PERFIL DE EXPRESIÓN DE LOS GENES INVOLUCRADOS EN LA BIOSÍNTESIS DEL GRUPO HEMO EN DOS LÍNEAS CELULARES DE RETINOBLASTOMA Y SU RELACIÓN CON LA TERAPIA FOTODINÁMICA Eva Ramón Gallegos 1, Eréndira Ruiz Galindo 1,2 y Francisco Arenas-Huertero 2. 1 Departamento de Morfología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Instituto Politécnico Nacional. Carpio y Plan de Ayala SN, colonia Plutarco Elías Calles, C.P. 11340, México D.F. evaramong@yahoo.com.mx, ereruga53@aol.com. 2 Departamento de Neurociencias, Instituto de Fisiología Celular. Universidad Nacional Autónoma de México. farenas@ifc.unam.mx RESUMEN La terapia fotodinámica (PDT) es una forma de tratamiento no invasor utilizada en el tratamiento de neoplasias. Para aplicarla se requiere de un fotosensibilizador que se acumula en el tejido neoplásico y al ser estimulado por una fuente de luz, va a producir un efecto citotóxico al generar especies reactivas de oxígeno. La PDT se usa para tratar tumores dentro de medios transparentes como del ojo. Una estrategia para hacer eficiente la PDT, sin efectos secundarios, es inducir por exposición al ácido δ-aminolevulínico (ALA) la acumulación de la protoporfirina IX (PpIX), ya que se considera como uno de los mejores fotosensibilizadores. Sin embargo esto ultimo ocurre sólo cuando la enzima FECH esta disminuida y la PBGD aumentada en la ruta de biosíntesis del grupo. El propósito de este trabajo fue evaluar los niveles de expresión de cada gen de la biosíntesis del grupo Hemo en la líneas celulares de retinoblastoma Y-79 y WERI-Rb-1, y correlacionarlo con la acumulación de la Pp IX por exposición al ALA. Se diseñaron los iniciadores para PCR basándonos en las secuencias reportadas del mrna en el GenBank para cada una de las enzimas que participan en la biosíntesis del grupo Hemo (ALAS, ALAD, UROS, UROD, PBGD, CPOX, PPOX y FECH). Se sintetizaron los cdna por RT-PCR y los productos fueron analizados por electroforesis. La intensidad de las bandas fue cuantificada por densitometría comparando la expresión de los genes con la expresión de la β-actina. La cuantificación de la PpIX se realizó 24 h después de exponer las células a 100 µg/ml de ALA. Los genes más expresados en ambas líneas celulares fueron PPOX, UROS y ALAS, y los genes menos expresados fueron ALAD para las células WERI-Rb-I, y FECH y UROD para Y79. PpOX se encontró expresado de 2.1 a 2.4 veces más que la FECH en ambas líneas celulares. Esto correlaciona con la alta cantidad de PpIX acumulada en ambas líneas celulares posterior a la exposición al ALA. Por lo tanto, es posible inferir que la PDT podría ser efectiva en la eliminación de células de retinoblastoma. Palabras clave: Retinoblastoma, hemo y PDT. INTRODUCCIÓN El retinoblastoma es el tumor maligno más frecuente en la infancia, antes de este siglo era una tumoración fatal, pero el desarrollo de la oftalmoscopía permite hacer un diagnóstico oportuno, mejorando el pronóstico y la sobrevida de los pacientes. No tiene
predisposición por raza ó sexo y son igualmente afectados el ojo derecho que el izquierdo. Se encuentra en 5º lugar en la clasificación internacional de cáncer en niños (1). Su incidencia mundial es entre 1.5 y 24.5 por cada 1000 000 de habitantes. En Estados Unidos la frecuencia es de 5.8 por millón en niños menores de 10 años y de 10.9 por millón en niños menores de 5 años (2). En México, Bravo-Ortiz y cols. reportaron una incidencia de 6.2 por cada millón (3). Alegría y cols. indican que en el 25% de los casos de retinoblastoma en México, el diagnóstico es tardío encontrándose este tumor en etapas III ó IV (4). El tratamiento en términos generales para los casos unilaterales es la enucleación, en los casos bilaterales se efectúa enucleación del ojo con tumor en etapa más avanzada, y radioterapia sobre el otro ojo. En los últimos años, el criterio de tratamiento se ha modificado con el propósito de conservar los ojos indicándose, radiaciones para tumores de tamaño medio y crioterapia y láser para tumores pequeños. La quimioterapia se usa para tratar extensiones extraoculares del tumor (5, 6, 7 y 8). También se ha usado la terapia fotodinámica como tratamiento, esta terapia involucra la administración de un fotosensibilizador seguido por un periodo de tiempo que permite la distribución y localización de componentes activos en el tejido tumoral. En 1986 Ohnishi y colaboradores (9) trataron cinco niños con retinoblastoma usando un derivado de hematoporfirina y láser de argón y reportaron que los tumores menores de 4 diámetros papilares pueden ser destruidos por este método ya que posterior a la fotoradiación la fluorangiografía reveló hipofluorescencia del tumor indicando obstrucción de los vasos y el examen histopatológico demostró destrucción de las células tumorales y angionecrosis, en 1989 Horsman y Winther (10) reportaron que el mecanismo de acción de la terapia fotodinámica es producir una muerte directa de las células tumorales y destrucción vascular. En este mismo año Winther (11, 12) investiga la sobrevida de células tumorales posterior a terapia fotodinámica, y demostró que las células tumorales del ojo sensibilizadas con Fotofrin II, in vivo fueron dañadas por luz cuando eran irradiadas in vitro y el daño dependía de la dosis de energía luminosa. A pesar de tener resultados prometedores, la administración de los fotosensibilizadores directamente, presenta algunos efectos adversos (13), de aquí la necesidad de proponer nuevos fotosensibilizadores muchos más específicos y potentes. Como una alternativaas a esto, se han propuesto las siguientes estrategias: utilizar el ácido δ-aminolevulínico debido a que induce la acumulación intracelular de uno de los fotosensibilizadores más potentes, la protoporfirina IX (PpIX) (14); y la sobreexpresión de una enzimas clave para la acumulación de la PpIX, la porfobilinogeno desaminasa. En la única publicación que existe relacionada con este ultima estrategias, los investigadores encontraron un aumento en la concentración de la enzima, pero no un incremento en la concentración de la PpIX (15). Últimamente, se han reportado que la acumulación de la PpIX depende de más de una enzima, así por la falta de información al respecto, en este trabajo nos propusimos determinar la expresión de los genes que codifican las enzimas involucradas en la biosíntesis del grupo hemo en células de retinoblastoma de origen humano. OBJETIVO Determinar la expresión de los genes que participan en la biosíntesis del grupo hemo y la concentración de la protoporfirina IX en las células de retinoblastoma Y79 y WERI-Rb-1.
METODOLOGÍA Condiciones de cultivo. Las células Y79 y WERI-Rb-1 fueron obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC) y mantenidas en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 C. Ambas líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI-1640 complementado con L-glutamina 2mM, suero fetal de bovino al 10%, piruvato de sodio 1X y penicilina 100U/mL-estreptomicina 100U/mL. Diseño de primers, extracción de RNA, síntesis de cdna y densitometría. La secuencia del mrna de cada una de las 8 enzimas involucradas en la biosíntesis del grupo hemo: sintetasa del ácido δ-aminolevulínico (ALAS, NM000688), deshidrogenada del ácido δ-aminolevulínico (ALAD, NM00031), Porfobilinogeno desaminasa (PBGD, NM000190), Uroporfirinogeno (UROS, NM000375), uroporfirinogeno descarboxilasa (UROD, NM000374), coproporfirinogeno oxidasa (CPOX, NM000097), protoporfirinogeno oxidase (PPOX, 000309) y ferroquelatasa (FECH, NM000140); fueron obtenidas de la base de datos del GenBank. El RNA fue extraído por el método de trizol (Invitrogen). El cdna fue obtenido a partir de 1 µg de RNA utilizando el kit de Firs Strand Sinthesis (Roche). La concentración del cdna fue normalizada utilizando el RNAm del gen β-actina. El producto fue analizado mediante un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio. Se tomaron imágenes de cada amplificación. Se realizó una RT-PCR semicuantitativa confirmando la amplificación a 20, 25 y 30 ciclos y comparando la amplificación, con el producto del gen control β-actina. Con base en esto se decidió utilizar el producto obtenido a 30 ciclos. La densitometría se utilizó para determinar la intensidad de la banda, y el análisis se realizó mediante el Software Imagen J, así los resultados se expresaron en unidades densitométricas (DU), de la relación entre el nivel de RNAm de cada gen del ciclo de la biosíntesis del grupo hemo y el gen de la β-actina. Determinación de la PpIX basal e inducida por el ácido δ-aminolevulínico. Para determinar la concentración de PpIX se utilizó el método de Piomelli (16) adaptado para cultivo de células por Ramón y cols. (17). Después de exponer 5 x 10 5 células Y79 y WERI-Rb-1 al δ-ala a una dosis de 100 µg/ml durante 3h en la oscuridad, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 0.2 ml de una suspensión de celita al 5% en solución salina. Se adicionaron 4 ml de una mezcla de acetato de etilo-ácido acético 4:1 y se agitó el tubo por 10 segundos en un agitador vortex. Se centrifugó por 30 segundos a 721.15 g y el sobrenadante se pasó a otro tubo. Se agregaron 4 ml de HCl 1.5 N y se agitó el tubo nuevamente durante 10 segundos en un agitador vortex, con una pipeta Pasteur se transfirió una alícuota de la fase de HCl a una cubeta del espectrofluorómetro. Se leyó la concentración de PpIX calibrado con una solución estándar de coproporfirina I, a una longitud de onda de excitación de 408 y 608 nm de emisión, la concentración se expresa en µg por número de células. Se leyó un blanco paralelamente, sustituyendo la suspensión celular por solución salina.
RESULTADOS Se encontró que los genes más expresados fueron: PPOX, UROS y ALAS en ambas líneas, así las células WERI-Rb-1 tuvieron 1.05, 0.92 y 0.88, respectivamente, y las células Y79 de 0.55, 0.66 y 0.67, respectivamente (Tabla 1). Los genes menos expresados fueron ALAD (0.33) en WERI-Rb-1 y FECH (0.23) y UROD (0.23) en Y79 (figura 1). Debido a que la baja expresión de la ferroquelatasa (FECH) está relacionada con la acumulación de la PpIX (18), analizamos la expresión entre esta enzima y las anteriores, y se cuantificó las PpIX tanto basal como inducida. La relación de expresión de la PPOX y FECH fue semejante en las dos líneas de retinoblastoma estudiadas. Sin embargo podemos observar que la relación de expresión fue de 2.1 y 2.4 veces más en PPOX que en FECH en WERI-Rb-1 y Y79, respectivamente. La concentración basal de PpIX en ambas líneas fue de 1 g/5x10 5, sin embargo alo inducirlas con -ALA esta concentración se incrementó de 15 y 18 veces más en WERI-Rb-1 y Y79 respectivamente (Fig. 2). Genes que participan en la biosíntesis del grupo hemo Unidades densitometricas de expresión (DU) WERI-Rb-1 Y79 ALAS 0.88 0.67 ALAD 0.33 0.38 PBGD 0.76 0.35 UROS 0.92 0.66 UROD 0.37 0.23 CPOX 0.71 0.46 PPOX 1.05 0.55 FECH 0.49 0.23 Figura 1. Relación de expresión de las enzimas que participan en la biosíntesis del grupo hemo en dos líneas de retinoblastoma. PpIX basal (g/5x10 5 células) PpIX inducida por exposición al -ALA (g/5x10 5 células) WERI-Rb-1 1.0 15.0 Y79 1.0 18.0 Figura 2. Concentración de PpIX en las líneas de retinoblastoma en condiciones basales e inducidas. CONCLUSIONES Los niveles de expresión más altos se encontraron en los genes PPOX, UROS y ALAS en ambas líneas celulares.
La expresión de la FECH fue 2 veces menor que la expresión de la PPOX en ambas líneas celulares, esto explica la alta acumulación de la PpIX por inducción con el δ- ALA. Por la capacidad que presentan las células de retinoblastoma de acumular la PpIX, se puede inferir que este tipo de cáncer es candidato a ser tratado por la PDT utilizando al ALA. BIBLIOGRAFÍA 1. Kramávorá E, Stiller CA. The international classification of childhood cancer. International Journal of Cancer 1996; 68: 759-765 2. Tamboli A, Podgor MJ, Horm JW. The incidence of retinoblastoma in the United States: 1974 a 1985. Arch Ophthalmol 1990; 108: 128-132 3. Bravo-Ortiz JC, Mendoza-Sánchez HF, Fajardo-Gutiérrez A. Algunas características epidemiológicas del retinoblastoma en niños residentes del Distrito Federal. Boletín Médico del Hospital Infantil de México 1996; 53: 234-239 4. Amozorrutia-Alegria V, Bravo-Ortiz JC, Vázquez-Viveros J, Campos-Campos L, Mejía-Aranguré M, Juárez-Ocaña S, Martínez-García MC, Fajardo-Gutiérrez A. Epidemiological characteristics of retinoblastoma in children attending the Mexican Social Security Institute in México city: 1990-1994. Paediatric and Perinatal Epidemiology 2002; 16: 370-374. 5. Shields JA, Shields CL, Sivalingam V. Decreasing frecuency of enucleation in patients with retinoblastoma. Am J Ophthalmo 1989; 108: 185-188 6. Abramson DH, Niksarli K, Ellsworth RM. Changing trends in the management of retinoblastoma: 1951-1965 vs 1966-1980. J Pediatr Ophthalmol Strabismus 1994; 31: 32-37 7. Murphree AL, Villablanca JG, Deegan WF. Chemotherapy plus local treatment in the management of intraocular retinoblastoma. Arch Ophthalmol 1996; 114: 1348-1356 8. Desjardins L. Current treatment of retinoblastoma. 153 children treated between 1995 y 1998. J Fr Ophtalmol 2000; 23 (5): 475-481 9. Ohnishi Y, Yamana Y, Minei M. Photoradiation therapy using argon laser and hematoporphyrin derivative for retinoblastoma, a preliminary report. Japanese Journal of Ophthalmology 1986; 30 (4): 409-419 10. Horsman MR, Winther J. Vascular effects of photodynamic therapy in an intraocular retinoblastoma-like tumour. Acta Oncológica 1989; 28(5): 693-697 11. Winther J. Photodynamic therapy effect in an intraocular retinoblastoma-like tumour assessed by an in vivo to in vitro colony forming assay. British Journal of Cancer 1989; 59(6): 869-872 12. Winther JB. The effect of photodynamic therapy on a retinoblastoma-like tumour. An experimental in vitro and in vivo study on the potential use of photodynamic therapy in the treatment of retinoblastoma. Acta Ophthalmologica Supplementum 1990; (197): 1-37 13. Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem Photobiol 1987; 45: 879-889. 14. Malik, Z.; Kostenich, G.; Roitman, L.; Ehrenberg, B.; Orenstein, A. Topical application of 5-aminolevulinic acid, DMSO and EDTA: protoporphyrin IX accumulation in skin and tumours of mice. J. Photochem. Photobiol. Biol. 1995, 28, 213-218. 15. Hilf, R.; Havens, J. J.; Gibson, S. L. Effect of δ-aminolevulinic acid on protoporphyrin IX accumulation in tumor cells transfected with plasmids containing porphobilinogen deaminase DNA. Photochem. Photobiol. 1999, 70, 334-340. 16. Piomelli, S. A micromethod for free erythrocyte porphyrins: the FEP test. J. Lab. Clin. Med. 1973, 81, 932 17. Ramón, G, E.; DeLeón, R. I.; Martínez, G. L.; Pérez, Z. A. In Vitro study of biosynthesis of protoporphyrin IX induced by δ-aminolevulinic acid in normal and cancerous cells of the human cervix. Arch. Med. Res. 1999, 30, 163-170. 18. Van-Hillegersberg, V. R.; Kort, W. J.; Wilson, J. H. Current status of photodynamic therapy in oncology. Drug. 1994, 48, 510-527.