Enzygnost* Anti-HBc/IgM

Enzygnost* Anti-HBc/IgM Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to hepatitis B (core) antigen in serum or plasma Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen das Hepatitis B (core)-antigen in Serum oder Plasma Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre l antigène de core de l hépatite B dans le sérum ou le plasma Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM contro l antigene «core» dell epatite B nel siero o nel plasma Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos de la IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno core da hepatite B no soro e no plasma English: Page 2 to 19 Deutsch: Seite 10 bis 17 Français: Pages 18 à 25 Italiano: Pagina 26 fino 33 Español: Pagina 34 hasta 41 Português: Páginas 42 a 49 Test procedure and programming steps Page 19 Testdurchführung und -programmierung Seite 17 Réalisation et programmation du test Page 25 Esecuzione e programmazione de test Pagina 33 Programación y realización del test Página 41 Procedimento e programação Página 49 Bibliography/Literatur/Littérature/ Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 50 OWSE G13 C0541 (909) H/R 1 Edition February 2004

Enzygnost* Anti-HBc/IgM Intended Use Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to hepatitis B (core) antigen in serum or plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP II, BEP III and BEP 2000 ELISA processors. The test was developed for investigation of individual samples, not pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation In almost all cases of acute hepatitis B infection, IgM antibodies to hepatitis B core antigen (anti- HBc IgM) are produced shortly after the onset of viral multiplication and remain in the circulation for about 7 to 17 weeks. For this reason, a relatively reliable diagnosis of acute hepatitis B infection can be derived solely on the basis of this parameter since HBsAg and HBeAg may also occur in the serum in chronic hepatitis and thus further parameters (anti-hbs, anti-hbe or anti-hbc) need to be evaluated for the differential diagnosis. In some cases of acute hepatitis B infection, the HBs and HBe antigens may have already disappeared before the onset of clinical symptoms, but the corresponding antibodies may still not be detectable. In such cases the assay of total anti-hbc would provide no clarification because these are long-term antibodies which may still be present in the circulation even years after an infection, possibly as the only antibodies. This gap in the diagnosis of acute hepatitis B can be filled by the assay of anti-hbc IgM 1. Principle of the Method The HBc/IgM Antibodies contained in the test sample bind to the anti-human IgM antibodies coated onto the wells of the microtitre plate. POD-labelled HBc antigen binds to the specific HBc/ IgM antibodies. After removing the excess conjugate and unbound sample constituents the enzyme reaction of the bound conjugate is determined (blue colour reaction). The enzymatic conversion of the chromogen is terminated by the addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The intensity of the colour reaction is proportional to the concentration of antibodies contained in the sample. Reagents Materials provided Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM test plate 1 pcs. HBcAg/POD-Conjugate 3 x 0.6 ml Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) 3 x 6 ml Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) 3 x 40 ml Control Serum, positive (Anti-HBc/IgM) 1 x 0.3 ml Control Serum, negative (Anti-HBc/IgM) 1 x 0.5 ml Washing Solution POD (concentrate)** 1 x 100 ml Buffer/Substrate TMB** 1 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml Stopping Solution POD** 1 x 100 ml Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs. Adhesive foils 6 pcs. PE bag for storing unused strips 1 pcs. Barcode table 1 pcs. Instruction for Use 1 pcs. ** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 2 Edition February 2004

Composition Enzygnost* Anti-HBc/IgM (test plate): Microtitration plate coated with monoclonal antibodies to human IgM. HBcAg/POD-Conjugate: Genetically engineered HBc antigen, conjugated with peroxidase (POD). Preservative: phenol (max. 1 g/l) Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing Boviserin and Tween 20. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Sample Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing glycerol, Boviserin and Tween 20. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc/IgM Control Serum, positive: Stabilised human serum containing IgM antibodies to HBc antigen, diluted in Sample Buffer. Nominal absorbance: 0.7 Preservative: phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc/IgM Control Serum, negative: Stabilised human serum without antibodies to HBc antigen, diluted in Sample Buffer. Nominal absorbance: 0.1 Preservative: phenol (max. 1 g/l) Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution. Preservative: n-butanol (max. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochloride Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera has been tested for HBsAg, anti-hiv1, anti-hiv2 and anti-hcv. Only donations with negative findings are used for the manufacture of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative. Only donations with anti-hiv1, anti-hiv2 and anti-hcv negative findings are used for the manufacture of Anti-HBc/IgM Control Serum, positive. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material 2. This also applies particularly for the Anti-HBc/IgM Control Serum, positive, as the production procedure does not assure virus inactivation. 3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of the Reagents Bring all the reagents and samples to +18 to +25 C before beginning the test (without removing the test plate from its container/bag). For each test plate, dilute 20 ml of Washing Solution POD to 400 ml with distilled or deionized water. Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 ml of Chromogen TMB with 10 ml of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit and store closed and protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water. For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial. Predilute all the test samples (but not the control sera) in tubes 1+100 with Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) [e. g. 10 µl sample + 1000 µl Sample Buffer (Anti-HBc/IgM)]. Working Conjugate Solution: Withdraw the necessary amount from the vial of HBcAg/POD Conjugate and dilute 1+10 with the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM). OWSE G13 C0541 (909) H/R 3

For half a test plate withdraw 0.6 ml of HBcAg/POD Conjugate and add to an original vial (6 ml) of the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) (= 1+10). Storage and Stability Stored unopened at the stated temperature all the components of the Enzygnost* Anti-HBc/IgM may be used up to the dates given on the labels. For details on the stability and storage of the opened and diluted reagents, see Table 1 in the Appendix. Equipment required: BEP II: For automatic dispensing of reagent and washing BEP III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µl Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3 days at +2 to +8 C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. Procedure Test procedure using the BEP II 1. Dispense samples: Fill 4 wells with 10 µl / well of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative, and one well with 10 µl Anti-HBc/IgM Control Serum, positive; then fill the following wells with 10 µl / well of prediluted sample and, at the end of the set of samples or at the end of the test plate, fill one well with 10 µl of Anti-HBc/IgM Control Serum, positive. Then seal with foil. The pipetting steps must be performed within 15 min per test plate. 2. Incubate: Incubate at room temperature (+18 to +25 C) for at least 15 min (max. 30 min). 3. Dispense conjugate: Remove the foil. Without washing the wells, add 100 µl of Working Conjugate Solution to each necessary well, cover with fresh foil and then place into the incubator. 4. Incubate: Incubate at +37 C ± 1 C for 60 ± 2 minutes, then proceed immediately to "5. Wash". 5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 or 5 times (see Note) with approx. 0.3 ml/well of Washing Solution POD. 6. Add substrate: Pipette 100 µl of Working Chromogen Solution into each well. Seal the plate with fresh foil. 7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 C for 30 min ± 2 min. 8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in "6. Add substrate". 9. Read: Read at 450 nm within one hour. It is recommended to use a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams). Read the absorbances of the control and patient samples at 450 nm; the recommended wavelength for the reference measurement is 650 nm (if nesessary, between 615 and 690 nm). Test procedure using the BEP III Before using the BEP III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 at "Test procedure with the BEP II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP III. OWSE G13 C0541 (909) H/R 4

Test procedure using the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP 2000). Test validation The individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the mean values if: -0.010 A neg. 0.1 0.010 A pos. 0.7 If one of the absorbance values of the Anti-HBc/IgM Control Serum is outside the specification, this value can be neglected. Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these conditions are not fulfilled, the test is to be repeated. Evaluation On the BEP 2000 and BEP III the results are evaluated automatically. Please consult the instruction manuals for further details in this respect. The following sections apply if the results are evaluated without software assistance. Calculate the mean absorbance of the negative controls, then add 0.07 to obtain the cut-off value: A neg. + 0.07 = cut-off value In order to improve the reliability of results close to the cut-off the following retest range has been defined for the test: cut-off value ± 10% Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows: Test result: 1. A sample < cut-off - 10% ^= HBc/IgM antibody negative 2. A sample > cut-off + 10% ^= HBc/IgM antibody positive 3. cut-off 10% A sample cut-off + 10% ^= equivocal If an equivocal result is obtained the sample is to be retested. If, after the retest, it is still not possible to class the samples as positive or negative, the result is considered equivocal. Limitations of the Procedure 1.Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test result. 2.Lipaemic, icteric or haemolytic samples do not interfere with the test. In isolated rare cases, samples with high levels of rheumatoid factor accompanied by high levels of anti-hbc may result in elevated signals. 3.Samples containing antibodies to CMV, HAV, HIV, HCV, rubella virus, as well as samples which are positive for anti-hbs, do not interfere with the test result. 4.Samples from patients with raised transaminase values as well as samples containing autoantibodies and ANA were not found to interfere with the test result. 5.Samples containing antibodies to EBV as well as samples from haemodialysis patients may exhibit elevated reactivity. 6.Inadequately coagulated sera, samples containing sodium azide, and microbially contaminated samples, should not be used. Any particulate constituents (e.g. fibrin clots) should be removed before the assay. 7.For thawed samples ensure good homogenisation of the material. 8.Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Exceptions are Washing Solution POD, Stopping Solution POD and the Working Chromogen Solution (which is prepared from Chromogen TMB and Buffer/Substrate TMB using the required lots). 9.Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid). Do not perform the OWSE G13 C0541 (909) H/R 5

substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 10.The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 11.Highly reactive samples may cause precipitation of the dye during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation. 12.The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 13.Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. 14.Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 + 3 (see Appendix). To establish the sensitivity, a total of 192 anti-hbc/igm-positive samples were investigated. All the tested samples were found to be positive as defined by the criteria of the Enzygnost* Anti- HBc/IgM test. Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape detection when the test is used on a large scale. To establish the specificity, a total of 2559 anti-hbc/igm-negatvie samples were investigated and the specificty was found to be 99.60% to 99.91% (initial testing) and 99.91% to 100% (retest result). Deviations from these findings may occur due to variations in sample population, test procedure, etc. Current knowledge indicates that a positive result in the anti-hbc/igm test does not yield definite evidence of HBV infection, just as a negative test result also does not definitely exclude HBV infection. Reproducibility The results on intra-assay and inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix). The data shown below are typical results. Depending on various factors (procedure, etc), different values may well be obtained. * Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Boviserin is a registered trademark of Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A. OWSE G13 C0541 (909) H/R 6

Tab. 1 Stability and Storage Material/reagent State Storage Stability diluted sample 1+100 +2 to +8 C 24 hours diluted with Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) Test plate once opened +2 to +8 C 6 weeks (remaining strips) in the bag with the desiccant HBcAg/POD Conjugate once opened +2 to +8 C 4 weeks Conjugate Buffer once opened +2 to +8 C 4 weeks (Anti-HBc/IgM) Working Conjugate Solution 1+10 +2 to +8 C 4 weeks +18 to +25 C 1 week Sample Buffer once opened +2 to +8 C 4 weeks (Anti-HBc/IgM) Anti-HBc/IgM Control Serum, +2 to +8 C 4 weeks positive once opened Anti-HBc/IgM Control Serum, +2 to +8 C 4 weeks negative Chromogen TMB once opened +2 to +8 C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 C expiry date Working Chromogen Solution 1+10 +2 to +8 C 5 days +18 to +25 C 8 hours closed container, protected from light Wash Solution POD undiluted (concentrate) once opened +2 to +8 C expiry date 1:20 +2 to +8 C 1 week 1:20 +18 to +25 C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date use each component by the expiry date at the latest OWSE G13 C0541 (909) H/R 7

Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies yielded the following data: Enzygnost* Anti-HBc/IgM Sample panel Number of samples Initially reactive Retest reactive Acute HBV Infection 192 192 n.d. Tab. 3 Specificity The specificity studies at two independent centres (W, R) yielded the following data: Enzygnost * Anti-HBc/IgM Sample panel Number of sample Initially reactive Retest reactive (W) normal negative serum samples 997 2 0 (W) normal negative plasma samples 501 2 0 (R) patient panel 1061 1 1 Tab. 4 Reproducibility Intra-assay Sample Mean % CV In a study on intra-assay reproducibility absorbance the samples were each tested in FP 1 0.236 4.3 20-fold determinations (FP 2, n=18). FP 2 0.182 6.8 FP 3 0.155 6.3 FP 4 0.159 5.7 Inter-assay Sample Mean % CV In the study on inter-assay reproducibility absorbance the samples were each tested in FP 1 0.158 10.9 3-fold determinations in 5 independent runs. FP 2 0.113 5.9 FP 3 0.125 5.8 FP 4 0.104 16.9 OWSE G13 C0541 (909) H/R 8

Tab. 5 Test procedure and programming Enzygnost* Anti-HBc/IgM Test procedure (BEP II, BEP III, BEP 2000) BEP Prepare reagents 2000 Menu programming for the BEP II 4 x 10 µl Control Serum, negative 2 x 10 µl Control Serum, positive 10 µl prediluted sample each MENU OPERATE 1 OPERATE 2 YES BEP II BEP III 15 min (max 30 min) in the case of partially (+18 to +25 C) filled plates: Add waterfilled strips to make up to half a plate 100 µl Working Conjugate Solution 60 min ± 2 min (37 ± 1 C) Wash 4x: BEP II 100 µl Working Chromogen Solution 30 min ± 2 min (+18 to +25 C protected from light) 100 µl Stopping Solution after max. 1 h Evaluate at 450 nm (Referencewavelength: 650 nm) Automatic processing Dispense conjugate WASHINGS - ASPIRATE - SOAKTIME - DISP VOL 100 CHANNEL 1 PHOT OPERATE 3 YES Wash and dispense chromogen WASHINGS 4 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 4 PHOT OPERATE 4 YES Dispense Stopping Solution WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 5 PHOT YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR EVAL MODE 1 GEN CUT NEG CONT 4 MAX NEG 0.1 MIN NEG - FACT NEG - MAX POS - THRESH 0.07 CUT OFF - Test result OWSE G13 C0541 (909) H/R 9

Enzygnost* Anti-HBc/IgM Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen das Hepatitis B (core)-antigen in Serum oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP II, BEP III und BEP 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung IgM-Antikörper gegen das Hepatitis B (core)-antigen (Anti-HBc/IgM) werden in nahezu allen Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion bereits kurz nach dem Beginn der Virusvermehrung gebildet und bleiben für ungefähr 7 bis 17 Wochen in der Zirkulation. Aus diesem Grunde kann die Anti-HBc/IgM-Bestimmung als einziger Parameter für eine relativ sichere Diagnose einer akuten Hepatitis-B-Infektion herangezogen werden, da HBsAg und HBeAg auch bei chronischen Hepatitiden im Serum auftreten können und somit für die Differentialdiagnose das Heranziehen weiterer Parameter (Anti-HBs, Anti-HBe oder Anti-HBc) notwendig machen. In einigen Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion können die HBs- und HBe- Antigene beim Auftreten von klinischen Symptomen bereits verschwunden, die entsprechenden Antikörper aber noch nicht meßbar sein. Eine Bestimmung von Gesamt-Anti-HBc würde in einem solchen Falle keine Aufklärung bringen, da es sich hierbei um Langzeit-Antikörper handelt, die auch noch Jahre nach einer Erkrankung möglicherweise als einzige Antikörper zirkulieren können. Die Anti-HBc/IgM-Bestimmung kann diese diagnostische Lücke schließen 1. Prinzip der Methode Die in der Untersuchungsprobe vorhandenen HBc/IgM-Antikörper binden sich an die auf der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierten Anti-Human-IgM-Antikörper. An die spezifischen HBc/IgM-Antikörper wird POD-markiertes HBc-Antigen gebunden. Nach Entfernung des überschüssigen Konjugates und der ungebundenen Probenbestandteile wird die Enzymreaktion des gebundenen Konjugates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch den Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. Reagenzien Inhalt der Handelspackung Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Testplatte 1 Stück HBcAg/POD-Konjugat 3 x 0,6 ml Konjugatpuffer (Anti-HBc/IgM) 3 x 6 ml Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) 3 x 40 ml Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv 1 x 0,3 ml Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ 1 x 0,5 ml Waschlösung POD (Konzentrat)** 1 x 100 ml Puffer/Substrat TMB** 1 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml Stopplösung POD** 1 x 100 ml Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung 1 Stück Abklebefolien 6 Stück PE-Beutel zur Aufbewahrung nicht benötigter Riegel 1 Stück Barcode-Tabelle 1 Stück Packungsbeilage 1 Stück ** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 10 Ausgabe Februar 2004

Zusammensetzung Enzygnost* Anti-HBc/IgM (Testplatte): Mit monoklonalen Antikörpern gegen Human-IgM beschichtete Mikrotitrationsplatte. HBcAg/POD-Konjugat: Gentechnologisch hergestelltes HBc-Antigen, Peroxidase (POD)-konjugiert. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Boviserin und Tween 20. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Glycerin, Boviserin und Tween 20. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv: stabilisiertes Humanserum mit IgM-Antikörpern gegen HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: 0,7. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l). Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ: stabilisiertes Humanserum ohne Antikörper gegen HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: 0,1. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l). Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: n-butanol (max. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf HBsAg, auf Anti-HIV1, Anti-HIV2 und auf Anti-HCV untersucht. Für die Herstellung von Anti- HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Für die Herstellung von Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv wurden nur Spenden mit negativem Anti-HIV1-, Anti-HIV2- und Anti-HCV-Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 2. Dies gilt insbesondere auch für das Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, da durch das Herstellungsverfahren eine Virusinaktivierung nicht garantiert werden kann. 3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. Alle zu untersuchenden Proben, nicht jedoch die Kontrollsera, werden in einem Röhrchen 1+100 mit Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) vorverdünnt (z. B. 10 µl) Proben + 1000 µl Proben- Puffer (Anti-HBc/IgM). Konjugat-Gebrauchslösung: Dem HBcAg/POD-Konjugat ist die benötigte Menge zu entnehmen und mit dem Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) 1+10 zu verdünnen. Für eine halbe Testplatte 0,6 ml HBcAg/POD-Konjugat zu einer Originalabfüllung (6 ml) Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) zupipettieren (1+10). OWSE G13 C0541 (909) H/R 11

Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc/IgM bei der angegebenen Lagertemperatur bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen. Erforderliche Geräte: BEP II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte BEP III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Testdurchführung Testdurchführung mit BEP II 1. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ, in eine Vertiefung 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 10 µl vorverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 10 µl Anti-HBc/IgM- Kontroll-Serum, positiv dosieren, mit Folie abkleben. Die Pipettiervorgänge müssen innerhalb 15 min pro Testplatte durchgeführt werden. 2. Proben-Inkubation: Mind. 15 min (max. 30 min) bei Raumtemperatur (+18 bis +25 C) inkubieren. 3. Konjugat-Dosierung: Folie abziehen und ohne vorher zu waschen, je 100 µl der Konjugat- Gebrauchslösung pro Bestimmung zupipettieren, mit neuer Folie abkleben und anschließend in den Inkubator stellen. 4. Konjugat-Inkubation: 60 min ± 2 min bei +37 C ± 1 C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4 bzw. 5mal (siehe Hinweis) waschen. 6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben. 7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 C lichtgeschützt inkubieren. 8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten. 9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert. Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. OWSE G13 C0541 (909) H/R 12

Testdurchführung mit BEP III Bei der Abarbeitung mit BEP III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 der "Testdurchführung mit BEP II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP III/Enzygnost* validiert worden. Testdurchführung mit BEP 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP 2000-Bedienungsanleitung). Testvalidierung Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn -0,010 E neg. 0,1 E pos. 0,7 Von den Extinktionswerten des Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP 2000 und BEP III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet. Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von 0,07 addiert: E neg. + 0,07 = Grenzwert (cut off) Um Ergebnisse nahe dem Grenzwert besser abzusichern, wurde eine grenzwertige Zone definiert: Grenzwert ± 10% Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: Testergebnis: 1. E Probe < cut off 10% ^= HBc/IgM-Antikörper-negativ 2. E Probe > cut off + 10% ^= HBc/IgM-Antikörper-positiv 3. cut off - 10% E Probe cut off + 10% ^= grenzwertig Untersuchungsproben mit einem grenzwertigen Testergebnis sollten erneut getestet werden. Ist auch danach keine Zuordnung der Proben als positiv oder negativ möglich, lautet das Testergebnis grenzwertig. Einschränkungen der Testdurchführung 1.Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2.Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. In seltenen Einzelfällen können Proben mit hohem Rheumafaktor- und gleichzeitig hohem anti- HBc-Gehalt zu erhöhten Signalen führen. 3.Proben mit Antikörpern gegen CMV, HAV, HIV, HCV, Rubella-Virus sowie Anti-HBs positive Proben beeinflussen das Testergebnis nicht. 4.Mit Proben von Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten sowie mit Auto-Antikörperoder ANA-haltigen Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 5.Proben mit Antikörpern gegen EBV sowie Proben von Hämodialyse-Patienten können erhöhte Reaktivität zeigen. 6.Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.b. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden. 7.Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. OWSE G13 C0541 (909) H/R 13

8.Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 9.Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 10.Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.b. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, dass weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten. 11.Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflusst. 12.Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 13.Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. 14.Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 und 3 (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden 192 anti-hbc/igm positive Proben untersucht. Alle getesteten Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost* Anti-HBc/IgM positiv gefunden. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können. Bei der Ermittlung der Spezifität wurden 2559 anti-hbc/igm negative Proben untersucht und eine Spezifität von 99,60% bis 99,91% (initiale Testung) bzw. 99,91% bis 100% (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a., sind abweichende Werte möglich. Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der anti-hbc/igm-testung nicht mit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs eine HBV-Infektion sicher ausschließt. Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich. * Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern. BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 14

Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität verdünnte Untersuchungs- 1+100 +2 bis +8 C 24 Stunden probe verdünnt mit Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) Testplatte nach Öffnen +2 bis +8 C 6 Wochen (restliche Riegel) im Beutel mit Trockenkapseln HBcAg/POD-Konjugat nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen Konjugat-Puffer nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen (Anti-HBc/IgM) Konjugat-Gebrauchslösung 1+10 +2 bis +8 C 4 Wochen +18 bis +25 C 1 Woche Proben-Puffer nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen (Anti-HBc/IgM) Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, +2 bis +8 C 4 Wochen positiv nach Öffnen Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, +2 bis +8 C 4 Wochen negativ Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Chromogen-Gebrauchslösung 1+10 +2 bis +8 C 5 Tage +18 bis +25 C 8 Stunden geschlossenes Gefäß, lichtgeschützt Waschlösung POD unverdünnt (Konzentrat) nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum 1:20 +2 bis +8 C 1 Woche 1:20 +18 bis +25 C 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum OWSE G13 C0541 (909) H/R 15

Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden folgende Daten ermittelt: Enzygnost* Anti-HBc/IgM Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv akute HBV Infektion 192 192 n.d. Tab. 3 Spezifität Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an zwei unabhängigen Zentren (W, R) folgende Daten ermittelt: Enzygnost * Anti-HBc/IgM Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv (W) normal negative Seren 997 2 0 (W) normal negative Plasmen 501 2 0 (R) Patientenkollektiv 1061 1 1 Tab. 4 Reproduzierbarkeit Intra-assay Probe Extinktions- % VK Bei der Untersuchung zur Intra-assaymittelwert Reproduzierbarkeit wurden die Proben in FP 1 0,236 4,3 jeweils 20-fach-Bestimmung (FP 2, n=18) FP 2 0,182 6,8 getestet. FP 3 0,155 6,3 FP 4 0,159 5,7 Inter-assay Probe Extinktions- % VK Bei der Untersuchung zur Inter-assaymittelwert Reproduzierbarkeit wurden die Proben in FP 1 0,158 10,9 jeweils 3-fach-Bestimmung in 5 FP 2 0,113 5,9 unabhängigen Läufen getestet. FP 3 0,125 5,8 FP 4 0,104 16,9 OWSE G13 C0541 (909) H/R 16

Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung Enzygnost* Anti-HBc/IgM Testdurchführung (BEP II, BEP III, BEP 2000) Vorbereitung der Reagenzien BEP 2000 Menüprogrammierung für den BEP II 4 x 10 µl Kontroll-Serum, negativ 2 x 10 µl Kontroll-Serum, positiv je 10 µl vorverdünnte Probe MENU OPERATE 1 OPERATE 2 YES BEP II BEP III 15 min (max 30 min) teilbestückte Platten mit (+18 bis +25 C) Wasserriegeln auf halbe Platten ergänzen 100 µl Konjugat- Gebrauchslösung 60 min ± 2 min (37 ± 1 C) 4x Waschen: BEP II 100 µl Chromogen Gebrauchslösung 30 min ± 2 min (+18 bis +25 C lichtgeschützt) 100 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) automatische Testabarbeitung Dosierung Konjugat WASHINGS - ASPIRATE - SOAKTIME - DISP VOL 100 CHANNEL 1 PHOT OPERATE 3 YES Waschen und Dosierung Chromogen WASHINGS 4 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 4 PHOT OPERATE 4 YES Dosierung Stopplösung WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 5 PHOT YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR EVAL MODE 1 GEN CUT NEG CONT 4 MAX NEG 0.1 MIN NEG - FACT NEG - MAX POS - THRESH 0.07 CUT OFF - Testergebnis OWSE G13 C0541 (909) H/R 17

Enzygnost* Anti-HBc/IgM Domaine d utilisation Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre l antigène de core de l hépatite B dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l aide des ELISA Processeurs BEP II, BEP III et BEP 2000. Le test a été mis au point pour l'analyse d'échantillons individuels, et non de pools d'échantillons. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro. Intérêt diagnostique Des anticorps IgM anti-antigène de core de l hépatite B sont formés dans presque tous les cas d hépatite B aiguë peu de temps après le début de la réplication du virus, et persistent dans la circulation pendant environ 7 à 17 semaines. Le dosage de l anti-hbc/igm peut donc être utilisé comme seul paramètre pour un diagnostic relativement fiable d hépatite B aiguë, dans la mesure où l AgHBs et l AgHBe peuvent également apparaître dans le sérum en cas d hépatite chronique, rendant ainsi le dosage d autres marqueurs (anti-hbs, anti-hbe ou anti-hbc) indispensables pour un diagnostic différentiel. Dans certains cas d hépatite B aiguë, les antigènes HBs et HBe peuvent disparaître dès l apparition des symptômes cliniques, alors que les anticorps correspondants ne sont pas encore mesurables. Un dosage d anti-hbc total n apporte alors aucun éclaircissement, dans la mesure où il s agit d un anticorps qui peut circuler à taux résiduel des années après la maladie. Le dosage de l anti-hbc/igm permet de combler cette lacune 1. Principe de la méthode Les anticorps IgM anti-hbc présents dans l échantillon à tester se lient aux anticorps anti-igm humaine fixés à la surface de la plaque de microtitration. L antigène HBc marqué à la POD se lie aux anticorps IgM anti-hbc spécifiques. Après élimination de l excès de conjugué et des éléments non liés de l échantillon, on mesure la réaction enzymatique du conjugué lié (réaction colorée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est interrompue par l addition de la Solution d arrêt POD (réaction colorée jaune). L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d anticorps dans l échantillon. Réactifs Contenu du coffret Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM plaque-test 1 pièce Conjugué AgHBc/POD 3 x 0,6 ml Tampon conjugué (Anti-HBc/IgM) 3 x 6 ml Tampon échantillons (Anti-HBc/IgM) 3 x 40 ml Sérum de contrôle positif anti-hbc/igm 1 x 0,3 ml Sérum de contrôle négatif anti-hbc/igm 1 x 0,5 ml Solution de lavage POD (concentrée)** 1 x 100 ml Tampon/substrat TMB** 1 x 30 ml Chromogène TMB** 1 x 3 ml Solution d arrêt POD** 1 x 100 ml Flacon vide pour solution d emploi du chromogène 1 pièce Feuilles adhésives 6 pièces Sachet PE pour conservation des barrettes non utilisées 1 pièce Tableau de codes à barres 1 pièce Fiche technique 1 pièce ** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 18 Edition Février 2004

Composition Enzygnost* Anti-HBc/IgM (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d anticorps monoclonaux anti-igm humaine. Conjugué AgHBc/POD : antigène HBc obtenu par génie génétique, conjugué à la peroxydase (POD). Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Tampon conjugué (anti-hbc/igm) : tampon Tris additionné de Boviserin et de Tween 20. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Tampon échantillons (anti-hbc/igm) : tampon Tris additionné de glycérine, de Boviserin et de Tween 20. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Sérum de contrôle anti-hbc/igm positif : sérum humain stabilisé contenant des anticorps IgM anti-aghbc, dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : 0,7. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Sérum de contrôle anti-hbc/igm négatif : sérum humain stabilisé exempt d anticorps anti- AgHBc,dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : 0,1. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate additionnée de Tween. Agent de conservation : phénol (max. 1g/l) Tampon/substrat TMB : peroxyde d hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate. Agent de conservation : n-butanol (env. 1%) Chromogène TMB : tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure Solution d arrêt POD : acide sulfurique 0,5 N Mises en garde et précautions d emploi 1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro. 2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à des tests de dépistage d AgHBs, d anti-vih1, d anti-vih2 et d anti-vhc. Pour la préparation du Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM négatif, seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Pour la préparation du Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif, seuls les dons trouvés négatifs en anti-vih1, anti-vih2 et anti-vhc ont été utilisés. Indépendamment de cela, tout produit obtenu à partir de sang humain doit etre manipulé avec les precautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure tout risque d infection 2. Ceci vaut particulièrement pour le Sérum de contrôle anti-hbc/igm positif, dans la mesure où le procédé de fabrication ne permet pas de garantir l inactivation virale. 3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test. 4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l autoclaver pendant au moins 1 heure à +121 C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l un à l autre et contenant chacun un désinfectant spécialement prévu pour inactiver les virus pathogènes pour l homme. Respecter les concentrations et temps d incubation indiqués par le fabricant. Préparation des réactifs Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage. Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l eau distillée ou désionisée en complétant à 400 ml. Solution d emploi du chromogène : pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l abri de la lumière. Après emploi, bien rincer le flacon avec de l eau distillée. Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d un flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB. Prédiluer tous les échantillons à tester, mais pas les sérums de contrôle, au 1/101 à l aide du Tampon échantillons (anti-hbc/igm) dans des tubes (par ex. 10 µl d echantillon + 1000 µl de Tampon échantillons (anti-hbc/igm). Solution d emploi du conjugué : prélever la quantité nécessaire de Conjugué AgHBc/POD et la diluer au 1/11 à l aide du Tampon conjugué (anti-hbc/igm). OWSE G13 C0541 (909) H/R 19

Pour une demi-plaque, ajouter 0,6 ml de Conjugué AgHBc/POD au contenu d un flacon (6 ml) de Tampon conjugué (anti-hbc/igm) (dilution au 1/11). Stabilités et conditions de conservation Avant leur ouverture, tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc/IgM se conservent à la température indiquée jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. Pour les stabilités et conditions de conservation après ouverture des flacons et préparation des réactifs à leur dilution d'emploi, se reporter au tableau 1 en annexe. Matériel nécessaire: BEP II: pour la distribution automatique des réactifs et l'automatisation des étapes de lavage BEP III: pour l'automatisation du test après la distribution des échantillons et de l'exploitation des résultats BEP 2000 : pour l entière automatisation du test et de l exploitation des résultats Pipettes: pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl Incubateur: bain-marie couvert (+37 ± 1 C) ou méthode d'incubation équivalente Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé. Echantillons à tester Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8 C. Pour une conservation plus longue, les congeler. Réalisation du test Réalisation du test à l aide du BEP II 1. Distribution des contrôles et échantillons : distribuer 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM négatif dans 4 cupules, 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule, 10 µl de chacun des chantillons à tester prédilués dans les cupules suivantes, puis, à la fin de la série ou de la plaque, de nouveau 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule. Couvrir la plaque d une feuille adhésive. Ces étapes de pipetage ne doivent pas durer plus de 15 mn par plaque. 2. Incubation des contrôles et échantillons : laisser incuber au moins 15 min (max. 30 min) à la température ambiante (+18/+25 C). 3. Distribution du conjugué : retirer la feuille adhésive, ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d emploi du conjugué, couvrir d une nouvelle feuille adhésive et placer la plaque dans l incubateur. 4. Incubation du conjugué : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 C ± 1 C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage. 5. Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans chacune d elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 à 5 lavages (cf. Remarque) 6. Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d emploi du chromogène, et couvrir d une nouvelle feuille adhésive. 7. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 C a l abri de la lumière. 8. Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d arrêt POD en respectant le même rythme qu en 6. 9. Mesure : faire une mesure photométrique dans l heure qui suit a 450 nm. Il est recommandé d utiliser un photomètre avec deux longueurs d onde (une de mesure et une de référence). La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. La longueur d onde de référence doit être de 650 nm (com-prise entre 615 et 690). Réalisation du test sur le BEP III Pour une utilisation sur le BEP III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu y compris la distribution des échantillons (point 1 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP II»). Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c est-à-dire non recouverte d une OWSE G13 C0541 (909) H/R 20