for protein dentification and itraq reporter ion quantitation using the Mus musculus database as reference. Of the near 00,000 peptides sequenced, 032 proteins were identified and quantified by itraq reporter ions, leading to the identification of 8 proteins that were significantly altered (> 2.5 fold variation) in at least two problem areas (PAR, AJO, ROC or MAT) compared to the reference (LP). The results 07

Pósters XXXVII Congreso SEBBM of itraq analysis were confirmed by Western blotting. The identified proteins provide insight about the different defense strategies in free-living mice affected by pollutants in DNP and its surrounding areas (CTM202-38720-C03-02, CVI-3829, CTM2009-2858-CO2-02, BIO675). Pr-6 Análisis de la expresión de la proteína CD26/DPPIV en diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal Marta Rodríguez Quiroga, Lorena Vázquez-Iglesias, Leticia Barcia Castro, Andrea Díaz Díaz, Oscar J Cordero 2, Fco.Javier Rodriguez Berrocal, María Páez de la Cadena Dpto.Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2 Dpto.Bioquimica y Biología Molecular, Ed. CIBUS, Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES La proteína CD26 (dipeptidil peptidasa IV, DPPIV; EC 3.4.4.5) es una glicoproteína transmebrana exopeptidasa, localizada en la superficie celular de linfocitos, células endoteliales y epiteliales. Sus funciones, dependientes e independientes de la actividad enzimática parecen estar relacionadas con la regulación de respuestas inflamatorias e inmunológicas, la transducción de señales y la apoptosis, sugiriendo su implicación en la progresión tumoral. También se encuentra en forma soluble en varios fluidos biológicos y hemos propuesto su utilidad como biomarcador en cáncer colorrectal (CCR). Se ha descrito como supresor tumoral tanto en cáncer de páncreas como en melanoma y hay indicios de que cumple esta función en CCR. Numerosos estudios muestran que las células tumorales reactivan lo que se conoce como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT). En su intento por liberarse de su confinamiento habitual, las células sufren una serie de cambios que conllevan a una mayor capacidad migratoria, invasividad y una elevada resistencia a apoptosis. Las células que están sufriendo esta transición se pueden identificar generalmente por la presencia o ausencia de determinadas moléculas que las dotan de una estructura más flexible, capacidad de viajar, y por una forma diferente a la de la célula epitelial. En este trabajo nos propusimos analizar la expresión de la proteína CD26 y de dos proteínas implicadas en la EMT: E-cadherina y vimentina en 8 líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal de diferentes estadios: SW6, SW480, SW620, DLD-, COLO205, T84, HT-29 y Caco-2 mediante técnicas de western blot y citometría de flujo. Los resultados muestran que las líneas SW480 y SW620 presentan un fenotipo mesenquimal ya que tienen niveles elevados de la proteína vimentina mientras que los niveles de E-cadherina son significativamente menores a los de las otras líneas celulares analizadas que muestran un fenotipo de tipo epitelial. Los resultados obtenidos tanto por citometría como por western blot indican que la proteína CD26 se expresa casi exclusivamente en células de fenotipo epitelial. Financiación: AECC (GCB33592CAST), INBIOMED (CN202/273), REGICC (CN202/27). Pm-7 Estudio del interactoma de Ixr en Saccharomyces cerevisiae Aida Inés Barreiro Alonso, Ángel Vizoso Vázquez, Mónica Lamas Maceiras, María Esperanza Cerdán Villanueva Universidad de A Coruña, A Coruña, ES Ixr es una proteína HMG de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Dicha proteína se identificó por su unión a DNA platinado. El cisplatino es una droga antitumoral empleada principalmente para el tratamiento de tumores sólidos como los presentes en el cáncer de ovario, testículo o cuello []. Ixr es, además, un factor transcripcional implicado en la adaptación a condiciones de normoxia e hipoxia. Así, se ha visto que reprime la expresión aerobia de genes como COX5B [2], TIR [3] y HEM3 [4] así mismo también se ha observado que en el caso de HEM3 activa su expresión en condiciones de anaerobiosis. Por otra parte Ixr participa en la respuesta a estrés oxidativo, ya que se ha determinado que su ausencia incrementa la sensibilidad a la presencia de peróxidos [5]. Estructuralmente Ixr se caracteriza por la presencia de dos dominios HMG dispuestos en tándem, y varias regiones de poliglutaminas. Diversos estudios han puesto de manifiesto que Ixr interacciona con DNA platinado a través de sus dominios HMG []. Para poder profundizar en el conocimiento de las diferentes funciones en las que está implicado Ixr es necesaria la búsqueda de nuevas interacciones de esta proteína. El sistema TAP (Tandem Affinity Purification) y el sistema de doble híbrido son dos técnicas de gran utilidad a la hora de identificar nuevas interacciones entre proteínas. En este trabajo se han empleado estos dos métodos para encontrar posibles interacciones de Ixr con otras proteínas en Saccharomyces cerevisiae. Para ello se ha optimizado el método TAP empleando diferentes etiquetas/epítopos y mejorando las condiciones de purificación. Bibliografía [] M.M. McA Nulty et al., Mutat. Res. (996), 75-86. [2] J.R Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (994), 9:7345-9. [3] J.P. Bourdineaud et al., Mol. Microbiol. (2000), 38:879-890. [4] R. Castro-Prego et al., FEMS Yeast Res. (200), 0:309-32. [5] R. Castro-Prego et al., Biochem. J. (200), 425():235-43. Pr-8 Niveles de proteína y actividad enzimática de MMP-9 en cáncer de pulmón no microcítico Leticia Barcia Castro, Sonia Blanco Prieto, Lorena Vázquez Iglesias, F.J. Rodriguez-Berrocal, M. Isabel Botana Rial 2, M. Paez de la Cadena Dpto. Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2 Servicio de Neumología, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Vigo, ES Las enzimas Metaloproteasas de Matriz Extracelular (MMP) juegan un papel esencial en la progresión del tumor en distintos tipos de cáncer. En particular la MMP9 o gelatinasa B degrada componentes de la matriz como el colágeno tipo IV por lo que se la relaciona con procesos de invasión y metástasis. Aunque la función reside en su actividad enzimática, la mayoría de los estudios sobre su valor como marcador tumoral se realizan cuantificando los niveles de proteína. El objetivo de nuestro estudio es determinar en el suero de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), los niveles de proteína y de actividad enzimática de MMP-9 mediante técnicas de ELISA y ensayos de zimografía. En las zimografías se cuantificó la actividad atendiendo a sus diferentes isoformas: prommp9 (92 kda), el conjunto de la prommp9 (92 kda) y la pro-mmp9-ngal (30 kda) y finalmente, la MMP9 total (prommp9, prommp9-ngal y Homodímero prommp9). Los resultados muestran que los niveles de MMP-9 (tanto de proteína como de actividad) se incrementan en las muestras de pacientes con CPNM en comparación con el grupo control. La media de los niveles de proteína en el grupo control es de 209,04±48,6 (ng/ml) frente a 392,29±24,6 (ng/ml) en CPNM. En el caso de la actividad, considerando el conjunto constituido por la prommp9 y prommp9-ngal, los valores para el grupo control son de 6,57±,38 (u.a.) frente a 25,39±3,9 (u.a.) de las muestras con CPNM. El estudio de correlación entre los niveles de MMP-9 obtenidos mediante zimografía y los obtenidos por ELISA muestran correlaciones diferentes dependiendo de la banda de actividad considerada siendo el conjunto prommp9 y prommp9-ngal el que presenta mejor correlación con los niveles séricos. Financiación: Agrupamento Inbiomed 202/73, Proyecto PS09-00405, Instituto de Salud Carlos III y fondos FEDER. 08

Granada 204 Pósters P-9 Análisis mediante pirosecuenciación del grado de metilación del gen SEPT9 en suero para el diagnóstico de cáncer colorrectal Loretta De Chiara, Olalla Otero-Estévez, María Páez de la Cadena, Francisco Javier Rodríguez Berrocal, Vicenta Soledad Martínez Zorzano Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Facultad de Biología, Universidad de Vigo, Vigo, ES Recientemente, tras analizar cualitativamente el estado de hipermetilación del gen SEPT9, éste ha sido propuesto como marcador diagnóstico para cáncer colorrectal (CCR). El objetivo de este trabajo es cuantificar mediante pirosecuenciación el porcentaje de metilación de SEPT9 en suero de individuos sometidos a colonoscopia. Adicionalmente se evaluó su valor diagnóstico para detectar casos de CCR y de neoplasia avanzada (adenomas avanzados o CCR). Por pirosecuenciación se estudiaron 7 sitios CpG incluidos en la región promotora del gen, en muestras de suero de: 2 individuos sin hallazgos, 5 con patologías benignas, 9 con adenomas no avanzados, 7 con adenomas avanzados y 22 casos de CCR. Para evaluar la capacidad diagnóstica se construyeron curvas ROC y se calcularon las áreas bajo la curva (AUC) para cada sitio CpG y sus combinaciones realizadas mediante regresión logística binaria. Fijando la especificidad al 90%, se estimó la sensibilidad del marcador en cada supuesto. Para el diagnóstico de CCR, los valores de AUC obtenidos para cada uno de los sitios CpG estudiados estuvieron comprendidos entre 0,5-0,60, con valores de sensibilidad de 4,5-8,2%. La mayor sensibilidad (36,4%) se alcanzó combinando las posiciones a 6 (AUC: 0,74). En cuanto a la detección de neoplasia avanzada, el AUC resultó entre 0,50-0,59 para los 7 sitios analizados, con sensibilidades de 0,3-24,%. La combinación óptima (posiciones a 4 y 7) mostró un AUC de 0,70 (sensibilidad 4,4%). En resumen, a pesar de la baja sensibilidad que presenta la metilación de SEPT9 para la detección tanto de CCR como de neoplasia avanzada, el análisis por pirosecuenciación permitió identificar los sitios CpG que más contribuyen, lo que permitirá optimizar su capacidad diagnóstica. Financiación: Fundación Científi ca de la Asociación Española contra el Cáncer (GCB33592CAST) y Fondo de Investigación Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III - FEDER (PI2/007). P-2 Análisis proteómico de vesículas de membrana externa aisladas de cultivos de la cepa probiótica Escherichia coli 97 en medio DMEM Lorena Toloza Maturana, Laura Aguilera Gil, María José Fábrega Fernández, Rosa Giménez Claudio, Laura Baldomà Llavinés, Josefa Badía Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona, Institut de Biomedicina de la UB (IBUB), Barcelona, ES Escherichia coli Nissle 97 (EcN) es un probiótico utilizado en el tratamiento de patologías intestinales. EcN favorece el equilibrio de la microbiota y mejora la homeostasis intestinal. Sin embargo, existe poca información sobre cómo las moléculas efectoras liberadas por este probiótico acceden a las células del huésped. Las bacterias gram-negativas producen vesículas de membrana externa (OMV). Estas estructuras desempeñan un rol importante en la interacción bacteria-huésped. Por ello, las OMV generadas por microbiota comensal y probióticos gramnegativos se vislumbran como agentes importantes en la señalización a nivel intestinal. Los estudios proteómicos pueden aportar información relevante en este contexto. Aquí se presenta el proteoma de las OMV aisladas de cultivos de la cepa EcN en DMEM, medio habitual para el cultivo de líneas de epitelio intestinal. Las proteínas de las OMV fueron separadas en geles de poliacrilamida-sds, extraídas del gel y analizadas por espectrometría de masas. Las proteínas identificadas fueron clasificadas en grupos funcionales según las bases UniProt y GenProtecEc y los resultados comparados con los obtenidos del proteoma de las OMV aisladas de cultivos en LB, recientemente publicado por nuestro grupo de investigación. Se identificaron un total de 48 proteínas, 4 eran comunes al proteoma de las OMV en LB. La distribución en grupos funcionales fue similar en ambos proteomas. En cuanto a su localización subcelular las OMV en DMEM presentan una mayor proporción de proteínas de membrana interna y de citoplasma. Así, el medio de cultivo determina la composición de las OMV. En conjunto los resultados demuestran que las OMV de probióticos contienen proteínas capaces de interaccionar con células del huésped y modular su función. * Estos autores han contribuido por igual. P-20 Análisis proteómico para el estudio de los mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de las RNA polimerasas eucarióticas Ana Isabel Garrido-Godino, Verónica Martínez-Fernández, Abel Cuevas-Bermúdez, Francisco Navarro Gómez Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES Las RNA polimerasas son complejos multiproteicos encargados de la transcripción. A pesar de que existe una amplia información de cómo estos complejos funcionan e interactúan en el núcleo celular de eucariotas, poco se sabe sobre los mecanismos de su ensamblaje citoplasmático y su posterior entrada al núcleo, así como de los procesos de reciclado y desensamblaje nucleares. Nuestra investigación ha permitido ahondar en estos procesos y describir nuevos mecanismos y proteínas implicados en los mismos. Mediante técnicas de análisis proteómicos, combinadas contécnicas genéticas, bioquímicas y de biología molecular hemos determinado la existencia de dos nuevas proteínas, Bud27 y Rtr que median estos procesos y que tienen un efecto directo en el ensamblaje de las RNA polimerasas eucarióticas y en el proceso transcripcional. Continuar con este tipo de abordaje, ayudará a clarificar y profundizar en estos mecanismos que tienen un interés crucial para entender la transcripción, no solo desde el punto de vista funcional en el núcleo, sino desde un punto de vista dinámico que implica, además, los procesos de ensamblaje y desensamblaje de la maquinaria de transcripción. P-22 c-myc como predictor de respuesta a la radioquimioterapia en el cáncer de recto Marta Cuadros Celorrio, Raquel Conde Muiño 2, Pablo Palma 2, Victoria Sánchez 3, Sofía Boyero 4 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e Inmunología, Universidad de Granada - Centro Pfizer-Universidad de Granada-Junta de Andalucía de Genómica e Investigación Oncológica (GENYO), Granada, ES, 2 Sección de Cirugía Colorrectal, Servicio de Cirugía General, HUVN Granada, Granada, ES, 3 Centro Pfizer - Universidad de Granada - Junta de Andalucía de Genómica e Investigación Oncológica (GENYO), Granada, ES, 4 Universidad de Granada, Granada, ES Introducción: El tratamiento actual del cancer de recto localmente avanzado (CRLA) incluye regímenes de radioquimoterapia (RQPT) antes de la exéresis quirúrgica. Hasta la fecha, no existe ningún marcador que pueda predecir la respuesta a esa RQPT, sin poderse detectar el alto índice de pacientes que no se benefician de esta actuación, no exenta de morbilidad y de un alto coste económico.el objetivo de este estudio es evaluar la expresión de c-myc como posible marcador de respuesta a la RQTP en pacientes afectos con CRLA. Material y métodos: Para determinar si la sobreexpresión del ARNm de c-myc se correlacionaba con una amplificación del ADN se realizó hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Además, se realizó la inmunohistoquímica de c-myc. Se analizaron mediante curvas ROC la 09

Pósters XXXVII Congreso SEBBM sensibilidad y especificidad de la sobreexpresión de c-myc para predecir la respuesta al tratamiento. Resultados: Identificamos mediante microarrays 257 genes cuya expresión era distinta y significativa entre respondedores y no respondedores a la RQTP. En la red de interconexión más importante destacaban 24 genes relacionados directa o indirectamente con c-myc. Ninguno de los tumores amplificó c-myc. El 00% de las muestras presentaron un elevado número de células tumorales positivas (>90%), independientemente de su respuesta al tratamiento.el análisis de curvas ROC indica que la sobreexpresión de c-myc tiene una especificidad del 93.8% y una sensibilidad del 70% para determinar la respuesta al tratamiento. Conclusiones: La sobreexpresión de c-myc a nivel de ARNm muestra una buena correlación con la respuesta a la QRTP en pacientes afectos de CRLA. P-23 (R-6) Differentiation of mouse embryonic stem cells towards pancreatic beta-cell surrogates through regulation of Pdx by nitric oxide Carmen Salguero Aranda, Rafael Tapia Limonchi, Gladys Cahuana Macedo 2, Ana Belén Hitos Prados, Irene Díaz Contreras, Karim Hmadcha, Mario Fernández Fraga 3, Franz Martín Bermudo, Bernat Soria Escoms, Juan R. Tejedo Huamán, Francisco Bedoya Bergua Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa- CABIMER, Sevilla, ES, 2 Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 3 Hospital Universitario Central de Asturias, Asturias, ES Pdx (Pancreatic and duodenal homeobox ) is a transcription factor that regulates the pancreatic development and the differentiation and functionality of beta cells. Our group has shown that exposure of mouse embryonic stem (mes) cells to high concentrations of NO donors such as diethylenetriamine nitric oxide adduct (DETA-NO) increases the expression of Pdx. In that study we report that the increase of Pdx expression after NO treatment is associated with the release of Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) and the histone acetyltransferase P300 from its promoter. Moreover, it is observed some changes in bivalent marks of histone H3k27me3 and H3K4me3, site specific changes of DNA methylation, and no changes in H3 acetylation of Pdx promoter. The knowledge of the regulation of the gene Pdx has allowed us develop a protocol to differentiate mes cells towards insulin producing cells. The protocol consists of adding to the culture medium 0.5 mm DETA-NO for 9 hours, 00 μm valproic acid for 6 days, 50 μm P300 inhibitor for 20 hours and a final step of suspension culture to form aggregates for 3 days. This simple and cost effective differentiation protocol allows the generation of cells stably expressing markers of beta-cells such as Pdx, Nkx6., GcK, Kir6.2, Glut-2 and insulin. Subvencionado por Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-20-65- 900000) y Junta de Andalucía (CTS- 727/20). particular, la nefropatía diabética (ND) es la principal causa (44,3%) de ERC terminal en el mundo. Estos pacientes presentan un riesgo cardiovascular (CV) añadido y se estima que el 40% de la población española con enfermedad renal oculta (no diagnosticada) fallecerá principalmente de problemas cardiovasculares. Si bien es conocida la existencia de un síndrome cardio-renal, o desorden por el cual la disfunción del corazón o riñón afecta al otro órgano, no se comprenden del todo los procesos que operan específicamente en este contexto. En este trabajo, perseguimos un doble objetivo: a) la identificación de nuevos marcadores de ERC, ND y riesgo CV, y b) la aplicación de nuevas tecnologías como la Espectrometría de Masas de Imagen (MSI) al estudio de la aterosclerosis como patología de base en el síndrome cardio-renal. En un abordaje multidisciplinar empleando RMN, DIGE y SRM-LC-MS/ MS en modelos animales tempranos de ND y aterosclerosis y en muestras humanas, hemos analizado el proteoma y el metaboloma de tejido renal, tejido arterial, orina y exosomas aislados de orina. En paralelo, hemos desarrollado y aplicado con éxito un protocolo MSI de análisis de arterias que permite identificar, in situ, mapas moleculares específicamente asociados a regiones arteriales concretas (zona de placa, capa íntima o capa media) y su implicación en el desarrollo de la lesión aterosclerótica. P-25 Aislamiento de una nueva hidrolasa a partir de un manantial geotermal mediante metagenómica funcional Mª Eugenia de Castro, Esther Rodriguez-Belmonte 2, Maria Isabel González-Siso 2 Universidad de A Coruña, A Coruña, ES, 2 Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de A Coruña, A Coruña, ES Las beta-galactosidasas (EC 3.2..23) constituyen una gran familia de proteínas con capacidad para catalizar la hidrólisis de enlaces β-d (,4)-galactosídicos y participar en reacciones de transgalactosilación. Por ello, son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria como intermediarias para la producción de leche sin lactosa, la revalorización de los sueros o la obtención de galacto-oligosacáridos, constituyentes fundamentales de los prebióticos, entre otros. En los últimos años, la posibilidad de obtener beta-galactosidasas termoestables y el creciente mercado de alimentos funcionales han incrementado su interés industrial. La metagenómica funcional permite analizar el genoma colectivo de una comunidad microbiana expresándolo de manera heteróloga y constituye un campo emergente de la biotecnología que ha permitido la caracterización de enzimas procedentes de microorganismos de ambientes difíciles de aislar por sus condiciones extremófilas. En el presente estudio se recoge la purificación y caracterización enzimática de una hidrolasa obtenida mediante búsqueda funcional en una metagenoteca de aguas termales procedentes del manantial del Riocaldo (Lobios, Ourense), no descrita hasta el momento y que presenta actividad hidrolasa estable a 65ºC. P-24 (R-3) Estrategias ómicas aplicadas al estudio de la patología renal y vascular Irene Zubiri, Marta Martín-Lorenzo, Laura González-Calero, María Posada-Ayala, Aroa S. Maroto, Fernando Vivanco, Gloria Álvarez- Llamas Departamento de Inmunología, IIS-Fundación Jiménez Díaz, UAM, Madrid, ES La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema emergente en todo el mundo. En España, en pacientes seguidos en atención primaria con enfermedades tan frecuentes como hipertensión arterial (HTA) o diabetes mellitus (DM), la prevalencia de ERC puede alcanzar el 35-40%. En P-26 Recombinant glycoproteins gp25 and gp350 for immunodiagnostic of EBV Iván Iglesias Baena, Encarnación Campos Gutierrez, Fernando Morcillo de Amuedo, Julian López-Viota, José Rojas, Ainel Alemán Vircell SL, Granada, ES Serodiagnosis of Epstein-Barr virus (EBV) gain relevance for its relationship with nasopharyngeal carcinoma and other EBVassociated diseases. Viral capsid glycoproteins gp25 and gp350 has been described as good antigens for early infections, which proteins combined with EBNA and p8 could improve the sensitivity. The yeast and mammalian overexpression of recombinant proteins is an important 0

Granada 204 Pósters tool to obtain post-translational modifications, which can be essential in its antigenicity, and higher yield than the native form obtained from virus culture. We have purified the tagged gp25 from Baculovirus and Pichia pastoris system, and the N-terminal gp350 and C-terminal gp350 from Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris system. The improvement of the expression conditions in a bioreactor were carried out with the control of parameters in order to reduce degradation and to obtain higher biomass. After yeast cell disruption and clarification, the purification strategy were carried out by affinity chromatography in FPLC system and analyzed using the specific monoclonal antibodies. Both enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and magnetic nanoparticules (MNP) have been used to get an antigen characterization of the different fussion proteins, developing a new method of diagnostic with high sensitivity and specificity. The gp25 obtained from Pichia pastoris showed similar activity than the commercial native antigen, and contribute to distinguish between possitive and negative serum samples for IgM. We have observed the crucial role of the expression in eukaryotic system of early antigens from the capsid of EBV in order to conserve the relevance glycosilations into the conformational epitopes. P-27 P recombinant antigen for the Mycoplasma pneumoniae diagnosis Anabel López Ramos, Ana Leticia Jiménez Escobar 2, Ivan Iglesias Baena, Encarnación Campos Gutierrez, Fernando Morcillo, Julian López Viota, Jose Rojas Vircell SL, Granada, ES, 2 Universidad de Granada, Granada, ES Mycoplasma pneumoniae is a human pathogen that causes atypical bacterial pneumonia with high prevalence in children and young adults. Other pathogens produce pneumonia with a nonspecific clinical, so to develop an immunological method with high sensitivity and specificity. A kit for the diagnostic of M. pneumoniae by ELISA has been developed by Vircell S.L. for detection of the infection in the early state (IgM). The adhesin P has been described as a good antigen for serological test for its immunogenicity. This membrane protein has been obtained from the bacterial extract, but in order to improve the relation yield-cost, we have designed the cloning and overexpression of P in eukaryotic and prokaryotic system. The C-terminal fragment of P has been cloned into expression vector for Baculovirus and Escherichia coli, obtaining a tagged proteins that were purified by affinity chromatography in FPLC system and analyzed using specific monoclonal antibodies. We have developed the expression and purification process to obtain the purified protein. The obtained recombinant P, conserve the crucial epitopes for the discrimination between positive and negative serum samples. Indeed, we have develop a new platform for mycoplasma diagnosis, using nanoparticles labelled to the antigen. P-28 Efecto de la aeroplisinina- sobre proteínas involucradas en el proceso angiogénico e inflamatorio Javier A. García-Vilas, Ana R. Quesada, Miguel Ángel Medina Torres Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA- Biomedical Research Institute of Málaga - Unidad 74, CIBER de Enfermedades Raras-CIBERER, Málaga, ES La aeroplisinina- metabolito secundario sintetizado por esponjas como mecanismo de defensa, ha sido caracterizada por nuestro grupo como un potente agente antiangiogénico por modular proteínas involucradas estrechamente en este proceso, tanto en células endoteliales de cultivos primarios como en células endoteliales inmortalizadas. Estudios posteriores que hemos realizado con la aeroplisinina-, han dilucidado que este compuesto también presenta capacidad antiinflamatoria al disminuir los niveles de proteínas a las que se les atribuyen importantes actividades inflamatorias por mediar algunos estadios como puede ser la atracción de células inflamatorias, proteasas para facilitar la trasvasación de las células desde el torrente sanguíneo hasta el foco inflamatorio, además de disminuir los niveles de COX-2 responsable de sintetizar moléculas de carácter inflamatorio. Tanto el proceso angiogénico como el proceso inflamatorio, no sólo se encuentran regulados por las proteínas a las que se les asocian directamente, sino que está descrito que en ambos procesos ejerce un importante papel las proteínas responsables del metabolismo redox. Mediante aproximación proteómica hemos comprobado que el tratamiento con aeroplisinina- modifica los niveles de proteínas relacionadas con el metabolismo redox, sugiriendo que el efecto antiinflamatorio y antiangiogénico de la aeroplisinina- demostrado en estudios anteriores, se debe al efecto multidiana sobre diversos módulos del metabolismo permitiendo engrosar las evidencias de este compuesto como un potente agente modulador de los procesos asociados a los tumores. Supported by grant P2-CTS-507 (Andalusian Government and FEDER) and funds from group BIO-267 (Andalusian Government). The CIBER de Enfermedades Raras is an initiative from the ISCIII. P-29 Actividad proteosomal en pacientes mexicanos con cáncer de próstata José Francisco Montiel-Sosa, Victoria Edwina Campos Garcia 2, Sandra Díaz-Barriga Arceo, Jorge Ramirez Salcedo 3, Sergio Ureta 4, Patricia Ramírez Noguera PhD. en Bioquímica, Departamento de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlán Izcalli, MX, 2 B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlan Izcalli, MX, 3 PhD. en Ciencias Biomedicas. Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, México, MX, 4 M.D.Médico Urólogo, Hospital Español, Distrito Federal, MX Dentro de las señales celulares involucradas en proceso de cáncer de próstata CaP, el sistema ubiquitina proteosoma y proteínas similares a ubiquitina (SUMO) juegan un papel muy importante. Con objeto de conocer el estado de ubiquitinación proteíca y sumoilación in vitro en biopsias de pacientes con cáncer de próstata se estimó, la capacidad de formación in vitro de aductos-ub y aductos-senp específicos utilizando las proteínas de fusión recombinantes HA-Ub-Vinilsulfona y HA-SUMO - y HA-SUMO 2/3-vinilsulfona (VS). Las sondas HA-Ub-VS y HA- SUMO--VS y -2/3-VS producto de la generación de unaproteína de fusión Tag-HA, reaccionaron covalentemente con los sitios nucleofílicos activos de las enzimas DUB y SENP respectivamente. Estas enzimas están presentes en el tejido prostático y dependiendo de su estado y actividad, se pudieron unir covalentemente con el grupo VS de cada sonda. Los resultados al momento muestran que la actividad similar a quimotripsina estimada por medio de ensayos fluorogénicos y utilizando sustratos específicos acoplados a coumarina está aumentada significativamente un 0 % respecto al control negativo analizado. Estas deducciones son importantes desde el punto de vista funcional del sistema ubiquitina proteosoma en la células. Este sistema multienzimático, es capaz de reconocer sustratos proteícos intracelulares necesarios en la modulación de señales enfocadas en el control de la función y degradación de proteínas señalizadoras en diversos procesos de transformación celular y cáncer. El aumento en la actividad proteolítica similar a quimotripsina sugiere una activación significativa en los pacientes de cáncer analizados quizá con este fin.

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P-30 Distinct serum proteome profiles associated with collagen-induced arthritis, and complete Freund s adjuvant-induced inflammation in CD38 / mice Antonio Rosal-Vela, Sonia García-Rodríguez, Jorge Postigo 2, Marcos Iglesias 2, Jesús Merino 2, Ramón Merino 3, Mercedes Zubiaur, Jaime Sancho Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Armilla (Granada), ES, 2 Departmento de Biología Molecular, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla, Universidad de Cantabria, Santander, ES, 3 Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria/CSIC-Universidad de Cantabria-SODERCAN, Santander, ES Collagen-type-II-induced arthritis (CIA) is milder in CD38 -/- than in WT mice. Their serum samples were treated with ProteoMiner-beads to equalize protein concentrations resulting in a significant enrichment in proteins from extracellular vesicles (blood microparticles, exosomes). ProteoMinerequalized samples were subjected to 2D-DiGE and MS-MALDI-TOF/TOF analyses to identify proteins that were differentially expressed in CD38 -/- versus WT mice either with arthritis (Col.II + /CIA + ), with no arthritis (Col. II + /CIA - ), or with inflammation (CFA-treated). Altered proteins included those involved in acute phase response (SAA), inflammation (B2MG, HABP2, Hemoglobin), complement activation (Ficolins, C4-B fragments, Cqb, C3-b-chain), polyclonal B-cell activation (Ig-kappa-light-chain) and lipid metabolism (APOE, APOAI, APOAII, APOAIV, APOJ/Clusterin). Of the proteins that changed in abundance, Hemoglobin and APOE could be indicative of the milder pathological process found in CIA + CD38 -/- mice, whereas another set of proteins such as HABP2, Ig-kappa-light-chain, SAA, Ficolin-, and Ficolin-2 were clearly associated to the stronger response of WT mice to either collagen immunization or CFA-treatment. Multivariate analyses revealed that the differential protein abundance of 28 distinct protein spots was able to discriminate between CIA + and CIA - mice, independently of their genetic background. This approach is suitable for the identification of arthritis, or inflammation serum proteome signatures in mice with distinct genetic backgrounds. P2. Metabolismo del nitrógeno P2- (R2-3) Análisis mutacional de la interacción GS-IFs en cianobacterias Rocío Robles Rengel, Lorena Saelices Gómez, Francisco Javier Florencio Bellido, María Isabel Muro Pastor Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, ciccartuja, Universidad de Sevilla-CSIC, Sevilla, ES La glutamina sintetasa de tipo I (GS) de Synechocystis sp. PCC 6803se regula a nivel transcripcional y postraduccional en función del balance carbono/nitrógeno celular. La regulación postraduccional se lleva a cabo mediante la interacción reversible proteína-proteína con dos factores inactivantes, IF7 e IF7 []. En el caso de Anabaena sp. PCC 720, existe un único factor inactivante denominado IF7A, homólogo a IF7 de Synechocystis. La GS de Synechocystis es inactivada por IF7, IF7 e IF7A, mientras que la GS de Anabaena sólo es inactivada por su propio factor, IF7A. Basándonos en esta observación, hemos construído cuatro proteínas quiméricas entre la GS de Synechocystis y la de Anabaena. El estudiocomparado de estas proteínas nos ha permitido localizar una región carboxilo terminal de 56 residuos de aminoácidos responsable de la interacción GS/IFs. Por otra parte conocemos la naturaleza electrostática de dicha interacción y se han identificado tres residuos de arginina de los factores inactivantes, claves para la funcionalidad de estas proteínas [2]. Hemos abordado un exhaustivo estudio mutacional de la región de 56 aminoácidos C-terminal de la GS de Synechocystis tanto in vitro (mediante ensayos de retardo en gel e inactivación con proteínas purificadas) como in vivo (expresando en Synechocystis las versiones mutantes de la GS). Hemos identificado tres residuos (glutamato 49, asparragina 456 y arginina 459 de la GS de Synechocystis) fundamentales para la interacción GS/IFs y la inactivación de la enzima. Analizando los resultados a la luz de la estructura de la GS de Synechocystis (PDB ID 3NG0), obtenida recientemente, observamos que estos tres residuos se localizan próximos y expuestos al solvente, constituyendo un núcleo para la interacción GS/IFs responsable de la inactivación de la enzima. Bibliografía [] García-Domínguez M, Reyes JC, Florencio FJ (999) Prot Natl Acad Sci USA 96, 76-766. [2] Saelices L, Galmozzi CV, Florencio FJ, Muro-Pastor MI. Mol Microbiol. 20 Nov; 82 (4):964-75. P2-2 (R2-) Análisis global de la degradación de residuos cianurados industriales por Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 Conrado Moreno Vivián, Víctor M. Luque-Almagro, Isabel Manso, Isabel Ibáñez, Lara P. Sáez, M. Paz Escribano, Purificación Cabello 2, Francisco Castillo, M. Dolores Roldán Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES, 2 Dpto. Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Diversas actividades industriales, como la minería y el electropulido del oro y otros metales preciosos en la joyería, generan residuos que contienen una elevada concentración de cianuro, un compuesto muy tóxico para la mayoría de los seres vivos. Así, la industria joyera de Córdoba genera anualmente varias toneladas de un residuo alcalino que contiene hasta,5 M de cianuro y diversos metales, como cobre, hierro y zinc, el cual debe ser tratado mediante procedimientos físico-químicos. La bacteria alcalófila Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 puede utilizar cianuro, cianato, diferentes nitrilos y complejos cianuro-metálicos como única fuente de nitrógeno, por lo que es un buen candidato para la biodegradación de los residuos cianurados industriales. Para optimizar la degradación del residuo de la joyería en biorreactores, se ha estudiado el efecto del ph, la aireación, la fuente de carbono y la cantidad de inóculo inicial, entre otros parámetros, y se ha comprobado que esta estirpe puede consumir hasta 2 mm de cianuro total cuando crece a ph 9, lo que evita la volatilización del cianuro como HCN. La secuenciación completa del genoma de esta estirpe (,2) ha permitido realizar estudios proteómicos y genómicos que revelan que el cianuro provoca en esta bacteria una respuesta global de adaptación a esta fuente de nitrógeno tóxica. La inducción de una oxidasa alternativa asociada a una malato:quinona oxidorreductasa permite, no sólo la respiración insensible al cianuro, sino también la formación de oxalacetato, que reacciona con el cianuro formando una cianhidrina. La nitrilasa NitC inducible por cianuro utiliza esta cianhidrina para formar amonio, que es asimilado por la ruta GS/GOGAT (3,4). El cianuro también induce sistemas de captación de hierro, ya que la biodisponibilidad del hierro disminuye por la formación de complejos estables con el cianuro. Además, el residuo cianurado induce una respuesta de estrés oxidativo y de defensa frente a metales. Finalmente, se han obtenido mutantes en los genes implicados en la biosíntesis de polihidroxialcanoatos de cadena corta y media identificados en el genoma, lo que ha permitido comprobar que, según la estirpe empleada (silvestre o mutantes), es posible producir material bioplástico de diferente naturaleza durante el crecimiento con el residuo cianurado, lo que confiere un valor añadido al proceso de biorremediación de este residuo industrial tóxico. Bibliografía [] Luque-Almagro et al. Environ. Microbiol. 5: 253-270 (203). 2

Granada 204 Pósters [2] Wibberg et al. J. Biotechnol. 75: 67-68 (204). [3] Luque-Almagro et al. Microbiology 57:739-746 (20). [4] Estepa et al. Environ. Microbiol. Rep. 4: 326-334 (202). Financiado por MICINN (BIO20-30026-C02-0) y Junta de Andalucía (Proyecto Excelencia CVI-7560). P2-3 Proteolytic control of the Bradyrhizobium japonicum transcription factor FixK 2 Juan J. Cabrera, Noemí Fernández, Mariette Bonnet 2, Monika Stegmann 2, Zeljka Maglica 3, Eilika Weber-Ban 3, Hauke Hennecke 2, Eulogio J. Bedmar, Socorro Mesa Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 Institute of Microbiology, ETH Zurich, Zürich, CH, 3 Institute of Molecular Biology and Biophysics, ETH Zurich, Zürich, CH FixK 2 is a key regulator that controls a large number of genes required for the anoxic and microoxic, endosymbiotic and nitrogen-fixing life styles of the α-proteobacterium Bradyrhizobium japonicum []. FixK 2 is an unusual member of the CRP/FNR family of bacterial transcription factors, because it is active in vitro without an additional effector molecule and is regulated posttranslationally by the oxidation of its singular cysteine residue [2]. In addition to its oxidation-mediated control, FixK 2 is also regulated by proteolysis. Despite the induction of fi xk 2 gene expression at low-oxygen concentrations, the steady-state levels of the FixK 2 protein remains constant regardless of the growth conditions [2]. Further, the B. japonicum ClpAP proteolytic system degrades FixK 2 in vitro [3]. Remarkably, the recently solved FixK 2 structure in complex with DNA revealed that the C-terminus of FixK 2 is surface-exposed, and therefore a target for proteolysis [4]. We also observed that a truncated variant is always co-purified together with N-terminally His 6 -tagged FixK 2 proteins. Mass spectrometric analysis revealed that this form a C-terminally cleaved derivative (between V220 and L22), which lacks the last twelve amino acids. Likewise, this shorter FixK 2 species is also present in cells of B. japonicum. In this work, we have constructed a series of protein variants with modifications within the C-terminus of FixK 2. Our results showed that the C-terminal stretch of twelve amino acids, and particularly L22, play a crucial role in FixK 2 proteolysis, protein folding, DNA binding and in vitro activity. In order to find out the function of the carboxy-terminal part of FixK 2 in vivo, we are currently testing different proteins derivatives with regard to their ability to complement a fi xk 2 mutant strain. Bibliografía [] Mesa et al. (2008) J. Bacteriol. 90:6568-79. [2] Mesa et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 06:2860-5. [3] Bonnet et al. (203) FEBS Lett. 587:88-93 [4] Bonnet et al. (203) J. Biol. Chem. 288:4238-46. This work was supported by the ERDF-co-fi nanced grant AGL20-23383 from MINECO. P2-4 Caracterización de la asparraginasa de pino: implicaciones en el desarrollo del sistema vascular Sonia H. E. Van Kerckhoven, Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre, Concepción Avila, Francisco M. Cánovas, Francisco R. Cantón Universidad de Málaga, Dpto Biol. Molecular y Bioquímica, Málaga, ES La asparragina es un metabolito clave en plantas para el transporte y reserva temporal de nitrógeno. La principal vía de movilización del nitrógeno contenido en el grupo amido de la asparragina implica a la enzima asparraginasa (ASPG, EC 3.5..), especialmente en tejidos que demandan altas cantidades de este elemento, tales como semillas en desarrollo y hojas jóvenes. Durante el desarrollo y crecimiento del tronco de los árboles, éstos afrontan un consumo masivo de carbono y nitrógeno para proveer la síntesis de celulosa y lignina. Estudios previos han demostrado que la expresión del gen de asparraginasa en el pino está asociada al intensivo desarrollo del sistema vascular que se produce en el tallo de las plántulas una vez que ésta ha agotado las reservas de la semilla, y que su expresión está confinada a las células de la región del cambium []. La observación de que este gen se expresa también en células de xilema secundario en diferenciación de árbol adulto sugiere que la ASPG podría jugar un papel importante en el desarrollo vascular y ser de gran relevancia en la producción de biomasa. Aunque conocemos, en líneas generales, la implicación de la asparraginasa en el transporte y movilización de nitrógeno, desconocemos los mecanismos moleculares que controlan espacial y temporalmente su actividad. En nuestro grupo seguimos diferentes aproximaciones para dilucidar el control transcripcional y post-transcripcional de esta enzima y su implicación en el desarrollo del sistema vascular. Nuestros objetivos específicos son determinar las características del procesado y activación de la asparraginasa de pino y los factores que regulan la expresión génica asociada al desarrollo vascular. Bibliografía [] Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre, Francisco M. Cánovas, Francisco R. Cantón. (2007). Planta, 225:205-29. Este trabajo ha sido fi nanciado con ayudas del Ministerio de Economía y Competitividad (BIO202-33797, AGL9-239C0202) y una ayuda F.P.U. del Ministerio de Educación a SVK (AP200-5434). P2-5 (R2-9) Control de RegR sobre la expresión de los genes nor de Bradyrhizobium japonicum: micro-oxia versus anoxia Ana Salas Huertas, María Jesús Torres Porras, María Jesús Delgado Igeño, Eulogio J. Bedmar Gómez Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos - Estación Experimental del Zaidín, CSIC, AP 49, Granada, ES Bradyrhizobium japonicum es una bacteria del suelo que establece una asociación simbiótica con plantas de soja y es capaz de desnitrificar tanto en vida libre como en simbiosis. Los genes napedabc, nirk,norcbqd y nosrzdyflx, que codifican las enzimas nitrato-, nitrito-, óxido nítricoy óxido nitroso-reductasa, respectivamente, son necesarios para llevar a cabo dicho proceso. En B. japonicum, se han descrito dos cascadas reguladoras, FixLJ-FixK 2 y RegSR-NifA, de respuesta a oxígeno. Estudios recientes de nuestro grupo de investigación han demostrado que la proteína reguladora RegR es necesaria para la máxima inducción de los genes nor en condiciones de cultivo anaeróbicas con nitrato y que este control es independiente de RegS []. En este trabajo, se ha investigado si el control que ejerce RegR sobre los genes nor ocurre también en micro-oxia o si es exclusivo de condiciones anóxicas. Para ello, se han cultivado la cepa parental USDA0spc4 y las mutantes en los genes regs y regr, en medio mínimo con succinato como fuente de carbono, con nitrato como aceptor final de electrones y en condiciones micro-óxicas (2% de oxígeno en la atmósfera gaseosa). Tras el cultivo de las células, se han realizado estudios de expresión de los genes nor mediante la determinación de la actividad β-galactosidasa de una fusión transcripcional norc-lacz y estudios de detección de la proteína NorC mediante tinción del grupo hemo c.los resultados obtenidos han confirmado que la proteína reguladora RegR está implicada en la inducción de los genes nor en respuesta a anoxia y nitrato. Sin embargo, en condiciones de micro-oxia los niveles de actividad β-galactosidasa de la fusión norc-lacz, así como la expresión de la proteína NorC en la cepa mutante regr, fueron superiores a los detectados en la cepa parental. Esto sugiere que, a diferencia de lo observado en anoxia, la proteína RegR podría tener un papel represor sobre la expresión de los genes nor en condiciones micro-óxicas. 3

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Bibliografía [] Torres et al., 204. PLOS one, en prensa. Este trabajo se ha subvencionado con fondos cofi nanciados por FEDER del proyecto AGL200-8607 del Ministerio de Economía y Competitividad. P2-6 (R2-8) El gen nosz como marcador molecular de la desnitrificación en ecosistemas naturales David Correa-Galeote, German Tortosa, Eulogio J. Bedmar Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos - Estación Experimental del Zaidín - Agencia CSIC, Granada, ES La relación entre el contenido en nitratos, la emisión de N 2 O y las distintas comunidades desnitrificantes en diferentes muestras medioambientales aún no ha sido establecida. En este estudio se determinó la abundancia relativa genes de la desnitrificación narg, napa, nirk, nirs y nosz con el fin de correlacionar los distintos genes tanto entre sí, como con el substrato inicial y el producto final de la reacción de la desnitrificación y a su vez, tratar de establecer un gen de la desnitrificación como marcador molecular de dicho proceso. Para ello se seleccionaron dos sitios de muestreo dentro del Parque Nacional de Doñana uno con escaso contenido en nitratos (Laguna del Acebrón, S) y otro con elevado contenido en nitratos (Arroyo de la Cañada, S2). La recogida de sedimentos se realizó en los meses de abril y octubre de los años 2008, 2009 y 200. El aislamiento, purificación y amplificación de los genes 6S rrna así como de los genes de la desnitrificación se realizó de la manera habitualmente realizada en el laboratorio. De acuerdo con el test de Spearman, la abundancia relativa de los genes de la desnitrificación no presentó correlación ni con el contenido en nitratos ni con la emisión de N 2 O en S. Por el contrario, para S2 existe correlación significativamente positiva entre el contenido en nitratos y cada uno de los genes de la desnitrificación, si bien el gen nosz fue el gen que presentó una mayor correlación. La emisión de N 2 O y la abundancia relativa de los genes de la desnitrificación en S2 fue negativa, encontrándose la mayor correlación negativa para el gen nosz. Por otra parte, tanto en S como en S2, todos los genes de la desnitrificación se correlacionaron estadísticamente entre sí, observándose la mayor correlación entre el gen nosz y el resto de genes analizados. Por tanto, se propone el gen nosz como un posible marcador molecular de las comunidades desnitrificantes en muestras medioambientales contaminadas con nitratos. P2-7 (R2-7) Identificación de una nucleasa en ejes embrionarios de judía regulada por nitrato Rocío Lambert Rodríguez, Juan Miguel Cabello Díaz, Cristina Caballo Linares, Francisco Antonio Quiles Luque, Pedro Piedras Montilla Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Las actividades nucleasas de plantas están implicadas en la degradación de ácidos nucleicos asociada a procesos de muerte celular programada y a los de restricción, reparación y recombinación del ADN. Sin embargo, el conocimiento sobre la función de las nucleasas de plantas es muy limitado. En ejes en desarrollo de judía se ha detectado una actividad nucleasa mayoritaria que utiliza ARN y ADNmc como sustratos, cuyos valores de actividad incrementaron tras la emergencia radicular coincidiendo con el incremento de actividad nucleotidasa (Cabello-Díaz et al, 202) y la acumulación de ureidos (Quiles et al, 2009), lo que podría sugerir una implicación en la movilización de reservas. Esta enzima se ha purificado y el gen que la codifica (PVN) se ha identificado mediante MALDI TOF/ TOF. Las características de la enzima purificada así como la secuencia del gen indican que pertenece a la familia S/P de nucleasas. Utilizando la base de datos del genoma de judía (www.phytozome.com), se han identificado 5 miembros de esta familia, cuya expresión se ha analizado durante la germinación y desarrollo postgerminativo temprano de judía. El gen PVN, que corresponde con la proteína purificada, fue el que mostró mayor valor de expresión en ejes en desarrollo. La inclusión de nitrato en el medio de imbibición redujo la expresión del gen, lo que sugiere una relación con el estado nutricional de plántulas de judía. Bibliografía Cabello-Díaz JM, Quiles FA, Lambert R, Pineda M y Piedras P (202). Plant Physiol. Biochem., 53, 54-60. Quiles FA, Raso MJ, Pineda M y Piedras P (2009). Physiol. Plant., 35, 9-28. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (AGL202-34230) y el Plan Andaluz de Investigación (BIO-5). P2-8 (R2-0) NRT y el transporte de compuestos nitrogenados en Chlamydomonas Victoria Calatrava, José Higuera, Zaira González, Emilio Fernández Reyes, Aurora Galván Cejudo Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES El nitrato es una señal positiva que activa la ruta de asimilación de nitrato/ nitrito. Para la activación de la ruta son necesarios dos factores, ) la entrada de nitrato al interior de la célula, y 2) la presencia de un NIT2 funcional. NIT2 es un factor de transcripción del tipo RWP-RK y es el principal gen regulador de la ruta que necesita además de una proteína dedo de zinc (NZF) para la óptima funcionalidad de NIT2, en respuesta a nitrato. Los mutantes nit2 ni sienten el nitrato ni crecen en medios con nitrato [, 2]. NRT2 y NRT son transportadores de nitrato que pertenecen a familias de proteínas no relacionadas. A la familia NRT2 pertenecen transportadores de nitrato/nitrito de alta afinidad y algunos de ellos esenciales para el crecimiento con nitrato como única fuente de nitrógeno. A la familia NRT pertenecen transportadores de nitrato, aminoácidos, oligopéptidos. Recientemente esta familia se ha denominado NPF (NRT/PTR Family). En el presente trabajo se ha estudiado el papel de NRT de Chlamydomonas (NPF7) en la señalización por nitrato y el efecto sobre la utilización de fuentes de nitrógeno orgánica, urea, aminoácidos, péptidos. Bibliografía [] Camargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, González-Ballester D, Lefebvre PA, Fernández E, Galván A (2007) Nitrate signaling by the regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell 9: 349-3503. [2] Higuera JJ, Fernandez E, Galvan A (204) Chlamydomonas NZF, a tandem-repeated zinc finger factor involved in nitrate signalling by controlling the regulatory gene NIT2. Plant Cell Environ. doi: 0./ pce.2305. Financiado por JA-P08-CVI-04257 y MINECO-BFU20-29338 (EU FEDER Programa). P2-9 (R2-2) 25 años de estudios sobre metabolismo de nitrógeno y carbono en haloarqueas María José Bonete, Mónica Camacho, Carmen Pire, Rosa María Martínez-Espinosa, Julia Esclapez, Vanesa Bautista, Anna Vegara, Susana Díaz, Francisco Pérez-Pomares, Basilio Zafrilla, Laia Pedro- Roig, Gloria Bravo-Barrales, Francisco I. Llorca División de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Alicante, Alicante, ES Los estudios sobre microorganismos extremófilos han aumentado exponencialmente en los últimos años. Estos organismos se han adaptado 4

Granada 204 Pósters a vivir en medios inhóspitos caracterizados por temperaturas, presiones, valores de ph y fuerza iónica extremos. Investigaciones recientes muestran que sus maquinarias celulares son únicas, ofreciendo una fuente valiosa de nuevos biocatalizadores y compuestos de alto valor añadido en el mercado. Nuestro grupo de investigación ha centrado sus esfuerzos en el estudio y caracterización del metabolismo del carbono y del nitrógeno de haloarqueas. Como es bien sabido, el N es uno de los elementos básicos de los seres vivos, y la disponibilidad de una fuente adecuada del mismo a menudo limita la productividad primaria en algunos ambientes naturales y en la agricultura. En relación a ello, cabe resaltar que las publicaciones sobre la regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional de la asimilación del nitrato/amonio son escasas en el Dominio Archaea. Este hecho ha motivado que recientemente nuestro objetivo se centre en comprender los mecanismos que subyacen en la regulación de este metabolismo y sus diferencias con los otros Dominios. Hasta el momento se ha aislado, caracterizado y expresado enzimas como glutamato, isocitrato y glucosa deshidrogenasas, glutamina sintetasa, ciclodextrin glucanotransferasa, nitrato y nitrito reductasas y proteínas reguladoras como GlnK (PII). Estos estudios se han complementado con otros de carácter fisiológico para conocer con detalle cómo estas haloarqueas se adaptan a condiciones cambiantes del medio o a medios extremos en los que además existen compuestos tóxicos. En este sentido, la vía de desnitrificación se presenta como una de las más destacadas para explorar posibles usos de las haloarqueas en biorremediación de aguas y suelos salinos. Para comprender mejor esta ruta metabólica se han purificado y caracterizado enzimas implicadas en ella y se han realizado análisis informáticos para identificar los genes involucrados en esta ruta en haloarqueas desnitrificantes. P2r-0 Estudio funcional de promotores de genes de la asimilación de nitrógeno en Haloferax mediterranei Rebeca González Guerrero, Anna Vegara Luque, Gabriel Felipe Rodríguez Lozano, Julia María Esclapez Espliego, Carmen Lucía Pire Galiana, María José Bonete Pérez Grupo Biotecnología de Extremófilos, Universidad de Alicante, San Vicente del Raspeig, ES Haloferax mediterranei es una arquea halófila extrema capaz de adaptar su metabolismo en función de la fuente de nitrógeno disponible. Puede crecer en presencia de amonio, nitrato, nitrito o aminoácidos como única fuente de nitrógeno. Se han llevado a cabo análisis mediante microarrays y por qpcr que indican cuáles son los genes cuya transcripción se ve afectada en función de la disponibilidad y de la fuente de nitrógeno. Entre estos genes se encuentran los que codifican la glutamina sintetasa (glna), glutamato sintasa (glts) y NAD-glutamato deshidrogenasa (gdh-). Se han clonado los promotores de estos genes fusionados con el gen de la β-galactosidasa de Haloferax lucentensis (bgah) como gen reportero en el vector pva-53 con el que se ha transformado Haloferax mediterranei, midiéndose la actividad β-galactosidasa de las células transformadas en medios con diferentes fuentes de nitrógeno. Además se han realizado mutantes en el promotor del gen glts que permiten la identificación de sitios clave en la regulación de la actividad de este promotor. Por último con el objetivo de identificar los posibles reguladores transcripcionales que se unan al promotor del gen glts, se han realizado ensayos de cromatografía de afinidad DNA-proteína, mediante la unión del promotor biotinilado a una matriz magnética con estreptavidina, e incubando con extractos de Haloferax mediterranei obtenidos en diferentes condiciones de cultivo. P2- Transcriptómica de la deficiencia en glutamina sintetasa plastídica en la leguminosa modelo Lotus japonicus Marco Betti, Carmen M. Pérez-Delgado, Margarita García-Calderón, Antonio J. Márquez Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES En las plantas existen diferentes isoformas de glutamina sintetasa (GS) cuya función fisiológica precisa está aún por esclarecer. En este trabajo se muestra un resumen de todos los estudios de transcriptómica llevados a cabo hasta la fecha con los mutantes Ljgln2-2 deficientes en GS plastídica (GS2) de L. japonicus, que fueron previamente aislados en nuestro laboratorio, y que constituyen los primeros mutantes de su clase que han sido identificados y caracterizados en plantas leguminosas. Dichos estudios han puesto de manifiesto la importancia de la GS2 en distintos procesos tales como la respuesta a sequía [] y la reasimilación de amonio fotorrespiratorio [2], estableciendo las múltiples interconexiones tanto de la GS2, como de la sequía y la fotorrespiración, con distintos procesos metabólicos de la célula. El hecho de que muchos de los cambios observados sean comunes para los distintos procesos examinados sugiere que la GS2 media en la respuesta a diferentes situaciones de estrés como el producido por la sequía ó por la existencia de un ciclo fotorrespiratorio incompleto en las plantas. Otros estudios más recientes utilizando redes de coexpresión han identificado posibles factores de transcripción que pueden tener papeles clave en la respuesta de las plantas [3]. Bibliografía [] Díaz P, Betti M, Sánchez DH, Udvardi MK, Monza J, Márquez AJ (200) New Phytol. 88, 00-03. [2] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi M, Kopka J, Márquez AJ, Betti M (203) Plant Physiol. 62, 834-848. [3] Pérez-Delgado CM (204) Tesis Doctoral, Universidad de Sevilla. Agradecemos la fi nanciación del proyecto P0-CVI-6368 y BIO-63 de la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, y Plan Propio Universidad Sevilla. P2-2 (R2-) THB, una hemoglobina truncada regulada por nitrógeno, modula los niveles de óxido nítrico (NO) y la actividad NR en Chlamydomonas Francisco Javier Ocaña Calahorro, Emanuel Sanz Luque, Aurora Galván Cejudo, Emilio Fernández Reyes Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Córdoba, Córdoba, ES La gran familia de hemoglobinas está presente en todos los organismos vivos. Durante mucho tiempo, se ha relacionado a estas proteínas con el transporte y almacenamiento de oxígeno. Sin embargo, su participación en diferentes procesos fisiológicos y una emergente variedad de funciones, le confieren una gran importancia, aunque la mayoría de ellas son todavía poco conocidas. En los últimos años, se ha relacionado a las hemoglobinas con la degradación del NO, que está implicado en multitud de procesos de señalización celular, de esta manera se evitarían posibles efectos tóxicos del NO debido a su acumulación. En el alga verde Chlamydomonas reinhardtii, encontramos la mayor familia de hemoglobinas truncadas descritas hasta la fecha (THB -2). En este trabajo, se describe cómo dos de ellas (THB y THB2) están reguladas por la fuente de nitrógeno y el factor de transcripción NIT2, que controla gran parte de los genes implicados en la asimilación de nitrato en el alga (transportadores y reductasas específicas). También se muestra cómo THB se sobreexpresa en presencia de NO y cómo es capaz de convertir in vitro el NO en nitrato. Además, se caracteriza cómo la nitrato reductasa está implicada de manera 5

Pósters XXXVII Congreso SEBBM muy eficiente en la reducción de la THB necesaria para su actividad, y cómo su represión produce un aumento de la actividad NR. Por lo tanto, sugerimos en este trabajo, que esta hemoglobina controla los niveles de NO e inhibe la actividad NR simultáneamente. P2-3 (R2-6) Estudio mediante técnicas ómicas del papel señalizador de la glutamina sintetasa plastídica en el metabolismo de la leguminosa modelo Lotus japonicus Margarita García-Calderón, Jesús Giráldez, Carmen M. Pérez- Delgado, Marco Betti, Antonio J. Márquez Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES El mutante fotorrespiratorio Ljgln2-2 de la leguminosa modelo Lotus japonicus es deficiente en la enzima glutamina sintetasa plastídica (GS2), siendo incapaz de reasimilar el amonio fotorrespiratorio cuando se cultiva en condiciones de aire (fotorrespiración activa) []. Cuando el mutante se cultiva bajo una atmósfera de alto CO 2, la planta no realiza la fotorrespiración, suprimiendo el efecto de la deficiencia en GS2 en este proceso. Para analizar si la GS2 pudiera estar implicada en otros aspectos del metabolismo de la planta además de en la fotorrespiración, se utilizaron técnicas ómicas en el estudio de plantas silvestres y mutantes bajo condiciones de alto CO 2. En plantas en simbiosis con Mesorhizobium loti, genes correspondientes al metabolismo del almidón y sacarosa y metabolismo de aminoácidos mostraron menor expresión en plantas mutantes respecto a WT. Los resultados sugieren que en plantas noduladas, la deficiencia en GS2 conlleva alteraciones en la expresión de genes del metabolismo del C y N, sugiriendo un papel de la GS2 en la señalización del balance C/N en plantas de L. japonicus. Estudios de co-expresión han permitido establecer la relación de la GS2 con el metabolismo del C, compatible con otros resultados anteriormente obtenidos sobre la deficiencia en nodulación de mutantes Ljgln2-2 [2]. Bibliografía [] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi MK, Kopka J, Márquez AJ, Betti M. 203. Plant Physiol. 62, 834-48. [2] García-Calderón M, Chiurazzi M, Espuny MR, Márquez AJ. 202. MPMI 25, 2-9. Agradecemos la fi nanciación de la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia de la Junta de Andalucía (proyecto P0-CVI-6368 y BIO-63) y Plan Propio Universidad de Sevilla. P2-4 (R2-4) Biosíntesis de fenilalanina en coníferas: caracterización de la familia arogenato dehidratasa de Pinus pinaster Jorge El-Azaz Ciudad, Fernando de la Torre, Concepción Ávila, Francisco M. Cánovas Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga, Málaga, ES En las plantas, la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos tirosina (Tyr) y fenilalanina (Phe) tiene lugar en los cloroplastos a través de la ruta del prefenato, que tiene su origen en la ruta del siquimato. En la ruta del prefenato, la biosíntesis de Phe tiene lugar mediante dos reacciones consecutivas: la primera de ellas consiste en la conversión de prefenato en arogenato a través de una reacción de transaminación (actividad prefenato-arogenato aminotransferasa, PAT) y posteriormente la transformación del arogenato en Phe (actividad arogenato dehidratasa, ADT). Muy recientemente, dos nuevas publicaciones han aportado evidencias respecto a la existencia de una vía alternativa de biosíntesis de Phe, que no dependería de arogenato (Yoo et al., 203; de la Torre et al., 204). En esta ruta alternativa el prefenato sería transformado en fenilpiruvato a través de la enzima prefenato dehidratasa (PDT). El fenilpiruvato producido en esta reacción sería posteriormente convertido en Phe a través de una transaminasa de aminoácidos aromáticos. Una particularidad de especial interés es el hecho de que las actividades ADT y PDT se encuentran en las mismas proteínas en Arabidopsis thaliana (Cho et al., 2007). En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha estado trabajando en la ruta del prefenato, centrados principalmente en la enzima PAT de Pinus pinaster, y más recientemente en la caracterización de familia de las ADT en esta misma especie. La presente comunicación desarrolla el trabajo de caracterización que estamos realizando en la familia de genes ADT/PDT de P. pinaster, integrada por al menos 9 genes candidatos presentes en el transcriptoma de esta especie (Canales et al., 203). Estos genes candidatos presentan patrones de expresión característicos y dependientes del órgano y el estadio de desarrollo de la planta. De estos 9 genes, 3 de ellos forman un grupo filogenético característico de gimnospermas. Los objetivos de nuestro trabajo se encuentran actualmente enfocados en la caracterización funcional de este grupo de 3 genes ADT/PDT característicos de coníferas. Bibliografía Canales J, et al. (203). Plant Biotechnol J. 2(3):286-99. Cho MH, et al. (2007)J Biol Chem. 282(42):30827-35. De la Torre F, El-Azaz J, Ávila C and Cánovas FM. (204). Plant Physiol. 64():92-04. Yoo H, et al. (203). Nat Commun. 4:2833. P2-5 (R2-5) Efectos de elevados niveles de CO 2 y nitrato durante el desarrollo de las hojas primarias de girasol Francisco José Canales Castilla, Purificación De la Haba, Elisabeth Barrientos, Lourdes de la Mata, Eloísa Agüera Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Se ha estudiado el efecto de elevados niveles de CO 2 y nitrato sobre el desarrollo de las hojas primarias de girasol. Las plantas se cultivaron 42 días con CO 2 ambiental (400 ml L - ) y 0 mm de nitrato (C0), CO 2 ambiental y 25 mm de nitrato (C25) y elevado CO 2 (800 ml L - ) y 25 mm de nitrato (T), en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad relativa, recolectándose el primer par de hojas a los 6, 22, 32 y 42 días. Los resultados indican que algunos procesos metabólicos son sensibles a la alta concentración de CO 2 y nitrato durante la ontogenia de las hojas primarias de girasol. Así, las plantas cultivadas con elevada concentración de CO 2 mostraron un mayor crecimiento que las plantas cultivadas con CO 2 ambiental, como refleja la determinación del peso seco (PS) de la planta completa, PS y área foliar así como la determinación de la masa foliar específica (SLM). La elevada concentración de CO 2 y nitrato (T) aumentó significativamente la fijación fotosintética de CO 2 en las hojas en relación con la concentración de CO 2 ambiental (C0 y C25), principalmente en hojas de jóvenes. El contenido en pigmentos fotosintéticos disminuyó con el desarrollo de la hoja en todos los tratamientos, especialmente con elevados CO 2 y nitrato (T), produciéndose la mayor disminución entre los 28 y 42 días. Estos resultados sugieren que el elevado CO 2 acelera la degradación de pigmentos fotosintéticos y posiblemente también la senescencia de la hoja. En los tres tratamientos, se genera un importante estrés oxidativo durante la senescencia de hojas primarias de girasol, como se revela por la acumulación de H 2 O 2, siendo esta acumulación más elevada en plantas crecidas con elevado CO 2, y elevado nitrato. En hojas senescentes el incremento en los niveles de H 2 O 2 ocurrió en paralelo con una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes (catalasa y ascorbato peroxidasa). Nuestro resultados indican que una elevada exposición a CO 2 puede provocar estrés oxidativo debido a la disminución 6

Granada 204 Pósters en la actividad de enzimas antioxidantes posiblemente como consecuencia de un incremento de la carbonilación de proteínas (Qui et al. 2008. Photosynth Res 97: 55-66). Agradecimientos: Investigación fi nanciada por la Junta de Andalucía Grupo de Investigación BIO-059). P2-6 Regulación de enzimas esenciales en el metabolismo de H. mediterranei en función de la fuente de nitrógeno Anna Vegara, Catalina Ruíz, Mónica Camacho, Julia Esclapez, Vanesa Bautista, María José Bonete División de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Alicante, Alicante, ES Haloferax mediterranei es una arquea halófila extrema que puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánicas u orgánicas para su crecimiento. Este microorganismo posee dos genes (glnk y glnk 2 ) que codifican proteínas de transducción de señales altamente conservadas, ambas pertenecientes a la superfamilia de las PII. Estas proteínas reguladoras actúan en la célula para que pueda adaptarse a las diferentes condiciones del medio; perciben señales del balance entre carbono y nitrógeno, modificando la actividad de las principales enzimas implicadas en los ciclos de dichos elementos. Con la generación de mutantes knockout en H. mediterranei deficientes en los genes glnk y glnk 2, mediante estudios fisiológicos y ensayos enzimáticos, se ha estudiado cómo afecta la ausencia de estas proteínas reguladoras a la actividad de enzimas clave como son glutamina sintetasa, isocitrato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa. Los resultados sugieren que la actividad isocitrato deshidrogenasa regula la ruta de asimilación de amonio, ya que un aumento de su actividad produce una disminución de la de glutamato deshidrogenasa. Además, las dos proteínas PII ejercen la misma función de activación sobre la actividad de glutamina sintetasa. P2-7 Efecto del cianuro sobre la expresión génica de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 Gracia Becerra, María Isabel Igeño, María Isabel Carmona, María Isabel Guijo, Faustino Merchán, Rafael Blasco Plá Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres, ES Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria que se aisló por su capacidad de utilizar cianuro como fuente de nitrógeno. El análisis trascriptómico (RNA-seq) de la respuesta global a cianuro de la cepa CECT 5344 en medio mínimo ha puesto de manifiesto que la mayoría de los genes regulados positivamente por cianuro están relacionados con procesos que ya han sido previamente descritos en el mismo contexto, pero utilizando otras aproximaciones experimentales. Así, la presencia de cianuro induce la expresión de operones implicados en el metabolismo del nitrógeno (cianato, aminoácidos y nitrilos), en la respuesta al estrés oxidativo y en la respiración insensible a cianuro (oxidasas terminales). El cianuro induce también la expresión de un nuevo grupo de genes probablemente involucrados en la degradación de compuestos aromáticos. Los genes regulados negativamente codifican proteínas pertenecientes a tres categorías: proteínas ribosómicas, transportadores (fosfato y sulfato) y proteínas implicadas en el metabolismo energético (ciclo de Krebs y fosforilación oxidativa). Estos resultados se han validado por q-pcr. El papel de los nuevos genes implicados en el metabolismo del cianuro, y no descritos hasta la fecha, se analizará mediante mutagénesis dirigida. La mayoría de los genes cuya expresión varía en respuesta a cianuro en medio mínimo también lo hace, y en el mismo sentido, en medio LB. Sin embargo, existen genes cuya expresión varía dependiendo de que el medio sea mínimo o rico. Entre ellos destacan algunas de las oxidasas terminales y otros genes que podrían proporcionar pistas acerca de la ruta de asimilación del cianuro. Los autores agradecen la fi nanciación de este trabajo por parte del Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO20-30026-C02-0), del Gobierno de Extremadura (GR065) y FEDER 2007-203. D. Macías agradece la beca concedida por el Programa de captación y formación de recursos humanos de excelencia en investigación, desarrollo e innovación 200 de la UEX cofi nanciado a su vez por la Junta de Extremadura. Los autores agradecen la ayuda técnica de G. Gutiérrez. P2-8 Papel de Trk y de la fuente de nitrógeno en la regulación del transportador de K + Hak en levaduras Norberto Escudero*, María C. Álvarez 2, José Ramos 2, José M. Siverio* Departamento de Bioquímica, Universidad de La Laguna, La Laguna, ES, 2 Departamento de Microbiología, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES La levadura Hansenula polymorpha presenta dos transportadores de K + ; Hak, de alta afinidad y regulado por los niveles de K + ; y Trk, de baja afinidad y constitutivo. HAK es inducido a bajas concentraciones de K +. La fuente de nitrógeno también afecta los niveles de Hak. La presencia de concentraciones elevadas de K + desencadena la endocitosis y degradación vacuolar de la permeasa. La deleción del gen TRK desregula HAK. En una cepa Δtrk, los niveles tanto del gen (HAK) como de la permeasa (Hak) son más altos que en la cepa silvestre. Los mutantes Δtrk son hipersensibles a Li + y Na + ; y los elevados niveles de Hak son regulados a la baja sólo en concentraciones superiores a 50 mm K +. Nuestros resultados sugieren que Trk podría actuar como un sensor de K + en la levadura por mecanismos que desconocemos. La sobreexpresión de TRK podría aportar pistas a este respecto. Para ello hemos creado una cepa en la que TRK se expresa bajo el promotor del gen de la nitrato reductasa YNR. Resultados muy preliminares indican que los niveles de Hak son bajos en medios con bajo K +. P3. Neurobiología molecular P3- (R3-3) APC/C-Cdh coordinates neurogenesis and cortical size during development María Delgado Esteban, Irene García-Higuera 2, Sergio Moreno 2, Ángeles Almeida Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL - Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES, 2 Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES The morphology of the adult brain is the result of a delicate balance between neural progenitor proliferation and the initiation of neurogenesis in the embryonic period. Here we assessed whether the anaphasepromoting complex/cyclosome (APC/C) cofactor, Cdh which regulates mitosis exit and G-phase length in dividing cells regulates neurogenesis in vivo. We use an embryo-restricted Cdh knockout mouse model and show that functional APC/C-Cdh ubiquitin ligase activity is required for both terminal differentiation of cortical neurons in vitro and neurogenesis in vivo. Further, genetic ablation of Cdh impairs the ability of APC/C to 7

Pósters XXXVII Congreso SEBBM promote neurogenesis by delaying the exit of the progenitor cells from the cell cycle. This causes replicative stress and p53-mediated apoptotic death resulting in decreased number of cortical neurons and cortex size. These results demonstrate that APC/C-Cdh coordinates cortical neurogenesis and size, thus posing Cdh in the molecular pathogenesis of congenital neurodevelopmental disorders, such as microcephaly. This work was funded by FEDER (European regional development fund) and Instituto de Salud Carlos III (PI2/00685; RD06/0026/008 and RD2/004/0007). P3r-2 Mitochondrial supercomplexes assembly explains differences in reactive oxygen species production between neurons and astrocytes Irene López Fabuel, Juan Pedro Bolaños Instituto de Biología Funcional y Genómica, Salamanca, ES Understanding the physiological roles of reactive oxygen species (ROS) in the brain requires dissecting out the contribution of each of the four different neural cell types to ROS formation. Here, the abilities of mitochondria isolated from rodent neurons and astrocytes, the most abundant brain cell types, to spontaneously form ROS were characterized. We found that ROS production is about one order of magnitude higher in astrocytes than in neurons. This observation is intriguing in view of the widely held notion that astrocytes, which express high levels of antioxidants, are efficient ROS detoxifiers. We also found that the main source of ROS in both cell types is the mitochondrial electron transport chain, but the difference is ROS production cannot be accounted by the relative abundance of total complex I, a major superoxide anion source within mitochondria. Furthermore, the high ROS production by astrocytes is conserved amongst several rodents, including Wistar rat and C57BL6 mice. In view that the mitochondrial supercomplex assembly factor, SCAFI, is not functional in C57BL6 mice, we conclude that the high ROS production in astrocytes is not due to a putative differential expression of this assembly protein. Interestingly, we found that in astrocytes a large proportion of complex I protein occurs free, whereas in neurons most complex I is part of supercomplexes. We conclude that this differential complex I assembly into supercomplexes explains the high mitochondrial ROS production by astrocytes. These results suggest cell-specific physiological roles for mitochondrial ROS in the brain. P3r-3 Understanding ApoD neuroprotective function: modulation of glial ApoD subcellular traffic upon metabolic and oxidative stress Raquel Pascua-Maestro, María Dolores Ganfornina 2, Diego Sánchez 2 Estudiante de doctorado, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología / IBGM Universidad de Valladolid / CSIC, Valladolid, ES, 2 Profesor titular, Valladolid, ES Apolipoprotein D (ApoD) is expressed in the nervous system, increases with aging and neurodegeneration, and is induced in response to serum deprivation or oxidative stress. To understand how ApoD traffic through different subcellular compartments affects glial cells protecting mechanisms, we analyze the time course of ApoD subcellular traffic upon exposure to low-serum and paraquat stimuli in a human astroglioma cell line. During treatment, the spatial pattern of ApoD reorganizes from large intracellular perinuclear organelles to a dotted surface pattern, indicative of engagement in intracellular vesicles followed by a second phase of action on the membrane. A small fraction of ApoD locates in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Both signals are independent of the experimental conditions. We also detect ApoD in the extracellular medium, indicating secretion to the extracellular space. Culture growth and metabolic or oxidative stress alters caveolae and endosome distribution. The intracellular localization of ApoD indicates that secretion is followed by interaction with the plasma membrane, caveolin-dependent endocytosis, and location in endosomes. No ApoD is immunodetected in mitochondria. Interestingly, an important fraction of ApoD is located in lysosomes. Large LAMP2-ApoD-positive organelles indicate ApoD presence in autophagolysosomes which is confirmed by co-localization with LC-3. ApoD presence inside lysosomes and autophagolysosomes is stable over time, suggesting an active role in autophagy. Previous hypotheses on ApoD neuroprotective roles in glial cells must be refined: control of plasma membrane and of the lysosome/autophagosome function must be key elements in the function of this lipid-binding protein. Support: MICINN (BFU20-23978), JCyL (VA80A-2). P3-4 (R3-) Molecular mechanisms underlying Parkinson s disease: LRRK2 takes centerstage Sabine Hilfiker CSIC, Granada, ES Mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are the most common cause of familial Parkinson s disease (PD), and risk factor variants increase the risk for sporadic PD. However, despite the importance of LRRK2 for the pathogenesis of both familial and sporadic versions of the disease, its biological function, and the mechanism(s) by which pathogenic mutations cause neurodegeneration in PD remain largely unknown. LRRK2 is a large multi-domain containing protein with various protein-interaction domains, a GTPase and a protein kinase domain. Altered catalytic activity correlates with neurotoxicity, indicating that targeting those activities may provide clues as to novel therapeutic strategies for LRRK2-linked PD. However, the cellular readout(s) of such altered catalytic activities remain largely unclear. Recent cell biological studies have started to highlight possible early cellular events which are altered in the presence of pathogenic LRRK2. These events include alterations in endocytosis, autophagy, retromer-mediated trafficking from late endosomes to the Golgi, and Golgi integrity. How mutant LRRK2 may induce such divergent effects on intracellular membrane trafficking pathways remains unclear, and may involve a large variety of distinct molecular mechanisms. Alternatively, since membrane trafficking pathways are highly interconnected and interdependent, a small number of LRRK2-mediated cellular alterations may give rise to the wide spectrum of vesicular trafficking alterations. I will present our data on the role of pathogenic LRRK2 in regulating Rab protein activities which can account for the majority of the observed cellular alterations. P3r-5 The human Tp53 Arg72Pro polymorphism modulates neuronal vulnerability to amyloid-beta neurotoxicity Rebeca Lapresa Ruiz de Gauna, María Delgado Esteban, Ángeles Almeida Parra Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL - Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES Alzheimer s disease (AD) is the most common form of dementia in the elderly. AD is a neurodegenerative disorder of the Central Nervous System characterized by an altered amyloid-beta (Ab) metabolism, leading to deposition of Ab peptides into neuritic plaques, tau hyperphosphorylation, 8

Granada 204 Pósters which forms neurofibrillary tangles, neuroinflammation and the degeneration of synapses and neurons in the hippocampus and cortex, regions implicated in learning and memory. It has been described that p53 plays an essential role in this neurodegeneration process []. The p53 protein naturally occurs in humans in two variants with single nucleotide polymorphism (SNP) resulting in Arg or Pro at residue 72. This SNP occurs in the proline-rich domain of this protein, which regulates its apoptotic activity [2]. Recently, we have demonstrated that the Arg72-p53 genotype increases neuronal susceptibility to ischemiainduced apoptosis [3]. The objective of this study was to determine the role of p53 Arg72Pro polymorphism on the susceptibility of neurons to Ab-induced neurodegeneration and its potential role as a genetic biomarker for AD risk. We used cortical neurons in primary culture from wild-type (wt) mice and both knockout p53 mice (KOp53) and Knock-in human p53, expressing either p53pro or p53arg. Neurons were then incubated in culture medium containing either 0 μm Ab(25-35), the active fragment of Ab, or 0 μm Ab(35-25), the inactive form, for 24 hours. We analysed protein expression levels by Western Blot and mitochondrial function and apoptosis by flow cytometry. We first found that Ab promoted p53 stabilisation in cortical neurons. Moreover, genetic depletion of p53 prevented Ab-induced mitochondrial depolarization and neurodegeneration, suggesting that p53 might play an important role in AD. Furthermore, we observed that the polymorphic variant p53arg increased the susceptibility of neurons to mitochondrial depolarization and the subsequent apoptosis caused by Ab, in comparison to the p53pro one. Thus, p53 Arg72Pro polymorphism modulates the susceptibility of neurons to Ab neurotoxicity and could determine the extent of brain damage in AD. These results pose Tp53 Arg72Pro SNP as a good biomarker candidate for AD risk. This work was funded by FEDER, ISCIII (PI2/0685, RD2/004/0007) and Junta de Castilla y León. R. Lapresa was funded by MECD (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte, becas FPU). Bibliografía [] Lanni C, Racchi M, Memo M, Govoni S and Uberti D (202) Free Radic Biol Med 52:727-733. [2] Pietsch EC, Humbey O, and Murphy ME (2006) Oncogene 25:602-6. [3] Gomez-Sanchez JC, Delgado-Esteban M, Rodriguez-Hernandez I, Sobrino T, Perez de la OssaN, Reverte S, Bolaños JP, Gonzalez-Sarmiento R, Castillo J and Almeida A (20) J Exp Med 208:429-437. P3-6 Cdh is essential for neurite outgrowth and synaptic plasticity in the adult brain in vivo Verónica Bobo Jiménez, María Delgado Esteban, Juan Pedro Bolaños Hernández, Ángeles Almeida Parra Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL - Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, Centro Superior de Investigaciones Científicas-CSIC/Universidad de Salamanca- USAL, Salamanca, ES The E3 ubiquitin ligase APC/C (Anaphase Promoting Complex/Ciclosome) is a multi subunit complex that regulates progression from metaphase to anaphase, exit from mitosis and G maintenance in proliferating cells. To be active, APC/C requires the binding of either one of two activators: Cdc20 or Cdh. Neurons are postmitotic cells that undergo an active downregulation of cell cycle-related proteins to survive. However, neurons retain the ability to activate the cell cycle machinery in response to pathological circumstances, including both acute injury and chronic neurodegenerative disorders. Recently, we described that Cdh is the main activator of APC/C in cultured cortical neurons. Moreover, APC/C-Cdh is essential for neuronal survival in vitro, as it prevents the activation of the cell cycle machinery and the subsequent neuronal apoptosis. Here we assessed whether Cdh regulates neuronal survival in vivo by generating mice lacking Cdh from excitatory neurons of the adult forebrain. These animals were viable but exhibited a severe impairment in neurite outgrowth and arborisation, leading to synapse loss and neurodegeneration in the adult cerebral cortex and hippocampal CA region. Moreover, Cdh loss induced basal anxiety and spatial learning and memory deficits. Our results demonstrate that Cdh is essential for neurite outgrowth and synaptic plasticity in the adult brain and supports the role of APC/C-Cdh in neuronal integrity and survival. Funded: Instituto de Salud Carlos III (PI2/0685 and RD2/004/0007), Junta de Castilla y León (GRS244/A/08 and GREX206), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF200-20008) and Fundación Miguel Casado San José. P3r-7 Papel regulador de Wrap53 en la isquemia cerebral Irene Sánchez Morán, Cristina Rodríguez, Ángeles Almeida Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL, Salmanca - Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES Durante la isquemia cerebral se interrumpe el aporte de glucosa y oxígeno a la región cerebral afectada, lo que desencadena una compleja cascada de señalización celular, denominada cascada isquémica, que culmina en la muerte neuronal. Se ha descrito que la proteína supresora de tumores p53 está implicada en la muerte neuronal isquémica []. En los últimos años se han identificado RNAs reguladores que desempeñan un importante papel en el control de la expresión de genes eucariotas [2]. Wrap53 es un cis-nat (Natural Antisense Transcript) que se localiza en el cromosoma 7p3 y solapa con la región 5 UTR de p53. Se ha descrito que los transcritos de Wrap53 controlan la expresión de p53 al interferir con la región solapante [3]. Es más, se han identificado varios SNP (single nucleotide polymorphisms) en Wrap53, específicos de humanos, que afectan a la capacidad de regulación de los niveles de p53. En el presente trabajo nos propusimos estudiar la posible función de Wrap53 en la regulación de la expresión de p53 en neuronas, tras el insulto isquémico. Además, hemos analizado la asociación entre SNP de Wrap53 (rs2287498 y rs2287497) y el estado funcional de pacientes de ictus isquémico. La expresión de Wrap53 y p53 se analizó mediante RT q-pcr en neuronas corticales y células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) diferenciadas sometidas a 90 minutos isquemia experimental (deprivación de oxígeno y glucosa). Los estudios clínicos se realizaron en una cohorte de pacientes de ictus isquémico procedente del Hospital Universitario de Salamanca. El estado funcional de los pacientes se evaluó a los 3 meses del ictus, mediante la escala de Rankin modificada. Nuestros resultados mostraron que los niveles de Wrap53 y p53 no variaron significativamente durante la isquemia. Sin embargo, observamos un incremento significativo en los niveles de Wrap53 a las 24 horas tras el insulto isquémico. El análisis genómico reveló que el SNP rs2287498 modula el estado funcional de pacientes de ictus, de manera que pacientes que portan el alelo T presentan peor pronóstico funcional a los 3 meses del infarto cerebral. En conclusión, nuestros resultados sugieren que Wrap53, NAT de p53, podría estar modulando la susceptibilidad de las neuronas a la isquemia. Es más, el estado funcional de pacientes de ictus isquémico está condicionado por el SNP rs2287498 de Wrap53, de manera que hemos identificado un nuevo biomarcador genético de pronóstico en ictus. El trabajo ha sido fi nanciado por el Instituto de Salud Carlos III (PI2/0685;RD2/004/0007), la Junta de Castilla y León y el FSE (ISM). 9

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Bibliografía [] Hong LZ, et al. (200) Neurosci Bull 26:232-240. [2] Watanabe T, et al. (2008) Nature 453:539-543. [3] Mahmoudi et al. (2009) Molcel 33, 462-47. P3-8 La expresión génica de receptores de adenosina y metabotrópicos de glutamato en cultivos primarios de neuronas se modula por glutamato y un derivado hidrosoluble de C 60 fulereno Davide Giust, Tatiana Da Ros 2, Mairena Martín 3, José Luis Albasanz 3 Institute of Inflammation and Repair, University of Manchester, Manchester, UK, 2 Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università degli Studi di Trieste, Trieste, IT, 3 Departamento de Química Inorgánica, Orgánica y Bioquímica, Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas / Facultad de Medicina de Ciudad Real, Centro Regional de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real, ES A concentraciones fisiológicas el glutamato, como principal neurotransmisor excitador, participa en procesos de aprendizaje y memoria a través de receptores ionotrópicos y metabotrópicos. Sin embargo, a elevadas concentraciones actúa como una neurotoxina, principalmente a través de receptores ionotrópicos, produciendo degeneración y muerte celular propia de muchas enfermedades neurodegenerativas. Los niveles de glutamato se regulan, entre otros, por la acción del nucleósido adenosina sobre sus receptores, inhibiendo su liberación, a través de receptores A, o estimulando la misma, a través de receptores A 2A. En el presente trabajo se estudió el efecto del L-Glutamato (L-Glu) en la arquitectura celular y en la expresión de los receptores de adenosina y metabotrópicos de glutamato; así como el posible papel neuroprotector del t3ss, un derivado hidrosoluble del C 60 fulereno. El estudio se llevó a cabo usando cultivos primarios de neuronas que fueron tratadas con L-Glu y t3ss. Se determinó la viabilidad celular por el método de MTT, se valoró la expresión de las proteínas MAP-2 y NEFH por inmunohistoquímica y se cuantificaron los genes que codifican los mglur y AdoR por PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados mostraron que el L-Glu causaba muerte neuronal que revertía en presencia de t3ss. Este derivado hidrosoluble de fulereno modulaba los receptores mglu y Ado en las mismas condiciones en las que revertía el efecto tóxico del L-Glu. Por tanto, los resultados sugieren que el fulereno protege las neuronas de la excitotoxicidad en un proceso que parece estar asociado a la modulación de la expresión génica de los receptores de adenosina y metabotrópicos de glutamato. P3-9 (R3-4) Effect of alpha-synuclein pathological mutations and post-translational modifications on stability and survival on neurons in situ Ignacio Iñigo, Iker Zuriguel 2, Laura Larrea 3, María Esther Luquin 3, Rafael Aldabe 3, Montserrat Arrasate 3 Center for Applied Medical Research-CIMA, Graduate Program on Neuroscience and Cognition, School of Medicine, University of Navarra, Pamplona, ES, 2 School of Sciences, University of Navarra, Pamplona, ES, 3 Center for Applied Medical Research-CIMA, University of Navarra, Pamplona, ES Alpha-synuclein (a-syn) is a presynaptic protein with a key role on neurodegenerative disorders like Parkinson s disease (PD) and dementia with Lewy Bodies (DLB). Although 90% of PD cases are sporadic, mutations on the gene encoding a-syn (SNCA) cause autosomal dominant PD. Indeed, duplications and triplications of SNCA gene cause parkinsonism with prominent dementia linking a-syn levels with neuronal death. Yet, the mechanisms that regulate a-syn steady-state levels on sporadic and familial PD cases with point mutations on the SNCA coding region remain unclear. It has been hypothesized that point mutations and/ or post-translational modifications on a-syn alter the stability of the protein leading to an increase of its steady-state levels and eventually to neuronal death. We have set up a microscope-based methodology to longitudinally track individual neurons and determine the risk of neuronal death induced by wild-type (wt) and mutant versions of a-syn. Furthermore, to determine the stability of wt and mutant versions of a-syn in living neurons we have applied a novel optical pulse-chase methodology based on the photoswitchable protein Dendra2 and longitudinal analysis to measure its half-life on neurons in situ. Among the pathological a-syn mutations, the E46K mutation increases significantly the risk of neuronal death on primary cortical neurons. Post-translational modifications modulate a-syn dependent neuronal death risk. We are currently analyzing whether these effects are associated with a change on the stability of the protein. Supported by: FP7-Marie Curie IRG (Project ID:224849), MINECO (BFU202-39737), Ramón y Cajal Program MICINN (RYC2008-0325) and UTE project CIMA. P3-0 Análisis de la expresión de SERCA2 en cerebros humanos afectados por la enfermedad de Alzheimer M. Rosario Sepúlveda, Julio Navascués, Ana M. Mata 2 Depto. Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Depto. Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Badajoz, ES La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una pérdida progresiva de memoria y una decadencia cognitiva. Esta neurodegeneración está asociada a la presencia de placas seniles de péptido β-amiloide y ovillos neurofibrilares de tau, así como a una alteración en la homeostasis del Ca 2+ intracelular. Entre los mecanismos reguladores del Ca 2+ neuronal se encuentra la Ca 2+ -ATPasa de retículo sarco(endo)plásmico (SERCA), que transporta Ca 2+ del citoplasma al interior del retículo a expensas de la hidrólisis de ATP. En este trabajo se ha analizado la expresión de SERCA2 mediante inmunohistoquímica en secciones de cerebros humanos sanos y afectados por la enfermedad de Alzheimer. Los resultados mostraron localización de esta proteína en el soma de neuronas en ambas muestras, y una elevada expresión en otro tipo celular no neural principalmente en los cerebros afectados. Se realizaron ensayos con marcadores específicos de astrocitos y microglía, células que cada vez son consideradas más relevantes en la patogénesis de la enfermedad. Nuestros resultados sugieren una relación entre la sobreexpresión de SERCA y la participación de la glía en la enfermedad de Alzheimer. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (BFU20-2333), Junta de Extremadura y FEDER (A.M.M); BFU200-998 (J.N.); CEI BioTic Granada mp_bs_35 (M.R.S.). P3- CSP-alpha is essential to maintain the quiescence of radial-glia like stem cells in postnatal neurogenesis Jose Luis Nieto-Gonzalez, Leonardo Gómez-Sánchez, Fabiola Mavillard, Pedro Linares-Clemente, Jose Antonio Martinez-Lopez, Ricardo Pardal, Rafael Fernandez Chacon Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) HUVR/CSIC/Universidad de Sevilla, Dpto. de Fisiología Médica y Biofísica and CIBERNED, Sevilla, ES Cysteine String Protein-α (CSP-α) is a synaptic co-chaperone that prevents activity-dependent degeneration of nerve terminals. Mutations in the 20

Granada 204 Pósters human CSP-α gene cause neuronal ceroid lipofuscinosis characterized by progressive dementia and seizures. Synapses formed onto granule cells by parvalbumin (PV)-expressing basket cells progressively degenerate in CSP-α KO mice. Using electrophysiology in acute hippocampal slices, we have found that the properties of GABA release from basket cells are dysfunctional in CSP-α KO mice. In addition, at the dentate gyrus of CSP-α KO mice, the number of calretinin-expressing neurons is significantly increased. We have systematically used BrdU injections and specific markers to uncover a severe deregulation of adult neurogenesis. We have observed that the pool of radial-glia like stem cells becomes progressively depleted due to hyper-proliferation, likely caused by a loss of stem cell quiescence. Surprisingly, part of these alterations occurs before basket cell synaptic dysfunction is established, suggesting that proliferation increase is partly due to a cell autonomous mechanism. Indeed, in the absence of CSP-α, although the number of neurospheres formed is much higher during the first passages, this number progressively becomes much lower than in controls. Our data are compatible with two types of alterations in adult neurogenesis: circuit-independent and circuit (PV neurons)- dependent mechanisms. Remarkably, our study uncovers an unanticipated requirement of CSP-α to maintain the quiescence of radial-glia like cells in postnatal neurogenesis. P3-2 POMGnT, a protein involved in muscle-eyebrain disease, is located in the Golgi complex in the mouse retina and 66W photoreceptors Mary Luz Uribe, Carmen Haro, María Paz Ventero, Laura Campello, Jesús Cruces 2, José Martín Nieto Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Alicante, Alicante, ES, 2 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES The POMGNT gene, encoding protein O-linked mannose β,2-nacetylglucosaminyltransferase, is associated with muscle-eye-brain disease (MEB) and other dystroglycanopathies. Its lack of function or expression causes hypoglycosylation of alpha-dystroglycan (α-dg) in muscle and CNS (including brain and retina), where it catalyzes the transfer of N-acetyl-glucosamine to O-mannosylated α-dg. MEB patients ocular symptoms include retinal dysplasia and detachment, glaucoma and abnormal electroretinogram. In this context, α-dg O-glycosylation is known to be relevant for the establishment of functional synapses between photoreceptors and their postsynaptic, bipolar cells in the retina. Nonetheless, the POMGnT expression pattern in the normal mammalian retina remains to be addressed. In this work we have demonstrated by means of RT-PCR and immunoblotting analyses that the POMGNT gene is expressed at the mrna and protein levels in all mammalian species studied, from rodents to humans. Immunohistochemical studies have shown that it concentrates in the myoid portion of mouse photoreceptor inner segments, where it colocalizes with GM30, a Golgi complex protein marker. Its presence in the Golgi has also been revealed in 66W cells, a mouse cone photoreceptor immortalized cell line. However, and in contrast to retinal tissue, POMGnT additionally accumulates in the nucleus in 66W photoreceptors, where it colocalizes with POMT and POMT2, two proteins known to form a heterodimer active in the O-linked addition of mannose to (unglycosylated) α-dg. These results are suggestive that POMGnT not only participates in the O-glycosylation of α-dg in the Golgi complex, but also of other yet-to-be-identified proteins in the nucleus of mouse photoreceptors. Funding: Instituto de Salud Carlos III grant PI2/057. P3-3 Alterations in age-dependent spatial segregation of secretory vesicles upon treatments associated with Parkinson s disease Mar Martínez Salvador, Elena Fernández, Sabine Hilfiker Instituto de biomedicina López Neyra, CSIC, Armilla, ES Neurons and neuroendocrine cells are packed with secretory vesicles, only a few of which seem to be releasable upon appropriate stimuli. Previous studies have shown that vesicles display functional and spatial segregation according to age, whereby newly synthesized vesicles seem to be preferentially released. Here, using various fluorescent cargo proteins which change colour with time fused to either neuropeptides or select neurotransmitter transporters, we evaluated effects of toxins associated with Parkinson s disease on secretory vesicle age and distribution in dopaminergic cells in culture. We found alterations in the percentage of old versus newly synthesized vesicles largely consistent with previously observed toxin-induced effects on secretion and/or axonal transport. Various reagents which modulate either proteasome function or macroautophagy indicate that preferentially older secretory vesicles are subject to degradation by autophagy (crinophagy). Similarly, older vesicles seem to be preferentially excluded from neurites, indicating the existence of a cellular mechanism able to distinguish vesicles according to their age for their intracellular transport as well as degradation. Additional studies underway are attempting to address whether proteins associated with familial Parkinson s disease also cause alterations in vesicle age with implications for dopaminergic transmission. P3-4 Increased intracellular iron load is associated with lysosomal alterations and modulated by TPC and TRPML2 channel regulation Belén Fernández, Sabine Hilfiker Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES Iron dyshomeostasis has been shown associated with various neurodegenerative diseases including Parkinson s disease (PD), but the underlying cellular mechanisms leading to eventual cellular demise remain unclear. Here, we show increased iron content in postmortem samples from PD patients as compared to age-matched controls. Artificially increasing iron content in cultured dopaminergic neuronal as well as non-neuronal cells causes increased apoptosis in a time- and dose-dependent manner, which is most pronounced in dopaminergic cells. Under non-toxic conditions, increasing iron content is associated with a pronounced proliferation of late endosomal/lysosomal compartments, where iron seems to be preferentially stored. Furthermore, increased intracellular iron load is associated with increased oxidative stress and autophagy induction. Interestingly, application of NAADP, an agonist of lysosomal TPC and TRPML channels, potentiates cell death associated with increased cellular iron content, whilst its antagonist Ned-9 inhibits the effects. Overexpression of TPC and TPC2 potentiates cell death induced upon intracellular iron increase, whilst the dominant-negative channel mutants are without effect. NAADP triggers a large increase in cytosolic iron in TPC2-expressing cells, indicating that iron is released from lysosomal stores in an NAADPmediated manner. Similar effects are observed with TRPML2, indicating that both channels regulate iron release from lysosomal compartments. Together, our data indicate that increased cellular iron load is associated with an increase in lysosomal proliferation which may be a consequence of enhanced iron storage in this organelle, and that iron release from acidic stores involves TPC2 and TRPML2 channels in a manner regulatable by NAADP and Ned-9. These data indicate that modulating lysosomal iron storage and release capacities may be a beneficial therapeutic strategy for a variety of disorders associated with iron dyshomeostasis. 2

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P3-5 El déficit en C-RAF incrementa la neuroinflamación y la apoptosis en el receptor auditivo tras exposición a estrés por ruido Rocío de Iriarte Rodríguez, Marta Magariños Sánchez 2, Isabel Varela-Nieto, Ulf R. Rapp 3 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC- UAM - CIBERER, Unit 76, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, ES, 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM - CIBERER, Unit 76, Instituto de Salud Carlos III - Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 3 Department of Molecular Biology, Max-Planck-Institute of Biochemistry, Madrid, ES Las proteínas RAF son serina treonina quinasas pertenecientes a la ruta RAS-RAF-MERK-ERK. Son esenciales para la proliferación, supervivencia y diferenciación celular durante el desarrollo, y en la homeostasis de los tejidos adultos. El déficit a homocigosis de CRAF es una enfermedad rara sindrómica que cursa sordera neurosensorial en el hombre (ORPHA648), observándose el mismo fenotipo en el ratón nulo C-Raf-/-. En contraste, los animales heterocigotos C-Raf+/- no muestran alteraciones funcionales ni anatómicas. Nuestro objetivo ha sido estudiar sí el déficit parcial de C-Raf predispone al daño auditivo. Para ello se ha utilizado como agente estresor el ruido y ratones C-Raf +/+ y C-Raf +/- y se ha realizado el estudio comparado de la neurofisiología (potenciales auditivos del tronco cerebral), la morfología y citoarquitectura (histología, inmunofluorescencia, TUNEL) y niveles de marcadores de tipo celular, proliferación, supervivencia e inflamación (RTqPCR y Western blotting). Los ratones de ambos genotipos presentaron un incremento de 50 db SPL en el umbral auditivo inmediatamente tras la exposición al ruido. Los ratones C-Raf +/+ recuperaron parcialmente la función auditiva 35 días después, por el contrario, los ratones C-Raf+/- presentaron una pérdida auditiva irreversible. Así mismo, mostraron un mayor daño celular y un aumento del 90% en el número de células apoptóticas. Las cócleas de los ratones C-Raf +/- presentaron mayores niveles basales de activación de JNK que las de C-Raf +/+. Ambos genotipos expuestos a ruido incrementaron la actividad de ERK y de proteínas implicadas en la respuesta inflamatoria (p-jnk) en la cóclea, así como en marcadores de apoptosis (PARP- fragmentado). En resumen, nuestros resultados indican que el receptor auditivo mantiene su función aun cuando los niveles de C-RAF estén disminuidos, pero que se reduce su capacidad de recuperación tras la exposición a estrés. Agradecimientos: RdI tiene un contrato asociado al proyecto SAF20-2439. El trabajo ha sido fi nanciado con la ayuda de este proyecto y con el FP7-AFHELO. P3r-6 Specificity of cell-penetrating peptides based on connexin43 and c-src in glioma stem cells Myriam Jaraíz Rodríguez, Marta Domínguez-Prieto, José M. Medina, Arantxa Tabernero Instituto de Neurociencias de Castilla y León-INCYL, Salamanca, ES Glioma stem cells (GSCs) are thought to be responsible for tumor initiation, relapse, and therapeutic resistance in gliomas, the most common brain tumors. Connexin43 (Cx43), the main gap junction channelforming protein in astrocytes, is down-regulated in GSCs. Interestingly, restoring Cx43 reverses GSC phenotype and consequently reduces their tumorigenicity. Our previous work shows that the interaction of Cx43 with c-src is responsible for this antitumorigenic effect. Aims: On this basis, we have designed several cell-penetrating peptides (CPPs) containing different regions of Cx43 involved in c-src interaction and we have investigated their role on GSC proliferation and migration. Methods: Human G66 GSCs, C6 rat glioma cells, neurons and astrocytes cultures were treated with CPPs. Cell growth was analyzed by MTT. Migration was studied using wound-healing assays, Time-Lapse live-cell Imaging and Immunocytochemistry. Results: Our results show that CPPs are internalized and reduced the rate of cell growth. Interestingly, the effects of CPPs are stronger in GSCs compared to other type of cells. TAT sequence did not significantly change the rate of growth. Although several studies show that Cx43 increases cell migration, our results indicate that the region of Cx43 that interacts with c-src does not exert this effect. In fact, the CPPs used in this study reduced the rate of GSC migration and locomotion. Conclusions: Our results indicate that c-src plays an essential role in the effects of Cx43 in GSCs proliferation and migration and suggest these CPPs as promising therapies. P3-7 Effect of Parkinson s disease-associated LRRK2 mutations and kinase inhibition on microtubule interactions Marian Blanca Ramírez, Elena Fdez 2, Sabine Hilfiker 2 Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES, 2 Instituto de Parasitología y Biomedicina López- Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES Mutations in LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) are associated with both sporadic and familial Parkinson s disease (PD). LRRK2 is a large protein containing both GTPase and kinase activities. Various studies indicate that LRRK2 interacts with microtubules and modulates cytoskeletal functions by regulating microtubule dynamics. We find that PD-related mutations in the GTPase domain, but not the kinase domain, cause templating of LRRK2 onto stable, acetylated microtubules. A similar templating is observed when inhibiting the kinase activity of LRRK2 by various distinct, specific kinase inhibitors. Such interaction can be partially disrupted by nocodazole, and fully disrupted upon coldinduced microtubule depolymerization. Microtubule regrowth assays indicate that LRRK2 filaments form with a delay after microtubules are reformed. Modulating the acetylation status of microtubules causes alterations in filament formation consistent with the idea that pathogenic LRRK2 interacts preferentially with stable microtubules. An artificial mutation in LRRK2 which enhances GTP hydrolysis decreases filament formation, whilst a mutation which abolishes an autophosphorylation site in LRRK2 is without effect. Together, the data indicate that LRRK2 filament formation is dependent on its GTPase activity, modulated by kinase inhibition, and occurs by preferential association with stable microtubules. Further studies are under way to determine the impact of such interactions on modulating posttranslational microtubule modifications. P3r-8 Targeted modulation of the glial inflammatory response in Retinitis Pigmentosa attenuates photoreceptor cell death María Platón Corchado, Catalina Hernández-Sánchez, Alberto M. Hernández-Pinto, Miguel Marchena, Noemí Álvarez-Lindo, Ana I. Arroba, Sean Jmaeff 2, Pablo F. Barcelona 2, H. Uri Saragovi 2, Enrique J. de la Rosa Centro de Investigaciones Biológicas-CIB-CSIC, Madrid, ES, 2 McGill University, Lady Davis Institute-Jewish General Hospital, Montreal, CA Purpose: Retinitis Pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of genetic retinal dystrophies. In most forms of RP, photoreceptor cell death is associated with disease progression. Reactive Müller cell gliosis and microglial activation are also found, often prior to photoreceptor death. 22

Granada 204 Pósters Here, we studied inflammatory pathways, arising from Müller cell and microglia that regulate neuronal cell death. Methods: We analyzed the expression of pro-inflammatory cytokines and of markers of reactive Müller cell gliosis and microglial activation by qrt- PCR and immunohistochemistry in retinas from wild type and RP mouse models. Growth factors and pharmacological agents were tested in retinal explants ex vivo and by intravitreal injection in vivo. The agents were selected to modulate the glial inflammatory response. The treatments included clodronate-liposomes (to cause depletion of microglia), IGF-I (to polarize microglia response), and antagonists of the p75ntr receptor (a receptor present in Müller and glial cells and whose activity stimulates TNFα production). Results: A marked increase in GFAP and TNFα transcription preceded photoreceptor cell death in RP retinas. Reduced photoreceptor cell death, better preservation of the outer nuclear layer, and decreased gliosis were observed upon treatment. Conclusions: Our results suggest the possible existence in the RP retinas of a pro-inflammatory loop mediated by the activation of p75ntr in Müller glial cells, which causes TNFα production. Modulation of the p75ntr inflammatory response is a possible target to attenuate RP progression. P3-9 LRRK2 delays degradative receptor trafficking by impeding late endosomal budding through decreasing Rab7 activity Pilar Rivero-Ríos, Patricia Gómez-Suaga, Elena Fdez, Marian Blanca Ramírez, Isidro Ferrer 2, Ana Aiastui 3, Adolfo López de Munain 3, Sabine Hilfiker Institute of Parasitology and Biomedicine López-Neyra, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-CSIC, Granada, ES, 2 Institute of Neuropathology, IDIBELL-University Hospital Bellvitge, University of Barcelona, Hospitalet de Llobregat, ES, 3 Neuroscience Area, Biodonostia Institute, San Sebastián, ES Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene cause lateonset autosomal dominant Parkinson s disease (PD), and sequence variations at the LRRK2 locus are associated with increased risk for sporadic PD. LRRK2 contains both GTPase and kinase domains flanked by protein interaction motifs, and mutations associated with familial PD have been described for both catalytic domains. LRRK2 has been implicated in diverse cellular processes, and recent evidence pinpoints to an important role for LRRK2 in modulating a variety of intracellular membrane trafficking pathways. However, the underlying mechanisms are poorly understood. Here, by studying the classical, well-understood, degradative trafficking pathway of the epidermal growth factor receptor (EGFR), we show that LRRK2 regulates endocytic membrane trafficking in a Rab7-dependent manner. Mutant LRRK2 expression causes a slight delay in early-to-late endosomal trafficking, and a pronounced delay in trafficking out of late endosomes, which become aberrantly elongated into tubules. This is accompanied by a delay in EGFR degradation. The LRRK2-mediated deficits in EGFR trafficking and degradation can be reverted upon coexpression of active Rab7 and of a series of proteins involved in bridging the EGFR to Rab7 on late endosomes. Moreover, expression of TBCD5, the Rab7 GAP, mimicks the effects of mutant LRRK2 on EGFR trafficking. Effector pull-down assays indicate that pathogenic LRRK2 decreases Rab7 activity both in cells overexpressing LRRK2, as well as in fibroblasts from pathogenic mutant LRRK2 PD patients as compared to healthy controls. Together, these findings provide novel insights into a previously unknown regulation of Rab7 activity by mutant LRRK2 which impairs membrane trafficking at very late stages of the endocytic pathway. Current studies are underway to determine whether LRRK2- mediated changes in intraluminal endolysosomal calcium may account for altered Rab7 activity. P3-20 Pathogenic mutations in LRRK2 cause alterations in cell cycle progression and premature centrosome splitting Jesús Madero Pérez, Elena Fdez, Patricia Gómez-Suaga, Angus C. Nairn 2, Ana Aiastui 3, Adolfo López de Munaín 3, Sabine Hilfiker Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra -CSIC, Armilla, ES, 2 Dept. of Psychiatry, Yale University School of Medicine, New Haven, US, 3 Neuroscience Area, Biodonostia Institute, San Sebastián, ES Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the most common cause of familial and sporadic Parkinson s disease (PD). The effects of pathogenic mutations in LRRK2 have generally been studied in differentiated, non-dividing neuronal cells. However, recent studies indicate that pathogenic LRRK2 may play a role in dividing cells as well, as indicated by alterations in adult neurogenesis or the increased cancer risk in LRRK2 PD patients. Here, we report that three pathogenic LRRK2 mutants cause alterations in cell cycle progression, nuclear shape alterations and premature centrosome splitting. Premature centrosome splitting is associated with partial displacement of the intercentrosomal linker protein rootletin, and can be partially or fully rescued when expressing rootletin, dominant-negative Nek2a or active PPa, indicating a LRRK2-mediated deregulation of the balance of the Nek2a/PP pathway controlling centrosome cohesion via intercentrosomal linkers. Alterations in centrosome cohesion and nuclear shape changes are reverted upon pharmacological LRRK2 kinase inhibition. Centrosomal and nuclear shape alterations are also observed in human dermal fibroblasts from G209S LRRK2 mutant PD patients compared to healthy controls. Together, our data indicate a mechanism for pathogenic LRRK2 function in dividing cells. P3-2 (R3-5) Chronic hypoxia aggravates Alzheimer s disease pathology by causing microglial dysfunction Rosana March-Diaz, Antonio Heras-Garvín, Adrian Viehweger, Sebastian Jimenez, Alberto Serrano-Pozo, Victoria Navarro, Almudena Gerpe 2, Marisa Vizuete, Antonia Gutierrez 3, José López- Barneo, Edurne Berra 2, Javier Vitorica, Alberto Pascual Bravo Instituto de Biomedicina de Sevilla-IBiS, Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2 Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias, CIC biogune - Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 3 Dept. Biología Celular, Genética y Fisiología - Facultad de Ciencias. Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA - Universidad de Málaga, Sevilla, ES Alzheimer s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder and the most common form of dementia. In many cases AD patients present concomitant vascular pathology. Low oxygen levels are also frequently found in the brain of AD patients. The most accepted hypothesis to explain the correlation between hypoxia and AD is the deposition of amyloid ß (Aß) occurring in the microvasculature (amyloid angiopathy) and the affectation by the disease of the locus coeruleus, a brain region involved in the control of brain blood flow. However, few data has been collected to understand the relation between hypoxia and AD progression. We show here the accumulation of the hypoxic marker HIFα (Hypoxiainducible-factor α), the major transcription factor for the adaptation to hypoxic conditions, in the brain of AD patients by western blot. We have also characterized the consequences of chronic exposition to hypoxia in the progression of the disease using a widely accepted AD mice model. AD mice were exposed to physiologic hypoxia (8.5% oxygen, 2 days) at initial and advances stages of the pathology. Brains from hypoxic animals showed no differences in the Aß content and number of plaques, but they showed a clear reduction in the total number of microglial cells that was even more evident around the Aß plaques. In vitro analyses suggest that hypoxia slows down proliferation and chemotaxis towards polymeric Aß in both cell line and primary microglial cultures. 23

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Interestingly, the brain cortex from the hypoxic animals showed a high increase in the number of dystrophic neurites surrounding the microgliafree Aß plaques. We observed also a decrease in the mrna levels of two markers of interneurons, Somatostatin and Neuropeptide-Y, in the hippocampus of hypoxic mice. These data suggest that hypoxia accelerates the progression of AD pathology. The pathway underlying microglial affectation by hypoxia has an enormous potential in neurodegenerative disorders where microglia function is correlated with the progression of the disease. P3-22 GPCR homo- and heteroreceptor complexes in the brain Dasiel Oscar Borroto Escuela, Manuel Narváez 2, Michael Di Palma, Wilber Romero-Fernández, Ismel Brito 3, Michael Bader 4, Malgorzata Filip 5, Luigi F. Agnati, Pierre Trifilieff 6, Jonathan Javitch 7, Kjell Fuxe Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, Stockholm, SE, 2 Department of Physiology, School of Medicine, University of Malaga, Málaga, ES, 3 IIIA-CSIC, Artificial Intelligence Research Institute, Spanish National Research Council, Barcelona, ES, 4 Max- Delbrück-Center for Molecular Medicine, Berlín, DE, 5 Laboratory of Drug Addiction Pharmacology and Department of Pharmacology, Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences, Kraków, PL, 6 University Bordeaux 2 INRA, Bordeaux, FR, 7 Department of Neuroscience, Columbia University, New York, US G protein coupled receptors (GPCRs) play critical roles in cellular processes and signaling and have been shown to form homo and heteroreceptor complexes with diverge biochemical and/or pharmacological activities. However, despite extensive experimental results supporting the formation of GPCR homo and heteroreceptor complexes in heterologous systems, the existence of such receptor-receptor complexes in their native environment remains largely unknown, mostly because of the lack of appropriate methodology. For instance, until recently years the methods that have been developed to study receptor-receptor interactions require that genetic constructs be expressed in the cells to enable detection of the receptor interactions, thus excluding the use of tissue samples. In order to demonstrate in native tissue the existence of GPCR homo and heteroreceptor complexes, especially in a manner that can be generally applicable to different receptor pairs, a well-characterized in situ proximity ligation assay (in situ PLA) has been adapted to confirm the existence of GPCR homo- and heteroreceptor complexes in brain slices ex vivo. We also describe the in situ PLA procedure as a high selectivity and sensitivity assay to image GPCR homo- and heteroreceptor complexes in brain sections by confocal microscopy and how the assay is performed. We point out as well the method advantages and disadvantages and compare it to other available techniques. P3-23 (R3-6) The neuronal-specific serum and glucocorticoidregulated kinase. protects against seizureinduced neuronal death Natalia Armas-Capote, Adoración Martínez-Palacián 2, Diego Álvarez de la Rosa, Teresa Giráldez 3 Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina y Centro de Investigaciones Biomédicas de Canarias-CIBICAN, Universidad de La Laguna, La Laguna, ES, 2 Dep. of Biochemistry and Molecular Biology II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos- IdISSC, Madrid, ES, 3 Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias- CIBICAN, Universidad de La Laguna, La Laguna, ES The M-current formed by tetramerization of Kv7.2 and Kv7.3 subunits is a neuronal voltage gated K + conductance that controls resting membrane potential and cellular excitability. Our group has previously shown that the neuronal isoform of the serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK.), with distinct subcellular localization and modulation, upregulates the Kv7.2/3 current in neurons. Moreover, transgenic mice (Tg.sgk) expressing a constitutively active form of SGK. (S55D) were resistent to seizures induced by kainic acid, unveiling a novel role for SGK. as a physiological regulator of the M-current and neuronal excitability (Miranda et al, J Neurosci 203 33:2684). The ubiquous isoform of this kinase, SGK, has been involved in protection from apoptosis (Mikosz et al JBC 200 276:20) and neurogenesis (Anacker et al PNAS 203 0:8708). Both mechanisms have been associated to seizure-induced neuronal death. Therefore, to explore whether SGK. also protects against seizure cell death, we compared the levels of neuronal death in Tg.sgk vs wild-type mice, using the Fluoro-Jade staining approach in different brain regions in mice with comparable seizure development. Our results show a significant decrease in neuronal death in transgenic mice after kainate treatment, even under status epilepticus. Experiments are underway in our laboratory to test signalling pathways involved in SGK. protective role. This result is clinically relevant, since both seizure-induced cognitive impairments and epileptic seizure severity are influenced by the extent of damage caused by seizures. P3-24 Dopamine D and D2 receptor immunoreactivities in the arcuate median eminence complex Wilber Romero Fernández, Dasiel Borroto-Escuela 2, Víctor Vargas- Barroso 3, Manuel Narváez Narváez 4, Michael Di Palma 5, Luigi F Agnati 6, Jorge Larriva Sahd 3, Kjell Fuxe 2 Faculty of Health Sciences, Technical University of Ambato, Ambato, EC, 2 Department of Neuroscience, Karolinska Institute, Stockholm, SE, 3 Institute of Neurobiology, National Autonomous University of Mexico, Campus Juriquilla, Querétaro, MX, 4 Department of Physiology, School of Medicine, University of Málaga, Málaga, ES, 5 Department of Earth, Life and Environmental Sciences, Section of Physiology, Carlo Bo University of Urbino, Urbino, IT, 6 IRCCS Lido Venice, Venice, IT Dopamine D and D2 receptor (DDR and D2DR) immunohistochemistry was used to determine the distribution of the DDR and D2DR immunoreactivities (IR) in the rat arcuate-median eminence complex. Punctate DDR and D2DR immunoreactivities were enriched in the lateral palisade zone, while the densities were low to modest in the medial palisade zone. DDR but not D2DR IR nerve cell bodies were found in the ventromedial part of the arcuate nucleus and in the lateral part of the internal layer of the median eminence. A large number of tyrosine hydrolase (TH) IR nerve cell bodies in dorsomedial part showed punctate DDR IR but only a few presented D2DR IR which were mainly found in a substantial number of TH cell bodies of the ventral periventricular hypothalamic nucleus. This immunohistochemical work could explain the role of DDR and D2DR in this region. P3-25 (R3-2) Super-resolution imaging of cargo transport Melike Lakadamyali ICFO, Instituto de Ciencias Fotónicas, Castelldefels, Barcelona, ES Intracellular transport is essential for maintaining cell function and morphology. Transport is carried out by molecular motors that convert the energy of ATP hydrolysis to mechanical motion. Several single molecule in vitro studies produced a wealth of information on the biophysical properties and function of these motors. However, the cellular environment imposes further challenges on motors. Multiple, opposing polarity motors must coordinate or compete to overcome road-blocks in the crowded cellular environment to effectively deliver their cargo in the right place at the right time. We are combining super-resolution microscopy with single 24

Granada 204 Pósters particle tracking to understand how motors tackle these challenges. Our studies have shown that, even the dense microtubule network can present obstacles to motor-mediated cargo transport, but motors are well-adapted to circumvent these obstacles. P3-26 Ultrastructural localization of the core-machinery for vesicle secretion Israel Salcedo González, Heidi de Wit, Jan van Weering Department of Functional Genomics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, Amsterdam, NL Neurons communicate with each other through synapses. The secretion of neurotransmitters is highly regulated by voltage-sensitive channels that allow Ca 2+ influx in the cell triggering the fusion of the vesicles, where the neurotransmitters are stored, with the active zone in the cell membrane. All this process is controlled by a set of proteins, including SNARE proteins. The SNARE proteins are a large family of proteins connected to the cell s membrane system, some, to the vesicles (v-snares) and some others to the cell membrane (t-snares), while other proteins help this core to operate correctly. Four proteins are essential for neurotransmitter release: Syntaxin, Munc8, SNAP25 and Synaptotagmin. This process starts with the assembly of Syntaxin and SNAP25 in the membrane, helped by Munc8. After, Synaptotagmin and Synaptobrevin bind to them and form the SNARE complex, docking the vesicles close to the membrane. When the SNARE complex is zippered, Complexin inhibits fusion until Synaptotagmin detects Ca 2+ influx, promoting membranes fusion and neurotransmitter release. It is known that, after fusion, the SNARE complex is dissolved by the enzyme NSF, but somehow the proteins should be prevented to bind again. Also, the axon button constitutes a very independent system as it is far away from the cell soma, making necessary to recycle the vesicles to gain functionality again. The aim of this research is to clarify the redistribution and recycling of the proteins involved in neurotransmitter release after vesicle fusion. To address this question, in our lab we use primary cultures of mouse chromaffin cells as a suitable model for neuron vesicle cycle. The cells are stimulated with a highly concentrated K + solution to trigger vesicle secretion. They are fixed at several times after stimulation. To visualize the proteins, immunofluorescent stainings are used for confocal microscopy, analyzing the redistribution of the proteins through the cell with the program Image J. To follow the exact organelle where the proteins are while recycling, electron-microscopy is used, labeling the proteins with immunogold particles. The data obtained from these techniques will allow insight for the first time into the cycle of the proteins responsible of vesicle fusion. P4. Parasitología molecular P4- (R4-2) Functional microengineered model of the human splenon-on-a-chip Aleix Elizalde-Torent, Luís Rigat-Brugarolas 2, María Bernabéu, Mariana De Niz, Lorena Martín-Jaular, Carmen Fernández- Becerra, Antoni Homs-Corbera 2, Josep Samitier 2, Hernando A. Del Portillo CRESIB-Barcelona Center for International Health Research, Barcelona, ES, 2 Nanobioengineering group, Institute for Bioengineering of Catalonia-IBEC, Barcelona, ES We have developed a newfangled microfluidic device that mimics the hydrodynamic behavior and filtering functions of the splenon, the minimal functional unit of the red pulp of the spleen able to maintain its filtering functions. Unlike any other previous microfluidic devices, the human splenonon-a-chip incorporates for the first time two compartments with different flow velocities (according to the physiological flow division) and two physical barriers representing the reticular mesh and the interendothelial slits (IES) where cells first slow down increasing the hematocrit and then traverse the IES in a unidirectional matter. To validate the use of this platform, several experiments were carried out with different types of red blood cells (RBCs). As a proof of concept, we described that old RBCs showed less deformability than freshly drawn RBCs when traversing the microconstrictions. Posterior analysis allowed studying the passage and deformability of infected RBCs through the IES using peripheral blood of BALB/c mice experimentally infected with the P. yoelii 7X-GFP strain. Results showed that infected reticulocytes are significantly more deformable than non-infected reticulocytes, in agreement with the higher deformability of reticulocytes parasitized by P. vivax, a human malarial parasite with reticulocyte tropism. These results suggest that the device is able to reproduce physiological conditions and to distinguish different types of RBCs by means of deformation/mechanical properties. Presently, we are determining if there is hemolysis during the pass of blood through the device, if there is pitting in the absence of macrophages and the rheological properties of malarial infected RBCs. P4-2 Cambios inducidos por choque térmico en el transcriptoma de Leishmania major Alberto Rastrojo, Begoña Aguado, José M. Requena Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM, Madrid, ES Los parásitos del género Leishmania, causantes de un grupo de patologías conocidas como leishmaniasis, son transmitidos a humanos y otros mamíferos a través de insectos hematófagos. Durante la transmisión, entre otros cambios, el parásito debe enfrentarse a un aumento significativo en la temperatura ambiente, siendo considerado un factor disparador del proceso de diferenciación. Para comprender mejor la relación entre el aumento de temperatura y la diferenciación en Leishmania, en este estudio, hemos analizado mediante RNASeq los cambios en el transcriptoma de la forma promastigote (propia del insecto vector) asociados a la temperatura de crecimiento propia de sus huéspedes (26 o 37ºC). La cuantificación de los niveles de expresión relativa de los.523 transcritos anotados para L. major y su análisis con diferentes programas (Cuffdiff, DESeq y DESeq2), han puesto de manifiesto importantes cambios en el transcriptoma inducidos por choque térmico. Considerando los resultados comunes a los 3 programas, observamos la expresión diferencial de transcritos, de los que 92 mostraron una acumulación y 9 disminuyeron sus niveles. Los transcritos codificantes de amastinas y otras proteínas específicas del estadio amastigote (forma del parásito en el huésped mamífero) aumentaron su expresión, así como transcritos codificantes de quinasas, ciclinas y proteínas de unión a RNA. También observamos la acumulación durante el choque térmico de 2 transcritos correspondientes a RNA estructurales (snorna y rrna). Además, hemos observado que el choque térmico tiene efectos importantes sobre mecanismos clave de la regulación de la expresión génica en Leishmania como son el trans-splicing, la poliadenilación y la terminación transcripcional. P4-3 Adenylate cyclase toxin promotes bacterial internalization into non phagocytic cells Asier Etxaniz Iriondo, César Martín, Kepa B. Uribe, Aitor Etxebarria, David González Bullón, Jon Arluzea 2, Felix M. Goñi, Juan Aréchaga 2, Helena Ostolaza Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Bilbao, ES, 2 Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina, Universidad del País Vasco, Bilbao, ES Bordetella pertussis causes whooping cough, a respiratory infectious disease that is the fifth largest cause of vaccine-preventable death in infants. Though historically considered an extracellular pathogen, this bacterium has been 25

Pósters XXXVII Congreso SEBBM detected both in vitro and in vivo inside phagocytic and non-phagocytic cells. However the precise mechanism used by B. pertussis for cell entry, or the putative bacterial factors involved remain largely unknown. Here we find that adenylate cyclase toxin (ACT), one of the important toxins of B. pertussis, is sufficient to promote bacterial internalization into nonphagocytic cells. After exhaustive characterization of the entry route we show that uptake of toxincoated bacteria proceeds via a clathrin-independent, caveolaedependent entry pathway, allowing the internalized bacteria to survive within the cells. Intracellular bacteria were found inside non-acidic phagosomes enriched in sphingomyelin and cholesterol, or free in the cytosol of the invaded cells, suggesting that the ACT-induced bacterial uptake does not follow the classical phagolysosomal pathway. Activation of Tyr kinases and toxininduced Ca 2+ -influx are essential for the entry process. We hypothesize that B. pertussismight use ACT to activate the endocytic machinery of nonphagocytic cells and gain entry into these cells, which represents a possible mechanism by which it might evade the host immune system. P4r-4 Molecular epidemiology and analysis of the risk of infection by Anisakis spp. (Nematoda: Anisakidae) in sardines (Sardina pilchardus) from Iberian waters Dolores Molina Fernández, David Malagón, Gema Merino Espinosa, Rocío Benítez, F. Javier Adroher, Joaquina Martín Sánchez Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES Sardine (Sardina pilchardus) is a fish commonly consumed and appreciated in Mediterranean countries. A molecular epidemiological survey with 90 sardines from 5 fishing areas of Mediterranean (Málaga, southern Spain) and Atlantic Spanish coasts (southern: Cádiz and Isla Cristina; northern: A Coruña and Ondarroa) were carried out to analyse the presence of Anisakis spp. larvae. All found larvae in fish were in third larval stage. The higher prevalence of these larvae was observed in fish from A Coruña (28.3%), followed from Ondarroa (5%) and Cádiz (2.5%). No Anisakis larvae were found in fish from Málaga and Isla Cristina. Three Anisakis genotypes were identified by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism of the ribosomal fragment ITS-5.8S-ITS2: A. simplex sensu stricto, A. pegreffii and a hybrid genotype between these two species. A. pegreffii was the more prevalent species in A Coruña (7.0 % of larvae). Only three Anisakis larvae (9.% collected larvae) were located in the musculature of sardines: two of them were identified as A. pegreffii, and the remaining one was a hybrid genotype. Sardine infection was associated with fishing area and fish length/weight. Risk factor multivariate analysis shows that the risk of infection increases.6 times per cm in the length of the sardines in the same fishing area. Also, in equal length, sardines from A Coruña have a risk of parasitization.5 times higher than those from other fishing areas. In any case, the low number of larvae found in the muscle supposes a low human anisakiasis risk. This risk is less, however, if people eat smaller sardines and/ or sardines from fishing areas with low prevalence of Anisakis infection, which reduces significantly the presence of Anisakis in this fish. P4-5 Caracterización multigénica de los vectores transmisores de fascioliasis humana y animal en Chile, basada en la utilidad de marcadores del ADN ribosomal y mitocondrial Verónica H Agramunt, Maria Dolores Bargues, Santiago Mas-Coma Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Burjassot, Valencia / Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad CEU-Cardenal Herrera, Castellón, ES Las implicaciones de los lymnaeidos en la transmisión de la fascioliasis, su epidemiología y control, insta a desarrollar nuevas herramientas para facilitar la clasificación de muestras, caracterización genética de las poblaciones naturales y cepas de laboratorio, y para dilucidar la sistemática y taxonomía de la família Lymnaeidae. Los marcadores de ADN ribosomal (ADNr) y de ADN mitocondrial (ADNmt) han demostrado ser útiles en esta tarea en los invertebrados en general. Su aplicación también ha demostrado ser útil en caracoles lymnaeidos a niveles específicos, genéricos y de taxones supragenéricos. Los espaciadores transcritos internos del ADNr, ITS-2 e ITS-, son las secuencias más útiles para clasificar especies de lymnaeidos. Un fragmento del gen de la subunidad I de la citocromo c oxidasa (cox) del ADNmt también resultó útil, aunque los marcadores del ADNmt deben ser empleados con precaución. Cada uno de los tres marcadores de ADN se amplificaron mediante PCR independientemente para cada especímen de lymnaeido, y cada producto de PCR se secuenció para una caracterización de haplotipos. Los datos de las secuencias de nucleótidos de los ITS-2 e ITS- del ADNr nuclear y de cox del ADNmt de depositaron en el GenBank. Los resultados obtenidos cambian el escenario de los lymnaeidos conocido hasta ahora en Chile. Se demostró la presencia de Galba truncatula en Chile, especie que ha sido siempre confundida con Lymnaea viator. Esta última podría ser la principal responsable de la infección animal, mientras que G. truncatula lo sería de la mayoría de casos humanos. Especímenes de Pectinidens diaphana mostraron una gran variabilidad intraespecífica en su ADN, con un nuevo haplotipo en ITS- y tres nuevos en cox. Lymnaea patagonica demostró ser un sinónimo de P. diaphana. Las escasas diferencias nucleotídicas a nivel de ITS-2 e ITS- mantienen a L. patagonica como una subespecie de P. diaphana. Tampoco Lymnaea lebruni presentó diferencias suficientes para considerarlo un taxón distinto respecto a P. diaphana y L. patagonica. Todo ello proporciona una nueva línea de base para llevar a cabo futuros estudios apropiados sobre la transmisión, epidemiología y control de la Fascioliasis humana y animal en Chile. Financiación: SAF200-20805, Ministerio de Economía y Competitividad; RD06/002/007, Red de Investigación Cooperativa en Enfermedades Tropicales-RICET, RETICS-FEDER, Ministerio de Sanidad, Madrid; y PROMETEO 202/042, Programa I+D de Grupos de Investigación de Excelencia, Generalitat Valenciana, Valencia. P4-6 (R4-) Carbohydrate-binding agents act as potent trypanocidals that elicit modifications in VSG glycosylation Víctor M. Castillo-Acosta, Antonio E. Vidal, Luis Miguel Ruiz- Pérez, Els J.M. Van Damme 2, Yasuhiro Igarashi 3, Jan Balzarini 4, Dolores González-Pacanowska Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Armilla (Granada), ES, 2 Laboratory of Biochemistry and Glycobiology, Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, Ghent, BE, 3 Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University, Toyama, JP, 4 Rega Institute for Medical Research, Leuven, BE The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the etiologic agent of African trypanosomiasis. The chemotherapy relies on a few drugs which have adverse side-effects. The cell surface of bloodstream forms dwelling in the mammalian host is covered by a densely packed coat of glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoproteins. The major component is the variant surface glycoprotein (VSG) which is glycosylated by both paucimannose and oligomannose N-glycans for building up the protective barrier against the immune system. Surface glycans are poorly accessible and killing mediated by peptide lectin-vsg complexes is hindered by active endocytosis. In contrast to previous belief, here we show that high affinity carbohydrate binding agents (CBAs) bind to surface glycoproteins and abrogate growth of T. brucei bloodstream forms. Specifically, binding of the mannose-specific Hippeastrum hybrid agglutinin (HHA) triggered intense perturbations in endocytosis and further parasite lysis. Prolonged exposure to HHA induced parasites 26

Granada 204 Pósters resistance based on their diminished capacity to bind the lectin. These parasites exhibited a loss of triantennary oligomannose at the expense of paucimannose structures in surface glycoproteins as a result of genetic rearrangements that abolished expression of the oligosaccharyltransferase TbSTT3B gene together with the appearance of novel chimeric enzymes. In addition, we have evaluated the trypanocidal activity of a series of prokaryote non-peptidic CBAs that rendered parasitological cure in acute models of African trypanosomiasis. Thus specific glycosylation patterns are important for CBA cytotoxicity and parasite fitness in vivo and agents binding efficiently to surface glycoproteins emerge as a new strategy for therapy for African trypanosomiasis. P4-7 Función, estructura y regulación de la expresión de la tirosina aminotransferasa de Leishmania infantum Miguel Ángel Moreno Izquierdo, Ana Alonso Ayala, Pedro José Alcolea Alcolea, Peter John Myler 2, Antonio Jiménez 3, Vicente Larraga Rodríguez Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 2 Seattle Biomedical Research Institute, Seattle, Washington, US, 3 Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES Leishmania infantum es el agente responsable de la leishmaniasis visceral en la cuenca mediterránea. En su ciclo biológico se alternan dos estadíos: promastigote (extracelular en el insecto vector, donde desarrolla un proceso por el que adquiere mayor infectividad conocido como metaciclogénesis) y amastigote (intracelular en el macrófago del hospedador mamífero). La falta de nutrientes esenciales hace que el parásito utilice rutas alternativas para obtener energía, como la degradación de aminoácidos aromáticos mediante transaminación, relacionada con la patogenia y la infectividad por la toxicidad para el hospedador de los productos finales de degradación. En L. infantum esta transaminación la lleva a cabo la tirosina aminotransferasa (LiTAT). LiTAT es una proteína citoplásmática, que se expresa en amastigotes y en promastigotes logarítmicos y metacíclicos en cultivo axénico. Por otro lado se sobreexpresa en cepas resistentes a óxido nítrico de L. chagasi. Dicha sobreexpresión podría explicarse por su interacción con la malato descarboxilasa, responsable de la síntesis de piruvato a partir de malato produciendo NADPH, requerido en la protección frente a estrés oxidativo. LiTAT, en ausencia de hierro, sufre una degradación mediada por proteasoma, la cual puede ser eludida por la deleción del dominio N-terminal. Por ello, LiTAT es un buen candidato para un diseño racional de inhibidores y su estructura unida al cofactor fue resuelta por cristalografía de rayos X a una resolución de 2.3 Å (PDB: 4ix8). Mediante acoplamiento molecular in silico, los residuos responsables de la diferente especificidad de sustrato entre LiTAT y el ortólogo en mamíferos fueron identificados, permitiendo generar un grupo farmacóforo para la identificación de nuevos inhibidores frente a la leishmaniasis. P4r-8 Identificación por cribado de una librería de sobreexpresión de genes implicados en el mecanismo de resistencia al suero humano de Trypanosoma brucei gambiense Jean-Mathieu Bart, Carlos Cordon-Obras 2, Fabian Lorenzo 3, Basilio Valladares 3, Agustin Benito, Miguel Navarro 2 Centro Nacional de Medicina Tropical Instituto de Salud Carlos III, Armilla, ES, 2 Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Armilla, ES, 3 Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES Trypanosoma es un protozoo que vive en el torrente sanguino de los mamíferos. Desarrolló a lo largo de la evolución una serie de mecanismos para eludir las respuestas inmunes específicas e innatas de sus huéspedes. De las tres subespecies de Trypanosoma brucei, dos son infectivas para el humano, T. b. rhodesiense y T. b. gambiense, mientras T. b. brucei es sensible al acción del suero humano (SH). Se ha descrito la Apolipoproteina L (ApoL) como el componente del suero humano responsable de la lisis de los tripanosomas, formando poros al nivel del lisosoma del parasito. En T. b. rhodesiense, la expresión de un único gen, el SRA (Serum Resistante Associated gene) es suficiente para conferir resistencia al SH, impidiendo la acción de ApoL. En T. b. gambiense, el parasito responsable de 95% de los casos de enfermedad de sueño, el mecanismo de resistencia no está todavía bien entendido. El objetivo de nuestro trabajo era descubrir genes implicados en el mecanismo desarrollado por T. b. gambiense para resistir al SH. Nuestra estrategia consistió en complementar la cepa sensible al SH de T. b. brucei por una librería de expresión construida a partir del ADN genómico de T. b. gambiense. La selección de los clones se hizo por adición de % de SH. Dos genes han sido identificados: HRF- y HRF-2 (Human Resistant Factor), cuya sobreexpresión permite a T. b. brucei proliferar en presencia de 0% de SH. HRF- se expresa en el nucléolo de la célula, y su papel regulador esta estudiado vía secuenciación masiva de ARN. HRF-2 es una proteína glicosilada perteneciendo a la familia de la lectinas. El análisis de su localización subcelular por inmunofluorescencia nos permitió colocalizar HRF-2 con proteínas implicadas en exocytosis. El KO de ambos genes HRF- y 2 en T. b. gambiense está en proceso y nos permitirá evaluar si su falta de expresión impide al parasito de resistir el SH. A pesar de la ausencia de la proteína TgsGP publicada recientemente como implicada en el mecanismo de resistencia al SH de T. b. gambiense, hemos caracterizados dos genes HRF- y HRF-2 cuya sobreexpresión confiere resistencia parcial. P4-9 ABCI3, un nuevo transportador mitocondrial de Leishmania major implicado en la susceptibilidad a antimoniales Talia Arcari, José Ignacio Manzano, Santiago Castanys, Francisco Gamarro Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES Los parásitos del genero Leishmania son responsables de un grupo de enfermedades devastadoras con diversas manifestaciones clínicas. La ausencia de vacunas y la frecuente resistencia a los fármacos, hace necesario identificar nuevas dianas terapéuticas. Los transportadores ABC (ATP-binding cassette) son una familia de proteínas implicadas en la resistencia a fármacos en diversos organismos. En el presente trabajo describimos la caracterización funcional del transportador ABCI3 de Leishmania major, que pertenece a un grupo de transportadores únicos de tripanosomátidos. Utilizando parásitos que sobreexpresan ABCI3 fusionada a GFP (GFP-ABCI3) y ensayos de permeabilización con digitonina, hemos determinado que ABCI3 se localiza en la membrana externa de la mitocondria del parásito. Hemos obtenido parásitos con un alelo delecionado para ABCI3 (LmABCI3 +/- ), y hemos realizado ensayos de viabilidad celular en presencia de fármacos leishmanicidas. Los promastigotes LmABCI3 +/- son cinco veces más resistentes a Sb(III) y As(III); al exponer los parásitos a concentraciones subletales de Sb(III), estos acumulan menos Sb(III), presentan unos niveles de ATP mayores, una menor despolarización de la membrana mitocondrial, y menores niveles de ROS que los parásitos control. Además, los parásitos que sobreexpresan una versión mutada inactiva del transportador (LmABCI3K088M) son también más resistentes a Sb(III). Actualmente estamos realizando ensayos de complementación de LmABCI3 +/- con una copia episomal del gen y posteriormente trataremos de obtener parásitos mutantes nulos. Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan Nacional de I+D+i Proyectos SAF202-34267 (F.G.), SAF20-2802 (S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia CTS-7282). 27

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P4r-0 Identificación y caracterización de nuevos fármacos de reposición activos frente a Trypanosoma brucei Marta Martínez-García, Luis Carvalho, Rubén Cebrián Castillo 2, Jenny Campos-Salinas, Ignacio Pérez-Victoria 3, J. Ignacio Manzano González, Santiago Castanys, Francisco Gamarro, Vanessa Yardley 4, Elena González, Mercedes Maqueda Abreu 2, José Mª Pérez-Victoria IPBLN-CSIC, Granada, ES, 2 Universidad de Granada, Granada, ES, 3 Fundación MEDINA, Granada, ES, 4 LSHTM, Londres, UK El protozoo parásito Trypanosoma brucei es responsable de la enfermedad del sueño, una de las enfermedades consideradas como olvidadas por la OMS que cuenta con un peor control farmacológico. Los pocos medicamentos disponibles son muy tóxicos y difíciles de administrar, por lo que se necesitan nuevos fármacos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica sin producir neurotoxicidad, a ser posible de administración oral y de un precio asumible por los pacientes. La reposición de fármacos (utilización de medicamentos en uso para tratar otras enfermedades) es una estrategia interesante para identificar este tipo de compuestos, ya que permite reducir el tiempo transcurrido desde la identificación del compuesto hasta su entrada en fase clínica de estudio. En este trabajo describiremos la actividad tripanocida y el mecanismo de acción de varios de estos prometedores compuestos frente a T. brucei. Un ejemplo lo constituye la tafenoquina (TFQ), un fármaco oral en fase clínica avanzada (IIb/III) para tratar y prevenir la malaria y que ha demostrado ser eficaz in vivo frente a Leishmania, aunque no frente a Trypanosoma cruzi. Mostramos que la TFQ es activa a concentraciones submicromolares frente a distintas subespecies de T. brucei, incluyendo T. b. rhodesiense. La TFQ provoca una despolarización mitocondrial en el parásito, aumento de Ca 2+ intracelular y producción de especies reactivas del oxígeno, que acaban produciendo alteraciones celulares a nivel del bolsillo flagelar, el núcleo y la mitocondria. También mostraremos el efecto de otros fármacos de reposición muy activos frente a T. brucei (IC 50% = 3 nm) cuyo mecanismo de acción estamos caracterizando. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF20-2825 (JMPV),SAF202-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO786(JMPV) y Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV). P4r- Analysis of the Trypanosomatid serine/threonine protein kinase Jean3, a novel potential therapeutic target Andrés Vacas-Oleas, Celia Fernández-Rubio, Carmen Sanmartin 2, Socorro Espuelas 3, Paul Nguewa Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona, ES, 2 Instituto de Salud Tropical/Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, University of Navarra, Pamplona, ES, 3 Instituto de Salud Tropical/Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, University of Navarra, Pamplona, ES Leishmaniasis, Sleeping sickness and Chagas disease are neglected diseases caused by intra-cellular parasites that belong to the Trypanosomatidae family. These pathologies affect several million people around the world. The transmission of the parasites between invertebrate vectors and mammalian hosts, involves morphological and physiological changes needed to acquire virulence and to adapt to the environment. This mechanism of differentiation is called metacyclogenesis. We identified a number of genes apparently involved during this process. One of our objectives is the validation of these genes as therapeutic targets. After screening the Leishmania and Trypanosoma genomes, we found plausible candidates involved in the parasites differentiation and adaptation phenomena. We mainly focus on protein kinases as promising druggable molecules described against different pathologies. After identifying Jean3 as a therapeutic target candidate in several trypanosomatids, the analysis of its structure and the prediction of its function were assessed by several bioinformatic tools in T. cruzi and L. major. We also demonstrated that Jean3 is differentially expressed during the stages of growth and proliferation. In addition, the infective forms of these parasites exhibit high gene expression levels of this protein kinase. We are now performing several experiments in order to study the localization of Jean3 and its implication in different processes such as treatment resistance, cell cycle and viability, cell death and apoptosis, and parasites virulence phenomena. P4r-2 Identificación funcional de posibles secuencias promotoras de la polimerasa de ARN tipo II en tripanosomas africanos Carlos Cordon-Obras, Andreu Saura, Diana López Farfán, Fabián Lorenzo 2, Nick Dickens 3, Basilio Valladares 2, Miguel Navarro Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES, 2 Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES, 3 The Wellcome Trust Centre for Molecular Parasitology, Glasgow, UK Los tripanosomátidos son protozoos flagelados pertenecientes al orden Kinetoplastida, organismos ancestrales que se separaron muy pronto del resto de la rama eucariota. Su particular evolución hace que presenten una combinación de rasgos procariotas y eucariotas única, fundamentalmente a nivel de transcripción y organización genómica. Con la salvedad del Spliced Leader (SL), un ARN que se añade al 5 de todos los ARN mensajeros, no se ha identificado ningún otro promotor de ARN polimerasa de tipo II (pol II), e incluso éste, es bastante particular, puesto que inhibidores específicos de pol II y pol III no reducen su actividad en la medida esperada. La transcripción, mediada en la mayoría de los marcos abiertos de lectura por la pol II, está organizada en policistrones, y se ha sugerido que los sitios donde cambia el sentido de la transcripción (SSR), son secuencias de iniciación de la transcripción. Sin embargo, no se ha identificado ninguna secuencia específica que pueda ser considerada como promotor. Para realizar este trabajo primero se generó un antisuero purificado por afinidad frente a la subunidad mayor de la pol II, lo que nos permitió analizar su expresión por Western blot, y su localización en el núcleo del Kinetoplastida modelo (Trypanosoma brucei) mediante inmunofluorescencia. Empleando este antisuero para inmunoprecipitación de cromatina y posterior secuenciación masiva identificamos posibles promotores de la pol II. Esta técnica reveló más de 200 picos significativos de acumulación de la pol II, la mayoría de ellos asociados con los SSR divergentes del genoma de T. brucei. La alta resolución de esta técnica nos permitió acotar con gran precisión regiones candidatas para actuar como promotores. El potencial de estas regiones como promotores se está evaluando mediante el análisis de actividad de un gen reportero insertado de forma estable en el genoma. Resultados preliminares muestran que algunas de estas regiones permiten la transcripción del gen reportero, al contrario de lo que ocurre con la misma construcción en ausencia de promotor. Estos datos, de confirmarse, supondrían la modificación del paradigma que dicta la ausencia de promotores de ARN pol II en los Kinetoplastida. P4-3 Caracterización de un nuevo transportador ABC esencial en Trypanosoma brucei, agente etiológico de la enfermedad del sueño Lina Orrego, Viviana Sánchez-Martíns, Marta Martínez-García, María Cabello-Donaire, Sophie Malagerie-Cazenave, Jenny Campos- Salinas, Antonio Estevez, Santiago Castanys, Francisco Gamarro, José M. Pérez-Victoria Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra -CSIC, Granada, ES La enfermedad del sueño es una enfermedad tropical causada por el protozoo parásito Trypanosoma brucei. La transmite la mosca TseTse, que inyecta las formas procíclicas del parásito al hospedador mamífero, 28

Granada 204 Pósters donde se transforman en formas sanguíneas que causan la enfermedad, mortal en ausencia de tratamiento. Como los medicamentos tripanocidas no son adecuados debido a su toxicidad y a la aparición de resistencias, es prioritario encontrar nuevas dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos. En este trabajo presentamos la caracterización de TbABCG6, un nuevo transportador ABC de T. brucei. La proteína ortóloga en el parásito Leishmania, se encuentra localizada en membrana plasmática y confiere resistencia a medicamentos leishmanicidas. En primer lugar, ensayos de northern y western blot indicaron que TbABCG6 se expresa mayoritariamente en las formas sanguíneas del parásito, estadío sobre el que se realizó el resto de la caracterización. Los ensayos de inmunofluorescencia usando anticuerpos generados frente a esta proteína mostraron que se localiza en vesículas cercanas al bolsillo flagelar del parásito, donde se encuentra concentrada la maquinaria endocítica y exocítica. La sobreexpresión de TbABCG6 no confirió resistencia a fármacos tripanocidas. Por el contrario, incrementó la sensibilidad a suramina, un fármaco que entra por endocitosis mediada por receptor, aunque esta mayor sensibilidad no se debe a diferencias en la acumulación de suramina. Por otra parte, la interferencia parcial de la expresión de TbABCG6 mediante RNAi causó una dramática disminución del crecimiento del parásito asociada con una anormal morfología celular (ensanchamiento del bolsillo flagelar y presencia de múltiples flagelos). La importancia de dicha proteína en la viabilidad del parásito sugiere un papel esencial de TbABCG6 en T. brucei que estamos tratando de elucidar. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF20-2825 (JMPV), SAF202-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO786 (JMPV) y Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV). P4r-4 El transportador ABCG2 de Leishmania está implicado en la resistencia a antimoniales Ana Perea, José Ignacio Manzano, Kirsten Verachtert, Santiago Castanys, Francisco Gamarro Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES La quimioterapia es actualmente la única herramienta de lucha disponible frente a la leishmaniasis, aunque el reducido arsenal de fármacos disponibles y el incremento del fallo terapéutico limitan el control de esta enfermedad parasitaria. La familia de transportadores ABC (ATP-binding cassette) en Leishmania incluye 42 genes distribuidos en 8 subfamilias (A- H), llevando a cabo funciones biológicas relevantes. Se han caracterizado varios miembros de la subfamilia ABCG, los cuales son half-transporters, implicados en la resistencia a fármacos, translocación de fosfolípidos a la membrana plasmática e infectividad. Nuestro grupo ha descrito que líneas dominantes negativas para el transportador ABCG2, presentan una menor infectividad en modelo murino. Hemos comprobado que la sobreexpresión de ABCG2 confiere una resistencia significativa a Sb(III) así como al ión metálico As(III), debido a una reducción en su acumulación por incremento de su eflujo. Igualmente, hemos observado que formas amastigotas de Leishmania que sobreexpresan el transportador ABCG2, son más resistentes a antimonio que la línea salvaje. Asimismo, comprobamos que la resistencia a metales revierte tras la reducción de los niveles de tioles mediante el pretratamiento con butionina-sulfoximida. Los estudios de localización subcelular en parásitos que sobreexpresan ABCG2-GFP, sugieren que el transportador se localiza en vesículas intracelulares del parásito. Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan Nacional de I+D+i Proyectos SAF202-34267 (F.G.), SAF20-2802 (S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia CTS-7282). P4m-5 Desarrollo y validación de un sistema HTS en un modelo experimental de LV para el descubrimiento de nuevos fármacos leishmanicidas Estefanía Calvo Álvarez, José Miguel Escudero Martínez, Rosa Reguera Torres, Rafael Balaña Fouce, Estefanía Calvo Álvarez Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de León, León, ES El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar la leishmaniosis visceral (LV), la forma más severa de los distintos tipos de leishmaniosis, es cada vez más urgente y necesario, debido a la ineficacia de los tratamientos actuales, su toxicidad y a la aparición de resistencias. El desarrollo de sistemas de alto rendimiento o HTS (High-Throughput Screening), permitiría testar miles de compuestos de manera rápida, efectiva y reproducible. Debido a la influencia crítica de la respuesta inmune del hospedador en el tratamiento de la infección, el sistema empleado incluye la totalidad de las poblaciones celulares involucradas en la interacción parásito-hospedador y la forma intracelular del parásito. Nuestro grupo ha validado un sistema HTS en placas de 384 pocillos, mediante el empleo de un modelo ex vivo de bazos infectados con una cepa de L. infantum que sobreexpresa de forma estable la proteína infrarroja irfp. La regulación de la expresión génica en Leishmania involucra las zonas 3 no traducidas (3 UTR), las cuales contienen señales necesarias para el procesamiento adecuado de los ARNm. La máxima expresión de la proteína irfp en la fase de amastigote fue analizada mediante el clonaje de distintas regiones 3 UTR de genes regulados diferencialmente en la fase intracelular del ciclo (A2, AMASTIN), y del gen HSP70II de L. infantum expresado de forma constitutiva, corriente abajo del reportero infrarrojo. La caracterización de la fluorescencia emitida fue realizada en promastigotes, amastigotes aislados de infecciones in vitro en la línea humana THP-, y amastigotes purificados de bazos de ratones BALB/c infectados. Las infecciones experimentales en ratones BALB/c para la obtención de los cultivos ex vivo se llevaron a cabo con la cepa irfp-3 HSP70+ L. infantum. La validación del sistema se realizó mediante el testado de una colección de 320 compuestos en placas de 384 pocillos, obteniendo valores Z>0.5. La capacidad para identificar compuestos mediante sistemas HTS es vital para el descubrimiento de nuevos fármacos que puedan ser empleados en un futuro en la terapia contra la leishmaniosis. Agradecimientos: trabajo fi nanciado por los proyectos AGL200 6078/ GAN y CYTED 24RT0482, del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). P4-6 Fosforilación de la histona H2AX en Leishmania major como respuesta al daño producido en el ADN por los derivados camptotecínicos Raquel Álvarez-Velilla, Rafael Balaña-Fouce, Rosa M Reguera- Torres, Yolanda Pérez-Pertejo Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de León, León, ES La camptotecina y sus derivados estabilizan el complejo de escisión que se genera entre la Topoisomerasa IB (TopIB) y la molécula de ADN durante el proceso de replicación. Esta estabilización a menudo implica la formación de roturas de la doble cadena debido a la colisión entre este complejo y la horquilla de replicación, lo que puede desencadenar tanto en un arresto del ciclo celular como en la muerte de la célula. Como consecuencia del daño producido se activan los procesos de reparación del ADN a través de modificaciones o variantes de las histonas. Uno de los marcadores mas tempranos del daño en el material genético en eucarioras es la ϒH2AX, una variante de la histona H2A con un serina fosforilada. En tripanosomatidos, esta fosforilación se produce en la treonina 30 situada en el extremo C terminal de la histona. Por lo tanto, este marcador nos es útil para una 29

Pósters XXXVII Congreso SEBBM correcta evaluación del daño sufrido en el ADN provocado por la acción de los inhibidores camptotecínicos. Diseñamos un péptido para la posterior inmunización de un conejo y así obtener anticuerpos específicos frente a la histona fosforilada. Estudiamos el daño producido por la camptotecina y tres de sus derivados: gimatecan, topotecan y el metabolito activo del irinotecan, denominado SN38, en promastigotes de Leishmania major. Estos compuestos fueron evaluados a una concentración fija y distintos tiempos, observándose en todos los casos una señal positiva para la histona fosoforilada que va aumentando hasta un máximo de 2 horas. Además se observa un arresto de ciclo celular en distintas fases como consecuencia de la rotura de doble cadena durante las primeras horas de exposición a la droga. Financiación: PI2/0004 del Instituto de Salud Carlos III y CYTED 24RT0482 del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). P4-7 Respuesta inmune de dendrímeros carbosilanos en ganglio de ratón infectado con Leishmania major Ana Tejería-Bengoechea, José Miguel Escudero-Martínez, Yolanda Pérez-Pertejo, Rafael Balaña Fouce, Rosa Mª Reguera Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de León, León, ES Se ha estudiado la respuesta inmune ex vivo de 0 nanopartículas dendriméricas derivadas de carbosilano con diferente carga, sobre gangliocitos murinos infectados con Leishmania major, el agente responsable de la leishmaniosis cutánea en el Viejo Mundo. Ratones BALB/c infectados en la almohadilla plantar con promastigotes metacíclicos de L. major modificados genéticamente con el gen que codifica la proteína fluorescente mcherry, se sacrificaron la 6º semana postinfección y se reseccionó el ganglio poplíteo que drenaba la lesión infectada. Los explantes de ganglio infectados se cultivaron en presencia de una concentración de cada dendrímero toxicológicamente no comprometida. Tras 72h de cultivo, se recogieron los sobrenadantes para valorar las citoquinas: IL-4, IL-2, TNFα e INFγ. El dendrímero BDEF 03 y los cinco derivados de éste, mostraron una disminución significativa de la IL-4 y un aumento tanto en la señal de TNFα como en la del INFγ, ambas correspondientes a una respuesta Th, cabe destacar, que ninguno de los dendrímeros mostró cambios en IL-2 con respecto al control. Los otros 4 dendrímeros, de generaciones superiores a los anteriores, fueron capaces de disminuir la respuesta Th2 mediada por la IL- 4, pero no fue significativa, mientras que en el caso de la respuesta Th, no se encontraron señales de un aumento del TNFα y del INFγ. Para completar estos resultados de la respuesta inmune se realizó la cuantificación de las actividades inos y arginasa de las células hospedadoras, obteniendo unos niveles altos de NO en el sobrenadante de los cultivo y una baja actividad arginasa atribuible a un ratio Th/Th2 elevado. Trabajo fi nanciado por los proyectos PI2/0004 del Instituto de Salud Carlos III y CYTED 24RT0482, del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). P4-8 (R4-4) Amino alcohols as an appealing and versatile scaffold for Leishmania chemotherapy. Unraveling their mechanism of action M. Ángeles Abengozar Infantes, Raquel García-Hernández 2, Pilar Fernández de Palencia, Luis Antonio Bustos 3, Ricardo Escarcena 3, Santiago Castanys 2, Esther Del Olmo 3, Francisco Gamarro 2, Arturo San Feliciano 3, Luis Rivas Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Unidad Metabolómica, Interacciones y Bioanálisis (UMIB), Madrid, ES, 2 Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, Armilla, ES, 3 Facultad de Farmacia, Departamento de Química Farmacéutica (USAL), Salamanca, ES The quest for new leads against the human infections caused by the protozoans of the genus Leishmania, known collectively as leishmaniasis, is urgently demanding, as chemotherapy, based on a paucity of drugs, is threatened by rising resistance. Aminoalcohols are a versatile pharmacological scaffold successfully assayed for anti-inflammatory, antitumoral, antibiotic and antiparasitic activities. In this work, a set of 5 alkyl-substituted aminoalcohols were assayed for leishmanicidal activity. All were active at micromolar range, being compound 5 the best candidate on intracellular L. donovani parasites (IC 50 = 0.7μM, and selectivity index = 7.4). The most active compounds induced depletion of intracellular levels of ATP; however, they displayed a non-homogenous mechanism lethal pattern, depending on subtle structural differences, as assessed by biochemical and microscopical techniques. Two polarized modes of action were unveiled; whereas for compound 5 is based on mitochondrial dysfunction, with inhibition of complex II of the respiratory chain, compound 8 behaved as a membrane-active agent inducing an irreversible loss of internal homeostasis with entrance of vital dyes. Aside from these two extreme prototypes, others, as compound 9, fell in an intermediate, gray area, between them with alteration of membrane traffic with intracellular vesiculation and accumulation of material at the flagellar pocket. Altogether aminoalcohols resulted as appealing new candidates for Leishmania chemotherapy. Supported by grants VI PN de I+D+I 2008-20 ISCIII -Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa RICET (RD2/008/0007, RD2/008/007, RD2/008/0002), PI2-02706 (LR), SAF202-34267 (F.G.), Proyecto de Excelencia CTS-7282 (F.G.) and JCyL 22U3. P4-9 Clonaje y expresión de la enzima E, activadora de ubiquitina, en Leishmania infantum Jaime Larraga, Pedro José Alcolea, Ana Alonso, Vicente Larraga Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES La leishmaniosis es una enfermedad producida por protozoos del género Leishmania que afecta a dos millones de personas en el mundo. Es una zoonosis transmitida a través de la picadura de dípteros del género Phlebotomus. Las principales formas clínicas son cutánea, visceral y mucocutánea. En Europa el agente causante de la enfermedad visceral es L. infantum. La enzima activadora de ubiquitina (E) cataliza el primer paso en la reacción de ubiquitinación que marca las proteínas para su degradación vía proteasoma. Al inicio de la cascada de la ubiquitinación, la enzima E une ATP-Mg 2+ y la ubiquitina. En el siguiente paso, una cisteína catalítica del enzima E, ataca el complejo ubiquitina-amp formado a través de una sustitución acílica, creando simultáneamente una unión tioéster, liberándose AMP. Finalmente el complejo E-ubiquitina transfiere la ubiquitina a la enzima catalítica E2 a través de una reacción de transesterificación. Se ha realizado el clonaje del gen activador de la ubiquitina E (LinJ.07.000) en el vector pqe-30 y se llevó a cabo la expresión en la cepa M5 de E. coli. Las condiciones óptimas de expresión resultaron ser 2h a 30 ºC, siendo parcialmente soluble. Se purificó usando cromatografía de afinidad y se está procediendo a su caracterización. Mediante el uso de los programas ClustalW y BlastP se ha realizado el alineamiento, siendo el grado de homología obtenido aproximadamente del 90% con L. major y L. braziliensis, reduciéndose este valor al 4% en el caso de Trypanosoma cruzi, siendo todavía menor en el caso de los mamíferos. Se ha llevado a cabo el modelado de la proteína con el programa PyMol. 30

Granada 204 Pósters P4-20 Efecto de la sobreexpresión de las proteínas fosfatasas (PP) en Leishmania infantum María Degayón, Ana Alonso, Pedro J. Alcolea, Miguel Angel Moreno, Vicente Larraga Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES La leishmaniasis visceral es una enfermedad zoonótica causada por el protozoo Leishmania infantum en la Cuenca Mediterránea, donde los perros son el reservorio principal. La transmisión se produce por la picadura del vector Phlebotomus perniciosus. A lo largo del ciclo biológico digenético, el parásito se desarrolla desde su forma extracelular y móvil en el hospedador invertebrado, promastigote; a su estado intracelular y no móvil, en el hospedador mamífero, amastigote. Las PP desempeñan un papel esencial en la regulación de una gran variedad de procesos en los organismos eucariotas. Sin embargo, las rutas de señalización celular que desencadenan estos cambios morfogénicos en L. infantum apenas han sido caracterizadas, lo que promueve este estudio. El alineamiento comparativo de las PP codificadas por el cromosoma 34 en L. infantum revela un núcleo catalítico altamente conservado que difiere únicamente en el extremo N-terminal. Los perfiles de expresión génica analizados por qrt-pcr a lo largo del ciclo biológico muestran que diversas PP se encuentran sobreexpresadas en promastigotes infectivos diferenciados en el flebótomo respecto a promastigotes de cultivo axénico. La sobreexpresión de las PP LinJ.5.0240 y LinJ.34.0840 en trasfectantes estables de L. infantum mediante la integración del plásmido pir-mcs, altera la cinética de crecimiento en promastigotes de cultivo axénico. Asimismo, los estudios por Western blot reflejan un drástico descenso en la sobreexpresión de las mencionadas PP tras 48 h de incubación. Estas observaciones sugieren que las PP podrían desempeñar una función esencial en los procesos de diferenciación celular. P4-2 Reticulocyte-prone malaria parasites predominantly invade CD7hi immature cells: implications for the development of an in vitro culture for Plasmodium vivax Lorena Martín Jaular, Aleix Elizalde-Torrent, Richard Thomson- Luque, Mireia Ferrer, Jose Carlos Segovia 2, Esperanza Herreros- Aviles 3, Carmen Fernandez-Becerra, Hernando A del Portillo 4 CRESIB (Barcelona Center for International Health Research), Barcelona, ES, 2 CIEMAT, madrid, ES, 3 Tres Cantos Medicines Development Campus, GlaxoSmithKline, madrid, ES, 4 ICREA - CRESIB (Barcelona Center for International Health Research), barcelona, ES The lack of an in vitro culture for malaria parasites with a unique tropism for reticulocytes, such as Plasmodium vivax or the P. yoelii 7X strain hinders research in these organisms. In order to advance in the characterization of infected cells during P.yoelii 7X-Balb/c experimental infections we have assessed CD7 expression in erythroid cells (TER9 + ) as a correlate of maturation. Parasites were found mainly in immature cells from blood after day 5 post infection (p.i.). Immature reticulocytes (CD7 hi ) were present in low levels at the beginning of the infeccion but its number increases as the infection progresses. The increase of CD7 hi cells in blood concurred with changes in erythropoietic organs. CD7 hi cells appeared in spleen at day 0p.i and increased in bone marrow from day 5 p.i. being the cells mainly infected. Interestingly, mean fluorescence intensity (MFI) of CD7 in infected cells was higher in both, bone marrow and spleen than in the blood at day 5 p.i. This fact strongly suggests that the parasite would begin the infection in erythropoietic organs; thereafter, immature cells would be released to blood. The parasite preference for immature cells that are rare in normal blood could have important implications for the development of an in vitro culture. As a proof of concept, we attempted in vitro culture of P.yoelli adding RBCs from mice with a pyruvate kinase deficiency (PKD). PKD mice presented high percentages of CD7 hi cells in blood comparing with normal animals. In these conditions, we were able to see merozoite reinvasion and viable parasites after 20 h of culture. P4r-22 Tráfico de hemo en Leishmania, un protozoo parásito auxótrofo para este metabolito esencial María Cabello Donaire, Alfonso Calvo 2, Francisco J. Gálvez 3, Noemí Vergara-Segura, Alba Rodríguez-Martínez, Lina Orrego, Marta Martínez-García, Sophie Malagarie-Cazenave, M. Carmen Ruiz- Cantero, Antonio M. Estévez, José Mª Pérez-Victoria Institute of Parasitology and Biomedicine López-Neyra, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-CSIC, Armilla, ES, 2 Centro de Investigación Médica Aplicada-CIMA/Departamento de Histología y Patología, Universidad de Navarra, Pamplona, ES, 3 Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES La leishmaniasis es una devastadora enfermedad tropical causada por el protozoo parásito Leishmania. Su control se basa en la quimioterapia, pero los fármacos leishmanicidas en uso clínico no son adecuados, por lo que es prioritario encontrar nuevos tratamientos. Una estrategia atractiva para la identificación de nuevas dianas farmacológicas consiste en aprovechar diferencias bioquímicas entre el parásito y el hospedador humano. El metabolismo del grupo hemo, un metabolito esencial en todos los organismos aeróbicos, constituye una de estas diferencias, ya que como el resto de tripanosomátidos patógenos, Leishmania es auxótrofo para esta porfirina y debe rescatarlo de la persona infectada. En este trabajo caracterizamos el tráfico de porfirinas a través de la membrana plasmática de L. major. Mostramos que la entrada de porfirinas es dependiente de proteína y que se afecta por variaciones de ph y temperatura así como por la presencia iones y de inhibidores de la producción de energía. A su vez, existe un eflujo de porfirinas que también caracterizamos. Por otra parte mostramos la caracterización de una nueva familia de transportadores de membrana pertenecientes a la superfamilia MFS. Algunos miembros están implicados en tráfico de porfirinas en el parásito y otros confieren resistencia a fármacos leishmanicidas. Finalmente, estamos analizando la implicación de transportadores ABCB en el tráfico de porfirinas en la mitocondria, el destino principal del hemo. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF20-2825 (JMPV), Junta de Andalucía BIO786 (JMPV) y Fondos FEDER de la UE (JMPV). P4-23 Identification of a novel chromatin factor (CPF) associated with VSG expression in African Trypanosomes Andreu Saura, Diana López Farfán, Isabel Vidal-Cobo, Miguel Navarro Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES Antigenic variation in Trypanosoma brucei involves a sophisticated mechanism to elude the host immune response by changes in the expression of different Variant Surface Glycoprotein (VSG). The VSG is expressed in a mono-allelic manner out of 000 VSG genes, from one telomeric site known as VSG-expression site (VSG-ES). The monoallelic expressed VSG gene is recruited in a single extra-nucleolar nuclear body (ESB) that seems to be controlled at several levels. In 3

Pósters XXXVII Congreso SEBBM this study, we have identified a novel chromatin factor that function by enabling and disabling the accessibility of transcriptional factors. We first developed a monoclonal antibody (C0E4 mab) against the recombinant protein and designed a trypanosome cell line that express an HA-tagged version of CPF. Western blot analysis using the mab C0E4 showed a single band corresponding to the endogenous CPF (05 KDa), also detected by epitope-tagging. Subcellular localization of CPF by Immunofluorescence microscopy using the mab localized the protein in the nucleus, as expected. Functional analysis by RNA interference confirmed first the depletion of CPF by Western blot analysis. To deepen the phenotype we carried out a reverse transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR), after CPF depletion which showed a decreased expression of VSG22 mrna, as well as a slightly increase of Procyclin mrna, the surface protein expressed in the Procyclic insect stage. However, no changes in the ribosomal RNA level were detected although is also transcribed by the same RNA polymerase. Next, we investigate the occupancy of CPF along the VSG-ES locus by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiments using the mab anti-cpf. ChIP-qPCR data analysis demonstrated that CPF is present in VSG22 coding region and the pseudo-vsg, genes located within the active VSG-ES. Future aims are directed to delineate the specific function of CPF in VSG-ES expression. P4-24 (R4-5) Caracterización funcional de las condensinas en la variación antigénica de Trypanosoma brucei Domingo I. Rojas-Barros, Jean-Mathieu Bart 2, Diana López-Farfán, Miguel Navarro Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC, Granada, ES, 2 Instituto de Salud Carlos III, Madrid, ES Los tripanosomas africanos eluden la respuesta inmunológica del hospedador expresando consecutivamente distintos tipos de la Glicoproteína Variable de Superficie (VSG) lo que permite al parásito una infección persistente. Trypanosoma brucei dispone de un complejo sistema genético dedicado a proporcionar todo un repertorio de miles de genes que codifican diferentes VSG. Sin embargo, para una variación antigénica eficaz, el parásito debe expresar en la membrana un solo tipo de VSG en un momento dado, lo que requiere la expresión monoalélica de la familia multigénica de VSG. Recientemente hemos descrito que el complejo Cohesina es importante para la regulación de la VSG, ya que la interferencia de RNA de las cohesinas conduce a la separación prematura de las cromátidas hermanas del VSG-ES y a un incremento en la frecuencia de aparición de nuevas variantes antigénicas (Landeira et al., JCB. 2009). Las condensinas, junto con las cohesinas, son complejos cuya función es esencial para mantener la topología de los cromosomas a lo largo del ciclo celular. Recientemente se ha sido descrito que las condensinas están involucradas en la regulación de la expresión génica (Hirano et al. G&D, 202). Para estudiar la función de las condensinas en T. brucei hemos caracterizado funcionalmente las subunidades TbSMC4 y TbCND2 del complejo. Para ello, hemos generado un anticuerpo monoclonal y un antisuero de conejo frente a TbSMC4. Análisis por imunoflorescencia nos ha permitido determinar la localización nuclear de TbSMC4. Experimentos de interferencia de RNA (RNAi) de TbSMC4 muestran un incremento significativo del porcentaje de células en fase G2, demostrando la función esencial de las condensinas en el control del ciclo celular en este protozoo parásito. Además, RNAi de TbSMC4 y TbCND2 provocó un incremento en la frecuencia de variación antigénica, detectándose la expresión de otras VSG. Estos resultados sugieren que el complejo Condensina juega un papel importante en el establecimiento y/o mantenimiento del estado transcripcional del VSG-ES. P4-25 Identificación de polimorfismo F200Y del gen de β-tubulina en una población de Haemonchus contortus aislada en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, Estado de México Rosa Isabel Higuera Piedrahita, Jorge Alfredo Cuéllar Ordaz, Maria Eugenia López Arellano 2, F. Alba Hurtado, Gabriel Ramírez Vargas 2, César Cuenca Verde Maestría en Ciencias de la Producción y Salud Animal. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. UNAM, Cuautitlán, MX, 2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, Jiutepec, MX Haemonchus contortus es uno de los parásitos gastrointestinales con mayor impacto en los sistemas productivos mexicanos. La genotipificación del polimorfismo F200Y del gen de β-tubulina permite monitorear la resistencia en fincas y puede ayudar a correlacionar con factores de riesgo y prácticas de manejo en campo. El aislamiento de la cepa de Haemonchus contortus en la FES Cuautitlán muestra susceptibilidad del 80-90% a bencimidazoles en ensayos in vitro (Moreno y col., 203), sin embargo se requiere confirmar como cepa susceptible por métodos moleculares. El objetivo de éste estudio fue determinar el polimorfismo F200Y del gen de β-tubulina de esta cepa provenientes de ovinos. El estudio se realizó en la Unidad de Helmintos del CENID-PAVET, INIFAP, Jiutepec, Morelos. Se realizó la extracción y digestión de DNA de larvas infectantes (L3) a 56 ºC por 2 horas, se realizó la cuantificacion DNA en un nanodrop, obteniéndose 2,8 ug/ ul, con una correlación de 260/280 de 2,04. Paso seguido, se realizó la técnica de Alelo Específico - PCR (AS-PCR) para la identificación del polimorfismos, se utilizaron 0uL de Gotaq que contiene X de buffer, 0.25uM de primer, 0,2 mm de dntp,.5 mm de MgCl2 y U de Taq polimerasa en 22uL y 40 ciclos de amplificación. En la primera reacción se utilizó ul de PN: (5 -GGCAAATATGTCCCACGTGC-3 ) y ul de PN2 (5 -GAAGCGCGATACGCTTGAGC- 3 ) y 8uL de DNA de larvas tres. El segundo PCR se realizó utilizando 8uL de DNA del primer PCR, se utilizó ul de PH (5 -GGAACGATGGACTCCTTTCG-3 ); ul de PH2 (5 - GATCAGCATTCAGCTGTCCA-3 ) y ul de PH3 (5 - CTGGTAGAGAACACCGATGAAACATA-3 ) para resistencia y ul de PH4 (5 -ATACAGAGCTTCGTTGTCAATACGA-3 ) para susceptibilidad (Méo y col., 202). Los resultados muestran que la cepa de Haemonchus contortus de la FES Cuautitlán presentó un patrón de bandas de 250 (fragmento resistente) y 550 (fragmento susceptible), lo cual indica que es una cepa heterocigota, resultados que contrastan con lo notificado por Moreno y col. (203) e Higuera y col. (204) donde había sido susceptible en estudios in vitro e in vivo. Éstos resultados nos indican que la presión que se realiza el aislamiento para mantenerla debe ser mínima manteniendo individuos susceptibles en su mayoría, además de que las pruebas moleculares son mucho más sensibles para realizar el diagnóstico de resistencia a bencimidazoles. P4-26 Estudio de nuevos compuestos con actividad leishmanicida, inhibidores de la expresión de genes implicados en la resistencia y virulencia Celia Fernández-Rubio, Daphne Campbell, Elena Ibañez 2, Esther Moreno 3, Andrés Vacas-Oleas, Juana Schwartz 3, Juan Antonio Palop 4, Alfonso Calvo 5, Socorro Espuelas 3, Carmen Sanmartin 4, Paul Nguewa Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona, ES, 2 Centro de Investigación Médica Aplicada-CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, ES, 3 Instituto de Salud Tropical/Department 32

Granada 204 Pósters of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, University of Navarra, Pamplona, ES, 4 Instituto de Salud Tropical/ Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, University of Navarra, Pamplona, ES, 5 Centro de Investigación Médica Aplicada- CIMA/Departamento de Histología y Patología, Universidad de Navarra, Pamplona, ES La OMS clasifica a la leishmaniasis como una de las enfermedades tropicales desatendidas y de interés mundial. Entre las prioridades actuales en el abordaje de estas patologías, está la búsqueda de nuevos tratamientos. A partir de un banco de compuestos, cuatro fueron seleccionados según los criterios empíricos de un buen fármaco. Dos de ellos (2b y 4b) presentaron en ensayos de dosis-respuesta frente a promastigotes de L. major bajas IC50s (< 3 μm) y altos índices de selectividad debido a su escasa toxicidad en macrófagos. Se midió el potencial terapéutico de los dos posibles antiparasitarios, observándose una reducción de la carga parasitaria cercana al 80% en macrófagos murinos infectados a concentraciones subletales de ambos. El fármaco leishmanicida de referencia, la paromomicina, presentó una disminución menor, cercana al 60%. Además, 2b y 4b inducen por sí mismos la liberación en los macrófagos de óxido nítrico cuya actividad leishmanicida ha sido ampliamente descrita. El estudio de la actividad de estos compuestos demostró alteración del ciclo celular con arresto en la fase G, siendo muy significativo en el caso del compuesto 2b. Se analizó la expresión de genes relacionados con la proliferación (PCNA), resistencia a fármacos (ABC-transporter y α-tubulina) y virulencia (QDPR). Se observa una disminución de los niveles de PCNA, α-tubulina y QDPR tras el tratamiento con ambos compuestos. Sin embargo, no varía la expresión de ABC-transporter, que se ha descrito como una de las principales familias de proteínas implicadas en la multiresistencia a fármacos. Por los resultados mencionados, consideramos estos compuestos con actividad leishmanicida como buenos candidatos para futuros estudios en un modelo animal de leishmaniasis cutánea. P4-27 (R4-3) Papel de la proteína de unión a RNA RBP33 en el silenciamiento de la expresión génica en Trypanosoma brucei Sandra Fernández Moya, Mark Carrington 2, Antonio M. Estévez 3 LMU-München, Departamento de Anatomía III-Biología Celular, Múnich, DE, 2 University of Cambridge Department of Biochemistry, Cambridge, UK, 3 Instituto de Parasitología y Biomedicina López- Neyra, IPBLN-CSIC, Armilla, ES En esta comunicación presentamos la caracterización inicial de la proteína de unión RNA RBP33 de Trypanosoma brucei. RBP33 es una proteína nuclear y esencial para la viabilidad del parásito. Hemos identificado el conjunto de los RNA asociados a RBP33 mediante inmunoprecipitación de los complejos RNA-proteína y posterior secuenciación masiva (RNAseq). La mayoría de los transcritos unidos a RBP33 están descritos como no codificantes, siendo un tercio de éstos producidos por genes localizados al final de las unidades de transcripción policistrónicas o localizados en orientación antisentido dentro de una unidad transcripcional. La depleción mediante RNAi de RBP33 conduce a un aumento en los niveles de RNA provenientes de regiones que están normalmente silenciadas, tales como zonas de cambio de hebra, retrotransposones o secuencias repetidas, siendo este fenómeno más acusado en la forma sanguínea del parásito. Este trabajo supone el primer ejemplo de una proteína de unión a RNA implicada en la regulación del silenciamiento génico en tripanosomas. P5. Radicales libres y estrés oxidativo P5- Cambios en la homeostasis del hierro (Fe) y expresión de óxido nítrico sintasa inducible (inos) en el preacondicionamiento (P) hepático con hierro frente a isquemia reperfusión (IR) Virginia Fernandez, Angela Novoa Arce, Arlette Román Salinas, Romina Vargas Villagrán, Luis A. Videla Cabrera, Pamela Cornejo Zamorano Universidad de Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de Farmacología, Santiago, CL La isquemia-reperfusión (IR) asociada a cirugías hepáticas bajo oclusión vascular, desencadena inflamación en el hígado, asociado a la activación temprana de las células de Küpffer que liberan especies reactivas del oxígeno, gatillando un estrés oxidativo drástico. El uso del protocolo de protección contra la IR consistente en 6 dosis de 50 mg/kg de Fe en días alternos (P con Fe; PFe), genera una ventana de estrés oxidativo transiente que recupera la actividad del NF-κB, factor de transcripción redox sensible. Considerando que NF-κB regula la expresión de la inos, y los efectos hepatoprotectores de esta enzima, en este estudio se evaluó la expresión (RT-PCR) y actividad (niveles de nitritos y nitratos séricos) de inos en ratas sometidas al protocolo de PFe o dosis equivalentes de salino (controles), seguido de h de isquemia y 20 h de reperfusión o cirugía sham (laparatomía sin isquemia). Además, se evaluó la expresión de proteínas que regulan la homeostasis del Fe, hepcidina (qpcr) que degrada a la ferroportina (exportador celular de Fe), ferroportina y ferritina (almacenador celular de Fe) (RT-PCR) en hígado de rata. En relación a controles-sham, la IR per se incrementó la expresión de inos, efecto exacerbado 5,2 veces por el PFe, el cual aumentó,3 veces (p<0,05) los niveles de nitritos/nitratos séricos. En estas condiciones, el PFe frente a la IR indujo la expresión de hepcidina (7 veces) y la de ferritina (2 veces), sin cambios en la expresión de ferroportina. Se concluye que el PFe se asocia a la inducción de inos, enzima de acción antioxidante ya que NO neutraliza radicales superóxido. La inducción de hepcidina limita los niveles de ferroportina, favoreciendo el almacenamiento del Fe en la ferritina, evitando sus efectos deletéreos. Financiado por FONDECYT 0006 P5-2 Protein kinase CK2 as a potential therapeutic target in glioblastoma: preliminary preclinical studies with apigenin based inhibition Laura Ferrer-Font, Estefania Alcaraz, Maria Plana, Ana Paula Candiota 2, Emilio Itarte, Carles Arús Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2 Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), Cerdanyola del Vallès, ES Glioblastoma (GBM) is the most aggressive human glial tumour, with a median survival of 4-5 months. Temozolamide (TMZ) is a standard chemotherapeutic for GBM treatment. Cancer stem cells (CSC) mediate chemoresistence, indicating their persistence in these tumours after treatment. Protein kinase CK2 contributes to tumour development, proliferation, and suppression of apoptosis in cancer, and it is overexpressed in human GBM. Targeting CK2 in GBM treatment could benefit patients. We have studied the CK2 expression level, using Western Blot analysis, normalized to constitutive tubuline content in preclinical GBM. Orthotopic GBM growing in C57Bl/6 mice (n=3) were generated by injecting 0 5 GL62 cells. Tumour volumes were assessed by T 2 W MRI during 5 days and mice sacrificed (final volume 77.3+0.9mm 3 ). Both contralateral 33

Pósters XXXVII Congreso SEBBM non-affected brain parenchyma and wild type mice brains (n=3) were investigated. We also evaluated the effect of TMZ and apigenin (API), a CK2 inhibitor, in cultured GL26 cells. For this, incubation of GL26 cells in 6-well plates with 20, 40 and 00μM drug was performed and cell viability was assessed by the Trypan Blue method. The expression level of CK2 catalytic subunit (CK2α) was found higher in tumour (4-fold) and in contralateral brain parenchyma (2-fold) than in wild type tissue (p <0.05). In contrast, no significant changes were detected in CK2 regulatory subunit (CK2β) expression, suggesting a predominance of free CK2α in tumours. In in vitro experiments, API decreased cell viability with respect to control as compared to TMZ (28.8+5% and 64.3+,5%, respectively) at equal drug concentration (00μM). Our data suggest that CK2 targeted inhibitors could offer an alternative treatment for chemoresistance to TMZ in preclinical GBM studies. Supported by: SAF 20-23870, SGR9-204. Cortical neurons in primary culture were stimulated with glutamate (00 μm) and mitochondrial function and generation of radical oxygen species were measured by flow cytometry. Here we described that glutamate promoted oxidative stress and mitochondrial membrane potential depolarization by a mechanism involving cyclin B accumulation. Moreover, expression of either cyclin B or hemi, a well-known APC/C inhibitor, induced oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegeneration. Our results suggest that NMDAR stimulation increased Cdk5 kinase activity leading to Cdh phosphorylation, APC/C inactivation and cyclin B stabilization. As a consecuence, cyclin B promoted oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neuronal apoptotic death. These results reveal Cdh as a novel Cdk5 substrate that mediates cyclin B neuronal accumulation in excitotoxicity. Funded by ISCIII (PS09/0366, RD06/0026/008) MICINN (SAF200-20008), and Junta de Castilla y León. P5-3 (R5-4) Activación por hipoxia del nicho neurogénico del cuerpo carotídeo Aida Platero-Luengo, Susana González-Granero 2, Blanca Díaz- Castro, José Ignacio Piruat, José Manuel García-Verdugo 2, Ricardo Pardal, José López-Barneo Instituto de Biomedicina de Sevilla, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2 Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, Valencia, ES El mecanismo por el cual los estímulos ambientales y la demanda fisiológica son capaces de modular los nichos neurogénicos en los organismos adultos es una cuestión clave para entender la función de los procesos de formación de nuevas neuronas en la etapa postembrionaria. Nuestros estudios con células madre neurales del cuerpo carotideo, un órgano quimiosensor responsable de la respuesta ventilatoria arterial, han revelado cómo el estímulo hipóxico es capaz de activar la proliferación del nicho neurogénico del cuerpo carotídeo a través del establecimiento de una estructura tipo sinapsis entre la célula glómica neuronal madura y la célula progenitora de donde proviene. De este modo, se establecen mecanismos de control donde los elementos maduros pueden influir sobre los elementos indiferenciados para conseguir un equilibrio en el desarrollo de la función del órgano. El modelo establecido para el cuerpo carotídeo demuestra cómo los distintos elementos de un nicho neurogénico se coordinan para permitir al tejido adaptarse a situaciones fisiológicas cambiantes. P5-4 (R5-3) Cyclin B: mediator of mitochondrial dysfunction in excitotoxicity Carolina Maestre, Miguel Veas-Pérez de Tudela 2, Juan P. Bolaños 2, Ángeles Almeida 2 Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES, 2 Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca, Hospital Universitario de Salamanca - Instituto de Biología Funcional y Genómica, Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca, ES Anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), an E3 ubiquitin ligase that destabilizes cell cycle proteins, is activated by Cdh in post-mitotic neurons, where it regulates axonal growth, synaptic plasticity and survival. The APC/C-Cdh substrate, cyclin B, has been found to accumulate in degenerating brain areas in Alzheimer s disease and stroke. Recently, we have reported that stimulation of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) that occurs in neurodegenerative diseases promoted the phosphorylation of Cdh by the Cdk5/p25 complex, a condition necessary and sufficient for its translocation to the cytosol and APC/C-Cdh inactivation. This led to the stabilization of cyclin B in cortical neurons and cell death. These results highlight the importance of elucidating the role of cyclin B in neurons under excitotoxic conditions relevant to neurological disease. P5r-5 NMDA receptor activity in astrocytes sustains neuronal survival through a p35/cdk5-nrf2 pathway Daniel Jimenez Blasco, Patricia Santofimia-Castaño 2, Antonio Gonzalez 2, Angeles Almeida, Juan P. Bolaños Institute of Functional Biology and Genomics (IBFG), University of Salamanca-CSIC, Salamanca, ES, 2 Department of Physiology, Faculty of Veterinary, University of Extremadura, Caceres, ES Glutamatergic neurotransmission unavoidably enhances reactive oxygen species (ROS) that in excess can trigger oxidative damage eventually leading to neurodegeneration. Neurons are equipped with discrete antioxidant defense that is insufficient to fully provide self-protection under certain stressing conditions. Their neighbor astrocytes complement the antioxidant defense and survival of neurons by releasing glutathione precursors, which neurons take up for de novo glutathione biosynthesis. However, the molecular mechanism by which neurons communicate astrocytes the need for glutathione precursors to support survival during neurotransmission is unknown. Here, we show that N-methyl-D-aspartate (NMDA), a glutamate-receptor subtype agonist, at a dose sustaining neurotransmission activates NMDA receptors in astrocytes triggering a signaling cascade involving protein kinase Cd-dependent p35/cyclin-dependent kinase-5 (Cdk5) activation. Active p35/cdk5 poly-phosphorylates nuclear factorerythroid 2-related factor 2 (Nrf2), which translocate to the nucleus to promote the expression of antioxidant genes. Furthermore, by releasing glutathione precursors, NMDA receptor-mediated Nrf2 activation in astrocytes sustains the antioxidant defense and survival of closely spaced neurons. Thus, during neurotransmission, glutamate-receptor activation in astrocytes decisively contributes to boost the antioxidant defense and survival of neurons. P5-6 (R5-2) Micro RNAs involved in redox responses: some examples related to organ fibrosis Santiago Lamas Peláez Consejo Superior de Investigaciones Cientificas - Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, Madrid, ES Recent evidences point to the existence of a set of micrornas that participate actively in redox homeostasis and hormesis, and the term redoximirs has been coined to define them. Reciprocally, proteins involved in the basic machinery of microrna processing can be influenced by the cellular redox state. MicroRNAs may regulate central pathways of the antioxidant response such as that of Nrf2 or directly regulate the generation of reactive oxygen species by targeting mrnas that code for proteins directly involved in this process such as NOXs 34

Granada 204 Pósters or components of mitochondrial complexes. We have focused on two different potential targets: a) mirnas regulating the levels of the most relevant endogenous antioxidant, glutathione (GSH) b) mirnas targeting ROS generating proteins involved in fibrogenesis. We identified mir-433 as a redoximir capable of targeting both the catalytic and modulatory subunits of Glutathione-cysteine ligase (GCL) and of reducing GSH levels. In addition we could demonstrate the participation of mir-433 in fibrotic processes by using models of fibrosis in the liver (bile duct ligation) and kidney (unilateral ureteral obstruction). We have also identified a novel microrna that participates in the regulation of fibrogenesis by targeting both NOX-4 and the TGF-b pathway in cellular and animal models of fibrosis as well as in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. We believe redoximirs constitute an important potential pathway to understand the involvement of redox responses in pathophysiological processes leading to organ fibrosis. P5-7 Influencia del estrés oxidativo en la vía de activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) hepática en ratas tratadas con hormona tiroidea (T 3 ) Pamela Cornejo Zamorano, Romina Vargas Villagran 2, Virginia Fernández Arancibia 2, Luis A. Videla Cabrera 2 Universidad Diego Portales, Facultad de Salud y Odontología, Escuela de Tecnología Médica, Ñuñoa, CL, 2 Universidad de Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de Farmacología, Independencia, Santiago, CL La administración de T 3 conduce a estrés oxidativo (EOx) hepático, mediado por el efecto calorigénico de la hormona. AMPK es un sensor del estado energético celular, regulada por alosterismo (AMP) y por fosforilación reversible de la subunidad catalítica α por distintas proteínas quinasas tales como TAK, CaMKKβ y LKB. El objetivo de este estudio es determinar el efecto del EOx en la expresión de AMPK en hígado de rata por la administración de T 3 y determinar su correlación con la expresión de TAK y CaMKKβ. Para esto los animales fueron pretratados 0,5 horas antes de la administración con T 3 (0, mg/kg de peso) con el antioxidante N-acetilcisteina (NAC) 0,5 g/kg. Se midieron los niveles de mrna con qpcr, niveles proteicos mediante Western Blot y 8-isoprostanos hepáticos y plasmáticos como parámetro de EOx con un kit comercial. La administración de T 3 produjo un incremento estadísticamente significativo en los niveles de mrna de AMPK en comparación con los controles (p<0,05), efecto suprimido parcialmente con el pretratamiento con NAC. Por otra parte, se observó aumento de 6,4 veces y 29 veces en los niveles de mrna de CaMKKβ y TAK respectivamente luego del tratamiento con la hormona en comparación con los controles, efecto abolido por la administración de NAC. Se determinó el efecto sobre la relación TAK fosforilada/tak no fosforilada, observándose un incremento estadísticamente significativo después de tratamiento con T 3 comparado con los valores controles (90%), efecto parcialmente suprimido en los animales que fueron pretratados con NAC (p<0,05). Los niveles de CaMKKβ aumentaron 65% en relación a los controles, efecto anulado con el pretratamiento con NAC. Los niveles de 8-isoprostanos plasmáticos y hepáticos de ratas tratadas con T 3 aumentaron en relación a controles, efecto abolido en los animales pretratados con NAC. Se concluye que el incremento en la expresión de AMPK hepática inducida por T 3 está mediado por un mecanismo redox al cual podría contribuir el aumento en la expresión y/o activación de TAK y CaMKKβ. Financiado por FONDECYT 20034. P5r-8 Análisis de las micorredoxinas de Corynebacterium glutamicum y su papel en el control del estrés oxidativo Almudena F. Villadangos, Jose A. Gil, Luis M. Mateos Área de microbiología, departamento de biología molecular, facultad de ciencias biológicas y ambientales, Universidad de León, León, ES Las células sufren oxidaciones moleculares indeseables derivadas del propio metabolismo aerobio y de agentes exógenos tóxicos. Los mecanismos de respuesta celular combaten esas oxidaciones manteniendo un ambiente reductor en el citoplasma mediante el uso de sistemas de buffer Redox. Un sistema Redox exclusivo de actinomicetos, el cual depende de redoxinas específicas (micorredoxinas; Mrx) y de compuestos de bajo peso molecular (micotiol; MSH), conforma el par Redox Mrx/MSH. Representantes del grupo de actinomicetos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y presentan gran interés desde el punto de vista industrial (p.e. Streptomyces es el principal productor de antibióticos) y médico. Con respecto a este último aspecto, el par Mrx/MSH podría ejercer un papel relevante en los procesos de supervivencia de los miembros de actinomicetos patógenos más representativos (Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus equi o Corynebacterium diphtheriae) frente al desafío con agentes oxidantes del hospedador. El conocimiento detallado de las micorredoxinas a nivel molecular y funcional en representantes de actinomicetos facilitaría la tarea indicada. Nuestro grupo de trabajo ha identificado varias micorredoxinas en Corynebacterium glutamicum, M. tuberculosis y R. equi, siendo denominadas Mrx y Mrx3. Las micorredoxinas son proteinas pequeñas con un centro activo conservado CxxC y próximo al extremo N-terminal; estas Mrx son específicas de MSH y no se acoplan con otros compuestos de bajo peso molecular (glutation o bacilitiol) de otros sistemas Redox. En C. glutamicum se han obtenido mutantes knockout simples y dobles para los genes mrx y mrx3, siendo estos mutantes sometidos a análisis de estrés oxidativoin vivo por presencia de metales pesados (cadmio, manganeso o arsenico) o agentes qúimicos como peróxido de hidrógeno y diamida. Los resultados indican que Mrx y Mrx3 tienen un papel importante en el restablecimiento de la viabilidad celular después de ser somentidos a estrés oxidativo. La proteina Mrx de C. glutamicum [] y M. tuberculosis [,2] ha sido recientemente caracterizada in vitro. Los ensayos in vitro realizados con Mrx para determinar la cascada multienzimática mostraron que la enzima es reducida mediante MSH [,2]. La proteína Mrx3 de C. glutamicum presenta igualmente el motivo típico CxxC del centro activo, así como una cisteína adicional atípica (C 65 ), aunque hasta el momento se desconoce su cascada enzimática in vitro. Bibliografía [] E. Ordóñez, K. Van Belle, G. Roos, S. De Galan, M. et al. J Biol Chem 2009; 284:507-56. [2] K. Van Laer, L. Buts, N. Foloppe, D. Vertommen, et al. Mol Microbiol. P5-9 DHA diet supplementation modulates the activation of neutrophils in post-exercise conditions Miquel Martorell, Xavier Capó, Antoni Sureda, Joan Miquel Batle, Isabel Llompart, Josep A Tur, Antoni Pons Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS, University of the Balearic Islands - CIBER: CB2/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, CIBERobn, Instituto de Salud Carlos III-ISCIII, Palma de Mallorca, ES Background and objectives: Docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n3) increases phagocytic and fungical activity of neutrophils. We aimed to 35

Pósters XXXVII Congreso SEBBM study the effects of training and DHA diet supplementation on the reactive oxygen and nitrogen species production by neutrophil in football players. Methods: Subjects were randomly included into two groups: placebo and experimental groups. The placebo group took one liter five times a week of a placebo drink and the experimental group consumed the experimental drink enriched with DHA. Blood samples, used to purify neutrophils and serum, were collected at the beginning in basal conditions and after 8 weeks of training and diet intervention in basal and in post-exercise conditions. ROS production by neutrophils after the activation with zymosan and with phorbol myristate acetate (PMA) were determined by chemiluminescence techniques. Nitrate levels were determined both in serum and in neutrophil using a nitric oxide analyzer (NOA) 280i (Sievers). Results: Neutrophils counts were not influenced by the training season or the DHA diet supplementation, but the acute exercise realized at 8 weeks significantly increased neutrophil counts. No effects were observed in the chemiluminescence produced by neutrophils after their activation with zymosan or PMA in the basal condition, however, the exercise significantly increased neutrophil ROS production in response to immune stimulus without effects of DHA diet supplementation. Moreover, the exercise significantly decreased the time at which the maximal ROS production was attained, and this decrease was higher in the experimental group. Exercise significantly decreased nitrate levels in neutrophil but their increased in serum, in both placebo and experimental groups, but this effect was higher in the experimental group. Conclusion: The consumption of an enriched DHA beverage for eight weeks accelerates the postexercise neutrophil production of ROS after stimulation with zymosan and increases the neutrophil secretion of nitrate in post-exercise conditions. Keywords: Docosahexaenoic acid; DHA; neutrophil; exercise; zymosan; PMA; nitrate. Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research and Health Sciences, Projects /079, Red Predimed-RETIC RD06/0045/004, and CIBERobn CB2/03/30038. P5r-0 (R5-5) The effects of NQO deletion in Nrf2/Akt pathways and growth deregulation of mouse embryonic fibroblasts Julia Ariza Gómez, Laura Jódar Montilla, Evi Mercken 2, Michel Bernier 2, Rafael de Cabo Moreno 2, José Manuel Villalba Montoro Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, University of Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario, CeiA3, Córdoba, ES, 2 Experimental Gerontology Section, Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging, National Institutes of Health, Baltimore, US NAD(P)H-quinone oxidoreductase (NQO) is a 3kDa ubiquitously expressed flavoenzyme that plays an important role in antioxidant defense, being one of the best characterized detoxifying enzymes whose expression is regulated by Nrf2. NQO catalyzes the reduction of several quinone substrates using both NADH and NADPH. Besides its role as antioxidant, NQO has been involved in the regulation of cell growth and development. Although cells from many solid tumors contain increased levels of NQO, low levels of NQO are also associated with tumor development and carcinogenesis. Our results show that the lack of NQO results in higher proliferation rates and extended lifespan of immortalized MEFs, which is consistent with a role for decreased NQO expression in tumor development. We have also observed increased nuclear translocation of Nrf2 in NQOKO MEFs, as well as in liver of NQOKO mice when compared to their Wt counterparts. An enhancement of Nrf2-mediated antioxidant response might constitute a hormetic response to the lack of NQO which, together with the activation of the Akt pathway and higher levels of the glucose transporter GLUT, could result in increased growth and lifespan of NQOKO cells. In fact, teratomas are generated when NQOKO cells are subcutaneously injected into immunodeficient mice. However, NQOKO MEFs also exhibited higher levels of apoptosis when compared to their Wt counterparts. This could be driven by the presence of dysfunctional mitochondria in NQOKO cells, which causes outer mitochondrial membrane permeabilization and the release of apoptotic factors that trigger the apoptosis process. Deregulation of mitogenic pathways could surpass this increase of apoptotic signaling resulting in the overall stimulation of growth rate and extended long-term survival of MEFs lacking NQO. P5- Hyperbaric oxygen therapy in the management of chronic wound induces an antioxidant response and modulates plasma VEGF and endothelin- Antoni Sureda, Juan M. Batle, Xavier Capó, Miquel Martorell, Silvia Tejada 2, Josep A. Tur, Antoni Pons Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS, University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, Spain and CIBER: CB2/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de Mallorca, ES, 2 Experimental Laboratory, Research Unit, Son Llàtzer Hospital, IUNICS and University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, ES Hyperbaric oxygen (HBO) treatment is the medical use of oxygen at higher than atmosphere of pressure. The aim of the study was to evaluate the effects of HBO clinical treatment on the antioxidant response and the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endothelin- in patients with chronic wounds. Ten patients with a chronic wounded situation (diabetic wounds, osteomyelitis, enteritis radica and osteoarthritis) were volunteered to participate in the study. The average time wounds without healing before starting the HBO treatment were 20.5 ± 0. months. The patients performed 20 HBO sessions and blood samples were taken before and 2 hours after the sessions, 5 and 20. No significant differences were reported in the hematological parameters. Serum CK activity was progressively decreasing with the sessions performed. No significant differences were reported in any enzymatic activity of erythrocytes after HBO treatments. Plasma catalase activity responded to the HBO therapy with a significant increase after the first and fifth sessions. Plasma MPO activity was significantly reduced after all analysed sessions. VEGF levels significantly increased after the sessions respect to the pre-session values. Endothelin- levels were progressively decreasing during the HBO therapy, with significant differences at the session 20. No significant differences were evidenced in plasma nitrite levels. The levels of MDA adducts in plasma were significantly lower at the last analysed session. In conclusion, HBO therapy increases the plasma antioxidant defenses and regulates angiogenesis and vascular tone by increasing VEGF and decreasing endothelin-, which may be important factors in promoting enhanced wound healing. Keywords: Antioxidants, Chronic wound, Hyperbaric chamber, Oxidative damage, VEGF. Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research and Health Sciences, Projects /079, Red Predimed-RETIC RD06/0045/004, and CIBERobn CB2/03/30038. P5-2 Assessment of environmental pollution applying oxidative stress biomarkers in the mussel Mytilus galloprovincialis Silvia Tejada, Antoni Sureda 2, Ainhoa Zuazu 3, Miguela Méndez 2, Antonino Natalotto 4, Salvatore Fasulo 4, Salud Deudero 3 University of the Balearic Islands / Experimental Laboratory, Research Unit, Son Llàtzer Hospital, IUNICS, Palma de Mallorca, ES, 2 Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS, University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, Spain and CIBER: CB2/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, 36

Granada 204 Pósters Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de Mallorca, ES, 3 Spanish Institute of Oceanography, Palma de Mallorca, BI, ES, 4 Dep. of Animal Biology and Marine Ecology, University of Messina, IT In polluted environments, and especially in coastal waters, living organisms are most often exposed to complex mixtures of chemical contaminants. Mussels are desirable as bioindicators since they are likely to reflect changes in the environment pollution status. Transplanting mussels from a reference site to different locations allows biomonitoring the alterations due to environmental pollutants. The aim of the present study was to analyse the biochemical response of the mussels (Mytilus galloprovincialis) exposed to petrol refinery. Mussels purchased from a mussel farm in Messina (Italy) were transplanted for two months in a control clean site (Brucoli) and a polluted site (Priolo refinery). A third group was maintained in the same conditions in the farm for two months. Gills from each specimen (n=8 for each station) were dissected and used for biochemical analysis. Mussels from the three studied areas presented the same length and width. Mussels from the polluted site presented higher levels of malondialdehyde respect to the clean site. The activities of catalase and glutathione-s transferase (GST) were significantly higher in the polluted site, whereas the activity of acetylcholinesterase was significantly lower respect non-polluted sites. A significant increase in the gene expression of metallothionein (MT)-0, MT-20 and cytochrome P450 were reported in the polluted site respect to the other areas, whereas the increase in catalase and GST was not statistically significant. In conclusion, pollutants induce oxidative stress and increase the antioxidant and detoxifying system in mussels. The use of biomarkers in gills of the mussel M. galloprovincialis is a good tool to categorize differences between polluted and non-polluted areas. Keywords: Antioxidants, Biomarkers, Oxidative damage, Pollution. Acknowledgments: National Parks Program 024/200 and CIBERobn CB2/03/30038. P5-3 Drug screening in Drosophila models of FRDA and PD Pablo Calap Quintana, Francisco José Sanz López, Lucía Benito Jardón, Verónica Muñoz Soriano 2, Sandra López Domènech 2, María Dolores Moltó Ruiz 3, Nuria Paricio Ortiz 2, María José Martínez Sebastián Departamento de Genética, Universidad de Valencia, Burjassot, ES, 2 Departamento de Genética, Universidad de Valencia - ERI de Biotecnología y Biomedicina, Burjassot, ES, 3 Departamento de Genética, Universidad de Valencia - Red de Salud Mental, CIBERSAM - Fundación Investigación Clínico de Valencia, INCLIVA, Burjassot, ES Friedreich ataxia (FRDA) is the most common inherited ataxia in the western population and is caused by a reduction in the level of the mitochondrial protein frataxin. Parkinson s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in the world and is caused by the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and the decrease of the striatal dopamine levels. In both neurodegenerative diseases oxidative stress and mitochondrial alterations seem to have an important role in the pathogenesis of both diseases. Many groups are trying to identify possible therapeutic molecules that may alleviate the symptoms of both disorders. For FRDA, the drug candidates under more intense study are antioxidants, iron chelators and compounds that increase the synthesis of frataxin. Current therapy for PD, based on a dopamine replacement strategy, provides effective control in the first stages of the disease, but fails in retard, stop or reverse the neurodegeneration. We have developed a model of FRDA in D. melanogaster that employs an irna expressed in the whole organism by means of the GAL4-UAS system with the purpose of reducing the expression of the Drosophila fh gene (which codifies Drosophila frataxin). Mutations in DJ- are associated to autosomal recessive forms of PD. As a D. melanogaster model of PD, we have used a Drosophila line carrying loss of function mutations in DJ-ß (ortholog of DJ-). The individuals of both disease models show a decrease of their motor performance. Using this phenotype, we started a screening of molecules that could recover the motor ability of these flies. So far, we have identified some possible candidates that belong to different functional categories. Among these compounds, there are antioxidants, chelators of different metals and metabolism modulators. Interestingly, some of the compounds are able to improve motor performance in flies of both disease models, while others seem to have a specific effect over either FRDA flies or PD flies. P5-4 La genisteína afecta a la eficacia de los tratamientos contra el cáncer de mama modulando la producción de especies radicales de oxígeno Daniel Gabriel Pons Miro, Daniel Palou Gramón, Adamo Valle Gómez, Jordi Oliver Oliver, Pilar Roca Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES Algunos tratamientos del cáncer de mama tienen como efecto la generación de especies radicales de oxígeno (ROS), lo que favorece la muerte celular. La genisteína (GEN), un fitoestrógeno presente en la soja, podría modular la producción de ROS gracias a su interacción con los dos tipos de receptores estrogénicos (ER), ERα y ERβ, siendo más afín por ERβ. Nuestro objetivo fue determinar los efectos de la GEN sobre la eficacia del cisplatino (CDDP), el paclitaxel (PTX) y el tamoxifeno (TAM) en líneas celulares de cáncer de mama con diferente ratio ER α/erβ. Se estudiaron las líneas MCF-7 (elevada ratio ERα/ERβ) y T47D (baja ratio ERα/ERβ) tratadas con μm GEN, 0μM CDDP, 0nM PTX y 0μM TAM, así como la combinación de los citotóxicos con la GEN, durante 48h. Se determinó la viabilidad celular (Cristal Violeta), la producción de ROS (Amplex Red) y la autofagia (monodansilcadaverina, indicador de apoptosis). En MCF-7 la GEN promovió una mayor viabilidad celular y una disminución de la autofagia provocada por los tratamientos excepto con CDDP, sin cambios significativos en la producción de ROS. En T47D la GEN provocó una disminución en la producción de ROS en los tratamientos de CDDP y TAM con la GEN respecto a los tratamientos solos, sin cambios significativos en la viabilidad celular ni en la autofagia. Los resultados parecen indicar que el tratamiento con GEN en células con una ratio ERα/ERβ alta podría favorecer la proliferación celular e inhibir la apoptosis debido a su actividad estrogénica. En cambio, en células con una ratio ERα/ERβ baja la presencia de GEN favorecería una reducción de la producción de ROS, pudiendo disminuir la eficacia de los tratamientos anticancerígenos. Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI2/0827) y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P5-5 Efecto del silenciamiento o inhibición de la UCP2 sobre el estrés oxidativo en la línea de cáncer de mama MCF-7 Mercedes Nadal-Serrano, Daniel G. Pons, Adamo Valle, Pilar Roca, Jordi Oliver Oliver Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES El estrés oxidativo juega un papel dual en el desarrollo del cáncer; por una parte una elevada producción de radicales libres de oxígeno (ROS) 37

Pósters XXXVII Congreso SEBBM promueve la muerte celular, pero a niveles menores los ROS pueden actuar como segundos mensajeros promoviendo la proliferación celular. La mitocondria es la principal fuente de producción de ROS en la célula, por lo que la UCP2 juega un papel importante en el control del estrés oxidativo, desacoplando la cadena respiratoria y evitando de esta manera la producción de ROS. El objetivo que nos propusimos fue determinar el efecto del silenciamiento con sirna o la inhibición con genipin de la UCP2 sobre la proliferación y el estrés oxidativo en la línea de cáncer de mama MCF-7. Concretamente se ha determinado la proliferación (cristal violeta), la producción de ROS (Amplex Red) y el daño oxidativo en lípidos y proteínas (4-HNE y grupos carbonilo, respectivamente). Mediante sirna se consiguió una importante disminución de los niveles de ARN mensajero de la UCP2, que se acompañó de una caída de los niveles de proteína. El silenciamiento y la inhibición de la UCP2 provocaron una disminución de la viabilidad de las células cancerosas, en el caso del genipin dependiente de la dosis. Además se observó un aumento importante en la producción de ROS, que se acompañó de un aumento de los daños oxidativos, tanto en lípidos como proteínas. De los resultados obtenidos se puede desprender que la inhibición de la UCP2 podría utilizarse como una nueva estrategia en el tratamiento coadyuvante del cáncer. Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI2/0827) y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P5r-6 (R5-6) Calorie restriction abolishes age-related changes of coenzyme Q levels in liver and skeletal muscle from mice fed a polyunsaturated fatty acidsenriched diet Lucía Fernández del Río, Guillermo López-Lluch 2, Plácido Navas 2, Jon J. Ramsey 3, María Isabel Burón, José Manuel Villalba Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario, ceia3, Córdoba, ES, 2 Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide-CSIC, CIBERER, Instituto de Salud Carlos III, Sevilla, ES, 3 VM Molecular Biosciences. UCDavis, Davis (California), US Coenzyme Q (Q) is a lipid-soluble electron carrier and a powerful antioxidant. Dietary n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA) increase hepatic Q levels with aging. To investigate if these effects were altered by calorie restriction (CR) we established two groups of mice fed lifelong diets containing soybean oil (high in n-6 PUFA) as the main fat source, either ad libitum or under CR. We also studied two additional CR groups fed diets containing lard (high in saturated and n-9 monounsaturated fatty acids) or fish oil (high in n-3 PUFA). Liver and skeletal muscle samples were taken after 6 or 8 months of dietary intervention starting at an age of 3 months. Hepatic Q9 and Q0 levels increased and Q9/Q0 ratio decreased with age in the control but not in the CR group. When comparing the three CR diets it was found that Q9 and Q0 levels were maximal in CR-fish, and Q9/Q0 ratio was the lowest in CR-soy and CRfish. In skeletal muscle, levels of coenzyme Q9 did not change either by CR or age but Q0 levels increased significantly with age in the control although not in CR group. Q9 levels were higher in CR-soy compared with CR-lard, whereas CR-fish displayed the lowest Q9/Q0 ratio. We demonstrate that: i) CR abolishes age-induced changes of Q levels in liver and skeletal muscle from mice fed PUFA-enriched diets, and ii) liver and skeletal muscle tissues adapt to a PUFA-enriched CR diet by increasing Q levels and decreasing Q9/Q0 ratio. P5r-7 Effects of exogenous lipid source on mitochondrial physiology and mtor pathway in an in vitro model Elena Gutiérrez Casado, Lucía Fernandez del Río, José Antonio González Reyes, María Isabel Burón Romero, Chary López Pedrera 2, José Manuel Villalba Montoro Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario, ceia3, Córdoba, ES, 2 Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Over the last few decades many scientific research groups have focused their interest on the knowledge of those processes that are involved in aging, as well as on their possible manipulation in order to stop or retard it. Nowadays, the unsaturation degree of membrane phospholipids (Membrane Theory of Aging) (Hulbert, 2003) and the endogenous generation of reactive oxygen species (ROS) (Mitochondrial/Free Radicals Theory of Aging) (Harman, 956) are two of the most widely accepted factors that affect aging. Unsaturation degree of cellular membranes is inversely proportional to longevity, although unsaturated fatty acids are also crucial to maintain the fluidity of the lipid membranes. Fatty acid content of the diet can modify the composition of membrane phospholipids (Ochoa-Herrera et al., 200), and can also affect the function of the electron transport chain (ETC) located in the inner mitochondrial membrane (Aoun et al., 202). The ETC is not only the most important cellular energetic machinery for ATP generation, but also one of the main sources of ROS in cells. ROS can interact with lipids and proteins altering the permeability of cellular membranes and the functional conformation of proteins. The Ser/Thr-kinase mtor is a crucial kinase in sensing the availability of nutrients and growth factors in cells, and promoting the activation/inhibition of different molecules involved in processes such as autophagy. Optimal nutrient sensing through the mtor pathway is impaired with aging. On the other hand, inhibition of mtor pathway by dietary manipulations as calorie restriction increases lifespan (López-Otín et al., 203). The aim of our work was to determine how the mitochondrial physiology, cellular oxidative damage, and the mtor signaling pathway could be modified by the supplementation with exogenous lipids using an in vitro model. A mouse hepatocarcinoma cell line (Hepa.6) was grown in culture medium containing either low (g/l) or high glucose (4,5g/l), and supplemented or not with two different lipid emulsions (at 7μg/ml): Lipofundin, based on ω-6 fatty acids (thus mimicking a diet enriched in soybean oil) or Lipoplus which also contains ω-3 fatty acids (thus mimicking a diet containing fish oil). After 48 hours of treatment with the corresponding emulsion, different parameters related with mitochondrial function (including mitochondrial potential and activities of ETC complexes) and oxidative stress (including superoxide and peroxide levels and oxidative damage), as well as the activation state of components of the mtor pathway were assessed. Our results indicate that exogenous fat, targets mitochondrial physiology, oxidative stress and mtor pathway in a manner that is dependent on fatty acid composition. P5-8 (R5-) Papel de p38alfa y del estrés oxidativo en el control de la citoquinesis Ana M. Tormos, Raquel Taléns-Visconti 2, María Jorques, Salvador Pérez-Garrido, Ana Bonora-Centellés, Ángel R Nebreda 3, Juan Sastre Departamento de Fisiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Burjasot, ES, 2 Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Burjasot, ES, 3 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Barcelona, ES La citoquinesis es la última etapa de la mitosis e implica una reorganización del citoesqueleto de actina. Un fallo de la citoquinesis es uno de los 38

Granada 204 Pósters principales mecanismos de formación de células poliploides en mamíferos, que pueden resultar genéticamente inestables. Nuestros resultados indican que la citoquinesis está regulada por la MAP quinasa p38alfa sensible al estado redox y puede verse afectada por el estrés oxidativo. La activación de MNK- es dependiente de p38alfa y MK2 y se requiere para la escisión del puente intercelular. Los ratones viejos con deficiencia específica de p38alfa en hígado tienen disminuida la fosforilación de MNK-. La vía de la pequeña GTPasa Rho a través de fosfo-prk-2, fosfocofilina, y p27- también está deteriorada en los ratones knock-out cuando son viejos. Asimismo, la ausencia de p38alfa condujo a una disminución de la fosforilación de HSP27, que se requiere para la polimerización de la actina. Por ello, se observa un grave deterioro de los filamentos de F-actina en el hígado de ratones viejos con deficiencia de p38alfa. No obstante, no se produce estrés oxidativo en estos animales. En consecuencia, la deficiencia de p38alfa a largo plazo afecta el ensamblaje de la actina, sin producir estrés oxidativo, dando lugar a un fallo de la citoquinesis y binucleación de los hepatocitos con el envejecimiento. Por otro lado, el aislamiento de hepatocitos produce marcada depleción de glutatión, incremento en la generación de especies reactivas del oxígeno y activación de la entrada en ciclo celular con bloqueo de la citoquinesis y binucleación. La adición de N-acetil cisteína previno la depleción de glutatión y frenó la entrada en el ciclo celular, evitando el fallo de la citoquinesis y la formación de hepatocitos binucleados durante el aislamiento. En consecuencia, nuestros resultados muestran que los hepatocitos entran en fase S pero no completan la division celular cuando existe deficiencia de p38alfa o durante su aislamiento, dando lugar en ambos casos a un fallo de la citoquinesis y binucleación. P5r-9 N-based ligands with intracellular oxidative activity as potential anti-tumor agents Marta González-Bártulos, Olaf Cussó, Miquel Costas, Xavi Ribas, Anna Massaguer 2 Bioinorganic and Supramolecular Chemistry group (QBIS), Department of Chemistry, University of Girona, Girona, ES, 2 Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology, University of Girona, Girona, ES Tumor cells have persistently higher levels of Reactive Oxygen Species (ROS) than normal cells which is a consequence of their abnormal metabolism together with genetic alterations [,2]. The constitutive oxidative stress of cancer cells provides a specific target for the design of novel redox-based anticancer therapies, as cancer cells are very vulnerable to pro-oxidant agents such as transition metal based-complexes [3]. When accumulated inside the cells, metals such as iron, manganese or copper, undergo cycling redox reactions that generate high levels of ROS, generating additional ROS, which likely increase the oxidative stress above the cytotoxic threshold, leading to a cell death [4]. Therefore, we evaluated the antitumoral properties of five polyamine Fe-Complexes and their corresponding uncomplexed ligands. Only the ligands displayed antiproliferative activity against breast adenocarcinoma MCF-7 and pancreas adenocarcinoma CAPAN- cancer cell lines. The most active compounds were selected to further analyze their cytotoxicity against a broad panel of tumor and non-malignant cell lines and their ability to inhibit the clonogenicity of cancer cells. In addition, the ability of the compounds to generate ROS inside the cells and the influence of the intracellular iron in their cytotoxicity was evaluated. Our results reveal that three ligands display an interesting anticancer activity, with higher IC 50 values in non-malignant cells than in tumor cells and exhibit inhibitory effect on the clonogenicity of tumor cells. Moreover, the ligands are not hemolytic against human red blood cells. We determine that the ligands are inducers of oxidative stress and that ROS induction is associated to their strong capactity to bind intracellular iron and generate the highly oxidant iron coordination complexes inside the cells, inducing the cell death. These results indicate that these ligands may be a potential pro-oxidant anticancer agents. References [] Cairns RA et al. Nat Rev Cancer 20. [2] Luo J et al. Cell 2009. [3] Montero AJ et al. Drugs 20. [4] Dixon S et al. Natu Chem Bio 204. P5-20 Presence of antioxidant enzymes and peroxisomes in olive fruits (Olea europaea L.) Eduardo López-Huertas, Luis A del Río Group of Antioxidants, Free Radicals and Nitric Oxide in Biotechnology, Food and Agriculture - Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Granada, ES The occurrence in olive (Olea europaea L.) fruit tissue of peroxisomes and different antioxidant enzymes is reported for the first time. Ultrastructural analysis showed that olive cells were characterized by the presence of large vacuoles and lipid drops. Plastids, mitochondria and peroxisomes were placed near the cell wall, showing some type of association with it. Olive fruit peroxisomes were purified by sucrose density-gradient centrifugation, and catalase, glutathione reductase and ascorbate peroxidase were found in peroxisomes. In olive fruit tissue the presence of a battery of antioxidant enzymes was demonstrated, including catalase, four superoxide dismutase (SOD) isozymes (mainly an Fe-SOD plus 2 Cu,Zn-SOD, and a Mn-SOD), all the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle, reduced and oxidized glutathione, ascorbate, and four NADPH-recycling dehydrogenases. The knowledge of the full composition of antioxidants (enzymatic and nonenzymatic) in olive fruits is crucial to be able to understand the processes regulating the antioxidant composition of olive oil. Supported by the ERDF-cofi nanced grant AGL20-24428 from the Ministry of Economy and Competitiveness, Spain. P5-2 NADPH oxidasas como dianas terapéuticas en la leucemia mieloide crónica Beatriz Sánchez-Sánchez, Sara Gutiérrez-Herrero 2, Guillermo López Ruano, Rodrigo Prieto Bermejo, Marta Romo-González, Marcial Llanillo, Atanasio Pandiella 2, Carmen Guerrero 2, Jesús F. San Miguel 3, Fermín Sánchez-Guijo 3, Consuelo del Cañizo 3, Angel Hernandez Hernandez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca - Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca- IBSAL, Salamanca, ES, 2 CIC-Centro de Investigación del Cáncer, CSIC, Salamanca, ES, 3 Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Las células cancerosas muestran una excesiva producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), lo que parece estar relacionado con el inicio y la progresión del cáncer. Las NADPH oxidasas son uno de los principales sistemas productores de ROS en la célula. La leucemia mieloide crónica (LMC) está provocada por la expresión de la quinasa BCR-ABL, cuya actividad conduce a un aumento de la producción de ROS, en parte a través de NADPH oxidasas. La terapia de la LMC basada en el uso de inhibidores de BCR-ABL es muy efectiva, sin embargo la existencia o aparición de resistencias a este tratamiento es aún un serio problema. En este estudio se evalúa la familia de las NADPH oxidasas como dianas terapéuticas en la LMC. Se ha analizado el efecto de diferentes inhibidores de NADPH oxidasas, ya sea solos o en combinación con inhibidores de BCR-ABL, en células de LMC y en dos modelos animales diferentes. Una de las conclusiones a las que llega el estudio es que la inhibición de las NADPH oxidasas deteriora drásticamente la proliferación y viabilidad de las células de LMC e inhibe el crecimiento de tumores in vivo. Además, la 39

Pósters XXXVII Congreso SEBBM combinación de inhibidores de las NADPH oxidasas con inhibidores de BCR-ABL era altamente sinérgica. Los investigadores sugieren que esta estrategia podría utilizarse no solo en LMC sino también en otros tipos de tumores. Por tanto, este estudio demuestra que las NADPH oxidasas son una interesante diana terapéutica para la LMC, que podría usarse como alternativa al uso de inhibidores de BCR-ABL, o para potenciar el efecto de dichos inhibidores. Será interesante en el futuro profundizar en la posibilidad de trasladar estos resultados a la práctica clínica. P5-22 Role of the NADPH oxidase NOX4 in liver tumorigenesis Eva Crosas-Molist, Esther Bertran, Joan Fernando, Isabel Fabregat 2 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, LHospitalet de Llobregat, ES, 2 Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Departament de Ciències Fisiològiques II, University of Barcelona, Barcelona, ES NOX4 has been implicated in a variety of physiological processes, including cellular senescence, apoptosis, survival, migration, endoplasmatic reticulum stress and differentiation. We have previously described that in liver cells, NOX4 upregulation is necessary for TGF-beta-induced suppressor effects, in particular, for cell death (Carmona-Cuenca et al., J Hepatol. 49:965, 2008). NOX4 is also required for TGF-beta-induced stellate cell activation during liver fibrosis (Sancho et al. PLoS One, 7(9):e45285, 202) and pre-clinical assays have suggested NOX4 inhibitors as useful tools to ameliorate this process (Jiang et al., Free Radic Biol Med., 53:289, 202). However, the potential consequences of sustained treatment of liver cells with NOX4 inhibitors are unknown yet. Here we show that stable knockdown of NOX4 expression in liver tumour cells increase their proliferative capacity. In vivo analysis in mice revealed that NOX4 expression is down regulated during diethyl-nitrosamine (DEN)- induced hepatocarcinogenesis. Furthermore, xenograft experiments in athymic mice indicated that NOX4 silencing confers advantage to human hepatocellular carcinoma (HCC) cells to form earlier and bigger tumours in vivo. Furthermore, silencing NOX4 in HCC cells induces a decrease in cell-to-cell and cell-tomatrix adhesion and an increase in cell migration. NOX4 knockdown resulted in decreased expression of E-cadherin and ZO-, components of adherent and tight junctions respectively, lower adhesion capacity and a decrease in focal adhesions. Moreover, a change in the integrin pattern in the plasma membrane was observed when NOX4 was silenced. All together, these results point to a role for NOX4 in maintaining epithelial structures, increasing cell-to-cell and cell-to-matrix adhesions, and preventing cell migration. In summary, NOX4 may play a relevant tumor suppressor role during early stages of liver tumorigenesis. In support of this idea, immunochemical analyses of NOX4 expression in human liver tumor cell lines and tissues revealed decreased NOX4 protein levels in liver tumorigenesis. P5-23 Amitriptyline, used alone or in combination therapy, modifies expression of several antioxidants in breast cancer cell lines Eduardo Díaz-Parrado, Jéssica Núñez-Vasco, Matilde Illanes, Ana Fernández-Rodríguez, Ana María Moreno-Fernández, Manuel De Miguel Dpto. Citología e Histología Normal y Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Introduction: Oxidative therapy is a promising anticancer strategy based on the production of high levels of ROS and/or the depletion of antioxidants of tumor cells. We have already demonstrated that Amitriptyline (Amit), a tricyclic antidepressant, induces an increase of ROS production, leading to apoptosis through the caspase-dependent pathway. In this work, in order to continue studying the potential antitumor activity of amitriptyline, we have analyzed the effects of amitriptyline on the expression of several antioxidants in human breast cancer cell lines, and in combination with the chemotherapeutic camptothecin (CPT). Materials and Method: MCF-0A (non-tumoral line cell) and MCF-7 and MDA-MB-23 cells (breast cancer cell lines with different hormonal characteristics) were treated 24h with Amit (20μM), 0μM CPT and a combination of both. Expression of several antioxidants (MnSOD, catalase, GSR, HO-) was analyzed by RT-qPCR. Results: MCF-0A: Antioxidant expression was decreased in the different treatment conditions, except for HO- that was significantly increased. MCF-7: With Amit, an increase of GSR and a decrease of HO- were observed. With the combination therapy, expression of the four antioxidants was decreased. MDA-MB-23: With Amit, all antioxidants showed a decreased expression except for HO-, which was higher than in control. With the combination therapy, similar results to MCF-7 were obtained, with the exception of the expression of HO-, which showed a significant increase. Conclusions: In general, Amit induces a reduction in the antioxidant system, especially dramatic for catalase in the combination therapy. However, HO- showed a significant increase in the non-tumoral cells and in the combination therapy of MDA-MB-23 tumor cells. HO- could be an important antioxidant against oxidative stress in breast cells since two of the cell lines tested reacted increasing notably its expression after oxidative treatment. After inducing oxidative stress, cells increase the expression of some antioxidants, different ones depending on cell type. P5-24 Caracterización de la enzima ascorbato peroxidasa en extractos crudos de Dunaliella salina Antonio León Vaz, Rocio Rengel Domínguez, Maria del Carmen Romero Cruz, Javier Vigara Fernández Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES Las especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el peróxido de hidrógeno, el radical superóxido, el radical hidroxilo y el oxígeno singlete, son continuamente producidas en plantas y microalgas en distintas rutas metabólicas y con distinta localización subcelular. La producción de estas especies se incrementa en situaciones de estrés ambiental, excediendo la capacidad detoxificadora del organismo y causando daños oxidativos a proteínas, ADN, lípidos y otras macromoléculas. Para evitar estos daños oxidativos los distintos organismos han desarrollado eficientes sistemas enzimáticos. La ascorbato peroxidasa (APX; EC...) es una hemoproteína que juega un importante papel en la eliminación de H 2 O 2 (la forma más estable entre las distintas ROS) utilizando ascorbato como donador de electrones. En este trabajo se presenta la caracterización del ensayo de actividad de la enzima de la APX en extractos crudos de la microalga eucariótica halófila Dunaliella salina. La actividad se muestra dependiente de sus sustratos (ascorbato y agua oxigenada) y se estabiliza con la presencia de EDTA en el medio de reacción, el ensayo también requiere un medio tamponado, siendo su ph óptimo 6,0, en tampón MES 00 mm. Se ha determinado una temperatura óptima de 34 ºC y una energía de activación de 3,3 kj/mol para el ensayo de actividad. La APX de Dunaliella salina muestra una cinética de Michaelis-Menten para el peróxido de hidrógeno, mostrando un valor de K m de 47,52 μm y una V máx de 449,33 U/ml; presentando una cinética sigmoidal para el ascorbato, con valores de S 0,5 de 3,05 μm y un factor de Hill de n=,06. La actividad APX de Dunaliella salina se inhibe drásticamente por azida y cinuro, inhibidores característicos de hemoproteínas, mostrándose una inhibición parcial por Mn +2 y por DTT. Por otro lado, la carencia de fuente nitrogenada o la presencia de metales pesados (Cd +2 ) en el medio de cultivo de Dunaliella salina, generó estrés oxidativo en la microalga, provocando el aumento de los niveles de actividad de la ascorbato peroxidasa. 40

Granada 204 Pósters P6. Regulación de la expresión génica y dinámica del genoma P6- (R6-4) Temporal and spatial regulation of the Yen Holliday junction resolvase prevents genome instability Miguel González Blanco, Joao Matos 2, Stephen C. West Clare Hall Laboratories, London Research Institute, Cancer Research UK, Potters Bar, UK, 2 Institute of Biochemistry, Department of Biology, ETH Zürich, Otto-Stern-Weg 3, Zürich, CH The careful orchestration of cellular events such as DNA replication, repair, and segregation is essential for equal distribution of the duplicated genome into two daughter cells. To ensure that persistent recombination intermediates are resolved prior to cell division, the Yen Holliday junction resolvase is activated at anaphase. Here, we show that the master cell-cycle regulators, cyclin-dependent kinase (Cdk) and Cdc4 phosphatase, control the actions of Yen. During S phase, Cdk-mediated phosphorylation of Yen promotes its nuclear exclusion and inhibits catalytic activity by reducing the efficiency of DNA binding. Later in the cell cycle, at anaphase, Cdc4 drives Yen dephosphorylation, leading to its nuclear relocalization and enzymatic activation. Using a constitutively activated form of Yen, we show that uncontrolled Yen activity is detrimental to the cell: spatial and temporal restriction of Yen protects against genotoxic stress and, by avoiding competition with the noncrossover-promoting repair pathways, prevents loss of heterozygosity. P6-2 (R6-3) Protein neddylation controls the timing of DNA end resection and DNA double strand break break repair Pablo Huertas, Sonia Jimeno, María Jesús Fernández Ávila 2, Cristina Cepeda García 2, Daniel Gómez Cabello 2, Andrés Cruz García CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2 CABIMER, Sevilla, ES DNA double strand breaks are the most cytotoxic lesions that can occur on the DNA. They can be repaired by different mechanisms and optimal survival requires a tight control between them. Here we show that protein deneddylation as a major controller of repair pathway choice. Neddylation inhibition changes the normal repair profile towards an increase on homologous recombination. Indeed, after DNA damage fast and local RNF-mediated neddylation acts as an inhibitor of BRCA and CtIP-mediated DNA end resection, a key process in repair pathway choice. A secondary wave of deneddylation by the COP9-signalosome allows resection to take place at later times. By controlling DNA resection, protein neddylation not only affect the choice between NHEJ and homologous recombination, but also controls the balance between different recombination subpathways. Thus, protein neddylation act as a molecular clock, controlling the timing of DNA end resection and repair events. P6-3 (R6-2) Role of chromatin dynamics on hormonedependent gene regulation in breast cancer cells Guillermo Pablo Vicent Martínez Centre de Regulació Genòmica (CRG), Barcelona, ES A close chromatin conformation prevents gene expression in eukaryotic cells. Genes activated by external cues have to overcome this repressive state by locally changing chromatin structure to a more open state. Although much is known about hormonal gene activation, how basal repression of regulated genes is targeted to the correct sites throughout the genome is not well understood. Here we report that in breast cancer cells the unliganded progesterone receptor binds genomic sites and targets a repressive complex containing HPg, LSD, HDAC/2, CoREST, JARIDB and the RNA SRA (Steroid Receptor Activator) to 20% of hormone-inducible genes, keeping these genes silenced prior to hormone treatment. The complex is anchored via binding of HPg to H3K9me3. SRA interacts with PR, HPg and LSD, and its depletion compromises the loading of the repressive complex to target chromatin promoting aberrant gene de-repression. Upon hormonal treatment the HPg-LSD complex is displaced from these constitutively poorly expressed genes as a result of rapid phosphorylation of histone H3 at serine 0 mediated by MSK, which is recruited to the target sites by the activated PR. On the other hand, the HPg-LSD complex is also recruited to the hormone-repressed genes BCAS and KRT23 promoting a close chromatin conformation. These results highlight the importance of the HPg-LSD complex as a key factor involved in hormonal gene regulation of breast cancer cells. P6-4 La cromatina-quinasa VRK regula la histona H2AX y la formación de los focos de reparación de ADN inducidos por radiación ionizante Marcella Salzano, Marta Sanz-García, Diana M. Monsalve, David S. Moura, Pedro A. Lazo Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca, (CSIC). Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES El daño local al ADN altera la estructura de la cromatina y el detectar y el responder a esta alteración es probablemente el inicio de la Respuesta al Daño del ADN (RDA). En este contexto, las cromatina quinasas son unos buenos candidatos por participar en la detección de la alteración local de la cromatina por daño al ADN y en sus respuestas celulares. VRK es una Ser-Thr quinasa nucleosomal identificada en el nuestro laboratorio como un nuevo sensor de la RDA. Está descrito que VRK regula muchos procesos celulares como por ejemplo el ciclo celular, condensación de la cromatina y protección de las células al daño génico por regulación positiva de p53. Nuestros resultados demuestran que su depleción por knock-down causa una pérdida global de la acetilación de las histonas independientemente de ATM. También hemos demostrado que VRK interacciona directamente con H2AX fosforilándola en Ser39 inmediatamente tras el daño al ADN inducido por radiación ionizante. El efecto sobre la fosforilación de H2AX y la formación de los focos es prevenido por el knock-out de VRK y rescatado por la quinasa activa, pero no con la inactiva, demostrando que es necesaria la actividad de VRK para la respuesta al daño del ADN. Además, el pretratamiento con los inhibidores de ATM demostró una cooperación de ATM y VRK sobre la formación de los focos de reparación. Concluimos que VRK es un nuevo componente de la cromatina, que reacciona a sus alteraciones y que participa a la respuesta muy temprana al daño génico, funcionando ella sola o en colaboración de ATM. P6r-5 Papel de SF3B en la reparación de los cortes de doble cadena en el DNA Mª Rosario Prados Carvajal, Cristina Cepeda García, Pablo Huertas 2 CABIMER, Sevilla, ES, 2 CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES De los muchos tipos de daños que puede sufrir el DNA, los cortes de doble cadena (DSB) son de los más citotóxicos, ya que causan mutaciones, reordenamientos cromosómicos e inestabilidad genómica. Así, las células han desarrollado diferentes mecanismos para la detección, señalización y reparación de estas roturas. La reparación de dicho daño puede realizarse 4

Pósters XXXVII Congreso SEBBM por recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR) o por unión de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining; NHEJ). La decisión entre ambos mecanismos de reparación depende de la activación o no del proceso denominado resección de los extremos de DNA. Dicho mecanismo es, por tanto, un proceso muy regulado y crítico en la supervivencia de las células. Una de las proteínas más importantes implicada en la resección del DNA es la proteína CtIP, que controla si el proceso de resección ha de activarse o no. Esta decisión depende de la integración de múltiples señales celulares por parte de CtIP, garantizando así que las DSB sean señalizadas y reparadas de la mejor manera posible. Para ello, CtIP sufre múltiples modificaciones postraduccionales e interacciona con diversas proteínas. Como parte de un estudio para entender como se regula la resección a nivel celular, hemos aislado nuevas proteínas que interaccionan físicamente con CtIP. Entre ellas, hemos encontrado diversas subunidades del complejo SF3B. Como la depleción de varios componentes de dicho complejo disminuyen la eficiencia de la recombinación homóloga, estamos estudiando su papel en resección con más detalles. Aquí, presentamos evidencias de que la depleción de distintas subunidades de SF3B reduce la resección de cortes de doble cadena inducidos en el DNA de manera artificial. Como se ha descrito que la subunidad SF3B2 del complejo es un sustrato de ATM, la quinasa principal del checkpoint de daño en el DNA, estamos analizando el papel de esas fosoforilaciones en la función del complejo SF3B en resección. P6r-6 Regulación del método de reparación de roturas de doble cadena en el DNA por HDAC, HDAC2 y PARP3 Cintia Checa Rodríguez, Pablo Huertas Sánchez, Daniel Gómez Cabello Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Sevilla, ES Los cortes de doble cadena (DSB) son el tipo de daño más citotóxico que puede sufrir el DNA, pudiendo causar mutaciones e inestabilidad genómica. Existen dos mecanismos para reparar estos cortes, la unión de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining; NHEJ) y la recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR). No se conoce bien el mecanismo por el que los DSB son reparados por una u otra vía. Sin embargo, se considera que el procesamiento de los extremos del corte, o resección, es un paso clave en esta decisión conduciendo a la reparación por HR e impidiendo la vía de NHEJ. La detección y señalización del daño (checkpoint) influye también en el método de reparación. El daño en el DNA conduce a una cascada de eventos coordinada, conocida como respuesta al daño en el DNA (DNA Damage Response, DDR) donde el reclutamiento de proteínas a la lesión está regulado en parte por modificaciones postraduccionales incluyendo la fosforilación y la poli (ADP-ribosilación). Recientemente, se ha demostrado que la poli (ADPribosa) polimerasa PARP3 es activada específicamente por los DSB in vitro y se ha propuesto que pueda tener un papel en HR. Por otra parte, la estructura de la cromatina influye en el reconocimiento, señalización y reparación de daños en el DNA. Las modificaciones de histonas pueden alterar sus propiedades e influir en la respuesta al daño. Se ha visto que las deacetilasas de histonas humanas HDAC e HDAC2 responden al daño del DNA y promueven la señalización y reparación de los DSB. Ambas proteínas parecen implicadas tanto en NHEJ como en HR. En este trabajo hemos analizado el efecto de la depleción de HDAC, HDAC2 y PARP3 sobre el balance entre NHEJ y HR. Para entender su función, hemos estudiado su posible papel en el proceso de resección y checkpoint. P6m-7 Identification of novel SND target genes involved in glycerolipid metabolism in human hepatoma cells under inflammatory conditions Enara Arretxe, Sandra Armengol, Sarai Mula, Leire Enzunza, Yolanda Chico, Begoña Ochoa, María José Martínez Universidad del País Vasco, Leioa, ES SND (Staphylococcal nuclease and Tudor domain-containing ) is a transcriptional corregulator involved in adipogenesis, stress response and cancer progression. Current evidence indicates that SND upregulation is a hallmark of several types of cancers. In particular in human hepatocarcinoma, SND overexpression is correlated with malignancy and a crosstalk between SND, mirna22, NF-κB and inflammation signaling pathways may be envisaged. Work in our lab demonstrated that SND gene activity in human hepatoblastoma cells is upregulated by a transcriptional network involving NF-κB, Sp and NF-Y binding in response to the inflammatory cytokine TNFa. Very recently, we have performed the first genome-wide search for endogenous SND binding sites by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip assays on HepG2 human hepatoma cells under basal and TNFα-induced inflammatory conditions. Here we validated by ChIP-qPCR the binding of SND to the promoter of four target genes, CHPT, LPGAT, LPIN and PTDSS, involved in regulation of glycerophospholipid metabolism. When SND protein was augmented in the nucleus by TNFα treatment, the transcript expression of CHPT, LPGAT and LPIN was increased whereas that of PTDSS was decreased. These results were compatible with the increment in the cellular phosphatidylcholine content detected in the TNFα treated cells. SiRNA-mediated SND silencing abolished the TNFα-induced changes on the mrna level of the target genes as well as the increment in cellular PC content. However, under non-inflammatory conditions, SND silencing did not affect the expression of LPIN and PTDSS but reduced the expression of CHPT and LPGAT. Our findings indicate that SND binding is essential for the TNFα action on the expression of these SND target genes involved in regulating cellular phosphatidylcholine content. Supported by Gobierno Vasco (IT336/9, AE-20--34, Saiotek calls) and UPV/EHU (UFI/20). P6r-8 (R6-5) VRK y AurKB interaccionan en mitosis regulando la fosforilación específica de la histona 3 y la correcta progresión del ciclo celular David da Silva Moura, Marta Vázquez-Cedeira, Pedro A. Lazo Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, CSIC, Universidad de Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES El ciclo celular es un proceso altamente regulado en el que participan diversas proteínas quinasa, como la Aurora B y la VRK. Estas dos quinasas controlan varios procesos para una correcta progresión del ciclo celular, entre los cuales se destaca la condensación de la cromatina. Durante la mitosis, las dos serina-treonina quinasas contribuyen significativamente en la condensación de la cromatina en varios mecanismos, entre los que se destaca la fosforilación de las histonas, más precisamente de la histona 3. VRK fosforila específicamente la treonina 3 (T3) de la histona 3 y la Aurora B fosforila específicamente la histona 3 en la serina 0 (S0). En este trabajo, hemos demostrado que VRK interacciona con Aurora B y que esta interacción se produce durante la mitosis, concretamente en las fases más tardías. Además, analizamos el efecto de la interacción VRK- Aurora B en la capacidad de fosforilar a la histona 3. Así, confirmamos que cantidades crecientes de Aurora B, afectaban a la fosforilación de la histona 3, en el residuo T3, por VRK y que este efecto era independiente de la actividad quinasa de la Aurora B. De la misma manera, cantidades 42

Granada 204 Pósters crecientes de VRK, activa o inactiva, afectaban a la fosforilación de la histona 3, en el residuo S0, por la Aurora B. El mismo efecto sobre la histona 3 fue verificado en ensayos quinasa con ( 32 P[ATP]). Posteriormente, hemos analizado durante el ciclo celular los niveles de fosforilación de la histona 3, en los dos residuos T3 y S0, y hemos demostrado que la disminución de la fosforilación de la histona 3 en los dos residuos coincide con la interacción VRK-Aurora B. Con estos resultados concluimos que la interacción VRK-Aurora B afecta negativamente la fosforilación de la histona 3 por las dos quinasas, y que este puede ser un mecanismo regulatorio para una correcta salida de la mitosis. P6-9 GtrS and GltR form a two-component system: The central role of 2-ketogluconate in the expression of exotoxin A and glucose catabolic enzymes in Pseudomonas aeruginosa Abdelali Daddaoua, Carlos Molina-Santiago 2, Jesús de la Torre 2, Tino Krell 2, Juan-Luis Ramos 3 Estación Experimental de Zaidín, CSIC, Otura, Granada, ES, 2 EEZ - CSIC, Granada, ES, 3 ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES In the human pathogen Pseudomonas aeruginosa the GltR regulator is required for glucose transport whereas GtrS is a sensor kinase that plays a key role in mediating bacteria-host interaction and pathogen dissemination in the host. We show that GtrS and GltR form a two-component system and this novel TCS was found to regulate the expression from the promoters P edd/gap-, P oprb and P glk, which control the expression of genes involved in glucose metabolism and transport. In addition, the GtrS/GltR pair regulates the expression of toxa that encodes exotoxin A, the primary virulence factor. Microcalorimetry-based ligand screening of the recombinant GtrS ligand binding domain revealed specific binding of 2-ketogluconate (2-KG) (K D = 5 μm) and 6-phosphogluconate (K D = 98 μm). These effectors accelerate GtrS autophosphorylation, with concomitant transphosphorylation of GltR leading to a 3-fold increase in transcription. Surprisingly, in vivo a similar increase in expression from the above promoters was observed for the mutant deficient in GltR regardless of the presence of effectors. Using footprinting assays, the GltR operator site was found to contain the consensus sequence 5 -tggtttttc-3. We propose that 2-ketogluconate is a key metabolite in the stringent transcriptional control of genes involved in virulence and glucose metabolism. Surprisingly, we found that the GltR response regulator is a repressor that is released from its target operators of the toxa and glucose metabolism genes upon phosphorylation. This system corresponds to another mode that guarantees a concerted regulation of carbohydrate metabolism and exotoxin A expression. P6-0 La inhibición de la actividad Aurora quinasa B mediada por VHC regula la respuesta antiinflamatoria en las fases iniciales de la infección Irene Francisco Recuero, Antonio Madejón 2, Julie Sheldon 3, Celia Perales 3, Ana Isabel Gil 2, Jordi Muntané 4, Esteban Domingo 3, Javier García-Samaniego Rey 2, Aurora Sánchez Pacheco Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2 Departamento de Digestivo, Ciberhed. Hospital Carlos III, Madrid, ES, 3 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid, ES, 4 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) - Hospital UniversitarioVirgen Del Rocio de Sevilla, Sevilla, ES Introducción: Los cambios epigenéticos, entre los que se encuentran las modificaciones covalentes de histonas, son cruciales en la inducción de inestabilidad genética asociada a enfermedades en humanos, incluyendo el desarrollo de fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo, se desconoce el papel que este tipo de modificaciones pueda tener en la evolución de la enfermedad hepática producida por el virus de la hepatitis C (VHC). Objetivos: Estudiar las modificaciones covalentes de histonas inducidas por la infección por VHC y determinar los mecanismos moleculares implicados. Métodos: Para determinar el papel del VHC en la inducción de cambios epigenéticos se utilizó un sistema de infección in vitro de VHC (VHCcc) sobre la línea celular Huh7.5. Alternativamente la región codificante de la proteína del core viral (genotipos a, b y 2a) se clonó en un vector de expresión eucariota con el que se realizaron ensayos de transfección transitoria sobre la línea celular Huh7.5 y en cultivos primarios de hepatocitos humanos. Las modificaciones de histonas se analizaron por Western Blot, utilizando anticuerpos específicos. Para determinar las actividades enzimáticas implicadas se ensayó el efecto de inhibidores específicos como el ZM443979 y ensayos de sirna. La expresión de genes implicados en el control de la actividad inflamatoria, como NF-κB y COX-2, se determinó por RT-PCR cuantitativa. Resultados: Hemos demostrado que el HCV a través de la proteína core inhibe la fosforilación del residuode Serina 0 de la histona H3 (H3Ser0ph), un marcador epigenético asociado a la regulación de la actividad transcripcional y la mitosis celular. Los ensayos con inhibidores de actividades enzimáticas implicadas en la fosforilación de histonas demostraron que el efecto sobre la H3Ser0 inducida por la proteína del core viral se inhibía en presencia de ZM443979, un inhibidor de la actividad Aurora quinasa B (AKB). Mediante ensayos de coinmunoprecipitación observamos una interacción directa entre la proteína del core viral y la AKB. La interacción con la proteína del core indujo una inhibición de la actividad quinasa de la AKB. Asociado a la inhibición de la actividad AKB se observó una inhibición de transcripción de NF-κB y COX-2, genes implicados en el control de la respuesta inflamatoria. La sobreexpresión de AKB revirtió este efecto y disminuyó la infectividad extracelular del virus, de manera opuesta la inhibición de la actividad de Aurora B aumentó la infectividad viral. Conclusiones: La proteína del core del VHC interacciona con AKB inhibiendo su actividad quinasa y disminuyendo los niveles de fosforilación de la H3Ser0ph así como la expresión de NF-κB y COX-2, dos genes implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Este mecanismo podría ser una nueva estrategia del VHC para asegurar su infectividad y persistencia en la célula huésped. P6- Vitamin D has wide regulatory effects on histone modifying enzymes in human colon cancer cells Antonio Barbáchano Becerril, Fábio Pereira, Asunción Fernández- Barral, Gemma Ferrer-Mayorga, Alberto Muñoz, María Jesús Larriba Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, Madrid, ES Vitamin D 3 is obtained from the diet or mainly synthesized in the skin and is converted into the active metabolite alpha, 25-dihydroxyvitamin D 3 (,25(OH) 2 D 3 ). Epidemiological data suggest a protective role of vitamin D against several neoplasias, particularly colorectal cancer.,25(oh) 2 D 3 is a major regulator of gene expression. Histones are subject to posttranslational modifications including methylation, acetylation and others. Misregulation of histone modifications alters gene expression and cell phenotype, which may contribute to cancer initiation, progression and/or metastasis. We found that,25(oh) 2 D 3 has a wide regulatory action on the expression of genes coding for histone demethylases of the Jumonji C domain and lysine-specific demethylase families (Pereira et al., 20; 202). Notably,,25(OH) 2 D 3 induces the expression of the histone demethylase JMJD3/ KDM6B that specifically demethylates the lysine 27 of histone H3 (H3K27) and has tumour suppressor activity. We found that the induction of JMJD3 is necessary for the adequate gene regulatory, antiproliferative, and prodifferentiation actions of,25(oh) 2 D 3 in human colon cancer cells. Conversely,,25(OH) 2 D 3 inhibits the expression of several Polycomb 43

Pósters XXXVII Congreso SEBBM group proteins that participate in the Polycomb repressive complexes (PRC) and 2, which are responsible for H3K27 methylation and promote tumorigenesis. The inhibition of PRC2 activity by DZNep potentiates the gene regulatory action of,25(oh) 2 D 3 and also its effects on colon cancer cell proliferation and differentiation. Thus,,25(OH) 2 D 3 exerts an ample regulatory effect on the expression of histone modifying enzymes involved in epigenetic regulation that, in turn, mediate,25(oh) 2 D 3 actions on gene expression and cell phenotype in colon cancer. directly regulates the expression of virulence functions in response to a host signal. In this work we aimed at understanding the molecular mechanism that leads to the activation of P. aeruginosa ECF sigma factors. We have identified two proteases, Prc and RseP, involved in the processing of several anti-sigma factors in response to their cognate inducing signal. Moreover, we have also observed that some anti-sigma factors are already processed in an N- and a C-domain prior to the perception of the signal. The biological significance of this observation is discussed. P6-2 New strategies in relationship between lncrnas and the SWI/SNF complex Antonio Herrera Merchán, Carmen Callejas Lechuga, Purificación Fernández Espinosa, Pedro Pablo Medina Vico Universidad de Granada, Granada, ES Long non-coding RNAs (lncrnas) are a new class of non-coding gene regulators. But unlike their smaller counterparts, micrornas, relatively less is known about the roles and functions of lncrnas. Current evidence suggests that lncrnas may play important roles in a wide range of biological processes in human cancers. Many of the LncRNAs have been functionally associated with chromatinremodeling complexes. SWI/SNF is chromatin-remodeling complex, which alters the interactions between DNA and histones and modifies the availability of the DNA for transcription. The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced the important and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF complex in cancer. However, although SWI/SNF complex play a key role in gene expression, the regulation of this complex itself is poorly understood. We hypothesize that LncRNAs could be also functionally related SWI/SNF playing a role in its function in carcinogenesis. Supporting this hypothesis, recently, an LncRNA was found functionally associated with the SWI/SNF complex, in prostate cancer. We are gathering preliminary results using new technologies of sequencing and immunoprecipitation of RNA (RNA-IP) to identify new LncRNAs associated with SWI/SNF in different tumor cell lines for subsequently develop functional assays to infer its biological role in tumor development. P6r-3 Unravelling the molecular mechanism activating ECF sigma factor in Pseudomonas aeruginosa Joaquín R. Otero-Asman, Cristina Civantos, Karlijn Bastiaansen 2, Marian Llamas Dept. of Environmental Protection, Estación Experimental del Zaidín-CSIC, Granada, ES, 2 Department of Molecular Microbiology Vrije Universiteit Amsterdam Faculty of Earth and Life Sciences, Amsterdam, NL Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that lives in a wide range of environments. There are many interactions between the environment and the bacterium that permit this niche variability. Many of these interactions are possible because of the action of a regulatory system known as cell surface signaling (CSS). CSS systems recognize signals from the environment and transmit them into the cytosol, affecting gene expression.the system is constituted by an outer membrane receptor, a cytoplasmic membrane located anti-sigma factor and an extracytoplasmic function (ECF) sigma factor in the cytosol. In absence of the inducing signal, the anti-sigma factor binds to and keeps inactive the sigma factor. The regulatory cascade starts with the recognition of the signal by the receptor, which promotes the proteolytic degradation of the anti-sigma factor and the activation of the ECF sigma factor. The ECF sigma factor can then interact with the RNA polymerase and induce expression of target genes. Most P. aeruginosa CSS systems have a role in the regulation of iron uptake, which is an important process for the pathogen during infection. However, this bacterium has a CSS system, called PUMA3 or Vre, that P6-4 Genetic analysis of the role of the Mlp export factor in genetic stability Francisco García Benítez, Hélène Gaillard, Andrés Aguilera López CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Transcription of a DNA sequence increases its recombination frequency, a phenomenon referred to as transcription-associated recombination (TAR). During transcription, negative supercoils are accumulated behind the advancing RNA polymerase, facilitating the unwinding of the DNA helix. This transient DNA opening favours the annealing of the nascent mrna to the transcribed strand (TS) forming a DNA:RNA hybrid (R-loop). R-loops can be formed naturally as intermediates in specific cellular processes, such as mitochondrial DNA replication or immunoglobulin class switching and have been suggested to play a role in transcription termination. A number of observations in E. coli, yeast and humans indicate that the non-transcribed strand (NTS) is more susceptible to damage than the TS. The formation of R-loops, in which the NTS remains single stranded, renders the NTS more vulnerable to DNA damage and contributes to TAR. We are interested in understanding the different mechanisms associated with the optimal biogenesis of mrna and the control of R-loops formation. We have found mlpd in a screening for deletions of non essential nuclear genes that show hyper recombination when we overexpress a human deaminase that preferentially targets ssdna in Saccharomyces cerevisiae. The MLP gene encodes a nuclear pore basket protein that has an important role in unspliced mrna retention, SUMO regulation and telomere organization. We investigate the role of Mlp, its paralog Mlp2 and their human homolog TPR in preventing genomic instability. Current results of Mlp will be presented and discussed. P6-5 Novel roles for the protein kinase DYRKA as a chromatin-associated transcriptional regulator Chiara Di Vona, Daniela Bezdan, Abul B.M.M.K. Islam 2, Nuria Lopez-Bigas 2, Stephan Ossowski, Susana de la Luna Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES, 2 Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, ES Our perception of how kinases regulate gene expression has recently been expanded to consider not only their influence on transcription factors and co-regulators but also that on histones, chromatin remodelers or components of the basal transcription machinery, all of which may be directly modified by kinases at specific genomic loci. DYRKA (dualspecificity tyrosine-regulated kinase) belongs to a highly conserved family of kinases represented in all eukaryotes and it is known to fulfil key roles during brain development. While DYRKA is present both in the nucleus and cytoplasm of mammalian cells, very little is known about the nuclear activities of DYRKA. We show here that nuclear DYRKA is an active kinase that participates in high molecular weight complexes, interacting with several components of the basal transcriptional machinery, including RNA polymerase II. We mapped the genome-wide profile of DYRKA interactions with chromatin and found that the kinase is recruited to RNA polymerase II-dependent promoters, where it activates transcription in a kinase dependent manner. DYRKA binds chromatin regions displaying a highly conserved palindromic sequence that lies close to the transcription 44

Granada 204 Pósters start site of target genes, a sequence that is apparently necessary for DYRKA-mediated transcriptional activation. Growth-dependent expression of a subset of DYRKA target genes depends on DYRKA protein levels and/or activity, and indeed, downregulation of DYRKA diminishes cell growth. Thus, we propose a novel role for DYRKA as a chromatin-associated transcriptional regulator and as part of the machinery controlling cell growth. P6-6 SMARCA4 expression regulation by mirnas in lung carcinogenesis IF Coira, EE. Rufino-Palomares, P. Peinado, C. Metheetrairut 2, L. Boyero, OA Romero 3, J Carretero 4, E. Farez-Vidal 5, M. Cuadros 5, FJ Reyes-Zurita 5, JA Lupiáñez 5, M Sánchez-Cespedes 3, FJ Slack 2, PP Medina University of Granada, Department of Biochemistry and Molecular Biology. Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), Granada, ES, 2 Yale University, New Haven, US, 3 IDIBELL, Barcelona, ES, 4 University of Valencia, Department of Physiology, Valencia, ES, 5 University of Granada. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Granada, ES SWI/SNF complex is chromatin-remodeling complex able to alter the interactions between DNA and histones and modify the availability of the DNA information to the cell machinery, using the energy of the ATP hydrolysis. Last deep-sequencing efforts on tumoral genomes have underlined the important and ubiquitous role of the SWI/SNF complex and cancer. It has been known that the expression of SMARCA4, the helicase/atpase catalytic subunit of the SWI/SNF complex, is frequently lost in NSCLC cell lines, mainly by mutations. In primary tumours, the loss of expression of SMARCA4 is also frequent, however it lost cannot be explained by mutations nor other gene silencing mechanisms such us promoter hyper-methylation. So, the regulation of SMARCA4 is partially unknown. In this assay, we study if the micrornas contributes to the loss of expression of SMARCA4 in lung tumors. For this purpose we have determined experimentally the 3 UTR, and analysed functionally the microrna binding sites previously predicted by bioinformatics tools. Results obtained indicated that the loss of expression of SMARCA4 observed in primary lung tumors can be due to microrna activity. P6-7 (R6-) RNAPII dephosphorylation is facilitated by the Rpb4/7 heterodimer Olga Calvo Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/Universidad de Salamanca, Salamanca, ES The eukaryotic RNAPII enzyme, whose activity is essential for transcription of protein-coding genes, is a complex of 2 subunits, Rpb to Rpb2. The Rpb4 and Rpb7 subunits bind to each other forming a complex in archaebacteria and in eukaryotic cells, and display some unique features that distinguish them from the remaining subunits. In the case of S. cerevisiae, the Rpb4/7 heterodimer can dissociate from the rest of the holoenzyme, and has been shown to be involved in several gene expression processes. Thus, they are important for transcription initiation, elongation and, in particular, Rpb4 contributes to contranscriptional recruitment of 3 -end processing factors. Moreover, recent evidences suggest that they are also involved in DNA repair, mrna export and decay, as well as in translation. Here, I present additional data showing that the Rpb4/7 heterodimer is important to maintain proper RNAPII phosphorylation levels in S. cerevisiae, regulating several kinases and phosphatases. In fact, in the absence of a functional Rpb4/7 heterodimer, RNAPII phosphorylation is dramatically enhanced all along the transcription cycle due to altered CTD phosphatases recruitment. P6-8 Roturas de ADN y topoisomerasas: el peligro de jugar con cuchillos Felipe Cortes Ledesma CABIMER, Sevilla, ES Las topoisomerasas de ADN son enzimas nucleares muy conservadas en la evolución que pueden considerarse un arma de doble filo. Por un lado, su acción es necesaria para regular los cambios topológicos inherentes a todos los procesos fundamentales que implican a la molécula de ADN, incluyendo tanto la transcripción, replicación y reparación como la condensación y segregación cromosómica. Sin embargo, su ciclo catalítico emplea un mecanismo de rotura transitoria y religación que, si se ve interrumpido, puede dar lugar a roturas de ADN persistentes, con las evidentes consecuencias que éstas pueden tener para la supervivencia celular y la integridad del genoma. Además, esta peculiaridad del mecanismo de acción de las topoisomerasas es la base de la eficacia antitumoral de los llamados venenos de topoisomerasas, un grupo químicamente heterogéneo de compuestos que inhiben específicamente el paso de religación catalizado por la enzima, induciendo así la formación de roturas de ADN que, por su alto índice de proliferación, afectan preferentemente a las células tumorales. Además de esta interesante relación con la terapia del cáncer, se ha demostrado que una deficiente reparación de roturas generadas por topoisomerasas puede ser la base de diversas patologías neurológicas humanas. Por lo tanto, comprender en su totalidad los mecanismos y la regulación que rigen la reparación de las roturas de ADN inducidas por topoisomerasas adquiere una importancia fundamental para la salud, con posibles implicaciones en el desarrollo de futuras herramientas, tanto de diagnóstico y pronóstico como terapéuticas. P6-9 Pitx2 differently controls the expression of host genes and gene-embedded micrornas in cardiac and skeletal muscle cells Francisco Hernandez-Torres, Amelia E Aranega, Diego Franco Jaime Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES The Pitx2 gene is a member of the Bicoid-like homeobox family that plays an importantrole in embryonic left-right signalling and subsequently during cardiac and skeletal muscle organogenesis. Pitx2 misregulation has been as well associated with skeletal and cardiac muscle diseases. Although three Pitx2 isoforms are expressed in mice, Pitx2a, Pitx2b and Pitx2c, only Pitx2c plays a determinant role in left right signalling and organogenesis. Over the last years we have gained insights into the transcriptional regulatory mechanisms driven by Pitx2 in both cardiac and skeletal muscle. Interestingly, besides playing a role in regulating a large number of protein-coding genes, micrornas are also regulated by Pitx2. Whereas the functional role of distinct micrornas in cardiac and skeletal muscle development and homeostasis is progressively emerging, their transcriptional control and the genetic networks in which they are involved remains largely unexplored. Among 34 differentially regulated micrornas by Pitx2 in either skeletal or cardiac muscle cells, 0 (~30%) display putative Pitx2 binding sites in the -3000 bp proximal promoter sequence, among with other muscle-enriched transcription factor binding sites. Curiously, only two of these micrornas were intergenic, supporting thus their own transcriptional regulatory mechanisms, while the majority of them were embedded into distinct host genes. Since transcriptional regulation of gene-embedded micrornas seemed to be modulated in accordance with transcriptional regulation of the host gene,we evaluated the host gene/microrna expression levels in Pitx2 gain-of-function experiments using Sol8 skeletal muscle and HL- atrial cardiomyocytes, respectively. Surprisingly, our data demonstrate that most of these micrornas are independently regulated from its host gene, and moreover such transcriptional regulation is cell-type specific. We our now working to establish the mechanisms by with Pitx2 can exert this micrornas transcriptional regulation. 45

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P6-20 Adult exposure to Bisphenol A decrease the expression of 5alpha-reductase type I in the prefrontal cortex of female rat. A novel mechanism underlying Bisphenol A-associated psychopathologies? Esperanza Ortega Sánchez, Beatriz Castro Bohorquez 2, Pilar Sánchez Medina 2, Jesús M. Torres de Pinedo 2 Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Dpto. de Bioquímica, Biología Molecular 3 e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad de Granada, Granada, ES Most people in developed countries are exposed almost continuously to Bisphenol A (BPA), an endocrine-disrupting chemical presents in food packaging and dental sealants. BPA is able to interfere with cognitive functions and behavior, but the mechanisms underlying these effects remain unknown. Allopregnanolone (AlloP) is a neuroactive steroid involved in modulating behavioral functions, stress, and neuroendocrine axes and its deregulation is implicated in the development of several psychopathologies. In these processes a key role is held by 5α-reductase (5α-R), the rate-limiting enzyme of AlloP synthesis. Given 5α-R type is the isozyme mainly implicated in the biosynthesis of AlloP, we examined the effects of BPA on 5α-R expression in the prefrontal cortex (PFC) of female rats. We focused on PFC since it is an important area for cognitive control and complex behaviors. Adult female Wistar rats were subcutaneously injected during 4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental Protection Agency (EPA) reference dose. Rats were euthanized at 30 min after the final administration. Quantitative RT-PCR and Western blot analysis were performed to quantify mrna and protein levels of 5α-R respectively. Under the conditions assayed, BPA decreased the expression of 5α-R. This finding is very interesting because reduced brain levels of 5α-R and, consequently AlloP, may contribute to increased the vulnerability for mental and emotional pathology in females. Thus, mood changes during the menstrual cycle, postpartum, major depression and epilepsy are pathologies associated with low AlloP levels. We present here a possible novel mechanism underlying BPA-associated psychopathologies but also raises questions about the safety of adult exposure to BPA. P6r-2 Análisis de la expresión de GFP con diferentes 3 -UTR en un mutante nup84 del NPC Bárbara María Varela-Rodríguez, Tania Alvarez-Felgar, Ana María Rodríguez-Torres, Maria Angeles Freire Picos Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la Coruña, A Coruña, ES Uno de los aspectos clave de regulación de la expresión génica es el procesamiento del extremo 3 de los RNA transcritos por la RNA polimerasa II. En las regiones 3 -UTR (3 -Untranslated) de los mensajeros se encuentran señales que determinan, entre otras, su estabilidad y en general todos los procesos post-transcripcionales. Menos conocido es el proceso que determina el emplazamiento de un mrna en el citosol por su paso a través del Complejo del Poro Nuclear (NPC). Datos de nuestro grupo [] indican que la mutación del factor Nup84 (que forma parte del complejo Y del NPC) de la levadura Saccharomyces cerevisiae afecta a la abundancia de transcritos detectables en los genes con poliadenilación alternativa. Esto nos llevó a buscar un sistema para identificar el producto final de la expresión, la proteína. Para ello expresamos GFP con variantes de regiones 3 -UTR de genes de levaduras: por un lado la 3 -UTR del gen CYC y por otro las variantes de la UTR de un gen con poliadenilación alternativa, KlCYC, expresado en S. cerevisiae [2]. El análisis de la expresión de GFP se llevó a cabo tanto por microscopía de fluorescencia como por fluorimetría y por western blot. Los resultados de fluorimetría permitieron apreciar diferencias importantesen la expresión de GFP en el mutante nup84 expresando la UTR de KlCYC. Los datos obtenidos resultaron ser más claros al analizarlos por esta técnica que por western. En la cepa salvaje, se obtienen niveles altos de GFP expresado con la 3 -UTR de CYC y bajos con la de KlCYC. Hemos comprobado por tanto, que se puede modular la expresión de GFP con estas UTR, y que el efecto del mutante nup84 varía en función de la 3 -UTR contigua a la región codificadora. Bibliografía [] T. Alvarez-Felgar, B.M Varela-Rodríguez y MA Freire-Picos. Variaciones en la expresión de genes con procesamiento alternativo en mutantes del poro nuclear. XXXVI Congreso de la SEBBM 203. [2] B.M. Varela-Rodríguez. Expresión de formas recombinantes de GFP en levaduras: efecto de la cepa y componentes del poro nuclear. Tesis de licenciatura. Facultad de ciencias, UDC 203. P6-22 DbdR, nuevo miembro de la familia de LysR, regulador transcripcional de la ruta de degradación anaerobia de 3,5-dihidroxibenzoato en Thauera aromatica AR- Molina-Fuentes, A., Pacheco, D., Marín, P., Díaz-Romero, A., Marqués, S. Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES T. aromatica AR- es una bacteria desnitrificante capaz de crecer en 3,5 dihidroxibenzoato (3,5-DHB) como única fuente de carbono y energía mediante una ruta oxidativa independiente de oxígeno utilizando nitrato como aceptor final de electrones []. La agrupación génica que codifica para las enzimas de la ruta y proteínas transportadoras consta de 20 genes en una región cromosómica de 29 Kb [2]. Un análisis de RT-PCR ha permitido definir una organización transcripcional en cinco operones, cuatro de los cuales son inducibles por sustrato. A ambos extremos de la agrupación se encuentran sendos reguladores de la familia de LysR. Mediante mutagénesis dirigida hemos determinado que el único gen regulador esencial de la ruta es dbdr. Un análisis de expresión en un fondo mutante dbdr revela que los operones principales de la ruta son dependiente de este regulador. Mediante extensión a partir de cebador hemos definido los promotores de estos operones, que muestran una notable conservación en estructura, y en los que se predicen los posibles sitios de unión para reguladores de la familia de LysR. Estos sitios de unión se están confirmando mediante ensayos de retardo en gel (EMSA) y de footprinting con DNAsa utilizando proteína DbdR sopreexpresada y purificada. El gen regulador forma un operón con qora, una de las enzimas responsable del segundo paso de la ruta. Este operón presenta niveles basales de expresión, inducibles en presencia de sustrato. Su actividad está regulada negativamente por la presencia de DbdR en ausencia del sustrato. Se han construido fusiones de cuatro promotores de la ruta (P orf8, P orf20, P dctp y P dbdr ) al gen reportero lacz para analizar su actividad en un huésped heterólogo en presencia y ausencia del regulador. Los resultados confirman el papel del regulador en la expresión de estos promotores, aunque la actividad basal y la fuerza de los distintos promotores varían. Esto siguiere distintos mecanismos de activación para los distintos promotores. Estas construcciones se han utilizado para analizar la expresión en T. aromatica AR-. Los resultados confirman que DbdR regula la expresión desde al menos P orf8, P orf20 y P dctp. Por otra parte se confirma la represión catabólica inicialmente descrita como la represión de la utilización de 3,5-DHB en presencia de benzoato(3): observamos que la presencia simultánea de succinato y 3,5-DHB produce una cinética típica de crecimiento diáuxico, donde el 3,5-DHB sólo se utiliza una vez consumido el succinato. Esta represión se ejerce a nivel de la expresión desde al menos los promotores P orf8 y P orf20. Finalmente, el análisis de la expresión de los promotores regulados en fondos mutantes para los distintos pasos de la ruta nos ha permitido determinar que la molécula efectora es el sustrato 3,5-DHB y no un producto de su metabolismo. Este extremo se analizará bioquímicamente mediante microcalorimetría isoterma de titulación (ITC) con la proteína reguladora purificada. 46

Granada 204 Pósters Bibliografía [] Gallus, C., and Schink, B. (998) Arch Microbiol. 69, 333-338. [2] Molina-Fuentes, A. (202) Tesis doctoral. [3] Philipp B & Schink B. (2000) Arch Microbiol. 73, 9. Proyecto fi nanciado por fondos FEDER, proyecto del MICINN BIO20-2365. del gen. Tras la activación del gen existe un desplazamiento de N-2 y una desestructuración parcial o total en los nucleosomas N- y N+, dejando accesible los elementos en cis del gen. También se estudia el posicionamiento de Egr en condiciones de silenciamiento para investigar la implicación de la proteína EGR en el desplazamiento del nucleosoma N-2. Los resultados reiteran la importancia del estudio de los mecanismos de regulación de la cromatina a nivel mononucleosomal. P6r-23 Electrophoretic mobility of catenated, knotted and supercoiled DNA molecules Jorge Cebrián, Alicia Castán, Maridian J. Kadomatsu-Hermosa 2, Víctor Martínez 2, Cristina Parra 2, María José Fernández-Nestosa 2, Christian Schaerer 2, Pablo Hernández, Jorge B. Schvartzman, Dora B. Krimer Department of Cellular and Molecular Biology. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Madrid, ES, 2 Scientific and Applied Computing Laboratory. Polytechnic School. National University of Asunción. P.O. Box 2 SL. San Lorenzo, Asunción, PY Two-Dimensional (2D) agarose gel electrophoresis is the method of choice to separate the stereoisomers for any given circular DNA molecule. Supercoiled, catenated and knotted families are clearly identified as they exhibit different electrophoretic mobility. Here we used classical genetics, treatments with Norfloxacine and 2D agarose gel electrophoresis run at different conditions (voltage and agarose concentration) to analyze the mobility of four families of stereoisomers of the same mass: monomeric CatAs (where both duplexes are nicked), monomeric CatBs (where one duplex is nicked and the other is covalently closed), covalently closed dimers and knotted dimers. The results obtained indicate that the contribution of catenane, knot and supercoil nodes to electrophoretic mobility varies significantly depending on the electrophoretic conditions employed. Whereas increasing voltage has little effect on the catenanes mobility, it changes significantly the mobility of supercoiled and knotted dimers. This observation was confirmed for CatBs. Moreover, for partially replicated molecules displaying two regions: one already replicated and the other not, the electrophoretic mobility is determined by the size of the region and the distribution of supercoiled and pre-catenane nodes. P6-24 Mecanismos de regulación de la cromatina: posicionamiento mononucleosomal en el gen Egr Angela L. Riffo-Campos, Josefa Castillo, M. Isabel Rodrigo, Gerardo López-Rodas, Luis Franco Laboratorio de Epigenética y cromatina. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Valencia e INCLIVA, Valencia, ES La cromatina es una estructura compleja formada por DNA, RNA y proteínas, que permite el empaquetamiento ordenado del genoma en las células eucarióticas. Representa un nivel adicional de regulación de todos los procesos metabólicos del DNA, como la replicación, reparación, recombinación y transcripción. El gen Egr (Early growth response ) pertenece al tipo denominados genes inmediato tempranos (IEGs), dado que se activa rápidamente en respuesta a señales mitogenicas que activan la proliferación celular fundamentalmente mediante la vía de señalización de las MAP Quinasas. En la presente investigación se estudia el posicionamiento nucleosomal del gen Egr en los modelos biológicos in vivo (hepatectomía parcial en ratón) e in vitro (línea celular MLP29 de precursoras de hepatocitos de ratón). El posicionamiento se determina mediante ensayos de digestión con la enzima MNasa y posterior análisis por PCR en tiempo real utilizando amplicones solapantes que cubren la región del promotor y el inicio de la transcripción del gen. Los resultados demuestran que la posición de los nucleosomas se mantiene en ambos modelos antes de la activación P6-25 BCL7A s role in haematological malignancies Carlos Baliñas Gavira, Pedro P. Medina 2 Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), Granada, ES, 2 University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular Biology I. Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), Granada, ES Gene expression regulation increases the functional versatility and adaptability of the cell by allowing it to express certain proteins when needed. It is, therefore, one of the most important and complex processes of biology. Changes in the gene expression patterns are key in cancer cell transformation, through an increase in expression of genes that promote carcinogenesis (oncogenes) and/or a decrease in expression of genes that prevent it (tumour suppressor genes). SWI/SNF chromatin-remodeling complex alters the interactions between DNA and histones and modifies the availability of the DNA for transcription. The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced the important and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF complex in cancer. However, although SWI/SNF complex play a key role in gene expression, the regulation of this complex itself is poorly understood. BCL7A was recently identified as a new member of the human SWI/SNF complex. Recently, some reports found BCL7A expression inactivated in hematological malignancies. After screening for BCL7A genetic alterations over a battery of hematological cell lines, we found two cell lines homozygously mutated for BCL7A. We are currently using these cell lines to analyze tumor phenotype changes after BCL7A expression restoration. Upon the completion of this task, we will go through functional analysis to determine BCL7A role in tumorigenesis. P6-26 El tirosol regula el patrón global de expresión de ARN mensajeros implicados en la reproducción, desarrollo y crecimiento de Caenorhabditis elegans Ana Cañuelo Navarro, Francisco J. Esteban Ruiz 2, Juan Peragón Sánchez Área de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2 Área de Biología Celular, Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES El tirosol (Tir, 2-(-4-hidroxifenil)etanol) es uno de los compuestos fenólicos presentes en el fruto y hoja de olivo beneficiosos para la salud. La incorporación de 250 μm de Tir en el medio de cultivo de Caenorhabditis elegans incrementa la longevidad, la termotolerancia y la resistencia al estrés oxidativo. En estudios previos hemos identificado, mediante el análisis de los cambios inducidos en el proteoma de esta especie, las proteínas dianas celulares sobre las que termina influyendo. En este trabajo hemos determinado los cambios que se producen en el patrón global de expresión de ARN mensajeros mediante un análisis de microarrays de ARN utilizando la metodología Affymetrix. Utilizando C.elegans GeneChip R Genome Array se han medido los cambios que se producen en la expresión génica de 22625 transcritos. En respuesta a 250 μm de Tir se producen cambios en los niveles de ARNm de 208 genes; en 206 el nivel de expresión estaba aumentado y en 2 de ellos disminuido. Un posterior análisis de enriquecimiento funcional puso de manifiesto que estos genes están implicados en procesos biológicos tales 47

Pósters XXXVII Congreso SEBBM como la reproducción, el metabolismo lipídico, el desarrollo embrionario y larvario, la morfogénesis y la regulación de la velocidad de crecimiento, transcripción, transporte, así como en otras funciones. Destaca la inducción de 9 genes que codifican para la Proteína Mayor del Esperma (msp). Estos resultados permiten relacionar el incremento en la longevidad con la reproducción, desarrollo y crecimiento en C. elegans mediado por tirosol. Este trabajo ha sido fi nanciado por el Plan de Apoyo a la Investigación, Desarrollo Tecnológico e Innovación de la Universidad de Jaén (R/3/200/02). P6-27 (R6-6) Mip6p, a putative mrna binding protein Manuel Martín Expósito, Susana Rodríguez Navarro Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Las proteínas de unión a ARN (RBP) juegan un papel clave en el control post-transcripcional de diferentes ARN, que, junto a la regulación transcripcional, es una de las vías para regular los niveles de expresión de genes durante el desarrollo. El control postranscripcional puede ocurrir a diferentes niveles en el metabolismo de ARN, incluyendo splicing, poliadenilación, estabilidad, localización y transporte del ARN mensajero del núcleo al citoplasma. La proteína Mip6 (MEX67-interacting protein 6) es una proteína con dominios de unión a ARN, que interacciona físicamente con las proteínas Mex67 y Sus. Mip6p posee tres dominios de unión a ARN en su extremo N-terminal. A través de distintas aproximaciones se ha tratado de identificar las dianas (RNA unidos) a estos RBP o identificar RBP que se unen a secuencias regulatorias conocidas. En general, los análisis genéticos indican que los RBP deben regular numerosos RNA ya que la pérdida de un RBP presenta mayores efectos que cepas desreguladas de ARNm conocidos. En nuestro laboratorio estamos realizando la caracterización funcional de Mip6. Hemos identificado que la localización de Mip6 varía en base a cambios de temperatura. Por otro lado, el dominio C-terminal es necesario para la interacción con Mex67 además de ser imprescindible para el paso de Mip6 entre el núcleo y el citoplasma. Además, el mutante mip6 presenta resistencia a estrés severo por temperatura. Por último, estamos estudiando cuáles son los ARN diana de Mip6 bajo condiciones de estrés como choque térmico. Se presentarán los últimos resultados más relevantes obtenidos en la caracterización de Mip6. P6r-28 RNAi-mediated silencing of plekstrin in murine erytrholeukemia cell differentiation Vanessa Fernández Calleja, Pablo Hernández 2, Jorge B. Schvartzman 2, Dora B. Krimer 2 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 2 Department of Cellular and Molecular Biology, Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES Murine erythroleukemias are experimental models that have been successful to comprehend tumour leukemogenesis mechanisms and normal erythropoiesis development. Friend murine erythroleukemia cells (MEL) derived from transformed erythroblasts immortalized by the Friend complex virus were used in our lab to study the cell differentiation blockade that characterize these cell lines. We established resistant cell lines (MEL-R) that unlike their parental line, are refractive to inducers of differentiation (Fernández et al., Leukemia Research (2008) 32, 2; SpringerPlus (203) 2, 392). Recent results using next generation sequencing recognized 487 genes that increased their expression greater than two fold between MEL undifferentiated and MEL-R cells. Among these genes we identified pleckstrin (plek), a protein implicated in signaling and cytoskeletal function. Cytoskeletal proteins undergo reorganization during terminal erythropoiesis and are involved in erythroid cell enucleation. After validation of the pleck results by real-time PCR and Western, we generated shrnas encoded by mammalian vectors that were used to transfect MEL cells and down-regulate plek in transient or stable transfectants. We analyzed also the effect of plek in early and late stages of cell differentiation. P6-29 Accurate chromatin structure is required for proper Top2 and condensin activities during chromosome decatenation and centromere biorientation Marina Murillo-Pineda, Marta Clemente-Ruiz, Fernando Monje Casas 2, Félix Prado Velasco CABIMER-CSIC, Sevilla, ES, 2 CABIMER-USE, Sevilla, ES The structural organization of chromosomes is essential for their correct function and dynamics during the cell cycle. The assembly of DNA into chromatin provides the substrate for topoisomerases and condensin, which introduce the different levels of superhelical torsion required for DNA metabolism. In particular, Top2 and condensin are directly involved in both the resolution of precatenanes that form during replication and the formation of the intramolecular loop that detect tension at the centromeric chromatin during chromosome biorientation. Here we show that histone depletion activates the spindle assembly checkpoint (SAC) and impairs sister chromatid decatenation, leading to chromosome missegregation and lethality in the absence of the SAC. We demonstrate that histone depletion impairs chromosome biorientation and activates the Aurora-dependent pathway, which detects tension problems at the kinetochore. Interestingly, SAC activation is suppressed by the absence of Top2 and Smc2, an essential component of condensin. Indeed, smc2-8 suppresses catenanes accumulation, mitotic arrest and growth defects induced by histone depletion at semi-permissive temperature. Therefore, our results reveal the importance of chromatin structure for the function of Top2 and condensin during precatenanes resolution and centromere biorientation, two essential processes for chromosome segregation. P6-30 Cambio de accesibilidad de la subunidad ribosomal 40S al IRES del virus de la hepatitis C tras la unión del mir-22 Ascensión Ariza-Mateos, Jordi Gómez Instituto de Parasitología y Biomedicina López - Neyra, CSIC - CIBER de enfermedades hepáticas y digestivas (CIBERehd), Armilla, Granada, ES El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva perteneciente a la familia Flaviviridae. El genoma comprende una región 5 no traducible que funciona como un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), incluyendo el codón de inicio de la traducción AUG, esencial para la síntesis de proteínas independiente de la estructura 5 -cap. Se ha demostrado que la enzima RNasa P, que procesa los precursores de los trna del hospedador, puede cortar in vitro el genoma del RNA de HCV en el IRES cerca del triplete iniciador AUG, indicando la presencia de una estructura tipo-trna en el IRES. Otros grupos y nosotros hemos demostrado previamente que el IRES de HCV reside en la región genómica -570 en una conformación cerrada que es capaz de cambiar a una conformación abierta por la unión de moléculas del microrna-22 en su flanco 5. En este estudio hemos probado cuantitativamente la capacidad del mir- 22 para interaccionar con el RNA-HCV tanto en la forma cerrada como en la abierta, determinando dos nuevos sitios de unión en tandem para el mir-22 en el flanco 3 del IRES. 48

Granada 204 Pósters Los efectos de unión del mir-22 en el flanco 3 del IRES fueron determinados mediante RNasa específicas de simple y doble cadena (RNasa A, T y V) y agentes químicos (DMS). Sin embargo, la accesibilidad a la estructura tipo-trna por las RNasa que reconocen específicamente este regiones tipo-trna (RNasas P y Z) fue afectada, al igual que la accesibilidad por la RNasa H, indicando que la unión del mir-22 en el flanco 3 del IRES provoca un cambio conformacional local en torno al codón de inicio de traducción, que podría afectar directamente a la unión de las subunidades ribosomales. Mediante ensayo de unión de la subunidad ribosomal 40S en presencia de mir-22, se pudo concluir que el mir-22 se une al RNA-HCV en ambos flancos del IRES-HCV y que esto podría ser un proceso sincrónico que induce un cambio conformacional global de la estructura del IRES afectando directamente a la unión de la subunidad ribosomal 40S. P6-3 The inhibitory state of the T-cell receptor alpha enhancer in T lymphocytes is not reverted upon T cell helper differentiation of CD4 + lymphocytes Úrsula Angulo Urrecho, Beatriz del Blanco, Jennifer López Ros, Cristina Hernández-Munain Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Armilla, ES The T-cell receptor α (Tcra) enhancer (Eα) is essential for Tcra locus germline transcription and primary Vα-to-Jα recombination during thymocyte development. We found that Eα is inhibited late during thymocyte differentiation and in peripheral T cells, indicating that it is not required to drive transcription of rearranged Tcra genes. Eα inactivation in peripheral T lymphocytes resulted in the lost of the enhancer-dependent chromatin modifications and in the disruption of functional long-range enhancer-promoter interactions as a consequence of the downregulation of E2A and GATA-3 in mature T cells. Since GATA-3 is essential for T helper (Th) 2 differentiation and has a role in regulatory T cell (Treg) maintenance and function, we hypothesized that Eα function might be re-activated during CD4 + cell differentiation. We have differentiated T cells in vitro to different Th subsets: Th, Th2, Th7 and Treg to evaluate whether there is a direct correlation between Eα activity and Gata3 and Tcfe2a transcription. Our results indicate that the high induction of GATA-3 transcription observed during Th2 differentiation is not sufficient to activate Eα activity in peripheral CD4 + T cells and that other factors are clearly required for enhancer function in these cells. Further experiments are currently being performed to extend these analyses during CD8 + T lymphocyte activation. P6-32 Regulación epigenética del promotor PRDMβ en mieloma múltiple Raquel Romero García, Laura Gómez Jaramillo, Francisco Mora López, Antonio Campos Caro Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES Objetivo: El gen PRDM codifica para un factor de transcripción clave en el proceso de diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas (CP). Existen dos isoformas de PRDM, denominadas PRDMα y PRDMβ, que se originan a partir de dos promotores diferentes. La proteína PRDMα actúa como represor de la transcripción mientras que se desconoce la función de la isoforma truncada PRDMβ aunque se ha observado que, en las líneas celulares de mieloma estudiadas, su expresión está aumentada con respecto a la de la proteína normal. Por ello, hemos estudiado si el estado de metilación de su promotor está relacionado con la expresión en mielomas. Metodología: Se han utilizado líneas celulares de mieloma que expresan la isoforma PRDMβ (U266, NCI-H929) y otras líneas de linfocitos que no la expresan (Daudi, Raji) así como poblaciones celulares de linfocitos B y de CP normales y patológicas derivadas de pacientes con mieloma. Se modificó el DNA genómico con bisulfito y se analizó el grado de metilación de las diferentes CpG por secuenciación. También se trataron las células con 5-Aza-2-deoxycytidine, un inhibidor de la metilación del DNA, para analizar, mediante PCR a tiempo real, si había cambios en los niveles de transcripción de PRDMβ. Resultados: Hemos analizado hasta 2 posiciones CpG presentes en el promotor de PRDMβ. Lo más destacado es que la línea celular U266 prácticamente no presenta metilación en ninguna de las CpG, solo en las posiciones CpG 7 y 8 en menos del 25% de los clones analizados. Sin embargo en líneas celulares como Daudi y Raji, así como en linfocitos B y CP normales, se observa un patrón diferente donde las posiciones 4, 5, 6, 9 y 2 están preferentemente metiladas. Para evaluar si la expresión de PRDMβ tiene relación directa con el estado de metilación del promotor, el tratamiento con 5-Aza-2-deoxycytidine mostró un aumento en los niveles de transcritos de PRDMβ en cultivos de células Namalwa pero no con U266. Conclusión: Estos datos indican que la metilación de las CpG en el promotor es, al menos, uno de los mecanismos por el cual se regula la expresión de PRDMβ. P7. Regulación metabólica P7- Profiling of promoter occupancy by SND coactivator in human hepatoma cells via ChIP-chip analysis Enara Arretxe, Begoña Ochoa, Sandra Armengol, Sarai Mula, Yolanda Chico, María José Martínez Department of Physiology, University of the Basque Country Medical School, UPV/EHU, Leioa, ES Staphylococcal nuclease domain-containing protein (SND), also known as p00 coactivator or Tudor-SN, is an evolutionarily conserved multifunctional protein implicated in a variety of cellular processes, including adipogenesis, stress response, gene transcription, RNA metabolism and cancer progression. Originally identified as a transcriptional coactivator of EBNA-2, we now know that SND can modify the expression of several genes by interacting with transcription factors STAT5, STAT6, c-myb and PPARγ. However, the relevance of SND as a transcriptional coactivator remains unresolved and no comprehensive picture of potential SND target genes has yet been reported. Interestingly, we found overexpression of SND in human hepatoma cells exposed to TNFα through NF-κB binding to gene promoter, supporting a role for SND in inflammation signalling pathways. To gain insight into the role of SND in gene transcription regulation, we performed genome-wide search for endogenous SND binding sites by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip analysis on HepG2 human hepatoma cells left untreated and upon TNFα stimulation. We found a set of 645 target genes in basal cells and 822 in cytokine-treated cells, of which 28 genes were exclusively bound in the treated group. Transcription factor binding site analysis of target genes at CEAS server revealed enrichment of motifs for established partners and novel transcription factors involved in stress response (i.e. HSF and ATF), viral infection (i.e. STAT and STAT3), cell proliferation (i.e. MEIS/AHOXA9, E2F, E2F and PAX) and metabolic regulation (i.e. p300 and CREB). Gene Ontology classification of SND target genes by DAVID showed enriched ontologies such as regulation of information molecules, metabolism, organ morphogenesis and central nervous system development. Major differences of TNFα-treated vs untreated human hepatoma cells were a few ontologies involving phospholipid metabolism, heat shock protein binding and the TGF-β signaling pathway. Supported by Basque Government grants IT-336/0 and S-PE3UN39. 49

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P7r-2 La sensibilidad del metabolismo de poliaminas a la privación de glucosa es mayor en células de neuroblastoma con amplificación de n-myc Mª Victoria Ruiz Pérez, José Luis Urdiales, Francisca Sánchez Jiménez, Miguel Ángel Medina Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga, Málaga, ES El oncogén n-myc es capaz de potenciar la síntesis de poliaminas, moléculas esenciales para la proliferación celular cuyos niveles están elevados en muchos tumores. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente en niños, muestra amplificación de n-myc en el 25% de los casos, y dicha amplificación está asociada a mala prognosis y escaso éxito del tratamiento. En este trabajo, hemos evaluado la relevancia de la amplificación de n-myc sobre varias características metabólicas de células de neuroblastoma humano, y hemos analizado los efectos de la inhibición de la glucólisis sobre el metabolismo de poliaminas en dichas células. Los resultados de este trabajo muestran una relación previamente desconocida entre la glucólisis y los niveles de poliaminas: la inhibición de la glucólisis desencadena eventos de señalización que llevan a una disminución de los niveles proteicos de N-Myc y a un descenso de la expresión de la enzima ornitina descarboxilasa y de los niveles de poliaminas, todo ello acompañado por un bloqueo del ciclo celular. Esta relación entre la privación de glucosa y la deficiencia de la síntesis de poliaminas, y su aparente relación con la amplificación de n-myc, podría ser explotada para el desarrollo de nuevas terapias antitumorales contra tumores que presenten amplificado este oncogén. P7m-3 (R7-5) Modulación del metabolismo de los cuerpos lipídicos hepáticos de ratón en la endotoxemia Lino Arisqueta Herranz, Hiart Navarro-Imaz, Yuri Rueda Estévez, Olatz Fresnedo Aranguren Departamento de Fisiología, UPV/EHU, Leioa, ES Durante la respuesta de fase aguda frente a patógenos se producen cambios específicos en el metabolismo de los lípidos que conducen a la denominada lipemia de la sepsis. Esta adaptación se considera parte de la respuesta inmune innata ya que favorece la eliminación del torrente sanguíneo de endotoxinas como el lipopolisacárido (LPS). La lipemia se origina, entre otros, como consecuencia de adaptaciones hepáticas que afectan al ensamblaje de VLDL, un proceso complejo en el que intervienen los cuerpos lipídicos (CL). Este estudio se propuso con el fin de analizar en qué medida el metabolismo de los CL hepáticos está implicado en la respuesta inmune innata. Para ello se administró LPS a ratones salvajes y ratones deficientes en leptina (ob/ob), cepa que presenta esteatosis hepática (acumulación de CL) y mayor sensibilidad a la endotoxemia. Uno de los efectos más destacables del tratamiento con LPS es una menor acumulación de CL hepáticos. El segundo es la reducción en el contenido de colesterol esterificado (CE) de estos CL. La cuantificación de la actividad de enzimas implicados en el metabolismo de lípidos neutros así como de la expresión de proteínas relacionadas condujo a proponer dos mecanismos para explicar estas adaptaciones: uno dependiente de la modulación de actividades enzimáticas y otro dependiente de la movilización de lípidos. Estudios con cultivos primarios de hepatocitos confirman que las citoquinas sobresecretadas tras el tratamiento con LPS participan en la regulación diferencial de las actividades triglicérido hidrolasa y diglicérido hidrolasa hepáticas, lo que probablemente conduce a una canalización de sustratos hacia la biogénesis de VLDL. Este mecanismo conduciría a la menor acumulación de CL en el hígado. Por otro lado, el menor contenido de CE de los CL se debe probablemente a una mayor secreción de colesterol al sinusoide mediada por sobreactivación del receptor nuclear LXR. En los ratones ob/ob estos mecanismos se encuentran atenuados, lo que podría condicionar una respuesta innata deficiente. Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-0) y UPV/EHU (UFI/20). P7m-4 Es la resistencia a la insulina dependiente de la remodelación del tejido adiposo? Martín Alcalá Díaz-Mor, Julio Sevillano Fernández, Jimena Pita Santibañez, Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles 2, María del Pilar Ramos Álvarez, Marta Viana Arribas Departamento de Química y Bioquímica, Facultad de Farmacia, Universidad San Pablo CEU, Madrid, ES, 2 Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad San Pablo CEU, Madrid, ES Introducción: La capacidad de expansión del tejido adiposo ante la acumulación de grasa en la obesidad es clave en el desarrollo de patologías asociadas. Sin embargo, se desconoce la cronología en la aparición de los cambios estructurales del tejido adiposo, así como la implicación de cada uno en la pérdida de funcionalidad. Objetivos: Determinar el papel de la remodelación de la matriz extracelular y la infiltración de macrófagos en el estroma vascular sobre la resistencia a la insulina (RI) en el tejido adiposo visceral (TAV) de ratones obesos. Métodos: Ratones CBL57/6J de 3 semanas de edad fueron divididos en 2 grupos: un control (C), alimentado con dieta estándar y un grupo alimentado con dieta rica en grasa (O), durante 4 y 28 semanas. Se analizaron parámetros metabólicos, proteínas de la cascada de señalización de la insulina en TAV y se analizó su estructura por inmunohistoquímica. Resultados: Se observó RI en el grupo O desde la semana 4. A pesar de que ya existía una infiltración de macrófagos inducida por HIF-α, todavía no se vieron cambios ni en el acúmulo de colágeno ni en la señalización de la insulina en el TAV. Sin embargo, en la semana 28, la RI en los animales O se caracterizó por la disminución en el receptor de insulina y el aumento en la fosforilación de p38 en el TAV. A nivel estructural, además de la infiltración de macrófagos, se observó un marcado acúmulo de colágeno total, tipo I y tipo III. Conclusiones: Durante el desarrollo de obesidad, la llegada de macrófagos parece ser uno de los primeros cambios en el TAV, aunque no es suficiente para bloquear allí la señalización de la insulina. Esta pérdida de funcionalidad del tejido se ve aumentada por los cambios estructurales posteriores, principalmente mediados por el acúmulo de colágeno. P7-5 The lack of GlnB and YejB compensates the detrimental effect of spot deletion in E. coli cells expressing wild type rela Manuel Montero, Goizeder Almagro, Alejandro Viale, Angel Sevilla 2, Manuel Cánovas 2, Cristina Bernal 2, Ana Belén Lozano 2, Francisco José Muñoz, Edurne Baroja-Fernández, Javier Pozueta-Romero Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), Mutilva, Navarra, ES, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus de Excelencia Internacional Regional Campus Mare Nostrum, Universidad de Murcia, Murcia, ES In Escherichia coli, intracellular ppgpp content in response to nutritional deficiency is controlled by the balanced action of RelA (synthetase I) and the dual-function (synthetase/hydrolase) SpoT. Generally ascribed to the detrimental effects of high (p)ppgpp levels, the co-existence of spot null (DspoT) with rela proficient alleles has been considered synthetically lethal. However, in a recent work we have reported the construction of DspoT mutants in a rela + background accumulating nearly wild type (WT) ppgpp levels when cells were cultured on a rich complex medium. Sequencing of the genomes from various selected DspoT clones identified in all of them suppressor mutations located in rela. In two of them, additional inactivating mutations were found in glnb and yejb, two genes that have not been characterized as genetically linked to rela. To know whether mutations resulting in the total abolishment of the glnb and yejb genes could compensate the detrimental effects of spot deletions in E. coli in this work we obtained multiple independent DspoTDglnB and DspoTDyejB clones. Importantly, these clones expressed WT RelA, displayed a nearly WT growth phenotype, and accumulated nearly 50

Granada 204 Pósters WT ppgpp and glycogen contents when cultured in a rich complex medium. None of these mutants, however, could grow on glucose minimal medium. The overall data (a) show that different mutations other than in rela can be selected in E. coli cells compensating the detrimental effects of spot deletion, and (b) point to the occurrence in E. coli of mechanism(s), other than SpoT-mediated ppgpp hydrolytic breakdown, that prevent ppgpp over-accumulation. To our knowledge this is the first report describing the production of spot null mutants of E. coli expressing WT RelA. P7-6 (R7-6) The development of insulin resistance can be regulated by the levels of G-protein coupled Receptor kinase 2 in myeloid cells Rocío Vila-Bedmar, Elisa Lucas, Marta Cruces-Sande, Hanneke Willemen 2, Annemieke Kavelaars 3, Cobi Heijnen 3, Cristina Murga, Federico Mayor Jr. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación Sanitaria La princesa, Madrid, ES, 2 Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL, 3 Department of Symptom Research, Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, US Introduction: G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) is a kinase classically involved in the modulation of the signalling mediated by many G protein-coupled receptors (GPCR), but it has also been recently described to contribute to the development of insulin resistance (IR) and fat mass accretion in vivo. Accordingly, our previously published studies have described that lowering GRK2 levels can confer protection against the development of IR in different mice models of this condition, and also that this kinase plays an important role in the regulation of obesity and energy expenditure. In this regard, obesity, which is currently considered as a chronic low-level inflammatory disease, is a risk factor for the development of IR. Particularly, macrophages that infiltrate adipose tissue during obesity have been recognized to have a key contribution to this metabolic disorder. In this work, we evaluate the potential effect of changes in the levels of GRK2 specifically in macrophages to the insulin resistant and obese phenotype observed after a high fat diet (HFD) in mice. Materials and Methods: The specific contribution of GRK2 in macrophages/myeloid cells in the context of IR and obesity has been assessed in a mice model with a specific partial deletion of GRK2 in myeloid cells, including microglia/macrophages/granulocytes (LysM- GRK2+/-). These mice were fed a HFD and insulin and glucose tolerance as well as insulin signalling in different tissues were explored. Results: Our study showed that LysM-GRK2+/- mice are partially protected against diet induced obesity (DIO), with no differences in food intake, and display lower fasting plasma glucose levels after high fat feeding. Moreover, HFD-fed LysM-GRK2+/- mice show improved glucose tolerance and a more potent activation of insulin signals in different insulin target tissues, and are protected against the development of non alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Conclusion: Our data establish that changes in GRK2 levels specifically in myeloid cells can regulate the development of diet-induced IR. P7r-7 (R7-8) Hacking the master transcriptional program of prostate cancer metabolism Lorea Valcárcel, Veronica Torrano, Ana Rosa Cortazar, Sonia Fernández Ruiz, Patricia Zuñiga García, Mar Lorente 2, Alfredo Caro Maldonado, Natalia Martín Martín, Amaia Zabala, Pere Puigserver 3, Brett Carver 4, Paolo Pinton 5, Guillermo Velasco 2, Ana Maria Aransay 6, Arkaitz Carracedo 7 CIC biogune, Derio, ES, 2 Biochemistry and Molecular Biology Department, School of Biology, Complutense University, Madrid, ES, 3 Department of Cancer Biology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, US, 4 Surgery, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, US, 5 Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine Section of General Pathology, University of Ferrara, Ferrara, IT, 6 CIC biogune, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (Ciberehd), Derio, ES, 7 CIC biogune, Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Derio, ES Prostate cancer (PCa) is the third most common tumor found and the third leading cause of cancer death in men in Europe. The main driver of PCa is the PI3K pathway, which regulates cell proliferation, survival and importantly, metabolism. The availability of a mouse model that is faithful to the human disease is an invaluable tool for the study of this type of cancer. While much is known about the signaling requirements of PCa, the metabolic needs of this tumor remain vastly obscure. We have previously demonstrated that in order to meet their energetic demands, cancer cells reprogram their metabolism through alterations in the transcriptional landscape. We have approached the study of cancer metabolism starting from a systematic analysis of transcriptional regulators that potentially contribute to the metabolic switch. To define these factors, we have applied metaanalysis constrains that ensure the selection of relevant candidates, approach that has been shown to be valid to identify novel metabolic cues. We have focused on metabolic transcriptional regulators that i) are altered in a significant proportion of publicly available databases, and ii) that show association with disease-free survival and metastatic disease. This approach allowed us to unveil the tumor suppressive potential of the transcriptional co-activator PGCA. Comparative analysis of PGCA expression in melanoma, where it has been shown to be up-regulated, has led us to define the appropriate expression level for gene re-expression in prostate cancer. PGCA re-expression leads to a tumor-suppressive reverse Warburg effect in vitro and in vivo, reflected as an increase in mitochondrial oxidative metabolism and decrease in lactate production as a consequence of the transcriptional regulation. Our data suggest that PGCA is at the top of prostate cancer metabolic reprogramming and that this event is of importance for the development of metabolic therapeutic strategies. P7-8 La osteopontina provoca cambios en el metabolismo lipídico y biliar en hígado de ratón Maitane Núñez, Beatriz Gómez-Santos, Olatz Fresnedo, Patricia Aspichueta University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES La osteopontina (OPN) participa en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Diferentes estudios han relacionado el aumento de OPN con la aparición de hepatocarcinoma pero se desconoce si este aumento juega algún papel importante en el metabolismo hepático y en la reprogramación metabólica, característica de este tipo de enfermedades. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar si el aumento de OPN provoca cambios en el metabolismo lipídico y biliar en ratón. Para ello, se administró OPN recombinante (ropn) vía intravenosa en dos días alternos. Se determinaron parámetros corporales, niveles de lípidos y expresión de genes relevantes. Los resultados muestran que la administración de ropn provoca un aumento de la masa hepática sin cambios de la corporal. Estos cambios están asociados a una remodelación lipídica, con un aumento en el contenido en colesterol libre (CL) y sin modificaciones en el colesterol esterificado (CE), diglicérido (DG) y triglicérido (TG). Paralelamente ocurre un descenso en la expresión de genes implicados en la síntesis de CE, el transporte de CL y en el metabolismo de lipoproteínas. La administración de ropn induce cambios en el metabolismo de glicerofosfolípidos, aumentando el contenido hepático de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE) y disminuyendo la expresión de genes relacionados con las vías de síntesis de PC. Estas modificaciónes del metabolismo de CL y PC pueden estar directamente relacionadas con un descenso en la expresión de genes 5

Pósters XXXVII Congreso SEBBM implicados en el transporte de sales biliares y en la regulación de la síntesis de ácidos biliares. En conclusión, la exposición a OPN produce una remodelación del metabolismo lipídico y biliar en el hígado de ratón. Subvencionado por GV (IT-336-0) y UPV/EHU (UFI/20). P7-9 Adaptation of T lymphocyte effector function to metabolic stress Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López-Rodríguez, José Aramburu Beltrán Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, ES In the last years it has been reported that nutrients and metabolism play essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T lymphocytes exhibit specific metabolic features depending on their activation and polarization stage, being this crucial for their role in adaptive immune responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and polarization towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it is both a main fuel for ATP production and a source of building blocks for macromolecule biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial variations in glucose concentration at inflammation sites and tumors, which raises the question of how glucose fluctuations affect their capacity to maintain ATP and appropriate responses to cytokines. We have explored the response of T lymphocytes to glucose deprivation during cytokine-driven polarization. Our results show that T lymphocytes can resist substantial glucose restriction and maintain ATP levels by arresting their proliferation. Results indicate that expression of different cytokines is differentially sensitive to glucose deprivation, and we are currently analyzing the contribution of various energy-regulatory pathways to cytokine expression. Our results suggest that local nutrient conditions during T lymphocyte activation can have a significant impact in their function over polarizing pressure from cytokines. Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF202-36535 to CL-R; SAF20-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730, 22530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR60, 204 SGR53). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-203-062670. P7m-0 Alterations of cellular metabolism of podocytes in a lipotoxic context Adriana Izquierdo Lahuerta, Cristina Martínez-García, T-K Yeo 2, Yurena Vivas, Patricia Corrales, Sheldon Chen 2, Gema Medina-Gómez Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES, 2 Division of Nephrology/ Hypertension, Northwestern University, Chicago, US In last decades there has been a rapid change in life style that has led to an alarming increase in the prevalence of obesity and obesityassociated complications. Obese patients are at increased risk of developing hypertension, heart disease, insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes and renal disease. The excess of calories are stored as triglycerides in adipose tissue, and also accumulate ectopically in other organs, including kidney, which contributes to the damage through a toxic process named lipotoxicity. Recently, evidences suggest that renal lipidic accumulation leads to glomerular damage and more specifically, whether this accumulation produces podocyte dysfunction. The aim of this study was to analyze the mechanisms underlying the process of lipotoxicity in podocytes, key cells in glomerular filtration barrier maintenance. We have used conditional immortalized cultured mouse podocytes treated with different doses (00, 500 and 750 μm) of palmitic acid (PA) and oleic acid (OA), for 24h. PA treatment produced an intracellular accumulation of lipid droplets and abnormal glucose and lipid metabolism. Such accumulation led to an inflammation associated to an increased phosphorylation at Ser 307 of the IRS-. Also, a lack of response to Akt phosphorylation via mtor in the presence of insulin was observed. Furthermore, this fatty acid produced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress as well as rearrangements of the actin cytoskeleton. These effects were not observed with treatment OA. It suggests that saturated fatty acids promote insulin resistance and disturb the podocyte metabolism, playing an important role in the renal dysfunction in the context of lipotoxicity. Acknowledgements: Fundación de la SEEN, MINECO (BFU202-33594), CAM (S200/BMD-2423) y Ayudas a la Movilidad 202 URJC. P7r- Mitochondrial ATP governs neuronal response to NMDA, and is maintained by calcium activation of ATP-Mg/Pi carrier, SCaMC-3 Carlos Rueda, Javier Traba, Ignacio Amigo, Irene Llorente-Folch, Beatriz Pardo, Araceli del Arco, Jorgina Satrustegui Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-CSIC- UAM, Universidad Autónoma de Madrid - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras CIBERER - Instituto de Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz-IIS-FJD, Madrid, ES Glutamate excitotoxicity is caused by sustained activation of neuronal NMDA receptors causing elevations in cytosolic Ca 2+ and Na +, activation of PARP-, fall in cytosolic NAD + and ATP, and delayed Ca 2+ deregulation (DCD) followed by neuronal death. Mitochondria undergo early changes in membrane potential during excitotoxicity but their relation with these events is still controversial. SCaMC-3/Slc25a23 is a mitochondrial ATP-Mg/Pi carrier which transports ATP or ADP in a strictly Ca 2+ -dependent way and is a candidate to play a role in the initial mitochondrial response to NMDA. We have studied the early responses to NMDA in cortical neurons including a rapid increase in oxygen consumption rate (OCR) which was found to be due to Ca 2+ -dependent upregulation of respiration. NMDA exposure resulted in a rapid fall in mitochondrial ATP ([ATP] mit ) in SCaMC-3 KO neurons, but not in control neurons, in which Ca 2+ -dependent adenine nucleotide uptake through the carrier maintained [ATP] mit. The fall in [ATP] mit in the KO neurons was associated with a blunted increase in respiration and a further decrease in cytosolic ATP levels, indicating that maintenance of [ATP] mit was required to upregulate OXPHOS upon NMDA exposure. The rapid fall in [ATP] and blunted respiratory response were prevented by PARP- inhibitors, mit indicating a rapid NMDA-induced PARP- activation as cause. A second consequence of the lack of SCaMC-3 was an early appearance of DCD. This was associated with reduced Ca 2+ retention capacity (CRC) and increased Ca 2+ - dependent swelling in mitochondria from SCaMC-3 KO mice incubated with physiological millimolar concentrations of ADP or Mg-ATP, suggesting that failure to maintain matrix AdN is responsible for both the impaired CRC in mitochondria and earlier neuronal DCD. SCaMC-3 KO neurons were more vulnerable to glutamate excitotoxicity in vitro and SCaMC-3 KO mice were more susceptible to kainate-induced seizures, showing that SCaMC-3 is an early player in excitotoxic cascade both in vitro and in vivo. P7r-2 G protein-coupled receptor kinase 2 regulates: The development of non-alcoholic fatty liver disease M Cruces Sande, R Vila Bedmar, E Lucas, HL Willemen 2, CJ Heijnen 3, A Kavelaars 3, Á González-Rodríguez 4, ÁM Valverde 4, F Mayor Jr, C Murga Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC, Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2 Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL, 3 Department of Symptom Research, Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson 52

Granada 204 Pósters Cancer Center, Houston, Texas, US, 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Barcelona - Instituto de Investigaciones Biomédicas `Alberto Sols CSIC-UAM, Madrid, ES Background: Insulin resistance (IR) and obesity are major health problems and important risk factors for the development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), a disease spectrum that includes hepatic steatosis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis, and cirrhosis. G proteincoupled receptor kinase 2 (GRK2), first identified as a G protein-coupled receptor regulator, has been recently described to play a relevant role in IR and obesity in vivo. GRK2 hemizygous (GRK2+/-) mice are protected against high fat diet (HFD)-induced systemic and hepatic insulin resistance and obesity. However, the effect of GRK2 in the development of HFDinduced NAFLD has not been studied. Materials and methods: Given the lack of a potent and specific GRK2 inhibitor, we used a global tamoxifen (Tx)-inducible murine model in which GRK2 levels are decreased once HFD-induced IR has been established. Also, a long term chronic state of IR and obesity was triggered by feeding wild type (WT) and GRK2+/- mice a 32 week-long HFD. To discriminate the effects of the differential body weight gain, we fed mice with a methionine-choline deficient diet (MCD), which induces NAFLD independently of fat mass accretion. Results: Systemic insulin sensitivity was preserved after decreasing GRK2 levels in the middle of a high fat feeding using tamoxifen, and accordingly enhanced insulin signaling was observed in the liver of HFD-fed Tx-induced GRK2-/- mice. Moreover, hepatic steatosis, a hallmark of NAFLD, was decreased in these mice. Also, different signs of inflammation present in WT mice were absent in Tx-induced GRK2-/- animals. Nevertheless, after a long term HFD we found no differences in steatosis between WT and GRK2+/- mice, despite the decrease in body weight gain and liver weight. Finally, we found an increase in GRK2 protein levels in the liver of mice fed a MCD, a well established model of NASH, similar to what is detected during HFD feeding in WT animals, and we are further characterizing this model. Conclusion: Taken together, these results suggest a role for GRK2 in the establishment and development of NAFLD. P7r-3 Obesity related cardiac hypertrophy is modulated by G protein-coupled receptor kinase 2 Elisa Lucas, María Jurado_Pueyo, Rocío Vila-Bedmar, Juan J. Lazcano 2, Javier Gómez-Ambrosi 3, Gema Frühbeck 3, Javier Díez 4, Cristina Murga, Federico Mayor Jr. Departamento de Biología Molecular y Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC) - Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, ES, 3 Metabolic Research Laboratory, Universidad de Navarra, CIBERobn, Pamplona, ES, 4 Division of Cardiovascular Sciences, Centre for Applied Medical Research (CIMA) and Department of Cardiology and Cardiovascular Surgery, University Clinic, University of Navarra, Pamplona, ES The heart is a constitutive energy-demanding organ. Although mitochondrial lipid oxidation is the principal energy source in the healthy heart, the maintenance of glucose utilization is necessary for normal cardiac function. Nevertheless, alterations in cardiac energy metabolism downstream neurohormonal stimulation play a crucial role in the pathogenesis of heart failure (HF). One biomarker molecule upregulated in human and several animal models of HF is G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2), a kinase originally discovered to regulate G proteincoupled receptor desensitization. Previous studies have described the potential role of GRK2 as a direct modulator of insulin signaling in several tissues in addition to its classical role in cardiac βar signaling regulation which can also have an indirect effect on insulin signaling. Since we have observed that GRK2 levels are increased in the hearts of high fat diet (HFD)-fed animals and also in ob/ob mice, we aimed to explore the effect of lowering GRK2 levels during HFD feeding in order to study whether GRK2 could be a good target to ameliorate the detrimental consequences of HFD in the heart. Given the lack of selective GRK2 pharmacological inhibitors, we have used GRK2 hemizygous mice (GRK2+/-) as a model to assess the effects of a sustained systemic inhibition of GRK2 on cardiac tissue. We find that, after 2 weeks of HFD, insulin-dependent cardiac responses are impaired in young wild type (WT) while preserved in GRK2+/- mice. Besides, adult 0 month-old WT mice fed a HFD for 32 weeks presented cardiomyocyte hypertrophy and pathological cardiomegaly, while in HFD-fed GRK2+/- animals heart size was indistinguishable from that of chow-fed mice. In addition, we detected that cardiac tissue of GRK2+/- adult mice fed with standard diet shows enhanced cardiac insulin sensitivity compared with aged-matched WT hearts, and displays features of non-pathological mild cardiac hypertrophy. These results highlight the importance of maintaining GRK2 levels under a certain physiological level to preserve insulin-mediated cardioprotection. P7-4 Increased expression of carnitine palmitoyltransferase A in rat ventromedial hypothalamus produces hyperphagia, overweight and alters the hyphothalamic lipidomic profile Joan Francesc Mir, Paula Mera, Gemma Fabrias 2, Fina Casas 2, Sofia Costa 2, Minéia Weber, Raquel Fucho, María Calderón-Domínguez, Harald Petri 3, Núria Casals 4, Laura Herrero, Dolors Serra Department of Biochemistry, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB) and CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBEROBN), Instituto Carlos III, Barcelona, ES, 2 Department of Biomedicinal Chemistry, Institute of Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC)/CSIC, Barcelona, ES, 3 UniQure, Amsterdam, NL, 4 Universitat Internacional de Catalunya, Sant Cugat del Vallés, ES Lipid metabolism in hypothalamic neurons is a key pathway in food intake modulation and glucose homeostasis. Carnitine palmitoyltransferase (CPT) A is the rate-limiting enzyme in mitochondrial fatty acid oxidation and it has recently been proposed as a crucial mediator of fasting and ghrelin orexigenic signaling. However, the relationship between changes in CPTA activity and the intracellular downstream effectors that contribute to appetite modulation in hypothalamus is not fully understood. The aim of our study is to analyze the peripheral and central effect of an increased CPTA expression in the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH). We used adeno-associated virus (AAV) to express a permanently active form of CPTA (malonyl-coa-insensitive CPTA, here CPTAM) in rat VMH. We have observed that permanent activation of CPTA in VMH led to hyperphagia, overweight, hyperglycemia and the development of insulin resistance. These effects seem to be triggered by changes in the expression of neurotransmitter transporters and hypothalamic changes in structural and bioactive complex lipids such as ceramides and phospholipids.these data highlight the role of ventromedial CPTA in the modulation of food intake and consequently glucose homeostasis. P7-5 Modulación de la composición lipídica de cuerpos lipídicos en hígado de ratón. Efecto de una dieta rica en grasa Hiart Navarro Imaz, Ibone Labiano Ciriza, Yuri Rueda Estévez, Lino Arisqueta Herranz, Olatz Fresnedo Aranguren Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES Los cuerpos lipídicos (CL) citoplasmáticos son estructuras especializadas en el almacenaje y movilización de lípidos que se acumulan en una 53

Pósters XXXVII Congreso SEBBM amplia diversidad de situaciones fisiológicas y patológicas. La dieta y los condicionantes metabólicos afectan a los niveles hepáticos de CL. Se han realizado diversos estudios proteómicos con la finalidad de establecer en qué modo se regula la composición de este orgánulo pero se desconocen las adaptaciones cuantitativas en el lipidoma. En este estudio describimos cómo afecta una dieta rica en grasa a la composición de los CL hepáticos en ratones salvajes y deficientes en leptina (ob/ob), que presentan esteatosis hepática por hiperfagia. Es destacable la similitud en la composición lipídica (triglicéridos, diglicéridos, colesterol libre y esterificado, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina) entre las dos cepas analizadas alimentadas con una dieta control. La característica más remarcable de los CL aislados de hígado de animales tratados con dieta rica en grasa es la disminución en el contenido de colesterol esterificado (CE). Esta disminución es muy marcada en los ratones ob/ob y va acompañada de modificaciones relevantes en los parámetros bioquímicos plasmáticos e índice hepático. El conjunto de resultados indica que la mejora de la función hepática de los ratones obesos alimentados con la dieta rica en grasa podría estar vinculada a una mejora en la gestión del colesterol acumulado en los CL hepáticos. El incremento en el transporte reverso de colesterol podría jugar un papel central en esta adaptación. Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-0) y UPV/EHU (UFI/20). P7m-6 (R7-7) Alteraciones en la vía tumoral Wnt/β-catenina en linfocitos circulantes inducidas por metabolitos relacionados con la diabetes Valle Montalvo-Romeral, María Gutiérrez-Salmerón, Ana Chocarro- Calvo 2, José Manuel García-Martínez, Antonio De La Vieja 3, Custodia García-Jiménez Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2 Ludwig Institute for Cancer Research - University of Oxford, Oxford, UK, 3 Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda (Madrid), ES Introducción: La población diabética presenta un riesgo incrementado de desarrollar ciertos cánceres tejido-específicos. Los cánceres asociados a diabetes suelen presentar alteraciones en la vía Wnt/β-catenina. Nuestro grupo ha demostrado que la acumulación nuclear de β-catenina, efector de la señalización tumoral por Wnt, sólo se produce en presencia de alta glucosa (hiperglucemia). Hipotetizamos que otros metabolitos característicos de la diabetes pueden inducir alteraciones en proteínas relacionadas con la vía Wnt/β-catenina cooperando con la alta glucosa para favorecer la aparición del fenotipo tumoral. Los linfocitos circulantes expresan los componentes de la vía Wnt y en pacientes diabéticos están expuestos a dichos metabolitos, por tanto planteamos la posibilidad de encontrar en ellos, marcadores tempranos de riesgo de cáncer asociado a diabetes. Objetivo: Identificar alteraciones moleculares en la vía Wnt/β-catenina en linfocitos circulantes humanos producidas por el ambiente metabólico de la diabetes. Metodología: Se usan linfocitos humanos procedentes de voluntarios sanos y la línea tumoral inmortalizada de linfocitos Jurkat. Se compara la respuesta de los linfocitos sanos y los tumorales a estímulos metabólicos característicos de la diabetes. Los resultados se analizan por western-blot, qpcr y citometría. Resultados: Se observan cambios en los componentes de la señalización tumoral Wnt/ β-catenina a nivel de expresión génica (p300), niveles proteícos (β-catenina) y funcionalidad (exhibición de receptor LRP6) en linfocitos humanos sanos que difieren de la respuesta observada en linfocitos tumorales (Jurkat). Conclusiones: Es posible detectar cambios a distintos niveles de la vía Wnt/β-catenina en linfocitos humanos expuestos al ambiente metabólico de la diabetes. Nuestros resultados sugieren la posibilidad de usar linfocitos circulantes de pacientes diabéticos para la detección precoz de marcadores predictivos de tumores asociados a diabetes. P7-7 Activación de blancos metabólicos río abajo de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) hepática por la hormona tiroídea (T 3 ) Luis Videla Cabrera, Romina Vargas Villagrán, Pamela Cornejo Zamorano 2, Virginia Fernández Arancibia Facultad de Medicina Universidad de Chile, Santiago, CL, 2 Faculad de Medicina Universidad Diego Portales, Santiago, CL La administración de T 3 activa a la AMPK hepática como respuesta adaptativa frente a condiciones de alta demanda energética. El hígado de ratas macho Sprague-Dawley tratadas con 0, mg T 3 /kg presentó un aumento (P<0,05) en los niveles de pampk (ELISA) y de sus blancos acetil-coa carboxilasa (pacc) y proteína de unión al elemento de respuesta a AMP-cíclico (pcreb) (Western blot), con mayor expresión de los ARNm de ACC, CREB y del receptor activado por proliferadores peroxisomales-γ coactivador-α (PGC-α)(qPCR). Conjuntamente, T 3 aumentó (P<0,05) la expresión proteica y de ARNm de la carnitina palmitoil transferasa-α (CPT-α), acil-coa oxidasa (ACOX) y acil- CoA tioesterasa 2 (ACOT2) hepáticas, con mayores niveles séricos de β-hidroxibutirato. Se concluye que la fosforilación de AMPK hepática por T 3 se asocia a la mayor activación de sus blancos directos ACC, CREB y PGC-α conduciendo a un incremento en la capacidad de oxidación de ácidos grasos, asociado al aumento en las enzimas relacionadas CPT-α, ACOX y ACOT2, y evidenciado por la respuesta cetogénica consecuente. La activación de la AMPK constituiría un mecanismo de señalización clave para la regulación de la dinámica energética hepática en apoyo de los mecanismos de preacondicionamiento, protección y/o reparación otorgados por T 3. Financiado por FONDECYT 20034. P7r-8 Mathematical modelling of the amyloidogenic pathway during Alzheimer s disease in the context of the lipid membrane Guido Rosales Santos, Mario Díaz 2, Néstor V. Torres Grupo de Biología de Sistemas y Modelización Matemática. Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y Genética. Universidad de La Laguna, La Laguna, ES, 2 Laboratorio de Fisiología y Biofísica de Membranas, Departamento de Biología Animal y Edafología y Geología, La Laguna, ES Alzheimer s disease (AD) is the most common cause of dementia. There is over 30 million people affected worldwide, and this number is increasing every year. There is not therapy for AD. It is caused by the neuronal death produced mainly by the toxic effect of amyloid-β peptides accumulation, after the precursor protein (APP) is cleaved by a specific beta secretase (BACE). APP and BACE proteins are located in the cellular membrane of neurons. Specifically, both APP and BACE reside within detergent resistant domains called lipid rafts. It is known that alterations in the lipid composition of lipid rafts play an important role in the disease, being this issue a very important aspect for finding a cure to AD. Systemic approach to the study of AD let us to quantify the importance of each component of the causal pathway to produce amyloid-β and its relationship with the lipid composition of the membrane. The objective of this work is to use mathematical modeling to understand the role of the membrane composition on AD and try to find an effective therapy for this disease. This work was funded by research Grants from Spanish MINECO (BIO20-29233-C02-02 and SAF200-224-C02-0) and from Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información (Ref. Project PIL207090 and PIL20700). GS is recipient of a fellowship from Fundación Cajacanarias para posgraduados. 54

Granada 204 Pósters P7r-9 (R7-) Adaptation of T lymphocyte effector function to metabolic stress Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López Rodríguez, José Aramburu Beltrán Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud, Universidad Pompeu Fabra, Barcelona, ES In the last years it has been reported that nutrients and metabolism play essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T lymphocytes exhibit specific metabolic features depending on their activation and polarization stage, being this crucial for their role in adaptive immune responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and polarization towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it is both a main fuel for ATP production and a source of building blocks for macromolecule biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial variations in glucose concentration at inflammation sites and tumors, which raises the question of how glucose fluctuations affect their capacity to maintain ATP and appropriate responses to cytokines. We have explored the response of T lymphocytes to glucose deprivation during cytokine-driven polarization. Our results show that T lymphocytes can resist substantial glucose restriction and maintain ATP levels by arresting their proliferation. Results indicate that expression of different cytokines is differentially sensitive to glucose deprivation, and we are currently analyzing the contribution of various energy-regulatory pathways to cytokine expression. Our results suggest that local nutrient conditions during T lymphocyte activation can have a significant impact in their function over polarizing pressure from cytokines. Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF202-36535 to CL-R; SAF20-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730, 22530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR60, 204 SGR53). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-203-062670. P7-20 Implicación de FAT/CD36 en la modulación del metabolismo lipídico hepático Larraitz Fernández-Ares, Daniela Mestre, Juan Luis García- Rodríguez, Igor Aurrekoetxea, Xabier Buqué, Patricia Aspichueta Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Bilbao, ES CD36 es una glicoproteína que en la enfermedad del hígado graso no alcohólica se sobreexpresa en la membrana plasmática del hepatocito donde juega un papel clave en la entrada de AG, siendo su destino metabólico desconocido. El objetivo fue investigar la implicación de CD36 en la modulación del metabolismo lipídico hepático e investigar el mecanismo. Se infectaron hepatocitos de ratón C57/6J con adenovirus sentido para CD36 y LacZ. Se analizó la incorporación de sustratos radiactivos en los principales lípidos hepáticos, y en los metabolitos solubles ácidos secretados. Se investigó la expresión de proteínas implicadas en estrés de retículo endoplásmico, actividad mtorc y se analizó su relación con el proceso de autofagia en presencia de inhibidores de la función lisosomal. La sobreexpresión de CD36 aumentó la incorporación de oleato en triglicéridos y en los metabolitos solubles ácidos secretados y de acetato en fosfolípidos. Además, provocó el incremento en p-s6 y la inhibición del flujo de autofagia, compatible con el incremento en la actividad mtorc. La inhibición de la función lisosomal disminuyó los niveles de p-s6 y revirtió la secreción de solubles ácidos y la esterificación lipídica. Como conclusión, la sobreexpresión de CD36 en el hepatocito induce una remodelación metabólica ligada a la activación de mtorc. El incremento en la síntesis de novo de fosfolípidos y esterificación de triglicéridos sugiere una mayor actividad de fosfolipasas lo que podría inducir mtorc. P7-2 Regulation of hypoxia response by NO in pluripotent stem cells Estefanía Caballano Infantes, Ana B. Hitos 2, Irene Díaz 2, Gladys M. Cahuana 2, Abdelkrim Hmadcha 3, Fran Martín 4, Bernat Soria 5, Juan R. Tejedo 4, Francisco J. Bedoya 4 Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) y Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 2 CABIMER, Universidad Pablo de Olavide, y Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), Sevilla, ES, 3 CABIMER, Fundación Progreso y Salud, y Red de Terapia Celular (Tercel), Sevilla, ES, 4 CABIMER, Universidad Pablo de Olavide; Red de Terapia Celular (Tercel), y CIBERDEM, Sevilla, ES, 5 CABIMER, Fundación Progreso y Salud; Red de Terapia Celular (Tercel), y CIBERDEM, Sevilla, ES The expansion of pluripotent cells (ESCs and ipscs) under conditions that maintain their pluripotency is necessary to implement a cell therapy program. Previously, we have described that low nitric oxide donor diethylenetriamine/ nitric oxide adduct (DETA-NO) added to the culture medium, promote the expansion of these cell types. The mechanisms involved in this response are not yet known. We present evidences that when ESC and ipscs are grown under normoxia in presence of Nitric Oxide (NO) triggers a similar response to hypoxia, thus maintaining the pluripotency. We have studied the stability of protein HIF-α (Hypoxia Inducible Factor) in presence of low NO. Because of the close relationship between hypoxia, metabolism, mitochondrial function and pluripotency we have analyzed by qrt-pcr the expression of genes involved in glucose metabolism and the glycolytic pathway such as: HK2, LDHA and PDK; besides other gene targets of HIF. We further analyzed the expression of genes involved in mitochondrial biogenesis such as PGCα, TFAM and NRF and we have observed that low NO maintains the same expression that in hypoxia. The study of the mitochondrial membrane potential using MitoTracker dye, showed a slight decrease in the membrane potential in cells with NO in normoxia, this indicated that NO might decrease the mitochondrial function. We will analyze other metabolic parameters, to determinate if this molecule regulates mitochondrial function and mimics Hypoxia Response. The knowledge of the role of NO in the Response to Hypoxia and the mechanisms that help to maintain self renewal in pluripotent cells grown under normoxia, can help to the design of culture media where NO could be optimal for stem cell expansion in the performance of future cell therapies. Subvencionado por: - Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-20-65-900000) - Junta de Andalucía (CTS- 727/20) P7-22 Papel de los factores de transcripción E2F y E2F2 en la esteatosis hepática Daniela Mestre Congregado, Igor Aurrekoetxea, Larraitz Fernández-Ares, Xabier Buqué, Ainhoa Iglesias 2, Ana Zubiaga 2, Patricia Aspichueta Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES, 2 Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES La enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA) se desarrolla en un 80% de pacientes obesos, lo que se considera un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (CHC). En el desarrollo de EHGNA y de CHC se producen importantes adaptaciones metabólicas. E2F, regulador del metabolismo oxidativo y cuya ausencia confiere resistencia a obesidad, es junto con otros factores de transcripción E2F importante regulador del ciclo celular. El objetivo fue definir el papel de los factores de transcripción E2F y E2F2 en la instauración de hepatoesteatosis. 55

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Se utilizaron ratones macho de 3 meses E2F -/-, E2F2 -/- y sus controles. Se indujo esteatosis administrando una dieta rica en grasa (HFD) durante 0 semanas. Se analizó la secreción hepática de triglicéridos (TG), el contenido hepático en TG y su modulación en condiciones pro-esteatóticas como la inhibición de la secreción de VLDL y el ayuno de 24 horas. La HFD indujo esteatosis en ratones control. En ratones E2F2 -/- el contenido hepático en TG era el 40% del de los ratones control y permaneció invariable tras la administración de la HFD. Sin embargo, el almacén de TG inducido por el ayuno de 24 horas era superior en los ratones E2F2 -/- que en los E2F - /- y sus controles. En animales E2F -/-, la HFD provocó el incremento de TG, aunque no llegó a los valores de sus controles, lo que es atribuible al aumento en la secreción de TG como lo demuestra su inhibición farmacológica. En conclusión, los factores de transcripción E2F y E2F2 están implicados en la instauración de la hepatoesteatosis por HFD. E2F ejerce un efecto sobre la secreción hepática de TG y E2F2 podría estar implicado en los procesos de síntesis de novo de lípidos. Gobierno Vasco IT-336-0. P7-23 Papel de la osteopontina en la modulación del metabolismo hepático durante el envejecimiento Beatriz Gómez-Santos, Maitane Núñez-García, Olatz Fresnedo, Patricia Aspichueta Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES El envejecimiento está caracterizado por una pérdida progresiva de la integridad fisiológica. La osteopontina (OPN) es una glicoproteína multifuncional que muestra expresión incrementada en patologías derivadas del síndrome metabólico y en varios tipos de cáncer, siendo la prevalencia de estas patologías mayor con la edad. Nuestro objetivo fue determinar si OPN modula el metabolismo lipídico hepático durante el envejecimiento y definir el mecanismo implicado. Se emplearon ratones deficientes en OPN (OPN-KO) y sus controles, de 3 y 0 meses de edad. Se estudió el contenido lipídico hepático y actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de triglicéridos y colesterol. Se analizaron parámetros séricos y rutas de señalización ligadas a procesos de síntesis y oxidación de lípidos. Los resultados mostraron que en animales control los niveles séricos de OPN aumentaban con la edad. La deficiencia en OPN durante el envejecimiento resultó en un aumento del índice hepático, del contenido hepático en colesterol esterificado y triglicérido así como en glicerofosfolípidos. Los cambios en las actividades enzimáticas analizadas no parecían ser causantes del incremento lipídico observado en los ratones OPN-KO de mayor edad, en los que la actividad mtorc estaba disminuida. Se observó mayor expresión proteica de la acetil-coa carboxilasa y menor porcentaje de su forma fosforilada compatible con su mayor actividad. Como conclusión, OPN modula el metabolismo lipídico hepático durante el envejecimiento. Su falta resulta en el incremento del almacén lipídico, debido, al menos en parte, al incremento de la síntesis de novo. Subvencionado por GV (IT-336-0) y UPV/EHU (UFI/20). P7-24 Dimorfismo sexual en el efecto de la rosiglitazona sobre la lipotoxicidad del músculo cardíaco asociada a una dieta hiperlipídica Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá-Thorbrügge, Bel M. Galmés- Pascual, Francisco J. García-Palmer, Isabel Lladó, Ana M. Proenza, Magdalena Gianotti Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES La ingesta de dietas hiperlipídicas (HL) provoca una hiperlipidemia que conlleva una mayor captación de ácidos grasos por parte del músculo cardíaco. La situación de lipotoxicidad que se genera se acompaña de resistencia a la insulina, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y disminución de la utilización de glucosa, que puede conducir a una pérdida de la capacidad contráctil y, por ende, a un fallo cardíaco. La rosiglitazona (Rsg) es una tiazolidinediona que aumenta la sensibilidad a la insulina y disminuye la lipotoxicidad periférica, a través de la mejora de la función mitocondrial. En estudios previos hemos demostrado la existencia de un dimorfismo sexual en la función y biogénesis mitocondriales, lo cual nos lleva a plantearnos si existen diferencias entre sexos en el efecto de la Rsg sobre la lipotoxicidad cardíaca asociada a la administración de una dieta HL durante 5 semanas en ratas. La Rsg (00mg/kg dieta) se administró a la mitad de los animales durante las dos últimas semanas del tratamiento. En respuesta a la Rsg, las hembras responden de manera más acusada a la disminución de triglicéridos en el miocardio provocada por la HL, lo que se acompaña de una mayor activación de la vía de señalización a la insulina y el consiguiente incremento en la utilización de la glucosa. Paralelamente, las ratas hembra tratadas con Rsg muestran un mayor metabolismo mitocondrial y un menor estrés oxidativo en el miocardio. En conclusión, la Rsg promueve una mayor movilización lipídica en el músculo cardíaco de las hembras, mejorando del fenotipo lipotóxico típico que es característico de la cardiomiopatía diabética. Financiado por MECD (SAF200-2792, una beca FPU), CAIB (PCTIB-3/20, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P7r-25 (R7-3) Protein Kinase A-dependent phosphorylation of the ATPase Inhibitory Factor (IF) determines the metabolic status of the cell Javier García-Bermúdez, María Sánchez-Aragó 2, José M. Cuezva 2 Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES Mitochondria play key roles in cellular metabolism and bioenergetics and are the master regulators in the execution of cell-death mediating intracellular signaling by calcium and reactive oxygen species (ROS). During the last years, the interest in mitochondria has experienced a boost because of its involvement in a growing number of human diseases displaying very different phenotypes. In mitochondria, the H + - ATP synthase is the rotatory engine of the inner membrane that utilizes the proton gradient generated by respiration for the synthesis of most cellular ATP in normal aerobic differentiated cells. The expression level of the nuclear encoded inhibitor peptide called ATPase Inhibitory Factor (IF) regulates the synthase activity of the H + -ATP synthase, being a central player in controlling the flux of ATP being produced by oxidative phosphorylation (OXPHOS). IF is a very short half-life protein that is highly overexpressed in most prevalent human carcinomas. The overexpression of IF in cancer promotes an increase in the flux of aerobic glycolysis and a ROS-mediated signal that results in retrograde signaling to the nucleus to activate programs of cell survival. However, the mechanisms that regulate the expression and activity of IF remain elusive. Herein, we demonstrate in human cancer cell lines that IF is regulated by posttranslational mechanisms. We show that the phosphorylation of IF on a serine residue by cyclic AMP-dependent protein kinase A (PKA) prevents its binding to the H + -ATPsynthase complex. Moreover, de-phosphorylated IF is strongly bound to the complex and exerts an enhanced inhibition on its enzymatic activity. Supported by SAF203-4945-R. 56

Granada 204 Pósters P7-26 Dimorfismo sexual en la respuesta de la paraoxonasa a la suplementación de una dieta hiperlipídica con rosiglitazona Bel M. Galmés-Pascual, Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert- Roig, Magdalena Gianotti, Ana M. Proenza, Francisco J. García- Palmer, Isabel Lladó Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES La ingesta de dietas hipercalóricas induce inflamación y estrés oxidativo y aumenta el riesgo cardiovascular. Estudios previos han puesto de manifiesto que las ratas hembra presentan un menor daño oxidativo tisular como resultado de una mayor capacidad antioxidante y funcionalidad mitocondrial. El enzima paraoxonasa (PON) es el principal responsable de la función antiaterogénica de las HDL, viéndose alterada su actividad por la dieta. La rosiglitazona (Rsg), un fármaco que mejora el perfil de sensibilidad insulínica, estimula la función mitocondrial y reduce el estado de inflamación. El objetivo fue determinar las diferencias entre sexos en la respuesta a la Rsg de marcadores de estrés oxidativo y, en particular, de la actividad y los niveles séricos de la PON. Para ello se utilizaron ratas macho y hembra Wistar de 22 semanas, alimentadas durante 6 semanas con una dieta hiperlipídica (22,5% de materia grasa). Durante las últimas dos semanas de tratamiento, la mitad de los animales recibieron la misma dieta suplementada con Rsg (00mg/kg dieta). La Rsg mejoró el perfil de sensibilidad a la insulina, aumentó la capacidad antioxidante total y disminuyó la peroxidación lipídica sérica de manera más acusada en las ratas macho que en las hembras. La suplementación de la dieta hiperlipídica con Rsg aumentó la expresión hepática de PON en las ratas macho, mientras que en las hembras produjo un aumento de la actividad del enzima. Estos resultados ponen de manifiesto un dimorfismo sexual en los efectos de la Rsg a nivel de protección antioxidante que podrían condicionar el riesgo cardiovascular en función del sexo. Estudio fi nanciado por MECD (SAF200-2792, una beca FPU), CAIB (PCTIB-3/20, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P7-27 (R7-4) Dimorfismo sexual en la función y biogénesis mitocondrial del tejido adiposo retroperitoneal en respuesta a la suplementación con rosiglitazona en ratas alimentadas con dieta hiperlipídica Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert-Roig, Bel M. Galmés-Pascual, Magdalena Gianotti, Francisco J. García-Palmer, Isabel Lladó, Ana M. Proenza Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental i Ciències de la Salut, IUNICS, Universitat de les Illes Balears. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES La población mitocondrial del tejido adiposo blanco retroperitoneal (TABr) de ratas hembra es menos diferenciada y más abundante que la de los machos. Este dimorfismo sexual se atenúa en respuesta a la alimentación con una dieta hiperlipídica (HL). El objetivo de este estudio fue determinar si la rosiglitazona (Rsg), un fármaco agonista del PPARγ que mejora la capacidad oxidativa y aumenta el contenido mitocondrial en los adipocitos, ejerce efectos dependientes del sexo en el TABr. Se utilizaron ratas Wistar de ambos sexos alimentadas durante 6 semanas con dieta HL que, a dos semanas del sacrificio y para la mitad de los animales, se suplementó con Rsg (00mg/kg dieta). En muestras de TABr se determinaron parámetros marcadores de función, biogénesis, dinámica y capacidad oxidativa mitocondriales, así como mecanismos antioxidantes. La suplementación con Rsg provocó un aumento de la masa y la dinámica mitocondriales en ambos sexos, aunque mucho más acentuado en los machos. Sin embargo, la capacidad oxidativa únicamente se incrementó en las hembras. La respuesta antioxidante, en cambio, se estimuló en igual medida en ambos sexos. En conclusión, el TABr parece responder de manera diferencial según el sexo a los efectos inductores de la biogénesis de la Rsg, aumentando la proliferación mitocondrial en las ratas macho y la diferenciación mitocondrial en las hembras. Esta respuesta heterogénea podría deberse a la acción de las hormonas sexuales, de acuerdo con resultados previos obtenidos in vitro que muestran un efecto opuesto del estradiol y de la testosterona sobre la biogénesis mitocondrial. Estudio fi nanciado por MECD (SAF200-2792, una beca FPU), CAIB (PCTIB-3/20, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P7-28 La suplementación de una dieta hipercalórica con rosiglitazona mejora la sensibilidad hepática a la insulina en las ratas macho pero no en las hembras Bel M. Galmés-Pascual, Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá- Thorbrügge, Ana M. Proenza, Magdalena Gianotti, Isabel Lladó, Francisco J. García-Palmer Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears, IdISPa - Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES La ingesta de dietas hipercalóricas conduce a resistencia a la insulina y a acumulación de grasa en el hígado. La rosiglitazona (Rsg) es un agonista de PPARγ que mejora la sensibilidad a la insulina de forma directa en el tejido adiposo blanco y, gracias a la secreción de adiponectina por los adipocitos, en el músculo y en el hígado. El objetivo fue determinar el efecto de la suplementación con Rsg de una dieta hipercalórica sobre la sensibilidad hepática a la insulina y a la adiponectina en ratas macho y hembra. Se utilizaron ratas Wistar alimentadas durante 6 semanas con una dieta hiperlipídica rica en sacarosa (HLS, 22,5% materia grasa). Durante las dos últimas semanas de tratamiento, la mitad de los animales se alimentaron con la misma dieta HLS suplementada con Rsg (00mg/kg). Se recogieron el suero, los depósitos grasos y el hígado. En el hígado se determinó la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y se analizó la vía de señalización de la insulina mediante la activación de Akt, y la de la adiponectina a través de AdipoR2 y la activación de AMPk. En el suero se determinaron los niveles de adiponectina. En comparación con las ratas hembra, la adiposidad y los niveles de triacilglicéridos hepáticos fueron más elevados en los machos HLS y disminuyeron de forma más acusada por efecto de la Rsg. Además, en las ratas macho, la Rsg mejoró la tolerancia a la glucosa aumentando los niveles séricos de adiponectina y los hepáticos de AdipoR2 e incrementando la activación de Akt. La disminución de la actividad fosfoenolpiruvato carboxiquinasa indica una menor producción hepática de glucosa. Por el contrario, en las ratas hembra los efectos de la dieta HLS y de la suplementación con Rsg fueron más moderados. En conclusión, la mayor acumulación ectópica de grasa en el hígado de los machos por la alimentación con la dieta HLS altera su sensibilidad a 57

Pósters XXXVII Congreso SEBBM la insulina de forma más acusada que en las hembras, alteraciones que se revierten, al menos en parte, por la Rsg. Estudio fi nanciado por MECD (SAF200-2792, una beca FPU), CAIB (PCTIB-3/20, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea Una manera de hacer Europa. P7-29 (R7-2) Mitochondrial glutamate transporter (Aralar): influence over myelin formation and dopamine metabolism Beatriz Pardo, Irene Llorente-Folch, Sara Laine-Menéndez, Carlos B. Rueda, Paloma González-Sánchez, Inés Juaristi, Paula Martínez-Valero, Araceli del Arco 2, Jorgina Satrústegui Dept. de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC, CIBER de Enfermedades Raras, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2 Área de Bioquímica, Centro Regional de Investigación Biomédica (CRIB), Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla - La Mancha, Toledo, ES The mitochondrial transporter of aspartate-glutamate Aralar/AGC is a regulatory component of the malate-aspartate shuttle, mainly expressed in neurons. Aralar-deficiency in mouse and human causes a shutdown of brain shuttle activity and global cerebral hypomyelination (OMIM ID # 62949) associated with a drastic drop in brain aspartate and N-acetylaspartate (NAA) levels. Aralar-knockout (Aralar-KO) mice show deficits in motor coordination, ataxia, hyperactivity, anxiety-like behaviour and hyperreactivity (a phenotype very similar to what is observed in the human patients). In Aralar-KO mice, the striatum is the brain region most affected in terms of size, amino acid and monoamine content. We find a fall in DA and in vesicular monoamine transporter-2 (VMAT2) levels which causes an increase both in non-vesicular dopamine and dopamine turnover (DOPAC/dopamine ratio) through MAO activity. Our results suggest that Aralar-deficiency results in a failure to produce mitochondrial NADH and to an increase of ROS in the cytosol causing a fall in VMAT2 and GSH/GSSH ratio in striatum. Aralar-hemizygous (Aralar-HT) mice, with half-a-dose of Aralar and decreased NAA, have also a heightened DOPAC/DA ratio with oxidative stress via MAO and increased sensitivity to amphetamine; as well as a delayed postnatal myelination. NAA is one of the most concentrated metabolites in human and mice brain, but the physiological functions served by NAA remain controversial. NAA is proposed to be involved in providing acetyl CoA needed for oligodendrocyte maturation and postnatal myelin synthesis, neuronal osmoregulation and energy metabolism. These data make further the point about the putative relevance of NAA in higher brain functions and control of behavior.the correlation between reduced NAA, hypomyelination and DA dysfuntion is relevant because its involvement in neurological and psychiatric human diseases and needs to be further investigated and discussed. P7-30 Detección temprana del daño oxidativo en pacientes hipercolesterolémicos: efectos del tratamiento con estatinas Lidia López López, Sandra Tavárez Alonso, Ana Martín Vega, Eulalia Alonso Iglesias Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES Numerosas evidencias clínicas y experimentales indican que las alteraciones en el balance oxidativo están implicadas en la instauración y progresión de las patologías de RCV como la hipercolesterolemia, y que parte de los efectos pleiotrópicos de las estatinas en esta patología se relacionan con sus beneficios sobre el estrés oxidativo. Entre los marcadores más recientemente introducidos de peroxidación lipídica se encuentran los 8-isoprostanos, compuestos estables resultantes de la oxidación del ácido araquidónico por radicales libres. Evaluando los niveles de 8-isoprostanos (ELISA) en plasma y orina de individuos control, hipercolesterolémicos e hipercolesterolémicos tratados con estatinas en este trabajo demostramos, tanto que los niveles de 8-isoprostanos pueden ser un marcador temprano de oxidación en humanos hipercolesterolémicos, como que el tratamiento con estatinas se asocia a prevención del daño oxidativo. Los niveles de 8-isoprostanos se elevan significativamente en plasma del grupo hipercolesterolémico (52,08±4,0 vs 39,06±3,7 pg/ml; p=0,06), normalizándose prácticamente por el tratamiento con estatinas (52,08±4,0 vs 4,34±2,5 pg/ml; p=0,04). Los resultados en orina corroboran estas observaciones, sin alcanzar las diferencias significación estadística. De las estatinas evaluadas, la atorvastatina es la que muestra un mejor perfil en la normalización de los niveles de 8-isoprostanos, así como en la reducción del colesterol total. De la comparación de estos resultados con los de otros indicadores de daño oxidativo a lípidos y proteínas, proponemos considerar a los 8-isoprostanos como el indicador más temprano de daño oxidativo en la detección y posterior evaluación del tratamiento con estatinas. Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063. P7-3 Integrando el papel de la resistina en un modelo de riesgo cardiovascular: estudio en ratones ob/ob Ana Martín Vega, Sandra Tavárez Alonso, Lidia López López, Pilar Codoñer Franch 2, Eulalia Alonso Iglesias Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES, 2 Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia; Servicio de Pediatría, HU Dr Peset, Valencia, ES La obesidad es uno de los factores principales de RCV. De origen multifactorial, la acumulación excesiva de grasa en el tejido adiposo promueve la liberación por este órgano endocrino de moléculas inflamatorias y adipoquinas implicadas, por diferentes vías, en las alteraciones metabólicas de la obesidad y en su asociación con el RCV. Para evaluar el papel de la adipoquina resistina en este contexto, hemos cuantificado sus niveles circulantes (Multiplex) y su relación con el estado metabólico (perfil lipídico y resistencia insulínica), el daño oxidativo (8-isoprostanos), la inflamación (IL-6) y el metabolismo de la arginina (óxido nítrico (NO) y poliaminas) en ratones ob/ob, un modelo genético de RCV. Los resultados sobre los niveles de resistina en este modelo de obesidad son contradictorios. Según nuestros resultados, los niveles de resistina en ratones ob/ob son significativamente más altos que en los controles lean (3269±297 vs 352±74 pg/ml; p<0,000), y se correlacionan positivamente con aumentos significativos del índice HOMA (p=0,002), colesterol (p=0,08), TGs (p=0,05), IL-6 (p<0,000), 8-isoprostanos (p=0,003), espermina (p=0,005) y peso de los paquetes grasos (p<0,000). Los niveles de resistina también se correlacionan, aunque de forma inversa, con el descenso en la producción de NO (p=0,003) y el cociente espermidina/espermina (p<0,000). Estos resultados apoyan el papel de la resistina en la RI en este modelo de obesidad, así como los mecanismos propuestos para su actuación que incluirían activación de la respuesta inflamatoria, del estrés oxidativo y descenso en la producción de NO. Los posibles efectos de la resistina sobre el metabolismo de las poliaminas merecen ser analizados. Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063. 58

Granada 204 Pósters P8. Señalización celular P8- (R8-3) Glutaminolisis y mtor: interacción entre el metabolismo y la señalización celular en cáncer Raúl V. Durán Group of Metabolism and Cell Signaling, Institut Européen de Chimie et Biologie VINCO Unit, U96 INSERM, Bordeaux, FR Tradicionalmente se ha contemplado la transformación metabólica de las células cancerígenas como un fenómeno secundario encaminado a abastecer a la célula de la energía necesaria para permitir una rápida proliferación. Sin embargo, en los últimos años esta visión ha cambiado con el descubrimiento de que los genes que codifican para determinados enzimas metabólicos pueden ser considerados como oncogenes o genes supresores de tumor. De esta manera, la transformación metabólica puede localizarse en el origen del cáncer. Esta conclusión lleva a la pregunta de cómo consiguen los cambios metabólicos celulares alterar las rutas de señalización para permitir el crecimiento descontrolado de la célula tumoral. En este sentido, nuestra investigación se centra en el estudio de los mecanismos por los que los nutrientes, en especial los aminoácidos, activan la vía de señalización mtor (mammalian target of rapamycin), un regulador principal del crecimiento celular. Nuestros resultados muestran que la glutamina, un aminoácido crucial para la bioenergética de las células cancerígenas, activa la ruta mtorc (mtor complex ) por medio de su propia degradación a través de la glutaminolisis. La glutaminolisis es la doble desaminación de la glutamina para producir α-cetoglutarato. El α-cetoglutarato intracelular activa a la familia de proteínas PHD (prolyl hydroxylases), necesarias para la activación de mtorc. Por lo tanto, la ruta glutamina/phd/mtorc constituye una cascada de señalización principal en la respuesta celular a la disponibilidad de nutrientes. Tanto la glutaminolisis como la ruta mtorc aparecen activados en una gran variedad de tumores. De esta manera, nuestros resultados suponen un claro ejemplo de cómo el metabolismo alterado de la célula tumoral afecta a procesos de señalización celular, fundamentales para el crecimiento rápido del tumor. La existencia de una relación mecanística entre glutaminolisis y mtorc abre las puertas a futuras investigaciones para determinar si ambos procesos tienen un efecto sinergístico como dianas terapéuticas contra el cáncer. P8r-2 Non-invasive spatio-temporal activation of engineered receptor tyrosine kinases with light Álvaro Inglés Prieto, Eva Reichhart, Karin Schelch 2, Robert Riedler, Michael Grusch 2, Harald Janovjak Institute of Science and Technology Austria, Viena, AT, 2 Institute of Cancer Research, Department of Medicine I, Comprehensive Cancer Center Vienna, Medical University of Vienna, Viena, AT Receptor tyrosine kinases (RTKs) are a large family of cell surface receptors that sense growth factors and hormones and regulate a variety of cell behaviours in health and disease. Contactless activation of RTKs with spatial and temporal precision is currently not feasible. Here, we generated RTKs that are insensitive to endogenous ligands but can be selectively activated by low intensity blue light. We screened lightoxygen-voltage (LOV)-sensing domains for their ability to activate RTKs by light-activated dimerization. Incorporation of LOV domains found in aureochrome photoreceptors of stramenopiles resulted in robust activation of the fibroblast growth factor receptor (FGFR), epidermal growth factor receptor (EGFR) and RET receptor. In human cancer and endothelial cells, light induced cellular signalling with spatial and temporal precision. Furthermore, light faithfully mimicked complex mitogenic and morphogenic cell behaviour induced by growth factors. RTKs under optical control (Opto-RTKs) provide a powerful optogenetic approach to actuate cellular signals and manipulate cell behaviour. P8-3 Critical role of p38mapk in the alternative activation of macrophages Sonsoles Hortelano Blanco, Lidia Jimenez, Sandra Herranz, Alfonso Luque Unidad de Terapias Farmacológicas. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras (IIER), Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, ES Alternative activation of macrophages plays an important role in a range of physiological and pathological processes, including inflammation, wound repair and tissue remodeling as well as parasite clearance and tumor progression. This alternative phenotype, also known as M2 macrophages, is induced by type 2 cytokines such as IL-4. The binding of IL-4 to its receptor leads to activation of two major signaling pathways: STAT-6 and PI3K. However, recent studies have described that p38mapk might play a role in IL-4-dependent signaling in some types of cells. Since IL-4 is one of the most relevant cytokines involved in the alternative activation of macrophages, we investigated whether p38mapk plays a role in the polarization of macrophages. Our results reveal that IL-4 induces phosphorylation of p38mapk in peritoneal macrophages, in addition to STAT-6 and PI3K activation. Furthermore, p38mapk inactivation, by gene silencing or pharmacological inhibition, suppressed IL-4-induced typical M2 markers, indicating the involvement of p38mapk in the signaling of IL-4 leading to M2-macrophage polarization. Moreover, p38mapk inhibition blocked phosphorylation of STAT-6 and Akt, suggesting that p38mapk is upstream of these signaling pathways. Taken together, our results establish a new role for p38mapk during IL-4-induced alternative activation of macrophages. P8r-4 Insights into novel DDR functions of GRK2 and repercussions on cell cycle arrest Adolfo Javier Molejón García, Verónica Rivas Guerrero, Federico Mayor Menéndez, Petronila Penela Márquez Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación Sanitaria La princesa, Madrid, ES DNA Damage Response (DDR) is a complicated and conserved signalling mechanism utilised by cells to repair errors in DNA in order to avoid genomic lesions that may arise from non-pathological origins (DNA replication, oxidative metabolism) or genotoxic insults (radiation, genotoxins). As such, DDR mechanisms exist as an anti-tumourigenic generated from a variety of genomic lesions from point mutations to chromosomal aberrations. Furthermore, defects in DDR signalling are associated to a variety of tumourigenic predispositions such as loss of p53, BRCA or ATM. In order to efficiently orchestrate a DDR response, cells require sensors (MRN, 53BP), signal transducers (ATM/ATR, Chk/Chk2, p53) and ultimately effectors (p2, Puma, Noxa). Depending on the type of signal in a genomically intact cell, the outcome will be either DNA repair and re-entry into cell cycle, or cell cycle arrest via senescence or apoptosis. GRK2, a GPCR Receptor Kinase, has emerging functions outside of its traditional role of phosphorylating GPCR receptors for desensitisation and subsequent internalisation for degradation or receptor recycling. We have recently uncovered that GRK2 is degraded by default during G2/M transition, which allows cell cycle progression. However, upon G2-checkpoint activation GRK2 is stabilized and cell cycle is arrested. In this cellular context, GRK2 helps cells to cope with damage by attenuating the p53 response and the expression of pro-apoptotic factors. We have unveiled evidence of GRK2 further modulating the DDR cascade upstream of p53 in response to acute and chronic genotoxic insults. As such, we suggest a complex intertwinement of GRK2 with ATM wherein GRK2 could be a target of ATM based on structural features and in vitro and in situ phosphorylation assays, while downstream functionality of ATM would be attenuated by GRK2 in a kinase dependent manner. Furthermore, we note an inverse correlation between GRK2 protein levels and degree of senescence in cellular models and physiological settings. In this light, we propose GRK2 59

Pósters XXXVII Congreso SEBBM as a potential therapeutic target owing to novel modulatory functions as well as putative substrate in DDR response. P8-5 Función de β2-quimerina como supresor de tumores en cáncer de mama Her2+ Victoria Casado Medrano, María José Caloca Roldán 2 Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2 CSIC (IBGM), Valladolid, ES Las quimerinas son una familia de proteínas GAP (GTPase activating proteins) que esta formada por cuatro miembros: α-, α2-, β-, y β2- quimerinas. Estas proteínas tienen una estructura característica con un dominio C que une DAG y ésteres de forbol, un dominio GAP que inactiva selectivamente a la GTPasa Rac, y un dominio SH2 N-terminal, solo presente en las isoformas α2- y β2 de las quimerinas. Estas características hacen únicas a las quimerinas dentro de las Rho-GAP y las situa como reguladores clave que conectan la señalización por DAG con la activación de Rac. La hiperactivación de GTPasas de la familia Rho, incluida Rac, es común en cáncer, por lo que a las proteínas inactivadoras de estas GTPasas se las atribuye un posible papel como supresores de tumores. Para comprobar este papel de β2-quimerina en cáncer de mama, hemos generado un modelo de ratón en el que hemos eliminado la expresión de esta proteína en ratones MMTV-ErbB2/Neu, que desarrollan cáncer de mama por la sobreexpresión del protooncogén ErB2/Her2/Neu en el epitelio mamario. Hemos evaluado el efecto de la deficiencia de β2-quimerina sobre el tiempo de latencia, la multiplicidad tumoral, la velocidad de crecimiento de los tumores, el número de lesiones preneoplásicas y la metástasis pulmonar. Nuestros resultados demuestran que la eliminación de β2-quimerina reduce significativamente la latencia en la aparición de tumores de mama y aumenta el número de lesiones preneoplásicas. Sin embargo, no hemos observado diferencias estadísticamente significativas en la multiplicidad o el crecimiento de los tumores en ausencia de β2-quimerina. Para estudiar los mecanismos moleculares regulados por β2-quimerina implicados en la transformación maligna hemos estudiado los niveles de Rac activado y las principales vías de señalización reguladas por el receptor ErbB/Neu (activación de Akt y ERK). En conjunto nuestros resultados indican que β2- quimerina regula los pasos iniciales del desarrollo de los tumores de mama mediados por activación del receptor ErbB2 a través de un mecanismo que implica la activación de la GTPasa Rac. P8-6 (R8-4) ERK5 binds and regulates the androgen receptor in prostate cancer cells: molecular and functional characterization Tatiana Erazo Andrade, Pau Muñoz Guardiola, José Ramón Bayascas, Néstor Gómez, José Miguel Lizcano Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona), ES Prostate cancer is the second commonest cause of cancer related death in men in the western world. Usually, prostate cancer is initially androgendependent so patients are usually treated with androgen deprivation therapy. However, after remission the tumor frequently progresses into a state of castration resistance, and available treatment options are only palliative in most cases. The MAP kinase ERK5 is activated in response to a wide range of growth factors and cellular stresses and controls cell proliferation and progression through the cell cycle, and the ERK5 pathway is associated with poor prognosis of prostate cancer. Here we show that ERK5 interacts with the AR protein in the cytosol of resting cells, and that activation of AR with androgens induces the translocation of both proteins to the nucleus, where they continue to interact with each other. Conversely, specific activation of ERK5 by the upstream kinase MEK5 also induces the nuclear translocation of both ERK5 and AR. We also provide evidences showing a functional link between these proteins. Over-expression of active ERK5 enhances the ligand-dependent trancriptional activity of AR (PSA promoter activity, a specific clinical biomarker for prostate cancer), whereas silencing ERK5 inhibits the AR transcriptional activation in response to androgens. Finally, we tested in prostate cancer cells the compound XMD8-92, a newly sinthetized ERK5 speficic inhibitor. XMD8-92 inhibits cell proliferation and induces cell death in both LnCaP (functional AR) and C4-2 (castrate resistant) cells, whereas inhibition of the ERK/2 pathway using MEK inhibitors had not significative effect. In conclusion, we propose ERK5 inhibiton as a new treatment fort androgen-dependent and castrate-resistant prostate cancers. P8r-7 ABTL082, a novel dual mtorc/2 and dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitor with a novel mechanism of action Ingrid Tatiana Erazo Andrade, José Alfon 2, Mariana Gomez- Ferreria 2, María Salazar 3, Mar Lorente 3, Marc Cortal 2, Guillermo Velasco 3, Carles Domenech 2, José Miguel Lízcano Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, ES, 2 Ability Pharmaceuticals SL, Edifici Eureka, Campus de la UAB Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, ES, 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES ABTL082 is a novel multitarget drug with high efficacy by oral route in mice models of cancer. In vivo ABTL082 induces the regression of tumor volume in xenograft models derived from human lung (A549) and human pancreatic cancer cells (MiaPaca-2), and very recently started a Phase I First in Human Clinical Trial in patients with advanced solid tumors. We have shown that ABTL082 induces the inhibition of two clinically validated targets: mtorc (mtor complex-) and dihydrofolate reductase (DHFR). Despite of this, ABTL082 does not bind any of these proteins, thus its precise mechanism of action remains to be described. Here we show that ABTL082 blocks the proliferation of lung and pancreatic cancer cell lines. ABTL082 induces autophagic cell death, but no apoptosis, and inhibition of fusion of autophagosomes with lysosomes prevents its citotoxicity. We also show that ABTL082 induces the expression of TRB3 (tribbles homologue 3), a known Akt protein inhibitor in both A549 and MiaPaca-2 human cancer cells. Overexpressed TRB3 interacts with Akt and prevents Akt phosphorylation (Ser473) by mtorc2. This, in turn, results in low levels of phosphorylated TSC2 and inhibition of mtorc (ribosomal S6 phosphorylation). Finally, ABTL082-induced mtorc inhibition would render the loss of expression of the Cyclin D, of E2F transcription factor (controlled by Cyclin D) and DHFR (controlled by E2F). Since TRB3 is down-regulated in some tumor types, the induction of TRB3 expression by ABTL082 might account for the anti-tumoral action of this compound. We proposed TRB3 expression levels as a biomarker to monitor the antitumor efficacy of ABTL082 in humans. P8r-8 Role of the APC/C complex mediated degradation of GRK2 in mitosis Clara Reglero, Verónica Rivas, Federico Mayor Jr., Petronila Penela Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Cantoblanco, ES Proteasome-dependent degradation of key kinases represents a major regulatory mechanism in the control of cell cycle. We have recently 60

Granada 204 Pósters reported that timely degradation of GRK2, a serine/threonine G proteincoupled receptor kinase, is part of an intrinsic pathway that ensures cell cycle progression. Besides being a key player in the desensitization of manifold GPCR receptors, GRK2 emerge as a signaling node due to its ability to regulate a variety of signaling proteins and cellular functions. We have previously found that GRK2 protein levels progressively decay during G2/M as a result of the sequential cooperation of the E3 ligases Mdm2 and APC/C. Thus, during G2 the functional interaction of Pin with the CDK2/cyclinA-dependent phosphorylated GRK2 triggers its Mdm2- mediated ubiquitination. At mitosis onset, GRK2 decay is promoted by the APC/C-Cdc20 complex that recognizes a D-Box in GRK2, in a spindle checkpoint-independent manner. It is expected that this tightly regulated degradation of GRK2 will have significant physiological consequences in mitosis. In this regard, recent data of our group have unveiled the functional interaction of GRK2 with regulatory factors involved in cytokinesis. Thus, we have demonstrated that GRK2 is a key modulator of microtubule dynamics through the phosphorylation of the tubulin deacetylase HDAC6. In addition, we have found that GRK2 influences the extent of PI3K activation by a direct interaction with the regulatory subunit p85, which also acts as a scaffold to regulate the Rho-family GTPase Cdc42 and Septins at the cleavage furrow. Our data reveal the presence of GRK2 in the midbody, a structure wherein HDAC6 and p85 are also found. Dynamic changes in the levels and functionality of GRK2 might help to timely activate HDAC6 or/and PI3K in order to orchestrate microtubule dynamics and to recruit/activate factors involved in organizing the contractile ring and setting the symmetry of the division plane. Our results suggest that defective or sustained degradation of GRK2 during mitosis could impair cytokinesis and contribute to polyploidy and chromosomal instability. P8-9 PAR-3 participates in Thy--induced astrocyte migration without affecting polarization Areli Cárdenas, Milene Kong, Alvaro Alvarez, Alejandra Valdivia, Andrew F.G. Quest, Lisette Leyton Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Independencia, CL PAR-3 is an important adaptor protein that participates in polarization of many cell types by forming a complex with PAR-6/aPKC; however, PAR-3 is not part of this complex during astrocyte polarization. We have shown that the neuronal protein Thy- induces astrocyte polarization and migration; however, the signaling mechanisms involved and the role of PAR-3 in these processes have not been completely elucidated. Here, we evaluated whether PAR-3 participates in adhesion, polarization and migration of astrocytes induced by Thy-. To this end, DITNC astrocytes were transfected with PAR-3-specific sirna or sirna control. Then, cells were seeded and treated with Thy--Fc or control TRAIL-R2-Fc. Cell polarity and focal adhesions were assessed by immunofluorescence staining of cells with anti-giantin and anti-vinculin, respectively, and analyzed by confocal microscopy. Cell migration was assessed in wound-healing assays and the cell-free area was calculated after 24h of Thy- stimulation. The polarization of DITNC cells upon Thy- stimulation was not affected by silencing of PAR-3, whereas these cells exhibited longer focal adhesions than control cells either non-stimulated or stimulated with the negative control protein (TRAIL-R2-Fc). Accordingly, astrocytes lacking PAR-3 migrated less than the control cells in the presence of Thy-. Our results implicate PAR-3 in Thy--induced astrocyte migration, but not polarization. Together, these observations suggest a novel role for PAR-3 in cell signaling pathways activated by Thy- in astrocyte migration. Acknowledgements: FONDECYT 34047 (AC), FONDECYT 049 (LL), 30250 (AFGQ); Iniciativas Científi cas Milenio BNI P09-05-F (LL); Anillo ACT (AFGQ). P8-0 The neurosteroid-regulated σ receptor engages NMDA receptor negative control for opioid analgesia Pilar Sanchez Blazquez, Maria Rodriguez-Muñoz, Manuel Merlos 2, Jose Miguel Vela 2, Javier Garzón Instituto Cajal, CSIC, Madrid, ES, 2 Drug Discovery & Preclinical Development, Esteve. Scientific Park of Barcelona, Barcelona, ES The antagonists of the sigma receptor (σr) are of therapeutic interest because these drugs reduce neuropathic pain and enhance mu-opioid receptor (MOR)-mediated analgesia. However, the precise molecular events implicated in the positive effects of these antagonists remain unknown. The present study has identified the σr within the protein assembly, supporting MOR-glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor cross-regulation, in which this receptor couples the negative influence of NMDARs to restrain opioid signalling in response to MOR activation. The σr is a neurosteroid-regulated receptor that associates with NMDAR NR subunits to maintain NMDAR signalling within physiological limits. The exogenous σr ligands likely mimic this physiological regulation through the use of agonists and antagonists to respectively enhance and reduce the ability of morphine-activated MORs to recruit NMDAR activity. Thus, the absence of σrs or σr antagonists disconnects both systems, enhancing morphine analgesia and diminishing the development of tolerance. At the molecular level, σr antagonists through the removal of σrs from their binding to NR subunits promote the entrance of negative regulators of NMDARs, likely Ca2+-CaM, which impair the negative feedback on opioid analgesia and reduce the impact of glutamate in neuropathic pain. Therefore, the negative effects of σr antagonists on NMDAR function alleviate neuropathic pain and also reduce the requirements of opioid receptor occupancy as a suitable adjuvant of opioid analgesia. (Supported by MSC, Plan Nacional Drogas -04 and MINECO, SAF 202-03499). P8- Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila Patricia Rojas Ríos, Isabel Guerrero 2, Acaimo González Reyes 3 Institute of Human Genetics (IGH) mrna Regulation and Development, Montpellier, FR, 2 Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, CSIC/Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, ES, 3 Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES Stem cells are characterised by their undifferentiated state, their potential for self-renewal and their capacity to produce one or multiple types of differentiated cells. These properties sustain homeostasis and repair of adult tissues and open a high expectative about the use of these cells in regenerative medicine. Adult stem cells are found in specialised microenvironments or niches that control their proliferation, self-renewal and differentiation of the progeny. The niches are composed of different support cells and signals like morphogens. The Drosophila ovary is an excellent system to study the molecular mechanisms that operate in stem cell niches because this organ contains a well-defined niche, the Germline Stem Cell (GSC) niche. Our data demonstrate that Hedgehog (Hh) signalling pathway is essential in the niche of the GSCs for their maintenance. The expression of Hh is regulated by Engrailed in a type of support cells of the GSC niche, the Cap Cells (CpCs). Hh is secreted from the CpCs and received by the Escort Cells, another type of niche cell, where the Hh pathway induces the expression of two essential GSC factors, Dpp and Gbb. Interestingly, Hh protein decorates short projections emanating from CpCs that remind to the filopodia described in different tissues of Drosophila larvae called cytonemes. When the Hh signalling is impaired within the niche, wildtype CpCs project longer Hh-coated cytonemes suggesting that the niche senses 6

Pósters XXXVII Congreso SEBBM and responds to changes in Hh signalling. In addition, we have found that the perturbation of the formation and/or dynamic of cytonemes in the niche compromised the GSC self-renewal demonstrating that cytonemes are essential for the maintenance of stem cells. P8r-2 Papel de TCFL5 en el desarrollo tumoral Javier Galán Martínez, Inés Sánchez Gómez, Konstantinos Stamatakis, Núria Gironès Pujol, Manuel Fresno Escudero Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES Las células madre tumorales, también denominadas Cancer Stem Cells (CSC) son parte de la población heterogénea del tumor siendo las responsables del mantenimiento de este, de la recurrencia y de la metástasis. Comprender el papel que desempeñan este tipo de células durante el desarrollo tumoral se ha convertido recientemente en un importante campo de estudio para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Una vía para la obtención de estas CSC es la formación de esferoides multicelulares tumorales (MCTS), un modelo de cáncer in vitro generado a partir de la agregación de células en suspensión. Estudios recientes muestran niveles elevados del factor de transcripción TCFL5 después de la formación de MCTS por la línea celular de cáncer de colon HT-29. El gen TCFL5 codifica para al menos cuatro isoformas de las cuales, de solo dos, se tienen referencias a nivel experimental, denominadas TCFL5 y CHA. TCFL5 presenta la secuencia canónica compuesta por 6 exones mientras que CHA carece del primer exón. Para determinar el papel de estas isoformas en la formación de MCTS y de CSC in vitro se sobreexpresaron las isoformas TCFL5 y CHA en diferentes líneas de cáncer de colon y se estudió el fenotipo tumoral de estas células así como la expresión de marcadores típicos de CSC. Además, se generaron tumores xenoinjertados a partir de estas células para determinar el crecimiento tumoral in vivo. Los resultados obtenidos muestran que, in vitro, las líneas celulares que sobreexpresan CHA presentan un fenotipo más tumoral y mayor expresión de marcadores de CSC que las líneas sobreexpresantes de TCFL5 que presentan el fenotipo opuesto. In vivo, sin embargo, las líneas que sobreexpresan CHA crecieron más lentamente que las TCFL5. P8r-3 Regulation of TtgGHI efflux pump by indole increases antibiotic resistance of Pseudomonas putida DOT-TE Carlos Molina Santiago, Abdelali Daddaoua, Juan Luis Ramos 2 Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Estación Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2 ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES In Gram-negative bacteria, multidrug efflux pumps are responsible for the extrusion of chemicals. Some of these efflux pumps are induced by endogenously produced effectors, while abiotic or biotic signals induce the expression of other efflux pumps. In Pseudomonas putida, the TtgABC efflux pump is the main antibiotic extrusion system and it is modulated by TtgR regulator. The plasmid-encoded TtgGHI efflux pump in P. putida DOT-TE, regulated by TtgV regulator, plays a secondary role in antibiotic resistance in the parental strain; however, its role is critical in isogenic backgrounds deficient in TtgABC. TtgV recognizes indole as effector which is not produced by Pseudomonas species, therefore, the indoledependent antibiotic resistance seems to be part of an antibiotic resistance programme at the community level. Transcriptomic analyses revealed that the indole specific response involves the expression of the TtgGHI pump but also a set of genes involved in iron homeostasis, as well as genes for amino acid catabolism. In a ttgabc-deficient P. putida, background ampicillin and other bactericidal compounds lead to cell death. Co-culture assays of E. coli and P. putida ΔttgABC allowed growth of P. putida mutant in the presence of ampicillin due to the induction of the indole-dependent efflux pump demonstrating that indole acts as an interspecies signalling molecule in antibiotic resistance. P8r-4 Crosstalk between HGF and BMP9 signaling pathways in hepatic progenitor oval cells Annalisa Addante, María García-Álvaro, Nerea Deleyto, Margarita Fernández, César Roncero, Isabel Fabregat 2, Blanca Herrera, Aránzazu Sánchez Instituto de Investigación Sanitaria, Hospital Clínico San Carlos (IdISSC). Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2 Laboratori d Oncologia Molecular, Universitat de Barcelona, Institut d Investigació Biomèdica de Bellvitge, L Hospitalet de Llobregat, Madrid, ES Oval cells constitute a bi-potential progenitor cell population from adult liver. Under chronic liver disease (CLD), they become activated and start to proliferate and differentiate into cholangiocytes and/or hepatocytes to compensate for the cellular loss and maintain liver homeostasis. It is well recognized the critical role of the TGF-b in CLD, but the role of other members of the TGF-b superfamily, the BMPs, is only partly understood. We focused our attention in BMP9, since previous results from our group and others indicated that BMP9 has a pro-tumorigenic action in HCC cells. To study BMP9 role in hepatic progenitor cells, we used an in vitro model of oval cell lines harbouring a genetically inactivated met tyrosine kinase (Met -/- cells) and its control (Met flx/flx cells) that also allow us to explore a possible signaling interaction between HGF and BMP9. Our data show that BMP9 induces canonical and non-canonical signaling pathways in both Met flx/flx and Met -/- oval cells, although Met appears to increase BMP9-induced Smad/5/8 activation. Interestingly, BMP9 decreases oval cell number, effect that is amplified in absence of Met. To elucidate the underlying mechanisms; we investigated a potential effect of BMP9 on apoptotic oval cell death. Our results show that BMP9 elicits a moderate but significant increase in apoptosis, which is more pronounced in Met -/- cells. Furthermore, HGF is able to prevent BMP9 effects in oval cells. All these data suggest that BMP9 is a suppressor (pro-apoptotic) factor in oval cells and they also evidence a novel functional crosstalk between Met/HGF and BMP9 signaling pathways in oval cell survival, with a mechanism that will be discussed. P8r-5 The Calcineurin splicing isoform CnAβ is implicated in early embryonic stem cell differentiation and reduces pathological cardiac hypertrophy Jesús María Gómez-Salinero, María Villalba-Orero, Marina Mercedes-Olañeta, Paula Ortiz-Sanchez, Enrique Lara-Pezzi Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, ES Embryonic stem cells (ESCs) have the ability to proliferate indefinitely in culture, and to differentiate into all embryonic lineages. Although the transcriptional program that coordinates pluripotency has been progressively unveiled during the past few years, the signalling pathways that regulate early differentiation events are not completely understood. We have recently described that CnAβ, an alternative splicing variant of the phosphatase calcineurin, enhances muscle regeneration and improves cardiac function after myocardial infarction. CnAβ lacks the autoinhibitory domain typical of calcineurin, and instead has a unique C-terminal domain with no similarity to any known protein. Unlike other calcineurin isoforms, CnAβ has no impact on NFAT-regulated genes and instead activates the Akt pathway. Interestingly, we have currently determined that CnAβ is 62

Granada 204 Pósters specifically located at the Golgy contrary to other calcineurin isoforms, and that this localization is mediated by its unique C-terminal domain. CnAβ is strongly expressed in stem and progenitor cells, although its role in these cells is unknown. We found that CnAβ downregulation had no effect on ESC pluripotency. However, CnAβ depletion in mescs during the first 48 hours of differentiation specifically affected differentiation towards the cardiac mesoderm lineage promoting hematopoietic differentiation. In contrast, CnAβ overexpression promoted differentiation towards the cardiac mesoderm lineage. Our results suggest that CnAβ regulates mesc differentiation through the control of the Akt/GSK3 signalling pathway. Interestingly, CnAβ knockout mice show increased cardiac hypertrophy in response to trans-aortic banding, whereas transgenic mice overexpressing CnAβ have decreased hypertrophy and improved cardiac function. Together, these results suggest that CnAβ is implicated in early mescs differentiation, and that it reduces pathological cardiac hypertrophy. P8-6 A proteomics strategy reveals novel roles for the protein kinase DYRKA within the nucleus Julia Roewenstrunk, Chiara Di Vona, Eva Borras 2, Eduard Sabido 2, Susana de la Luna Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES, 2 Proteomics Unit, Centro de Regulación Genómica-CRG y Universitat Pompeu Fabra-UPF, Barcelona, ES The protein kinase DYRKA (dual-specificity tyrosine-regulated kinase) is an evolutionary conserved kinase highly sensitive to gene dosage alterations. Reduced levels of DYRKA in individuals due to gene truncation or microdeletions cause microcephaly, intrauterine growth retardation and developmental delay. On the other hand, DYRKA overexpression is associated to some neuropathological traits in Down syndrome. Evidence obtained in different model systems indicates that DYRKA regulates brain growth across evolution, by playing a role in neuron survival and differentiation. These activities have been associated to DYRKA-mediated phosphorylation of mostly cytosolic targets. However, DYRKA is also localized in the nucleus, but information on functional roles for nuclear DYRKA is still pretty scarce. To search for the identity of physiological targets of nuclear DYRKA, we have implemented a quantitative interaction proteomic approach based on DYRKA affinity purification from nuclear extracts followed by label-free quantification mass spectrometry. By using statistical values, we have generated a rankedlist of putative interactors that includes already known DYRKA partners as the scaffold DCAF7 or members of the 4-3-3 family of proteins. To gain insight into the biological role of nuclear DYRKA, we have looked for the enrichment of gene ontology (GO) terms for the proteins found in the screen. A significant enrichment in GO terms associated with RNA splicing, transcription and DNA repair was found. We have validated the interaction of DYRKA with several of its putative targets by direct and reverse co-immunoprecipitation experiments. Moreover, we have generated experimental evidence indicating that some of the DYRKA putative interactors are novel DYRKA substrates. In summary, we have defined a nuclear DYRKA interactome that will be a powerful tool for the characterization of the functional participation of DYRKA in specific nuclear processes. P8-7 (R8-2) Regulation of satellite cell functions in aging Eusebio Perdiguero Santamaría Universidad Pompeu Fabra (UPF), Barcelona, ES Among the principal properties that distinguish adult mammalian stem cells from their more differentiated progeny is the capacity of stem cells to remain in a quiescent state for prolonged periods of time. However, the molecular pathways for the maintenance of stem-cell quiescence remain largely unknown. Recent studies reported that, in skeletal muscle of old mice, the muscle fiber expresses grow factors, driving satellite cells to break quiescence by undergoing proliferation, and this would explain the previously accepted skeletal muscle regenerative decline with aging. A deep analysis of muscle stem cell aging has provided us with a novel vision on why aged muscle stem cells lose their homeostatic quiescent state. In very old, geriatric mice, satellite cells do not undergo a proliferative pathway; instead, they switch to a pre-senescence stage. This switch has dramatic consequences, since it converts the satellite cell reversible G0 arrest into an irreversible G0 arrest that abrogates cell activation upon muscle injury, thus precluding efficient regeneration and stem cell self-renewal in aged mice. We have established that satellite cells from sarcopenic geriatric, unlike those from non-sarcopenic old mice, enter into a point of no-return, and lose their reversible quiescence state in homeostatic conditions. We have also found this loss of quiescence in satellite cells of progeric mice with accelerated aging and in samples from aged humans. Mechanistically, we have found that geriatric and progeric satellite cells express senescence markers like p6ink4a. Indeed, p6ink4a, which is never expressed in adult or old muscle stem cells in homeostatic conditions, becomes de-repressed in geriatric and progeric satellite cells, correlating with loss of reversible quiescence. Genetic silencing of p6ink4a in geriatric and progeric satellite cells reverses G0 irreversible senescence into a G0 reversible quiescence, thus allowing stem cell activation and muscle regeneration in aged mice. Our results further show that in conditions of muscle injury, in which satellite cells need to proliferate extensively to form new myofibers, geriatric satellite cells are unable to proliferate and undergo instead an accelerated entry into a deep senescence state (geroconversion). We propose that satellite cell geroconversion arises from two opposed forces: the proliferative pressure of the damaged muscle local environment and the persistent cell cycle arrest induced by a p6ink4a -regulated Rb/ EF2 anti-proliferative axis on aged satellite cells. P8r-8 Function of C3G as a regulator of cell migration/ invasion and tumour growth Celia Sequera, Neibla Priego, María Arrechederra, Ana Vázquez, Sara Ortiz-Rivero 2, Aránzazu Sánchez, Carmen Guerrero 2, Almudena Porras Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES, 2 Centro de Investigación del Cáncer IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES C3G is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rap and R-Ras, but it also acts through mechanisms not dependent on its GEF activity. It is essential for embryonic development due to its role in integrin-mediated adhesion and migration. In addition, C3G inhibits migration of highly invasive breast carcinoma cells, although the mechanisms involved remain unknown. The function of C3G in human cancer is controversial acting as either a tumour suppressor or mediator. p38 MAPKs regulate different cellular functions, including migration. p38a MAPK is the most abundant isoform and essential for embryonic development. p38a plays also a dual role in cancer depending on the tumour type and stage and it can promote migration and invasion of tumour cells. We have previously described that C3G through inhibition of p38a MAPK regulates cell death. We have now analyzed if C3G also regulates migration and invasion through mechanisms dependent on p38a in non-tumour and tumour cells. By knocking-down/out C3G and/or p38a, we have found that C3G inhibits migration and invasion through a mechanism that involves down-regulation of p38a activity. This was confirmed by using a selective p38a/b inhibitor. In addition, we have demonstrated that Rap- activation is not required for these C3G actions. MMPs might be important mediators of C3G/p38 effects on invasion. We are further characterizing the mechanisms used by C3G and/or p38a to regulate these processes. We have also found that both C3G and p38a promote tumour growth of HCT6 cells, as determined by in vitro and in vivo assays. 63

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P8-9 DUSP0 is a cyclooxygenase 2 activity induced gene and it regulates colon cancer cell stress responses Marta Jiménez Martínez, Konstantinos Stamatakis, Alba Jiménez- Segovia, Beatriz Barrocal, Manuel Fresno Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES Colorectal cancer is one of the deadliest types of cancer, due to its high metastatic capacity and chemoresistance acquisition. Cyclooxygenase 2 (COX-2) elevated expression has been shown to play an important role in colorectal tumour development and its inhibition can help prevent cancer death. We performed gene expression microarray analysis to identify genes up- or down-regulated by COX-2 overexpression. We identified genes with altered expression in these conditions, one of them being the Dual Specificity Phosphatase 0 (DUSP0), specific for JNK and p38 MAPKs. DUSP0 resulted to be up-regulated by COX-2 activity as well as by PGE2 treatment in a concentration depended manner. We generated cell lines stably expressing DUSP0 or silencing DUSP0 by infecting with lentivirus the colorectal adenocarcinoma HT29-LucD6 cells. We found that DUSP0 are implicated in cell proliferation and stress resistance to serum deprivation, osmotic and genotoxic agents and to confluence arrest. DUSP0 could be regulating the HT29 cell response at these conditions through the p38 pathway. These results suggest that DUSP0 expression can confer a growth and survival advantage in tumor environment to colorectal cancer cells. P8-20 Identification of PMEPA as a cyclooxygenase 2 induced gene and its potential implication in cancer progression Alba Jiménez Segovia, Konstantinos Stamatakis, Marta Jiménez, Beatriz Barrocal, Manuel Fresno Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES Cyclooxygenase 2 (COX-2) elevated expression has been associated with tumour development especially in colorectal cancer, and it is known that its inhibition can prevent cancer. In order to study the mechanisms that mediate the pro-tumorigenic effects of COX-2 we generated cell lines stably overexpressing this gene and performed gene expression microarray analysis to identify genes regulated by this overexpression. One of the up-regulated genes in the COX-2 overexpressing cells is PMEPA, identified as an androgen-induced gene, highly expressed in several cancers. The encoded product is a transforming growth factor-β (TGF-β)-induced transmembrane protein overexpressed in breast, prostate and colorectal cancer. In order to study PMEPA effects, we both overexpressed and silenced, PMEPA in human colon adenocarcinoma (HT29) and human ovarian carcinoma (Skov3) cells, generating stable cell lines. We studied in vivo and in vitro cell characteristics, noting significant differences between empty vector (EV) and PMEPA overexpressing cells. We observed differences in cell morphology, caused by a different distribution of the actin cytoskeleton. Those morphological differences are related to a PMEPA- induced process of Epithelial Mesenchymal Transition. Mouse xenograft experiments, with subcutaneous and intraperitoneal injection of the mentioned cells in nude mice, showed a differential effect of PMEPA overexpression in the two cell types, HT29 and Skov3, leading to a final growth delay of HT-29 xenografts, while PMEPA overexpressing Skov3 cells had a high initial survival and proliferative advantage compared with EV cells. These findings suggest that PMEPA may have an important role in cancer progression. P8r-2 (R8-6) P2X7 receptor stimulation in neurons mediates different pathway activation in the presence or absence of calcium Bakarne Urzelai, Francisco Llavero, José Luis Zugaza 2 Universidad del País Vasco (UPV/EHU)/Centro Vasco de Neurociencias Achucarro, Leioa, ES, 2 Ikerbasque/Centro Vasco de Neurociencias Achucarro/Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES P2X7 belongs to the family of ionotropic ATP-gated receptors, which function as ion channels mediating calcium influx. P2X7 is one of the predominant purinergic P2X receptor subtype expressed in neural cells. It is involved in a variety of processes such as ATP-mediated cell death, regulation of receptor trafficking, and inflammation. It is largely known that P2X7 receptor stimulation leads to regulation of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) extracellular regulated kinases (ERK/ERK2), c-jun N-terminal kinase (JNK) and p38. The canonical pathway for the activation of these MAPKs is mediated by Ras. Here, we show that P2X7 receptor stimulation triggers not only the MAPK activation but also the Ras GTPase activation. Besides, we demonstrate that in the presence of calcium this Ras/MAPK pathway regulation is mediated by the Ras guanine exchange factor (GEF) RasGRF. For its activation, this GEF requires a calcium input from the extracellular medium, which will intracellularly bind to calmodulin. In this configuration, Ca +2 -loaded calmodulin binds to the RasGRF IQ motif and activates it. Surprisingly, P2X7 also activates Ras in a Ca +2 -independent manner. In addition, this alternative Ras activation leads to the activation of the small GTPase Rap and more importantly, triggers neural cell death. Our findings demonstrate that P2X7 stimulation in neurons activates two different signaling pathways depending on the presence or absence of extracellular Ca +2, leading to cell survival versus cell death. P8-22 (R8-) Tetraspanin-enriched microdomains. Translating signals from the plasma membrane to Rac GTPase and exosomes María Yáñez-Mó Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES Tetraspanin-enriched microdomains (TEM) have unique biophysical properties suited for the regulation of cell motility and intercellular adhesion. In this study we demonstrate that TEM play a role in the compartmentalization of Rac GTPase at the plasma membrane and into exosomes, providing a molecular mechanism for the regulation of cell motility by tetraspanins. We characterized the intracellular TEM interactome by high-throughput mass-spectrometry, and found a specific interaction of tetraspanin CD8 with the GTPase Rac. This interaction was confirmed biochemically and microscopy cross-correlation analysisthat demonstrated in situ integration of both molecules into the same molecular complex. Pull-down experiments revealed that CD8-Rac interaction was direct and independent of Rac activation status. Knockdown of CD8 resulted in enhanced protrusion rate, altered focal adhesion formation and decreased cell migration, correlating with increased active Rac. Re-expression of wild typecd8, but not its truncated form lacking the C-terminal cytoplasmic domain, rescued these effects. The phenotype of CD8 knockdown cells was mimicked by treatment with a soluble peptide with the C-terminal sequence of the tetraspanin. TEM-driven compartmentalization was also relevant for protein sorting into exosomes. Quantitative proteomics showed that TEM ligands account for a great proportion of the exosome proteome and that a selective repertoire of CD8-associated molecules, including Rac, is not correctly routed to exosomes in cells from CD8-deficient animals. Therefore TEMdependent compartmentalization is revealed as a new regulatory mechanism of Rac activity. Moreover, our data provide firm evidence that insertion into TEMs is critical for protein inclusion into the exosome structure. 64

Granada 204 Pósters P8r-23 GRK2 modulates cell proliferation and invasive migration of the highly metastatic MDA-MB-23 breast cancer cells Laura Nogués, Philippe Chavrier 2, Federico Mayor Jr., Petronila Penela 3 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES, 2 Membrane and cytoskeleton dynamics department, Institut Curie, Paris, FR, 3 Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES Breast cancer progression and outcome are conditioned by the acquisition of two key abilities by tumour cells: the growth and survival capability that trigger resistance to therapy and the invasion into host tissues resulting in metastatic dissemination. Although both processes are usually studied separately, the underlying mechanisms seem to be governed by the same signalling nodes, including growth factor and chemokine receptors, p53 mutations and components of the Ras/ MAPKs/ PI3K axis. In addition, other cancer-associated factors can cooperate with these oncogenic-signalling routes to strength tumoural properties. In this sense, the serine/threonine kinase GRK2 is emerging as a key signalling node tightly connected to these cascades, given its participation in relevant biological processes such as cell cycle, proliferation or migration. Moreover, our recent findings show a novel interaction of GRK2 with the histone deacetylase HDAC6, which has also been associated with malignant transformation and invasive motility in breast cancer. All these evidences strongly suggest a relevant contribution of GRK2 in breast cancer tumorigenesis. We report herein that GRK2 subcellular distribution is altered in transformed breast cancer cells. Moreover, GRK2 modulates in vitro and in vivo proliferation of the triple negative MDA-MB-23 cells, in a HDAC6- phosphorylation dependent manner, and protects from SAHA (an HDAC6 inhibitor)-induced cell death. Furthermore, GRK2 also potentiates MDA-MB-23 cell migration towards different oncogenic stimuli, whereas GRK2 down-regulation results in suppression of both cell migration and invasion in 2D and 3D models. Finally, GRK2 is required for two-dimensional matrix proteolysis, suggesting a relevant role of GRK2 in the formation of protrusive structures termed invadopodia. Overall, these results point GRK2 as a possible contributor towards cell malignancy and as a potential drug target. P8r-24 K-Ras modula la respuesta fibrótica inducida por TGF-β mediante mecanismos independientes de la vía de Smad Cristina Cuesta Apausa, José Manuel Muñoz Féliz, Nuria Perretta Tejedor, Carlos Martínez Salgado 2, Isabel Fuentes Calvo Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca, ES, 2 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES La fibrosis es uno de los estadios finales de muchas enfermedades crónicas. Se caracteriza por la presencia de miofibroblastos y por una deposición excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC). El factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) es una citoquina muy importante en la regulación de los procesos fibróticos. Señaliza a través de las proteínas Smad2 y Smad3 gracias a la activación de su receptor tipo I. Además puede activar otras vías de señalización, como la vía de Ras. Hay 3 isoformas de las proteínas Ras: H-, N- y K-Ras. Nuestro objetivo es determinar si K-Ras regula la expresión de proteínas de MEC inducida por TGF-β y a través de que ruta de señalización intracelular. Para ello hemos generado una línea de fibroblastos embrionarios knock-out de K-Ras (KO). La expresión proteica se ha analizado por western blot. Las expresiones basales de fosfo-smad2 y fosfo-smad3 son similares en fibroblastos KO de K-Ras y WT; sin embargo la expresión de fosfo-erk/2 es menor en fibroblastos K-Ras -/-, mientras que la expresión de fosfo-akt es mayor en estas células. TGF-β aumenta la expresión de Ras-GTP y la fosforilación de Erk/2 sólo en fibroblastos WT, e induce una fosforilación similar de Smad2 y Smad3 en fibroblastos WT y K-Ras -/-. Además, TGF-β estimula la expresión de fibronectina, colágeno tipo I y colágeno total sólo en fibroblastos WT. En ausencia de K-Ras la inhibición de la vía de Erk/2 no reduce la expresión de fibronectina y colágeno tipo I. Sin embargo, la inhibición de la vía PI3K/Akt disminuye la síntesis de colágeno tipo I y de fibronectina en fibroblastos WT y KO. Estos datos sugieren que la isoforma K-Ras regula negativamente la expresión basal de proteínas de MEC (a través de la vía de PI3K/Akt), regula positivamente la activación de la vía de Erk/2, y es necesaria para la activación de Erk/2 en respuesta a TGF-β, pero no para la activación de la Smad2 y 3. Además, K-Ras es necesaria para el incremento en la expresión de proteínas de la MEC inducido por TGF-β, fundamentalmente a través de la vía de Erk/2. P8-25 Chemotaxis of Pseudomonas to gammaaminobutyrate (GABA) Jose Antonio Reyes Darias*, Vanina García*, Miriam Rico Jiménez, Andrés Corral Lugo, Olivier Lesouhaitier 2, Dalia Juárez Hernández 3, Yiling Yang 4, Shuangyu Bi 4, Marc Feuilloley 2, Jesús Muñoz Rojas 3, Victor Sourjik 4, Tino Krell Department of Environmental Protection, Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada, ES, 2 Laboratory of Microbiology Signals and Microenvironnement LMSM, EA 432, Normandie Université, Université Rouen, Evreux, FR, 3 Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas-Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, MX, 4 Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology & LOEWE Research Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), Marburg, DE Bacteria are able to migrate toward a more suitable environment by detecting chemical and physical stimuli, in a process called chemotaxis. Environmental stimuli are sensed by chemoreceptors, so called methyl accepting chemotaxis proteins (Mcp), which is typically composed of a periplasmic ligand-binding domain (LBD) and a cytosolic signalling domain. Chemotaxis occurs primarily to growth substrates but was also reported for neurotransmitters, plant signals or quorum sensing signals and the physiological relevance of taxis to these compounds is poorly understood. Gamma-aminobutyrate (GABA) is ubiquitously present in nature and has many functions like being a neurotransmitter, plant signal or growth substrate. We show by microcalorimetric analysis that the recombinant LBDs of the chemoreceptors PctC in the pathogenic Pseudomonas aeruginosa and McpG in the saprophytic P. putida KT2440 bind GABA. Receptor chimeras comprising the LBD of either PctC or McpG with the Tar signaling domain were constructed and the signal output determined using fluorescence resonance energy transfer (FRET). The resulting EC 50 values for GABA were with 3.6 ± 0.3 nm (PctC-Tar) and 5.7 ± 2 nm (McpG-Tar) extremely low, indicating that both receptors are highly sensitive for GABA. The EC 50 of PctC-Tar for GABA was 300-fold inferior to the value for L-Pro, the strongest responding protein amino acid. Experiments with Caenorhabditis elegans showed that pctc mutation did not alter bacterial virulence. However, mcpg mutation caused a reduction in tomato root colonization following chemotaxis. The C. elegans data and the presence of a GABA receptor in a saprophytic indicate that GABA taxis may not be related to virulence. The environmental omnipresence of GABA and its multi-functionality suggests that other bacteria may also show GABA taxis. * Authors contributed equally to this work. 65

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P8-26 Characterization of a new human oncogene Bárbara de la Peña, Cristian Suárez, Angustias Page, Josefa P. Alameda, Llanos Casanova, Ángel Ramírez, Manuel Navarro CIEMAT, Madrid, ES Most human tumors have mutations in genes of the Ras small GTPase protein family. Ras proteins work as binary molecular switches that control intracellular signaling networks. Inappropriate activation of ras causes aberrant signal transduction, proliferation and malignant transformation. Oncogenic mutations in Ras prevent GTP hydrolysis, locking Ras in a permanently active state. The main Ras isoforms are H-Ras, N-Ras and K-Ras, mutations of which are found in several types of human tumors. In spite of this, the human Ras family consists on some 36 different genes, many of which have been scarcely studied. One of these relatively unkonwn genes is ERas (Embryonic Ras), which is a constitutively active Ras protein. ERas is located in chr X, and is expressed only in embryonic stem cells, being undetectable in adult tissues. In the course of a high-throughput genetic screening to identify novel genes mutated in human cancer, we detected insertional mutations leading to the activation of ERas in a number of tumors. In this work, we describe the cloning and introduction of ERas in several non-malignant human cell lines. Forced expression of a HA-tagged ERas results in drastic changes in cell shape, mobility and invasivity, as well as in the activation of specific downstream pathways. Our results suggest that inappropriate expression of ERas could have a role in human cancer. P8-27 (R8-5) Identificación de Hit como un nuevo regulador de la salida de mitosis en Saccharomyces cerevisiae Ana Isabel de los Santos Velázquez, Fernando Monje Casas Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Utrera, ES En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la salida de mitosis se produce gracias a la liberación de Cdc4 desde el nucleolo hasta el citoplasma, donde esta fosfatasa revierte los eventos de fosforilación determinados por las ciclinas mitóticas, lo cual conduce finalmente a la inactivación de las mismas. La liberación de Cdc4 se produce gracias a dos cascadas de señalización: la ruta FEAR (Cdc-Fourteen Early Anaphase Release) y la ruta MEN (Mitotic Exit Network). Aunque no es esencial, FEAR juega un papel importante en la correcta segregación del ADNr y los telómeros, la dinámica del huso mitótico, y la activación de MEN. Así, la identificación de nuevos componentes de esta ruta es importante para entender mejor el proceso de salida de mitosis. En nuestro grupo de investigación, hemos identificado la proteína Hit, de función desconocida hasta el momento, como un posible nuevo componente de la ruta FEAR, y estamos analizando el papel específico que esta proteína juega en la correcta regulación de la liberación de Cdc4 y la salida de mitosis. P8r-28 Regulación de la desacetilasa de histonas SIRT6 en relación con el fenotipo tumoral María Gutiérrez-Salmerón, Valle Montalvo-Romeral, Ana Chocarro- Calvo 2, José Manuel García-Martínez, Antonio De la Vieja 3, Custodia García-Jiménez Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2 Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford, Oxford, UK, 3 Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, ES Introducción: La hiperglucemia favorece el desarrollo tumoral con efectos directos sobre las células tumorales y efectos sistémicos. Nuestro grupo ha demostrado que mientras la señalización tumoral por Wnt conduce al acúmulo citosólico del efector de la vía: la β-catenina, su retención nuclear y activación transcripcional (responsable del aumento de proliferación y otras características tumorales) requiere la existencia de niveles elevados de glucosa. Esta acumulación nuclear dependiente de hiperglucemia está mediada parcialmente por inhibición de la actividad desacetilasa de las sirtuinas y, aunque hay evidencia de la implicación de SIRT, se desconoce si hay otras sirtuinas implicadas y cuáles son los mecanismos subyacentes. Recientemente se ha demostrado que el silenciamiento de SIRT6 altera el metabolismo de la glucosa y conduce a una disminución de la glucemia y, por consiguiente, de la insulinemia. A diferencia de otras sirtuinas los niveles de SIRT6 fluctúan de unos tipos celulares a otros y esta sirtuina además de la actividad desacetilasa posee actividad ADPribosilasa. Los importantes efectos de SIRT6 sobre el metabolismo de la glucosa nos han conducido a plantear el Objetivo: identificar estímulos que alteran los niveles y actividad de SIRT6 y su relación con el fenotipo tumoral. Metodología: células tumorales intestinales humanas y murinas estimuladas con: glucosa, Wnt-3A o LiCl. Se evalúan cambios en niveles o modificaciones por Western Blot e inmunofluorescencia; en expresión génica por qpcr y en actividad desacetilasa por luminiscencia. Mediante citometría determinamos su influencia en proliferación celular. Análisis estadístico por ANOVA y post-test Bonferroni. Resultados: Las proteínas Wnt-3A y LiCl reducen significativamente los niveles de SIRT6 afectando a la actividad desacetilasa. Las alteraciones de los niveles de SIRT6 correlacionan con alteraciones de la proliferación celular. Conclusiones: Algunos estímulos como Wnt o LiCl pueden facilitar la aparición o progresión tumoral a través de la depleción ejercida sobre SIRT 6. P8r-29 Interleukin 2 requieres p56 Lck /PLCy/nPKCs (PKCθ)/αPIX pathway to induce Rac -PYGM activation in T cells Francisco Llavero Bernal, Bakarne Urzelai López de Aberásturi, José Luis Zugaza Gurruchaga 2 Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES, 2 Ikerbasque/ Centro Vasco de Neurociencias Achucarro/Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES Small GTPases of the Rho family have been implicated in important cellular processes such as cell migration and adhesion, protein secretion, and/or gene transcription. However, little is known about the role that Rho GTPases play in IL-2-mediated responses in Kit 225 T cells. Our group has shown that IL-2 induces Rac activation, which interacts with PYGM and modifies its activity to trigger T cell proliferation. We have investigated the mechanisms by which PYGM is activated through Rac in T cells. Our results suggest that IL-2 stimulates α-pix/rac /PYGM pathway activation through the novel Protein kinase C theta type (PKCθ). Furthermore, by constructing αpixs 225A y αpixs 488A mutants we show that these residues are essential for PYGM activation. Moreover, it has been published that β subunit of the IL-2- receptor activates p56 Lck which in turns activates the phosphoinositide phospholipase C-gamma (PLCγ). Here, we have observed that p56 Lck and PLCγ are implicated in the IL-2 signaling cascade that leads to Rac/PYGM pathway activation. These data reveal a novel signaling pathway in which IL-2 transduces signals through the Lymphocyte cell-specific protein-tyrosine kinase (p56 Lck )/Phosphoinositide phospholipase C-gamma (PLC)/novel Protein kinase C theta type (PKCθ)/Rho guanine nucleotide exchange factor αpix /Rac axis to activate PYGM. 66

Granada 204 Pósters P8r-30 Novel functional complexes between Galphaq and PB domain-containing proteins Sofía Cabezudo Violero, Guzmán Sánchez Fernández 2, Catalina Ribas Núñez 2, Federico Mayor Menéndez 2 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO), Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2 Max-Planck- Institute for Heart and Lung Research, Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM) and Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES Introduction: G proteins play an essential role in the initiation of G-protein coupled receptor (GPCR) signalling. Particularly, the Gαq/ family has been classically shown to associate and activate PLCβ. However, additional effectors are responsible for other Gαq functions. We have reported that GPCR activation promotes a direct interaction between Gαq and PKCƷ. This association involves the basic PB-type II domain of PKCƷ and a novel acidic region in Gαq different from the classical effector-binding region. This interaction leads to the stimulation of the ERK5 pathway and to the development of cardiac hypertrophy, independently of the canonical effector PLCβ. In this work, we have described that another PB containing protein, such as p62, belong to this Gαq/PKCƷ complex and explored additional downstream pathways for this new Gαq interactome. Methods: Biochemical characterization of the Gαq/p62 complex was performed by mutagenesis and co-immunoprecipitation analysis. Functionality of the Gαq/PKCƷ complex was determined performing XCELLigence, propidium iodide incorporation and annexinv assays. Results: We demonstrate that Gαq and p62 can be found in the same functional protein complex. This association is enhanced upon Gαq activation by GPCR. Furthermore, GRK2, a negative regulator of Gαq signalling, abrogates this complex. This association involves the PB domain of p62 and the acidic region of Gαq, described to be essential for PKCƷ binding. Interestingly, this association is preserved in PKCƷ deficient cells, suggesting a direct interaction. Additionally, we show that the Gαq/ PKCƷ/ERK5 complex links Gαq to an apoptotic cell death pathway which is autophagy-dependent. Conclusion: Overall, our study provides concluding evidence showing that PKCƷ acts as a functional effector of Gαq through the engagement of a novel binding region in the alpha subunit leading to ERK5 activation and apoptotic cell death in a mechanism dependent on autophagy where p62 could play an interesting role as part of this complex. These results could help to uncover the identification of new potential pharmacological targets for the treatment of cardiovascular diseases. P8-3 IRF2-Binding Protein Like: implication of the Ser526 phosphorylation on its cellular localization, transcriptional activity and its novel role as growth suppressor Jon Vallejo, Aintzane Apraiz 2, Dorkaitz Basarte 3, Asier Fullaondo, Ana M. Zubiaga Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/ EHU, Leioa, ES, 2 Departamento de Biología Celular e Histología, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES, 3 Dpt Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, Fac. de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES Ras proteins are important molecular switches that control intracellular signaling networks, and their deregulation is one of the key events leading to cellular transformation. On-going work in the laboratory has identified IRF2BPL, an interferon regulatory factor family member, as a new downstream effector of H-Ras. IRF2BPL encodes a transcription factor that is thought to play a role in transcriptional regulation of hormones such as GNRH and PENK. It shows both target dependent transcriptional activator and repressor activities and it has been described to form a complex together with IRF2BP and IRF2BP2. However, the mechanisms that underlie the regulation and functional activity of IRF2BPL are largely unknown. The aim of this study is to characterize the regulation and function of this protein. We present evidence that IRF2BPL is predominantly nuclear and shows a strong transcriptional repressor activity in serum-starved cells. Activation of signaling pathways by the addition of serum leads to translocation of the protein to the cytoplasm. IRF2BPL contains a nuclear localization sequence (NLS) that is highly conserved in the interferon regulatory factor family. Within the NLS of IRF2BPL2 lies a Serine residue (Ser526) that has been found phosphorylated in proteomic studies, raising the possibility that this phosphorylation may be critical for its localization and functional activity. Substitutions of Serine at position 526 to Alanine (non-phosphorylable) and Aspartic acid (phospho-mimetic) have been generated by site-directed mutagenesis. Preliminary results suggest that Ser526 phosphorylation is important for IRF2BPL localization and function. Moreover, we have found that IRF2BPL overexpression leads to a decreased colony formation in both non-transformed and HRasV2-transformed NIH3T3 cells, which is associated with an early accumulation of cleaved caspase-3, suggesting increased apoptotic cell death. Taken together, our results point to an important function of IRF2BPL in the negative regulation of transcriptional activity and cellular proliferation. P8r-32 Regulation of c-src tyrosine kinase activity by calmodulin Silviya R. Stateva, Estefanía Anguita, Valentina Salas 2, Gustavo Benaim 3, Antonio Villalobo Instituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2 Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Caracas, VE, 3 Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto de Biología Experimental & Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Caracas, VE Calmodulin (CaM) is a Ca 2+ -receptor protein that regulates more than one hundred target proteins with and without enzymatic activity in Ca 2+ - dependent and independent manners and modulates a myriad of cellular processes, some of which are vital for tumorigenesis (i.e. cell proliferation, apoptosis and autophagy) []. c-src is a non-receptor tyrosine kinase that participates in signaling pathways that transduces events initiated by different types of cellular receptors and adhesion molecules, and controls many cellular functions including: cell migration, proliferation, differentiation, apoptosis and stress-response, among others [2]. It has been previously demonstrated that CaM directly interacts with c-src in a partial Ca 2+ -dependent manner and that trifluoperazine, a CaM antagonist, inhibits the phosphorylation of c-src, suggesting that CaM plays an important role in survival signals in pancreatic tumor cells [3]. We demonstrate in this work that recombinant c-src directly binds CaM in Ca 2+ -dependent and independent manners, suggesting that this kinase likely has more than one CaM-binding domain. A couple of IQ-like motifs identified in silico in c-src could be responsible for the binding of CaM to this kinase in the absence of Ca 2+. We also show that CaM enhances the autophosphorylation and tyrosine kinase activity of c-src in the absence and presence of Ca2+, most strongly in the former condition. We are testing whether the CaM antagonist W-7 inhibits or not the hydrogen peroxideinduced phosphorylation of c-src in human breast adenocarcinoma SK- BR-3 cells, and whether or not CaM-dependent protein kinase II and/or the CaM-regulated protein phosphatase calcineurin, play a role in this process. Bibliografía [] Berchtold MW, Villalobo A (204) Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 843: 398-435. 67

Pósters XXXVII Congreso SEBBM [2] Thomas SM, Brugge JS (997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 3: 53-609. [3] Yuan K, Jing G, Chen J, Liu H, Zhang K, Li Y, Wu H, McDonald JM, Chen Y (20) J. Biol. Chem. 286: 24776-]24784. Funded by SAF20-23494, S20/BMD-2349 and PITN-GA-20-289033 to AV. P8m-33 Papel de la AMPK (proteína quinasa activada por AMP) en la amplificación de la señalización tumoral por glucosa Ana Chocarro-Calvo, José Manuel García-Martínez 2, María Gutiérrez-Salmerón 2, Valle Montalvo-Romeral 2, Antonio De la Vieja 3, Custodia García-Jiménez 2 Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford, Headington, Oxford, UK, 2 Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Rey Juan Carlos, Alcrocón, ES, 3 Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, ES Estudios epidemiológicos asocian un aumento en la incidencia de cánceres sitio-específicos con la diabetes. Las células tumorales sufren alteraciones del metabolismo de la glucosa, de lípidos y de proteínas por lo que la reprogramación del metabolismo energético celular ha despertado un fuerte interés clínico como estrategia para combatir la enfermedad. La proteína AMPK permite a la célula adaptarse al estrés metabólico por lo que representa una diana molecular importante en cáncer y diabetes. Nuestro grupo ha demostrado que la hiperglucemia amplifica la señalización tumoral por Wnt/b-catenina en cánceres asociados a diabetes a través de aumentos en niveles y actividad de la acetil transferasa p300. Objetivos: Caracterizar el papel de la AMPK en la amplificación de la señalización tumoral por glucosa. Metodología: Usamos células tumorales intestinales murinas (STC- ) y humanas (HT-29) en normo o hiper-glucemia. Los tratamientos incluyen inhibidores/activadores de AMPK, sobreexpresión y depleción de AMPK. Las alteraciones en las proteínas se miden por western Blot, inmunofluorescencia e inmunoprecipitaciones. Resultados: La hiperglucemia aumenta la fosforilación de AMPK (T72) correlacionando con un incremento en los niveles, acetilación y actividad acetiltrasferasa de p300. Estos efectos son reproducidos por la activación de AMPK mediante Metformina/AICAR o la sobreexpresión de una forma silvestre y son bloqueados por un inhibidor de AMPK (Compuesto C) o su depleción mendiante sirna específico. Conclusiones: La AMPK media la amplificación de la señalización tumoral por hiperglucemia en cánceres asociados a diabetes y sugiere un nuevo mecanismo de adaptación de la célula tumoral a estas condiciones de estrés metabólico. P8-34 Latexin enhances retinoic acid-mediated differentiation in human neuroblastoma-derived SH-SY5Y cells Carla Granados, María Sánchez-Osuna 2, Josep Vendrell, Irantzu Pallarès, Víctor J. Yuste 2 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Ciències i Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES, 2 Cell Death, Senescence and Survival Group, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES Latexin, the only known endogenous carboxypeptidase inhibitor, was initially identified in the lateral neocortex of rat brain and has been used as a marker of neurons in the developing brain. Latexin also plays a role in regulating hematopoietic stem cells homeostasis, inflammation, and protein aggregation. Interestingly, latexin expression appears downregulated in several cancer cells because of hypermethylation of its promoter. Thus, the over-expression of latexin in these cells prevents tumour growth, suggesting a possible involvement of latexin in tumour suppression. Retinoic acid (RA) is a natural metabolite of vitamin A that plays an essential role in neural development. RA induces differentiation through the regulation of genes involved in cell proliferation, cell cycle and cell death. Among these genes, RA has been found to activate the expression of a number of tumor suppressors such as retinoic acid receptorβ(rarb), tazarotene-induced gene (TIG) or thioredoxin reductase. In our study, we demonstrate that RA induces the expression of latexin in SH- SY5Y neuroblastoma cells. Moreover, SH-SY5Y cells that constitutively and stably express latexin, present enhanced RA-mediated differentiation, as shown by both increased levels of the neuron specific enolase (NSE) differentiation marker, and decreased levels of the DNA-binding protein inhibitor (ID) dedifferentiation marker. These first results encourage us to further characterize the molecular pathways behind latexin-mediated tumor suppression activity, likely involving cellular differentiation, which seem of great interest to unveil the initial stages leading to the development of certain types of cancer. P8-35 (R8-7) Development of a luminescence-based mitocondrial calcium assay optimized for high-throughput screening Paloma Navas Navarro, Javier García-Sancho 2, Britta Jehle 3, Joe Lewis 3, Fabiana Perocchi 4, María Teresa Alonso Alonso 2 Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2 Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM) - Universidad de Valladolid - Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Valladolid, ES, 3 Chemical Biology Core Facility - EMBL Heidelberg, Heidelberg, DE, 4 Maximilians-Universität (LMU) Munich, Munich, DE Mitochondria are capable of uptaking large amounts of Ca 2+ via a membrane- potential, ruthenium-red-sensitive mechanism recently identified as the mitocondria calcium uniporter. Mitochondria Ca 2+ uptake controls intracellular Ca 2+ signalling, cell metabolism, cell survival and other celular functions by buffering cytosolic Ca 2+ levels and regulating mitochondrial effectors. Mitochondrial Ca 2+ signaling pathways are considered drug targets, as their regulation can determine cell fate in disease models such as ischemia-reperfusion injury, neurodegeneration, cardiomyopathies or metabolic disorders. However, till present, no selective and specific compounds with therapeutic potential are available to modulate mitochondrial Ca 2+ homeostasis. Aequorin is a calcium-binding photoprotein that emits bioluminescence when it is reconstituted with its cofactor coelenterazine. We have developed an aequorin-based assay to monitor mitocondrial Ca 2+ kinetics and we have optimized it for high-throughput screening using a 96-well-platereader platform. A bioluminescence-based assay has several advantages over a fluorescence-based one: ) targeting of the aequorin probe to mitochondria matrix is extremely precise, thus permitting the selective measurement inside the organelle;2) aequorin can be reconstituted with different prosthetic groups allowing to cover a large dynamic range of Ca 2+ concentration, from 0-7 to 0-3 M; 3) aequorin has a low Ca 2+ buffering effect and it is nearly insensitive to changes in Mg 2+ or ph that may occur inside mitochondria; 4) it has a high signal-to-noise ratio, making it an ideal Ca 2+ sensor for high-throughput screening; 5) the raw luminescent signal can be calibrated in Ca 2+ concentration by discharging all the remaining aequorin. We have engineered a HeLa monoclonal cell line that stably expresses a mitochondrial matrix-targeted GFP-Aequorin fusion protein. Aequorin was reconstituted with coelenterazine n, which reduces its affinity for Ca 2+, it has a slower consumption rate and allows to monitor Ca 2+ kinetics for long periods of time. 68

Granada 204 Pósters P8-36 Regulation of Zic gene expression by nitric oxide and its role in the regulation of sonic Hedgehog pathway in mouse embryonic stem cells Amparo Beltrán Povea, Carmen Salguero Aranda, Rafael Tapia Limonchi, Ana Belén Hitos Prados, Irene Díaz Contreras, Gladys Cahuana Macedo, Bernat Soria Escoms, Francisco Bedoya Bergua, Juan R. Tejedo Huaman Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Sevilla, ES Our laboratory has developed a protocol for endoderm differentiation of mouse embryonic stem cells which consists in exposing cells to high concentrations of a nitric oxide donor for 9 hours. This treatment suppresses the expression of pluripotency genes such as Oct4 and Nanog, and induces differentiation events of early acquisition of epithelial morphology and expression of markers of definitive endoderm such as Pdx. We observed in previous studies in mouse embryonic stem cells (mesc) that nitric Oxide causes an increase of the expression of Zic-, a marker of differentiation toward ectoderm, so we decided to study this gene in endodermic differentiation process. It has been proved that Zic and Gli proteins physically and functionally interact through their zinc finger domains, and that Zic is essential to the regulation of Sonic Hedgehog (Ssh) pathway in neural development. The aim objective of this study is to determine if Zic is regulated by NO, and if this gene has a role in the regulation of Ssh pathway in mesc related with endoderm development. In our early studies in mouse embryonic stem cells (mescs) we have analysed Zic gene and protein expression of cells treated with high concentration of nitric oxide, as well as the DNA methylation on its promoter region, showing that the expression of Zic in presence of Nitric Oxide was increased, without significant changes on DNA methylation. Furthermore, we found that the transcription factor Egr could active to Zic expression after NO treatment. Then we proved that Zic coexpressed with Pdx in cells treated with NO, in adult pancreatic cells and in pancreas tissue, which are enough evidence to suspect that Zic may be involved in the process of differentiation to endoderm. Finally, we determined that NO treatment suppresses Ssh signaling pathway, decreasing the expression of it targets genes. To test whether this modification is promoted by Zic, we developed gain and loss of function assays of Zic, reveling thus the possible role of Zic in Ssh signaling pathway inhibition and differentiation process toward endoderm in mesc. Subvencionado por: - Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-20-65-900000) - Junta de Andalucía (CTS- 727/20) P8m-37 Sam68 participa en las vías de señalización de leptina e insulina en células de cáncer de mama Flora Sánchez-Jiménez, Antonio Pérez-Pérez, Jenifer Martin- González 2, Antonio M. Carmona-Fernández, Victor Sánchez- Margalet Hospital Universitario Virgen Macarena, Montemayor, ES, 2 Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Introducción: La obesidad y la resistencia a la insulina son factores de riesgo bien conocidos para el desarrollo del cáncer de mama en mujeres postmenopáusicas. La elevación de los niveles de leptina e insulina modulan positivamente el crecimiento de estas células tumorales. La proteína Sam68 es una proteína de unión a ARN que también interacciona con proteínas de señalización. Se ha demostrado previamente la sobreexpresión de Sam68 en células de cáncer de mama. Además, Sam68 puede ser reclutado en las vías de señalización de leptina e insulina como substrato del receptor, habiéndose mostrado su participación en la proliferación, crecimiento celular y efectos antiapoptóticos mediados por estas hormonas en diferentes tipos celulares. Objetivos: Estudiar la expresión de Sam68 y su nivel de fosforilación medidos por leptina e insulina en diferentes líneas celulares de cáncer de mama (MCF7, MDA-MB-23 y BT-474), estudiando asimismo el efecto de la inhibición de la expresión de Sam68 mediante sirna. Resultados: En nuestro trabajo se ha demostrado un incremento en la cantidad de proteína y expresión génica de Sam68 en respuesta al estímulo con leptina o insulina en todas las líneas celulares de cáncer de mama estudiadas. Además, tanto la estimulación con leptina como con insulina, promovieron un incremento en la fosforilación en tirosina de Sam68, regulando negativamente su capacidad de unión a RNA en estas líneas celulares. La inhibición de la expresión de Sam68 resultó en una menor activación de las vías MAPK y PI3K en la estimulación con ambas hormonas. Conclusión: Estos resultados sugieren la participación de Sam68 en la señalización de los receptores de leptina e insulina en células de cáncer de mama, mediando los efectos tróficos de estas hormonas en proliferación y crecimiento celular. P8r-38 Leptin prevents apoptosis triggered by increased temperature in placental explants Antonio Pérez-Pérez, Ayelen Toro 2, Flora Sánchez-Jiménez, Jenifer Martín-González 3, Teresa Vilariño-García, Cecilia Varone 2, Víctor Sánchez-Margalet Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular, Hospital Universitario Virgen Macarena, 3 Facultad de Medicina, Sevilla, ES, 2 Departamento de Química Biológica, IQUIBICEN, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR, 3 Department of Stomatology (Endodontics section), School of Dentistry, University of Sevilla, Sevilla, ES Maternal fever is common during pregnancy and and has for many years been suspected to harm the developing fetus. Whether increased maternal temperature produces exaggerated apoptosis in trophoblast cells remains unclear. Since p53 is a critical regulator of apoptosis we hypothesized that increased temperature in placenta produce abnormal expression of proteins participating in the p53 pathway and finally caspase 3 activacion. Moreover, leptin, produced by placenta, has demonstrated to promote the proliferation and survival of trophoblastic cells. That is why, we aimed to study the possible role of leptin preventing apoptosis triggered by high temperature, as well as the molecular mechanisms underlying this effect. Fresh placental tissue was collected from normal pregnancies. Placental explants were exposed to increased temperature (40ºC and 42ºC) for different time points. We employed 0 nm leptin which is the optimal leptin concentration. Western blotting and real-time PCR were performed on tissue lysate for protein and mrna expression of p53 and downstream effector proteins, p2, Bax, Mdm2 and caspase 3. Maximal apoptotic effect of high temperature was obserbed after 3 h incubation of trophoblasts. Protein and mrna expression of p53, p2, Bax, Mdm2 and caspase 3 were significantly increased in explants at 40ºC and 42ºC in compared with explants to 37ºC. Conversely, this increased expression was significantly attenuated by leptin 0 nm at both 40ºC and 42ºC. These data illustrate the potential role of leptin for inhibiting the excessive apoptosis in villous trophoblast triggered by high temperature. However, the upstream regulation of p53 with regard to exaggerated apoptosis in response to elevated temperature merits further investigation. 69

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P8r-39 PTEN mediates the inhibition of c-src oncogenic activity promoted by connexin43 in glioma cells and astrocytes Ana González Sánchez, Marta Domínguez-Prieto, Sandra Herrero- González, Jose M Medina, Arantxa Tabernero Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de Castilla y León), Salamanca, ES Gliomas are the most common brain tumors and they present a very bad prognosis. One of their characteristics is a high activity of the oncogen, c-src, and a low expression of connexin43 (Cx43), the main protein forming gap junction channels in astrocytes. In previous works we showed that restoring Cx43 to glioma cells inhibits c-src activity. Since c-src activity is inhibited by c-terminal Src kinase (Csk) phosphorylation and PTEN dephosphorylation, we investigated wether Cx43 could regulate c-src activity by recruiting or regulating said enzymes. In this work we show that silencing PTEN expression in C6 glioma cells stably transfected with Cx43 (C6Cx43) reverted the effect of Cx43 on c-src activity and on cell proliferation. These results indicate that PTEN participates in the inhibition of c-src activity promoted by Cx43. Using confocal microscopy and co-inmunoprecipitation studies, we confirmed the interaction between Cx43, PTEN and c-src in C6 glioma cells transfected with Cx43 and astrocytes in primary culture. In addition, we found Csk in this inmunocomplexes, suggesting that Cx43 can recruit the machinery required to inactivate c-src. Finally, we found that restoring Cx43 expression in C6 glioma cells, in addition to reduce c-src activity and proliferation, upregulates PTEN and Csk. According with the results, it could be concluded that PTEN and Csk participate in the inhibition of the activity of c-src promoted by Cx43 in glioma cells and astrocytes. P8-40 Regulación de los niveles de PLK por la E3 ligasa SKP-CUL-F-box Ana Cristina Rivas, Servando Giráldez, Joaquín Herrero-Ruiz, Mar Mora-Santos, María Cristina Limón-Mortés, Carmen Sáez 2, Miguel Ángel Japón 2, Maria Tortolero, Francisco Romero Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla y Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, ES PLK (Polo-Like Kinase) es una quinasa de serina/treonina que interviene en muchos de los eventos que tienen lugar durante la mitosis, como la entrada en mitosis, la maduración de los centrosomas, el ensamblaje del huso mitótico, la separación de las cromátidas hermanas, la activación del complejo APC/C y la salida de mitosis y el inicio de la citocinesis. Además, PLK está implicada en la replicación del ADN y en el restablecimiento del ciclo celular tras el punto de control de G2 producido por los daños en el ADN. Durante el ciclo, PLK se degrada vía APC/C-proteasoma comenzando su degradación al final de la mitosis y continuando a lo largo de la fase G. PLK también se degrada por el APC/C en G2 en respuesta al daño en el ADN. Por otra parte, recientemente hemos descrito que en la fase S los niveles de PLK están controlados por la ligasa de ubicuitina SCF FBXW7α. En este caso, PLK es ubicuitilada y degradada vía proteasoma en condiciones no estresantes e incrementándose este efecto tras radiación ultravioleta. Esta degradación contribuye a la parada del ciclo celular en la fase S al impedir la formación de los complejos de pre-replicación (pre- RC), lo que reduce la proliferación celular. Dado que se ha descrito que las ligasas de ubicuitina SCF FBXW7α y SCF βtrcp pueden regular la estabilidad de un mismo sustrato, tanto cooperando como interfiriendo en la degradación del mismo, hemos estudiado el efecto de SCF βtrcp sobre PLK y sus posibles implicaciones en las funciones de la quinasa. P8r-4 Transporte núcleo-citoplasmático del complejo SNF de Saccharomyces cerevisiae Montserrat Vega, Alejandra Fernández-Cid 2, Alberto Riera 2, Pilar Herrero, Fernando Moreno Departamento de bioquímica y biología molecular, Universidad de Oviedo, Oviedo, ES, 2 MRC Clinical Sciences Centre - Imperial College Faculty of Medicine, London, UK La familia de proteín quinasas AMPK/SNF es esencial para establecer en todas las células eucariotas, incluidas las levaduras, la regulación metabólica adecuada en respuesta a diferentes tipos de estrés. El complejo SNF de S.cerevisiae está constituido por tres subunidades, una subunidad catalítica Snf y dos subunidades reguladoras, Snf4 y una de las tres subunidades implicadas en la localización subcelular del complejo (Sip, Sip2 o Gal83). En S. cerevisiae, este complejo se requiere no solo para la adaptación de la levadura a diferentes condiciones ambientales, entre las que se incluye el estrés nutricional generado por condiciones de limitación de glucosa, sino que también está implicado en procesos de desarrollo. En esta comunicación presentamos datos de la influencia de los niveles de glucosa en la distribución subcelular y mecanismo de transporte al núcleo del complejo SNF. Experimentos de coinmunoprecipitación de cromatina (ChIP) demuestran que las tres proteínas que forman parte del complejo SNF (Snf, Gal83 y Snf4), están presentes en el núcleo tanto en condiciones de alta como de baja glucosa. Hasta ahora el sistema de importación y exportación utilizado por estas proteínas era desconocido. Aquí mostramos la interacción de estas tres proteínas con las importinas del sistema clásico de importación, Kap95 y Kap60, así como su interacción con la exportina Xpo, en condiciones de alta y baja glucosa. Experimentos in vitro muestran que la interacción de Snf4, Snf y Gal83 con las importinas Kap60 y Kap95, está regulada por la presencia de GspGDP y GspGTP. Demostrando que la direccionalidad del transporte núcleo-citoplásmico viene dada por la GTPasa Gsp en función de si está cargada con GDP (citoplasma) o GTP (núcleo). P8r-42 Mechanism for the specific targeting of methyltransferases to chemoreceptors in Pseudmonas aeruginosa PAO Andrés Corral Lugo, Cristina García Fontana, Manuel Espinosa Urgel, Tino Krell Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES Chemosensory pathways are major signal transduction mechanisms in bacteria. Methyltransferases of the CheR family and methylesterases of the CheB family control chemoreceptor methylation, and this dynamic posttranslational modification is necessary for proper chemotaxis of bacteria. Studies with enterobacteria that contain a single CheR or CheB show that, in addition to binding at the methylation site, some chemoreceptors bind CheR or CheB through additional high-affinity sites at distinct pentapeptide sequences in the chemoreceptors. We investigated the recognition of chemoreceptors by CheR proteins in the human pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO. Of the four methyltransferases in PAO, we detected an interaction only between CheR2 and the chemoreceptor methylaccepting chemotaxis protein B (McpB), which contains the pentapeptide GWEEF at its carboxyl terminus. Furthermore, CheR2 was also the only paralog that methylated McpB in vitro, and deletion of the pentapeptide sequence abolished both the CheR2-McpB interaction and the methylation of McpB. When clustered according to protein sequence, bacterial CheR proteins form two distinct families-those that bind pentapeptide-containing chemoreceptors and those that do not. These two families are distinguished by an insertion of three amino acids in the β-subdomain of CheR. Deletion of this insertion in CheR2 prevented its interaction with and methylation of McpB. Pentapeptide-containing chemoreceptors are common to many bacteria species; thus, these short, distinct motifs may enable the specific assembly of signaling complexes that mediate different responses. 70

Granada 204 Pósters P8-43 Singularidad de SUMO en la regulación de las PHD Almudena Gerpe-Pita, Amelie Schöber, Onintza Carlevaris, Edurne Berra CIC biogune, Derio, ES Utilizando el oxígeno como sustrato, las PHD (Prolyl Hydroxylase Domain containing proteins) son enzimas que catalizan la hidroxilación de sus proteínas dianas sobre un residuo prolina. Estas dioxigenasas, conservadas a lo largo de la evolución y de las que se han descrito tres isoformas en mamíferos (PHD-3), se identificaron inicialmente como los sensores de oxígeno responsables de regular la estabilidad de la subunidad α del factor de transcripción HIF (Hypoxia Inducible Factor), el jefe de orquesta de la cascada de señalización de hipoxia y el mantenimiento de la homeostasis de oxígeno. No obstante, las PHD no son enzimas redundantes y si bien PHD, 2 y 3 comparten ciertos substratos y tareas, es evidente que también muestran ciertas especificidades en cuanto a su función y regulación. La SUMOilación es una modificación postraduccional que conlleva la conjugación covalente de SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier). El proceso de SUMOilación implica una cascada de reacciones enzimáticas en la que intervienen un complejo único de activación, Uba2/Aos o SAE/ SAE2, una enzima de conjugación (Ubc9), una E3 específica para ciertos sustratos (PIAS, RanBP2 o Pc2 son algunos ejemplos) y desumoilasas, responsables de la deconjugación de SUMO. La interacción dinámica entre SUMOilación y desumoilación modula importantes vías de señalización molecular y entre ellas, la cascada de señalización de hipoxia. Por ello, nos planteamos estudiar el papel de SUMO en la regulación de las PHD. En esta presentación discutiremos nuestros resultados más recientes sobre el papel singular de SUMO en la regulación de PHD, 2 y 3, su implicación en las rutas dependientes e independientes de HIF y su relevancia fisiopatologica. P8-44 La activación de ERK /2 es suficiente para restaurar la degradación proteica mediada por dexametasona en células de músculo esquelético José Dámaso Vílchez Rienda, Rafael Salto González, María Elena Cabrera Cazorla, Joan J Guinovart i Cirera 2, María Dolores Girón González Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2 Instituto de Investigación Biomédica, Universidad de Barcelona y CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Barcelona, ES La atrofia muscular se desarrolla en situaciones de ayuno prolongado, enfermedades como cáncer, diabetes, SIDA o sepsis y en condiciones como el envejecimiento, denervación o tratamiento con glucocorticoides. En estas situaciones, se produce una disminución en la síntesis de proteínas conjuntamente con un aumento en su degradación. La degradación de proteínas en músculo esquelético está mediada por la actividad de dos rutas conservadas: ubiquitina-proteasoma y un aumento de la autofagia lisosomal. La primera ruta, responsable del recambio de la mayoría de proteínas musculares solubles y miofibrilares, se activa como resultado de una expresión aumentada de ubiquitina y ligasas de ubiquitina, como ATROGEN y MuRF. La autofagia juega un papel muy importante en la degradación proteica en el músculo esquelético e implica un incremento en la transcripción de una serie de genes como LC3, p62 y Bnip3. Ambas rutas están moduladas por el factor de transcripción Forkhead box O3 (FoxO3). FoxO3 normalmente está fosforilado por Akt y en estado inactivo en el citosol, pero en ausencia de una represión de Akt, se transloca al núcleo donde induce la expresión de una serie de genes relacionados con los dos sistemas de degradación. En cultivos de células musculares de rata L6, el tungstato sódico, activador de ERK /2, es capaz de inhibir la degradación inducida por dexametasona. El tungstato promueve la fosforilación de FoXO3a, lo que conduce a su inactivación e inhibición de su translocación al núcleo y por tanto, a una disminución en la actividad del promotor de ubiquitina así como una menor expresión de las ligasas de ubiquitina. Asimismo, el tungstato reduce la formación de autofagosomas, la expresión de la forma lipidada de LC3, la degradación de p62 y reduce los niveles de mrna de Bnip3 en células tratadas con dexametasona. Estos resultados obtenidos en cultivos celulares apoyan la idea de que la activación de ERK /2 disminuye la degradación proteica a través de los dos sistemas celulares, proteasoma y lisosomal, por lo que el tungstato sódico podría ser un agente útil situaciones fisiopatológicas en las que se presentase una atrofia muscular. Proyecto Financiado por la Fundación Botín. P8-45 Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate (GABA) Miriam Rico Jiménez, Francisco Muñoz Martínez, Cristina Gracía Fontana, Matilde Fernandez 2, Bertrand Morel 3, Álvaro Ortega 4, Juan Luís Ramos, Tino Krell Estacion experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 Bioilíberis SL, Granada, ES, 3 Departamento de Química Física, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 4 Universidad de Murcia, Murcia, ES The paralogous receptors PctA, PctB and PctC of Pseudomonas aeruginosa were reported to mediate chemotaxis to amino acids, intermediates of amino acid metabolism and chlorinated hydrocarbons. We show that the recombinant ligand binding regions (LBRs) of PctA, PctB and PctC bind 7, 5 and 2 L-amino acids, respectively. In addition, PctC-LBR recognized GABA but not any other structurally related compound. L-Gln, one of the three amino acids that is not recognized by PctA-LBR, was the most tightly binding ligand to PctB suggesting that PctB has evolved to mediate chemotaxis primarily towards L-Gln. Bacteria were efficiently attracted to L-Gln and GABA, but mutation of pctb and pctc, respectively, abolished chemoattraction. The physiological relevance of taxis towards GABA is proposed to reside in an interaction with plants. LBRs were predicted to adopt double PDC (PhoQ/ DcuS/CitA) like structures and site directed mutagenesis studies showed that ligands bind to the membrane-distal module. Analytical ultracentrifugation studies have shown that PctA-LBR and PctB-LBR are monomeric in the absence and presence of ligands, which is in contrast to the enterobacterial receptors that require sensor domain dimers for ligand recognition. P8-46 Protein kinase CK2 affects the stability of the HB-EGF receptor ErbB4 in 786-O cells E. Alcaraz, J. Vilardell, E. Sarró 2, M. Plana, A. Meseguer 2, E. Itarte Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2 Fisiopatologia Renal, CIBBIM, Institut de Recerca Hospital Universitari Vall Hebron, Barcelona, ES Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), a member of the EGF family, binds and activates ErbB and ErbB4. ErbB4 is expressed as different alternatively spliced isoforms that are characterized by variant extracellular juxtamembrane (JM) and intracellular cytoplasmic (CYT) domains. The JM domain of type a (JM-a) can be cleaved by ADAM 7 in response to binding of ligands to the receptor, or the activation of PKC. The proteolytic fragment can be further cleaved by γ-secretase, which releases the intracellular domain as a soluble fragment of 80kDa (CYT2-ICD) which can translocate into the nucleus where it functions as a co-activator or co-repressor for a number of transcription factors. In previous studies we had observed that protein kinase CK2 was involved in the response to HB-EGF in the renal cell carcinoma 786- O cell line. To study the potential role of CK2 in ErbB4 receptor processing, we generated a stable transfected 786-O cell line that expresses JMa-Cyt2 ErbB4 isoform, characteristic of renal cells. Treatment of these cells with the CK2 inhibitor CX-4945 resulted in a marked reduction of ErbB4 levels. Under the same conditions, CX-4945 did not affect the levels of the membrane 7

Pósters XXXVII Congreso SEBBM protein transferrin receptor or of the CK2 substrate Iκ. Destabilization of ErbB4 promoted by CX-4945 did not cause to the accumulation of CYT2- ICD, as occured in response to HB-EGF or PMA, but to the complete loss of bands detected with the anti-erbb4 antibody. Treatment with lysosomal proteinases inhibitors (leupeptin and pepstatin) attenuated the effect of CX- 4945 on CYT2-ICD leading to its accumulation. Moreover, interaction between CK2 (CK2α and, in particular, CK2β subunit) and ErbB4 receptor has been detected by pull down analysis, and downregulation of CK2β using sirnas decreased the expression of ErbB4. To sum up, CK2 seems necessary to maintain ErbB4 levels within the cell. Supported by grants BFU2009-089 (MCINN) and SAF-20-29506 (MINECO). P8-47 MDN-0066 a novel inhibitor of VHL/HIF pathway produced by a new Pseudomonas species Bastien Cautain, Nuria De Pedro, Javier Pascual, Jesus Martin, Fernando Reyes, Olga Genilloud, Francisca Vicente Fundacion MEDINA, Armilla, ES Throughout recent history, metabolites of microbial origin have had an extraordinary impact on the welfare of humanity. In fact, natural products have largely been and still are considered an exceedingly valuable platform for the discovery of new drugs against diverse pathologies. Such value is partly due to their higher complexity and chemical diversity as compared to those of synthetic and combinatorial compounds. Mutations in the Von Hippel-Lindau (vhl) gene are responsible for VHL disease, congenital polycythemia, and are found in many sporadic tumor types. The primary cause of morbidity and mortality for these patients arises from progression of Renal Cell Carcinoma (RCC) or end-stage renal disease. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (vhl) tumor suppressor gene arises in the majority of Renal Cell Carcinoma (RCC) as well as in other types of cancer and is associated with a high degree of vascularization and poor prognosis. Loss of pvhl function thus represents a pathognomonic molecular defect for therapeutic exploitation. In this study, renal carcinoma cell lines with naturally occurring vhl mutations (RCC4 VA) and their genetically matched wild-type vhl (RCC4 VHL)counterparts were seeded onto 96-well plates and treated with a collection of,040 organic extracts obtained from 30 unicellular bacteria strains belonging to at least 25 genera of the phyla Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria and Bacteroidetes. This strategy allowed us to identify several extracts obtained from the bacterial strain F-278,770 T showing biological activities not associated with previously known active metabolites. The fractionation and structural elucidation of one of these extracts led to the discovery of a new lipodepsipeptide (MDN-0066) with specific toxicity in pvhl deficient cells that is not detectable in cells with pvhl expression rescue. This discovery demonstrated the feasibility of selectively targeting the loss of the vhl tumor suppressor gene for potential clinical benefit and may have great impact on the development of new targeted therapies from natural product for the treatment of cancer and other genetic diseases. P8m-48 Papel de la proteína de unión a ARN Sam68 en la señal de la leptina y la insulina en células de la granulosa Teresa Vilariño García, Antonio Pérez-Pérez 2, Victor Blasco Rodriguez 3, Nicolás Prados Nodd 3, Manuel Fernández Sánchez 3, Víctor Sánchez Margalet 2 Departamento Bioquimica Médica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de Sevilla, Sevilla, ES, 2 Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular, Hospital Universitario Virgen Macarena, Facultad de Medicina, Sevilla, ES, 3 Instituto Valenciano de infertilidad de Sevilla, Sevilla, ES La obesidad es un problema medico no solo porque se asocia a la diabetes tipo 2 y al riesgo cardiovascular, sino también por porque se asocia a ovario poliquístico, resistencia a la insulina y subfertilidad en la mujer en edad reproductiva. La proteína de unión a ARN Sam68 se expresa en células de la granulosa y las hembras de los ratones knockout son subfértiles, con problemas de ovulación. Ya que hemos encontrado que Sam68 puede reclutarse a la señal de los receptores de insulina y leptina, planeamos estudiar la participación de Sam68 en la señal y la acción de los receptores de insulina y leptina en células de la granulosa. Además, estudiamos la expresión de Sam68 en células de la granulosa en respuesta a la leptina y la insulina in vitro. Las células de la granulosa se obtuvieron a partir de la obtención de ovocitos para la fertilización invitro. La señalización se studio por inmunoprecipitación e inmunoblot de las proteínas fosforiladas. La expression de Sam68 se inhibe por estrategia antisentido. El nivel de expression de Sam68, los receptors de leptina e insulina se cuantificaron por RT-PCR e inmunoblot. Hemos encontrado que Sam68 se tirosín-fosforila por estimulación con insulin o leptina en células de la granulosa, reclutando Sam68 a los complejos de señalización y disminuyendo la capacidad de unión al ARN. Además, tanto la leptina como la insulina aumentan la expresión de Sam68 en las células de la granulosa. Finalmente, la expresion de Sam68 es necesaria para la activación completa de las vías de señalización PI3K y MAPK, por insulin y leptina en células de la granulosa. En conclusion, Sam68 es reclutado a la señal del receptor de leptina e insulin, su expression se induce por ambas hormonas, y la expression de Sam68 es necesaria para la completa activación de la transducción de la señal de los receptores de insulina y leptina. Sam68 puede ser un nuevo elemento en la resistencia a la insulina ovárica y la fertilidad disminuida en mujeres obesas P8r-49 β3 Integrin is essential for invadopodia formation in TGF-β lung carcinoma treated cells Rafael Peláez Cristóbal, Xabier Morales, Elisabeth Salvo, Saray Garasa, Ana Rouzaut Universidad de Navarra/CIMA, Pamplona, ES Tumor cell migration and invasion are crucial events during cell metastasis, which is the main cause of death in patients with cancer. Depending on the mechanical properties of the tumor stroma, cancer cells develop invasive actin-rich structures capable of degrading the surrounding extracellular matrix (ECM) known as invadopodia. Integrins are transmembrane proteins implicated in cell adhesion and migration. Integrin activation induces signaling cascades conducive to the reorganization of cell cytoskeleton. Recent reports have demonstrated the presence of different integrins surrounding the invadopodia core in breast and melanoma cancer cells. β3 integrin and αvβ3 heterodimer have been associated with poor prognosis and increased metastasis in several carcinoma types. We aimed to determine whether β3 integrin participates in invadopodia formation in lung carcinoma cells. We based our hypothesis on our previous findings of specific TGF-β induction of β3 integrin dependent metastasis in lung carcinoma cells. In this study, we demonstrated that β3 integrin is temporarily allocated on the invadopodia of H57 NSCLC cells. β3 integrin silencing or functional blockade completely abrogates invadopodia formation, even after treatment with TGF-β (a cytokine that significantly induces invadopodia formation) while β3 integrin re-expression restores the capacity of invadopodia formation in integrin deficient cells. Moreover, integrin activation induces different signal pathways (FAK, SRC, ERK and Small GTPases family) allowing invadopodia formation. In conclusion, we demonstrated a dual role of the β3 integrin in invadopodia formation during cancer cell metastasis: it contributes to the initial cell 72

Granada 204 Pósters adhesion and then it activates signal pathways implicated in invadopodia formation. P8r-50 Mecanismos de regulación de la expresión de ENA en respuesta a ph alcalino: un estudio cuantitativo Maria López Malo, Silvia Petrezselyova, David Canadell, Joaquín Ariño UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Barcelona, ES La alcalinización del medio supone una situación de estrés para la levadura Saccharomyces cerevisiae, que conlleva una respuesta adaptativa que da lugar a un remodelado de la expresión génica. Uno de los genes relevantes para la adaptación a ph alcalino es ENA, que codifica una Na + ATPasa implicada en la detoxificación de sodio. En la regulación del gen ENA por ph alcalino están implicadas diversas rutas de señalización. Una de ellas está mediada por la proteína calcineurina que desfosforila el factor transcripcional Crz, permitiéndole la entrada en el núcleo y por tanto la unión a las secuencias específicas activando el gen. La respuesta independiente de calcineurina está bajo el control de dos rutas diferentes, Rim0 y Snf, en las que está implicado el represor Nrg. Si bien este proceso ha sido caracterizado desde un punto de vista cualitativo, no ha sido investigado desde un punto de vista cuantitativo, que permita eventualmente el modelado del mismo. Para ello hemos analizado a lo largo del tiempo en células expuestas a estrés alcalino diversos parámetros como la tasa de transcripción y la cantidad de marn de ENA, la cantidad de Crz, su transición citosol-núcleo y su cinética de unión al promotor de ENA, así como la cantidad de Ena producida. Un análisis similar para el represor Nrg está en curso. De esta manera confiamos definir los parámetros que gobiernan la expresión de Ena en respuesta a estrés alcalino. P8-52 TGFβ2 dictates disseminated tumor cell fate in target organs through TGFβ-RIII and p38α/β signaling Paloma Bragado Domingo IDIBAPS, Barcelona, ES Metastases are thought to arise from disseminated tumor cells (DTCs) that can either initiate growth immediately or reprogram into dormancy. In this state they can remain undetected for long periods before resuming growth and forming overt metastases. The mechanisms driving dormancy of DTCs remain largely unknown. We hypothesize that via a seed and soil mechanism the target organ microenvironment where DTCs lodge controls the timing of DTCs dormancy and thus their fate. Using head and neck and breast cancer models we have studied the nature of the organ-derived signals that control the interconversion of DTCs between dormancy and proliferation states. We found that the bone marrow (BM) represents a growth restrictive micro-environment in which DTCs persist for long periods of time in a quiescent/dormant state. In this tissue, host-derived TGFβ2, but not TGFb, signaling, activates p38α/β, inducing a [ERK/p38] low signaling ratio. This results in induction of DEC2/ SHARP and p27, downregulation of CDK4 and dormancy of malignant DTCs. TGFβ2-induced dormancy required TGFβ -receptor-i, TGFβ -receptor- III and SMAD/5 activation to induce p27. In contrast, in lungs, which is a site commonly permissive for metastasis, TGFb2 signals are weaker and only a short-term dormancy ensues before DTCs start proliferating and fuel metastases. Importantly, systemic inhibition of TGFβ-receptor-I or p38α/β activities awakened dormant DTCs fueling multi-organ metastasis. Our work reveals a seed and soil mechanism where TGFβ2 and TGFβRIII signaling through p38α/β regulate DTC dormancy and defines restrictive (BM) and -permissive (lung) microenvironments for HNSCC metastasis. By identifying key pathways controlling dormancy we open opportunities for eradication of the residual disease. P8r-5 Búsqueda de nuevos mecanismos de actuación de la proteína fosfatasa Ptc Laura Tatjer Recorda, Asier González Seviné, Joaquín Ariño Carmona UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Sabadell, ES Las proteínas fosfatasas de tipo 2C (PP2C) conforman una familia de enzimas monoméricas, conservadas a lo largo de la evolución, que en S. cerevisiae están codificadas por 7 genes estructuralmente relacionados (PTC-7). La isoforma más estudiada en levaduras es Ptc, ya que ésta puede desempeñar múltiples funciones específicas no compartidas con las otras PP2C. Como consecuencia, un mutante ptc presenta defectos de crecimiento ante diversas formas de estrés, como los que activan la vía de señalización de la integridad de la pared celular (p. ej., ph alcalino y el blanco de calcoflúor) o en presencia de rapamicina, un inhibidor de la vía TOR, la cual señaliza la falta de nutrientes. Con el objeto de identificar posibles dianas de la acción de Ptc, hemos rastreado bibliotecas genómicas para encontrar genes que, en sobreexpresión, alivien el fenotipo de sensibilidad a ph alcalino, blanco de calcoflúor y rapamicina del mutante. Como resultado de la búsqueda se han aislado un total de 25 genes que suprimen o alivian uno o varios fenotipos característicos del mutante ptc. Nos hemos centrado en el estudio de PPH2 y PPH22, que codifican dos subunidades catalíticas redundantes de la proteína fosfatasa de tipo 2A. Los resultados obtenidos nos indican que la carencia de Ptc estaría alterando los diferentes complejos fosfatasa-tap42, que actúan como efectores de la vía TOR cuando ésta es inhibida. Financiado por BFU20-3097-C3-0. P9. Transgénesis en mamíferos P9r- IGFR (insulin-like growth factor type receptor) regula la regeneración del epitelio bronquiolar induciendo la diferenciación de las células de Clara Sergio Piñeiro-Hermida, Icíar P. López, Raquel Torrens, José G. Pichel Centro de Investigación Biomédica de la Rioja (CIBIR), Fundación Rioja Salud, Logroño, La Rioja, ES Los IGF (insulin-like growth factors) son factores pleiotrópicos que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia celular activando el IGFR, su receptor específico. Controlan el desarrollo y la homeostasis del pulmón, su regeneración tras daño y participan en enfermedades pulmonares como el síndrome de distrés respiratorio, la fibrosis y el cáncer. Aunque la expresión pulmonar de IGFR es ubicua y sus niveles son elevados en el epitelio, la acción de IGFR depende de la disponibilidad de los ligandos, del momento del desarrollo y del tipo celular. Como los ratones deficientes en IGFR mueren al nacer por insuficiencia respiratoria debido a la hipoplasia e inmadurez pulmonar, para determinar la función de IGFR en el epitelio del pulmón murino adulto se generaron mutantes condicionales Nkx2.-Cre; Igfr fl/fl, que expresan la recombinasa Cre en el epitelio respiratorio. Estos ratones mutantes expresan niveles reducidos de mrna de Igfr en el pulmón, presentan alteraciones en el epitelio bronquiolar terminal (adelgazamiento, reducción de la densidad celular y aumento de la proliferación), pero sin impacto morfológico aparente en el parénquima alveolar. Durante la recuperación del daño bronquiolar inducido por la ablación selectiva de las células epiteliales de Clara con naftaleno, la deficiencia de Igfr mantiene los defectos histológicos, dispara la proliferación y retrasa su diferenciación. In vitro, los IGF inducen la expresión de CCSP (Clara Cell Secreted Protein) en células epiteliales bronquiolares humanas. 73

Pósters XXXVII Congreso SEBBM Los resultados demuestran que la señalización mediada por IGFR en el epitelio respiratorio regula la regeneración del epitelio bronquiolar dañado, induciendo la diferenciación de las células de Clara. P9-2 (R03_9-2) Retos y nuevas oportunidades en transgénesis animal mediante las nucleasas de edición genómica CRISPR-Cas9 Lluís Montoliu, Davide Seruggia Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES Las primeras células troncales pluripotentes embrionarias (ES) de ratón se describieron en 98 por Martin Evans. En 986, Mario Capecchi integró el uso de dichas células y la experiencia en recombinación homóloga desarrollada por Oliver Smithies para diseñar el protocolo de inactivación dirigida de genes en el genoma de ratón, proceso por el cual los tres investigadores recibieron el premio Nobel en 2007. Durante años esta poderosa tecnología ha permanecido relativamente invariable y ha permitido la generación de miles de mutaciones en el genoma de ratón. El panorama cambió a partir de 2009, cuando se publicaron las primeras ratas con genes inactivados mediante el uso de ZFN. Las nucleasas dirigidas de dedos de zinc (ZFN) están constituidas por unas proteínas quiméricas con un dominio de unión a DNA, variable, en función de la secuencia a inactivar, y un dominio de corte (endonucleasa) de DNA en doble cadena, derivado del enzima de restricción FokI. Un par de años más tarde, en 20, apareció la segunda generación de nucleasas de edición genómica, las TALEN, en los que de nuevo un dominio de unión a DNA se combinaba con un dominio endonucleasa. Pero la verdadera revolución no llegaría hasta 203, cuando se publicaron los primeros trabajos demostrando el uso de las nucleasas CRISPR-Cas9, derivadas de bacterias, en las que el reconocimiento no estaba mediado por una proteína sino por una pequeña secuencia de RNA que posteriormente interaccionaba con el dominio endonucleasa (Cas9). Esta tercera (por el momento) versión de las nucleasas de edición genómica ha supuesto una verdadera revolución en la manera como diseñar y generar alteraciones genéticas de diverso tipo en prácticamente cualquier organismo. En el laboratorio hemos realizado la transición desde las TALEN a las CRISPR-Cas9 con éxito, y por ello comentaré las ventajas y las limitaciones de estas fabulosas nuevas herramientas de modificación genómica que están llamadas a substituir, prácticamente por completo, nuestro trabajo de mutaciones, tradicionalmente abordado a través de células ES. P9r-3 Inactivación de regiones intergénicas mediante CRISPR-Cas9 en el genoma de ratón Davide Seruggia, Marta Cantero, Lluis Montoliu Centro Nacional de Biotecnologia (CNB-CSIC), Madrid, ES Apenas un 2% del genoma de mamíferos está ocupado por regiones génicas que codifican para proteínas. El resto del genoma está plagado de secuencias de ADN repetidas y de elementos reguladores de la expresión génica, esenciales para el control en tiempo y espacio de la transcripción. Nuestro laboratorio está interesado en el estudio estructural y funcional de las secuencias aisladoras genómicas, capaces de delimitar dominios de expresión e impedir la interacción entre loci vecinos. Uno de nuestros modelos experimentales es el locus de la tirosinasa de ratón, cuya mutación está asociada con albinismo. En experimentos anteriores demostramos la existencia de regiones aisladoras genómicas en posición 5 y 3 del locus de la tirosinasa de ratón. En particular, la región 5 contiene elementos fundamentales para la expresión correcta de este gen que cuando se eliminan en construcciones transgénicas condicionan una expresión variegada. Desde hace muchos años nuestra intención era reproducir los experimentos realizados sobre transgenes en el propio locus endógeno. Sin embargo, la presencia de múltiples secuencias repetitivas alrededor de estas secuencias intergénicas reguladoras impedía la aplicación de aproximaciones tradicionales, basadas en recombinación homóloga en células ES. Con la aparición de las nuevas nucleasas de edición genómica, en particular con las CRISPR-Cas9 ha sido posible diseñar una estrategia para eliminar estas secuencias reguladoras, intergénicas, directamente del locus endógeno. Los primeros resultados obtenidos han sido extraordinariamente positivos, con alteraciones fenotípicas evidentes similares a las obtenidas anteriormente durante el análisis de ratones transgénicos. En este trabajo presentaremos los resultados obtenidos aplicando la tecnología CRISPR- Cas9 para la inactivación específica de secuencias intergénicas in vivo, en el genoma de ratón. P9r-4 (R03_9-4) Antizyme Inhibitor 2 expression in the adrenal gland: study with knock-out mice Ana Lambertos Escudero, Bruno Ramos Molina 2, Carlos López García 2, Cristina Peñafiel Verdú 2, Andrés Joaquín López Contreras 2, Asunción Cremades Campos 2, Rafael Peñafiel García 2 University of Murcia, Los Alcázares, Murcia, ES, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology B and Immunology, Faculty of Medicine, University of Murcia, Murcia, ES Polyamines are small organic cations essential for cell proliferation, differentiation and survival. Ornithine decarboxylase (ODC), the key enzyme controlling polyamine biosynthesis, is negatively regulated by proteins termed antizymes (AZs). We recently described a novel antizyme inhibitor (AZIN2) that stimulates ODC activity and polyamine uptake. To gain insight on the tissue expression profile of AZIN2 and to explore its possible physiological role, we generated Azin2 knock-out mice expressing bacterial β-d-galactosidase as a reporter gene, under the control of the Azin2 endogenous promoter, what allows a very sensitive and specific detection of the expression of the gene in the tissues of transgenic mice. Whole mount analysis and histochemical detection of lacz using X-gal staining revealed that Azin2 is expressed in the medulla but not in the cortex of adrenal glands. The majority of chromaffin cells displayed a granular-like reactivity, with clusters of cells with both cytosolic and a more intense superimposed granular staining. No sexual dimorphism was observed. Azin2 mrna levels were halved in heterozygous and dramatically reduced in homozygous mice. Adrenal polyamine and catecholamine content and mrna levels of genes related with polyamine metabolism were not affected by Azin2 deficiency. Microarray analysis comparing gene expression in wild type and knock-out mice identified 28 genes that were down-regulated more than 2-fold in the adrenal gland of transgenic mice and 67 genes up-regulated. Bioinformatics tools suggest that both catecholamine secretion and the amount of secretory vesicles may be reduced in the adrenal gland of knock-out mice. These results support the previous view that AZIN2 may participate in vesicular trafficking and secretion. (Supported by SAF20-2905). P9-5 (R03_9-5) Generación de translocaciones cromosómicas en células humanas asociadas a cáncer mediante el empleo de CRISPR-Cas9 Juan Carlos Ramírez, Raúl Torres, Sandra Rodríguez-Perales 2 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC, Madrid, ES, 2 Centro Nacional Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, ES Las translocaciones son un tipo de reordenamiento cromosómico frecuentemente descrito en el inicio y/o evolución de muchos tipos de cáncer. Algunas de ellas producen oncogenes que son responsables de la transformación maligna. El mecanismo específico que genera este tipo de reordenamiento es complejo y aún no se conoce en detalle, pero siempre es desencadenado por la dos roturas de doble hebra (DSB) en el ADN de dos cromosomas no homólogos. La reparación errónea de esas roturas al reunir 74

Granada 204 Pósters de manera ilegítima los dos fragmentos de los cromosomas rotos resulta en la generación de translocaciones. Para poder tener un conocimiento más completo sobre como afectan las translocaciones cromosómicas al inicio del cáncer es necesario reproducir de manera precisa estos reordenamientos. Hemos desarrollado una nueva estrategia para inducir translocaciones cromosómicas específicas basada en la capacidad del sistema CRISPR-Cas9 de inducir DSBs en localizaciones específicas. Como modelos de estudio hemos elegido las translocaciones t(8;2)/ RUNX-ETO y t(;22)/ewsr-fli, características de algunos tipos de leucemia mieloide aguda y del sarcoma de Ewing. Usando el sistema CRISPR-Cas9 hemos sido capaces de inducir con una elevada frecuencia estas translocaciones tanto en líneas celulares establecidas, como en células progenitoras humanas (células hematopoyéticas y mesenquimales). El análisis por FISH y la secuenciación a nivel de ADN, ARN y proteína de los genes de fusión generados revelan una alta fiabilidad y precisión del sistema CRISPR-Cas9, proporcionando una nueva herramienta muy poderosa para el estudio del cáncer lo que podría llevar al desarrollo de nuevas terapias basadas en los productos de estas translocaciones. P20. Transportadores de membrana P20- (R20-) Role of Aquaporins in cell proliferation: Functional inhibition of AQP3 with a gold-based compound Miriam Echevarría Irusta, Ana Galán-Cobo, Ana Serna, Reposo Ramírez Lorca, Ismael Sánchez Gomar, Juan José Toledo-Aral Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla (Departamento de Fisiología Médica y Biofísica) - Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Respiratorias (CIBERES) y Neurodegenerativas (CIBERNED), Sevilla, ES Objective: Numerous studies indicated an abnormal AQPs expression in tumor of different origins and a role for these proteins in angiogenesis, cell migration and proliferation had been shown. Recently we verified that the gold (III) complex Auphen significantly inhibits the cell proliferation of AQP3 expressing cells. Then to better understand the role AQPs may play in the cell proliferation process we explore the effects that stable overexpression of these proteins (o-aqps) produce over the proliferation and cell cycle of wt-pc2 cells as a cellular model. Methods: Cell cycle by flow cytometry with propidium iodide and cell proliferation through cell counting and BrdU staining were used. Using Nocodazole we evaluated the cell response to arrest its cell cycle and the resistance to apoptosis by Annexin V staining; and proteomic and transcriptomic techniques were performed to highlight key molecules implicated in cell proliferation which expression may be altered by overexpression of AQPs. Finally, in cells with large expression of AQP3 we explore the effect of Auphen over cyclins expression and cell cycle progression. Results: Cells with o-aqps showed higher cell proliferation rate and larger percentage of cells in phases S and G2/M. After 24h in the presence of Nocodazole, o-aqps cells exhibited less modification of the cell cycle pattern and lower Annexin V specific staining consistent with a higher resistance to apoptosis. Additionally, in AQP3-expressing cells treated with Auphen, strong arrest of the cell cycle in the S-G2/M phases, in concordance with the analysis of cyclins (A, B, D, E) levels was observed. The RTqPCR analysis comparing o-aqps cells to wt cells validated interesting changes in the expression of molecules related with cell proliferation, tumor and cell cycle progression, such as, Zeb2, Jun, JunB, NF-kβ, Cxcl9, Cxcl0, TNF, and TNF receptors. Conclusions: The significant role of AQPs in the cell proliferation process seems to be connected to increments in the cell cycle turnover. Our results support the view that larger expression of AQPs confers to the cell a more tumor-like phenotype that contributes to explain the presence of these proteins in much different type of tumors. A potential therapeutic effect of Auphen in tumors where cell proliferation can be associated with AQP3 seems promising, but more studies are necessary to clarify this issue. P20-2 (R20-6) Occurrence of carbon catabolite repressionregulated mechanism involved in the transport of extracellular ADP-glucose in Escherichia coli Goizeder Almagro, Manuel Montero, Alejandro M. Viale 2, Mehdi Rahimpour, Abdelhatif Bahaji, Francisco José Muñoz, Edurne Baroja-Fernández, Javier Pozueta-Romero Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), Mutilva, ES, 2 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR, CONICET), Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, AR ADP-glucose is the precursor molecule for glycogen and starch biosynthesis in bacteria and plants, respectively. Due to the high abundance of this nucleotide-sugar in tubers and endosperms present in the normal diet of many animals, we explored the possible occurrence of an ADP-glucose transport system in the enterobacterial species Escherichia coli. To avoid artifacts resulting from the possible conversion of periplasmic ADP-glucose breakdown products into glycogen, in this work we used glglc and pgm null mutants unable to catalyze the reversible conversion of ADP-glucose into glucose--p, and glucose--p into glucose-6-phosphate, respectively. Noteworthy, these cells converted the exogenoulsy added ADP-glucose into glycogen. Uptake of ADP-glucose was confirmed by the disappearance of this nucleotide-sugar from the culture medium. ΔpgmΔptsG, ΔpgmΔptsH, ΔpgmΔptsI and ΔpgmΔcrr cells impaired in the PTS components produced glycogen from exogenously added ADP-glucose, indicating that the transport of this nucleotide-sugar is not mediated by PTS. Furthermore, ΔpgmΔcyaA and ΔpgmΔcrp cells, both impaired in the CRP-cAMP carbon catabolite repression mechanism, neither incorporated ADP-glucose nor produced glycogen from ADP-glucose, demonstrating that the uptake of this nucleotide-sugar is CRP-cAMP regulated in E. coli. Finally, using a systematic and comprehensive gene-disrupted mutant collection of E. coli we identified some genes belonging to the CRP-cAMP regulon encoding membrane proteins whose absence impair ADP-glucose transport. P20-3 (R20-2) Insights into the functional mechanism of secondary transporters revealed by X-ray crystallography José Luis Vázquez Ibar Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES Atomic structures of membrane transport proteins have revealed important insights regarding the functional mechanism of membrane transport proteins. In particular, these structures have confirmed the validity of the alternate-access model, predicted forty years ago, as the general mechanism used by these proteins to translocate substrates from one side to another side of the membrane. In addition, questions like how substrate is recognized by the transporter and how substrate triggers protein conformational changes are being answered combining these high-resolution crystal structures with biochemical and functional assays. In this regard, here I am presenting two examples of substrate induced-fit mechanism in secondary transport proteins, the initial step for substrate translocation. First, the latest crystal structure of the lactose permease of E. coli in occluded state with bound substrate reveals how substrate is able to sculpt the binding site; revealing some hints about substrate and proton-motive force coupling. Second, the structure of the onward-facing conformation of the L-arginine/agmatine exchanger of E. coli with bound substrate reveals the molecular mechanism of substrate-induced conformational changes in this transporter. 75

Pósters XXXVII Congreso SEBBM P20r-4 (R20-4) Bases moleculares del efecto dominante negativo de una mutación de GlyT2 asociada con hiperplexia Esther Arribas González, Jaime de Juan Sanz 2, Carmen Aragón Rueda 3, Beatriz López Corcuera 3 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM - IdiPAZ- Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2 Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College, New York, US, 3 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES La hiperplexia o enfermedad de sobresalto es un síndrome clínico raro caracterizado por una respuesta exagerada a estímulos triviales auditivos o táctiles. Este trastorno neurológico puede producir daño cerebral y/o muerte súbita en neonatos debido a episodios de apnea y fallos cardiorrespiratorios. La enfermedad es causada por un déficit en la neurotransmisión glicinérgica inhibidora. La forma presináptica de la hiperplexia puede originarse por mutaciones en el gen humano del transportador neuronal de glicina GlyT2 (SLC6A5). GlyT2 media el reciclado de la glicina desde la hendidura hasta el terminal presináptico constituyendo la principal fuente de neurotransmisor liberado en las sinapsis glicinérgicas. Aunque la mayoría de las mutaciones detectadas son recesivas, produciendo pérdida de función bialélica por inactividad del transportador o por su ausencia de la membrana, hay un mutante dominante negativo sobre el tráfico de GlyT2. Hemos explorado las propiedades y alteraciones estructurales de este mutante y analizado el efecto dominante negativo que retiene a GlyT2 en el retículo endoplasmático impidiendo su expresión en superficie. La introducción de una arginina en lugar de Ser- 52 altera el plegamiento del transportador y promueve mejor asociación con la chaperona calnexina, menor unión a Sec24D y, por tanto, retención en retículo. Hemos demostrado la formación de oligómeros comunes GlyT2-S52R. La sobreexpresión de calnexina rescata el efecto dominante negativo incrementando la cantidad de GlyT2 que alcanza la membrana y reduciendo la interacción entre GlyT2 y su mutante. El rescate por chaperonas químicas ha sido investigado en un sistema heterólogo y en cultivos primarios de neuronas. P20r-5 (R20-5) Regulación del transportador neuronal de glicina GlyT2 por el receptor purinérgico P2X3 Lucía Villarejo López, Esperanza Jimenez 2, Carmen Aragon 3, Beatriz López-Corcuera 3 Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2 Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC, UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital Universitario La Paz, UAM, Madrid, ES, 3 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES La glicina es el neurotransmisor inhibidor más abundante en áreas caudales del sistema nervioso central, desempeña un importante papel en la generación de ritmos motores y permite el procesamiento de señales nociceptivas, sensoriales y respuestas reflejas espinales. Es, además, un activador del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) en vías glutamatérgicas excitadoras donde funciona como agonista obligado del glutamato. La neurotransmisión mediada por glicina finaliza cuando es retirada de la hendidura sináptica por los neurotransportadores (GlyT) presentes en las membranas plasmáticas de la glía adyacente (GlyT) y en los botones presinápticos de neuronas glicinérgicas (GlyT2). Las dos isoformas han sido asociadas a la patogénesis de ciertos desórdenes del sistema nervioso como la esquizofrenia, alteraciones cognitivas, dependencia de alcohol, dolor, epilepsia, desórdenes respiratorios e hiperplexia o enfermedad del sobresalto, un desorden neurológico humano caracterizado por sobresaltos enérgicos y generalizados en respuesta a estímulos triviales acústicos o táctiles asociado con una deficiente neurotransmisión glicinérgica inhibidora cuya segunda causa principal son mutaciones en el gen humano de GlyT2. Un aspecto de gran interés es el estudio del papel de los transportadores de glicina GlyT y GlyT2 en vías nociceptivas, ya que la red de interneuronas glicinérgicas localizadas en las astas dorsales de la médula espinal regulan la transmisión de la señal dolorosa desde la periferia a regiones superiores del cerebro. Trabajos de eliminación génica han revelado que la actividad de los GlyTs, puede modular la neurotransmisión glicinérgica, por lo que conocer la regulación de los GlyTs en vías nociceptivas puede tener consecuencias terapeúticas. De hecho, la inyección intratecal de inhibidores de GlyTs produce analgesia en modelos animales de dolor. Estudios previos, han demostrado que la neurotransmisión glicinergica puede regularse por la actividad de receptores purinérgicos. En este trabajo, hemos descrito cómo el receptor P2X3 es capaz de regular la actividad de transporte de GlyT2 y proponemos las rutas de señalización que median esta comunicación intercelular entre neuronas sensoriales e interneuronas glicinérgicas. P20-6 (R20-3) Modulación del tráfico de los transportadores de nucleósidos concentrativos (CNT) a la membrana plasmática y sus implicaciones en la acción de fármacos derivados de nucleósidos Paula Fernández-Calotti Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Barcelona, Instituto de Biomedicina (IBUB). CIBERehd, Barcelona, ES Los análogos de nucleósidos (AN) constituyen una clase importante de antimetabolitos proapoptóticos utilizados en el tratamiento de neoplasias hematológicas, tumores sólidos y enfermedades infecciosas. El ingreso de estas moléculas a las células se produce a través de los transportadores de nucleósidos de membrana (TN) concentrativos (hcnt) y equilibrativos (hent) contribuyendo a la biodisponibilidad del fármaco y a la citotoxicidad o capacidad antiviral del mismo. La resistencia a los AN se ha relacionado a la biodisponibilidad y la entrada a las células entre otras causas. La regulación de la actividad de los TN de forma específica es un enfoque adecuado para modular la biodisponibilidad de un determinado AN. Demostramos que el ácido transretinoico (ATRA) induce el tráfico de hcnt3 a la membrana plasmática causando un aumento en su actividad y en la consecuente entrada del AN fludarabina en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) causando una reversión de la resistencia al fármaco. Recientemente hemos observado que el tráfico de hcnt3 en células de colon depende de la interacción directa de la porción amino terminal del hcnt3 con Galectina 4. Por otro lado, la terapia combinada para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C implica interferón α (IFNα) y el AN ribavirina. Aunque en condiciones basales hent es el principal transportador de ribavirina, ningún estudio ha evaluado el papel de hcnt2, un excelente potencial transportador de ribavirina, en presencia de IFNα. Demostramos que IFNα induce un rápido y transitorio aumento de la actividad hcnt2 en células HHL5 derivadas de hepatocitos y un consecuente incremento en la entrada de ribavirina a estas células. Es evidente que la expresión de los TN posee un papel fundamental en la biodisponibilidad y en la respuesta a fármacos AN. El análisis del patrón de expresión de TN podría ser útil como biomarcador del metabolismo y acción de fármacos asi como también para predecir la respuesta a una determinada terapia. Por lo tanto, el estudio de las propiedades regulatorias de cada TN es fundamental para la mejora de los tratamientos antitumorales y antivirales. 76