Optimizando la Vitrificación de Ovocitos y Blastocistos Alberto Valcárcel IFER Jornada de Actualización en Biología de la Reproducción Congreso ESHRE 2015 Julio 14, 2015
-4 trabajos de vitrificación de blastocistos -1 trabajo de vitrificación de embriones clivados -3 trabajos de vitrificación de oocitos -1 trabajo de vitrificación de células stem embrionarias humanas
Resultados neonatales de blastocistos vitrificados por el uso de un contenedor cerrado. Dr H. Iwahata y col., Escuela de Medicina de la Universidad de Santa Mariana, Kanagawa, Japón. El objetivo del trabajo fue estudiar si el uso de contenedores cerrados para la vitrificación podía afectar negativamente el desarrollo embrionario posterior. Trabajaron con 875 blastocistos desvitrificados que fueron transferidos en transferencia única. De ellos, 313 fueron vitrificados en un sistema cerrado y 562 en un sistema abierto.
Postulan que el efecto de la disminución del rango de velocidad de enfriamiento por el uso de un sistema cerrado se revierte con una adecuada velocidad de desvitrificación, de manera que en la práctica, los resultados del uso de un sistema cerrado o abierto resulta similar. Por lo tanto, sugieren el uso de sistemas cerrados por su demostrado beneficio en cuanto a disminuir el riesgo de infecciones cruzadas y los similares resultados neonatales.
Vitrificación de blastocisto único de día 5 ó de día 6 utilizando un sistema cerrado (Rapid-I, Vitrolife). Resultados clínicos de 327 ciclos. Dr S. Sciorio y col., Centro de Fertilidad y Endocrinología Reproductiva, Edinburgo, Escocia. El objetivo del trabajo fue comparar los resultados reproductivos del uso de blastocistos de día 5 y día 6 vitrificados por un sistema cerrado. Vitrificaron sólo blastocistos de excelente calidad obtenidos de ovocitos frescos de un programa de ovodonación. Trabajaron con 327 blastocistos desvitrificados de día 5 y 219 blastocistos desvitrificados de día 6.
BLASTOCISTOS DIA 5 BLASTOCISTOS DIA 6 SIGNIFICANCIA P<0.05 SOBREVIDA (%) 90,2 (295/327) 89,9 (197/219) NS TASA DE IMPLANTACIÓN (%) TASA DE EMBARAZO (%) TASA DE ABORTO (%) 52,3 (103/197) 44,9 (44/98) NS 40,1 (79/197) 36,7 (36/98) NS 8,6 (17/197) 7,1 (7/98) NS
Concluyen: -que la vitrificación de blastocistos de día 5 y de día 6 tienen resultados reproductivos similares. - Que el uso de sistemas cerrados para la vitrificación de blastocistos es un método que brinda buenos resultados reproductivos tanto en blastocistos de día 5 como en blastocistos de día 6. Por lo tanto, sugieren el uso de sistemas cerrados para la vitrificación de blastocistos.
Trabajaron con 237 blastocistos de excelente calidad a los que a 118 se les realizó colapsado artificial por el uso de un pulso láser y 119 blastocistos intactos (controles) y se los vitrificó. El comportamiento luego de desvitrificar se grabó y observó con un time-lapse. Estudio del efecto de colapsar artificialmente el blastocele de los blastocistos antes de la vitrificación y su comportamiento luego de la desvitrificación. Dr B. Kovacic y col., Centro Médico Universitario de Maribor, Maribor, Eslovenia. El objetivo del trabajo fue evaluar cómo influye la reducción del fluído del blastocele previo a la vitrificación, en la tasa de sobrevida, en la velocidad de reexpansión del blastocisto, en su morfología y en la tasa de implantación.
Los resultados presentados mostraron que las tasas de sobrevida fueron similares (100% y 99,2%, colapsados y no colapsados), la velocidad de reexpansión fue mayor en los que tenían colapsado el blastocele (14,5 ± 12,5 µm/h vs 5,5 ± 14,0 µm/h). A la hora de haber sido desvitrificados, las dimensiones de los blastocistos en ambos grupos eran similares y la morfología también. Al analizar el tiempo necesario para eclosionar, los blastocistos no colapsados lo hicieron más rápido que los colapsados (83,3 ± 38,9 min vs 97,0 ± 31,2 min), pero la eclosión completa del blastocisto lo realizaron más frecuentemente los blastocistos colapsados artificialmente (53,4% vs 16,9%, p< 0,01). La tasa de implantación fue semejante en ambos grupos (26,3% vs 28,6%, colapsados vs no colapsados). Concluyen que el colapsado artificial de los blastocistos antes de vitrificar no presentaría ventajas y que representa una manipulación adicional que no se justificaría.
Analizaron los resultados reproductivos de la transferencia de 1239 embriones de día 2, 590 de día 3 y 356 blastocistos de día 5. En la mayor parte de los casos se transfirió un sólo embrión y de excelente calidad. El 60% de los embriones se transfirió a endometrios de ciclos naturales y el 40% a endometrios tratados hormonalmente. En todos los grupos, las edades de las pacientes fueron 33,5 ± 5,5 años). Resultados reproductivos de la transferencia única de embriones de día 2, día 3 y día 5 luego de la vitrificación con un sistema cerrado en endometrios de ciclos espontáneos y tratados hormonalmente. Dr A. Van Langendonk y col., Universidad Libre de Bruselas, Hospital Erasmo, Bruselas, Bélgica. El objetivo del trabajo fue evaluar cómo influye en la tasa de embarazo el tipo de preparación endometrial según se transfieran embriones de día 2, día 3 o día 5 vitrificados/desvitrificados con un contenedor cerrado.
Los resultados mostraron que las tasas de sobrevida fueron similares (92,1% día 2, 95,6% día 3 y 90,4% día 5).
Concluyen que las tasas de implantación son mejores al transferir blastocistos desvitrificados que al transferir embriones de día 2 ó dia 3. Además, la tasa de implantación de embriones vitrificados en día 2 ó día 3 es semejante. Indicaron (aunque no presentaron los resultados que los avalaran) que la tasa de implantación no se ve afectada por el tipo de preparación endometrial.
El tiempo de almacenamiento no modifica el perfil de expresión génica de oocitos metafase II criopreservados por método lento. Dr P. Scaruffi y col., Unidad de Fisiopatología de la Reproducción, Génova, Italia. El objetivo del trabajo fue evaluar si el tiempo de almacenamiento de oocitos criopreservados por método lento alteraba el transcriptoma de oocitos metafase II. Trabajaron con 21 oocitos donados en fresco y 44 criopreservados. De los 44 criopreservados, 24 de ellos estuvieron criopreservados 3 años y 20 oocitos durante 6 años. Analizaron 19 genes. Todos presentaron expresión diferencial respecto a los controles frescos. Sus resultados indicaron que había 10 genes sub-expresados y 9 sobreexpresados en los oocitos criopreservados respecto a los oocitos frescos.
Los que se encontraban sub-expresados pertenecían a genes involucrados en la función de los ribosomas y en los de transporte de proteínas intracelulares. Los sobre-expresados correspondían a una serie de funciones celulares no específicas. Los perfiles de expresión entre los genes de oocitos criopreservados durante 3 y 6 años fueron semejantes, o sea que el tiempo de almacenamiento per se no modificaría el perfil de expresión en oocitos criopreservados. Concluyeron que la criopreservación no sólo produce modificaciones en la morfología oocitaria, fisiología e integridad molecular, sino que también afecta el perfil de expresión génica de los oocitos respecto a los oocitos frescos. El expositor dijo que sus próximos estudios serán analizar el comportamiento de oocitos vitrificados respecto al perfil de la expresión de genes.
Impacto de la criopreservación en el transcriptoma oocitario. Vitrificación vs congelamiento lento. Dr. V. Bianchi y col., Hospital Careggi, Udine, Italia. Se plantearon evaluar el impacto del método de criopreservación utilizado en la expresión génica del oocito. Analizaron 8 oocitos MII frescos (controles), 8 congelados por método lento y 9 vitrificados, provenientes de 8 pacientes que los donaron (3 de cada uno de ellos, asignados 1-1-1). Todas las donantes de los oocitos eran menores de 36 años y normorrespondedoras. Los estudios cualitativos mostraron bajos niveles de alteraciones en los patrones de expresión génica respecto a los controles cuando los oocitos fueron criopreservados por método lento, mientras que fueron altos cuando los oocitos fueron vitrificados.
Sin embargo, los estudios cuantitativos por PCR a tiempo real demostraron que esas alteraciones en los patrones de expresión tanto en los casos en que fue baja (congelamiento) como altas (vitrificación) resultaron ser NO significativas cuantitativamente respecto a los controles frescos, sugiriendo que la vitrificación de oocitos sería un método seguro. Sin embargo, el expositor dijo que deberían seguir con estos estudios, en particular aumentando el número de oocitos analizados, para obtener una conclusión definitiva.
Un estudio prospectivo del uso de oocitos frescos y vitrificados por método aséptico en un programa de ovodonación de oocitos. Dr. A. Paptheodorou y col., Escuela de Medicina Reproductiva, Ioannina, Grecia. El objetivo de este estudio fue comparar el desarrollo embrionario y los resultados reproductivos del uso de oocitos frescos y desvitrificados en un programa de ovodonación. Trabajaron con 75 donantes, todas menores de 30 años, en las que se obtuvieron no menos de 16 oocitos, asignándose 8 en fresco y 8 para vitrificar de cada una y para cada rama del estudio. Los oocitos vitrificados fueron desvitrificados, fertilizados y cultivados hasta blastocisto. Lo mismo se realizó con los oocitos en fresco. En todos los casos se transfirió 1 o dos blastocistos.
RESULTADOS DE DESARROLLO EMBRIONARIO TASA DE FERTILIZACIÓN (%) OOCITOS FRESCOS OOCITOS DESVITRIFICADOS SIGNIFICANCIA 77.2 72.1 NS TASA DE LLEGADA A BLASTOCISTO (%) 53.1 43.3 P< 0.05 TASA DE BLASTOCISTOS DE EXCELENTE CALIDAD (%) 32.8 22.5 P< 0.05
RESULTADOS REPRODUCTIVOS TASA DE IMPLANTACIÓN (%) OOCITOS FRESCOS OOCITOS DESVITRIFICADOS SIGNIFICANCIA 34.7 36.1 NS TASA DE EMBARAZO CLÍNICO (%) 50.0 52.7 NS TASA DE EMBARAZO EVOLUTIVO (%) 48.6 51.3 NS
Concluyen: -La vitrificación de oocitos tiene un impacto negativo en el desarrollo embrionario. -Aunque es obvio que la vitrificación tiene un efecto negativo en ese sentido en un programa de ovodonación, medido en términos de menor tasa de llegada a blastocisto, finalmente la vitrificación NO influye en las tasas de embarazo clínico ni evolutivo en un programa de ovodonación. -Proponen que para equiparar los resultados embriológicos, una alternativa aceptable es aumentar el número de oocitos de donante a ser vitrificados (más de 8).
Efecto de la criopreservación en el ADN mitocontrial (ADNmt) de células stem embrionarias humanas. Dr. J. Kopeika y col., Unidad de Reproducción Asistida, Londres, Gran Bretaña. El objetivo de este estudio fue estudiar el impacto de la vitrificación en las tasas de mutación del ADNmt de 4 líneas celulares derivadas de embriones humanos: -Células stem derivadas de embriones normales (KCL) -Células stem derivadas de embriones portadores de distrofia de Huntington (HD) -Células stem derivadas de embriones portadores de Von Hippel-Landau (VHL) -Células stem derivadas de embriones portadores de distrofia miotónica (MD) En todos los casos determinó la secuencia del ADNmt de cada línea celular y se la comparó con las secuencias de las mismas inmediatamente después de desvitrificar y luego de un cultivo por 72 horas de las células desvitrificadas.
El análisis del ADNmt inmediatamente después de ser desvitrificadas mostró una tasa de mutación incrementada significativamente en 0.03 por 100 bps (puntos de ruptura, breakpoints) del ADN en promedio de las líneas celulares. Esta tasa subió a 0.05 por 100 bps luego del cultivo por 72 horas. Hubo también diferencias significativas en la tasa de mutación entre las distintas líneas celulares estudiadas. Así, el ADNmt de la línea VHL-4 tuvo una tasa de aumento de mutaciones de 0.1 por 100 bps, mientras que en la línea KCL (de embriones normales) fue 0.039 y en la línea HD fue 0.013. La tasa de mutación fue significativamente mayor en la región LOOP (0.18 por 100 bps del ADNmt respecto a la región CYT-B (0.12) o la región ND-4 (0.12).
La mayoría de las mutaciones resultaron ser SUSTITUCIONES de bases, aunque también hubo delesiones de bases e insersiones de bases. La importancia de este trabajo es que demuestra que la vitrificación no es inocua al ADNmt AL MENOS en líneas celulares derivadas de blastocistos humanos. Sugieren que aunque no puede ser establecida una relación directa con lo que puede suceder al vitrificar y desvitrificar oocitos y/o embriones humanos, o al cultivarlos por al menos 72 hs, sus resultados deberían generar la inquietud de generar estudios de este tipo tanto en oocitos como embriones para asegurar que la vitrificación es una metodología segura al menos a nivel del ADNmt.
AGRADECIMIENTOS
Buscando el mejor momento para transferir blastocistos desvitrificados en función del grado de expansión en que fueron vitrificados. Dr Y. Panagioditis y col., Centro de Fertilidad Iakentro, Tessalonica, Grecia. El objetivo del trabajo fue analizar como afecta el grado de expansión del blastocisto antes de vitrificar en los resultados reproductivos y cómo lo hace el tiempo entre la desvitrificación y la transferencia para dos tiempos fijos (3 horas y 18 horas). Establecieron 6 categorías de grado de expansión: - mórula de dia 5, blastocisto temprano, blastocisto completo, blastocisto expandido, blastocisto eclosionado parcialmente y blastocisto eclosionado completo.
Los tamaños muestrales de cada grupo fueron: 121, 199, 279, 321, 306 y 65 blastocistos cada uno. En todos los casos, transfirieron 2 blastocistos de idéntica calidad. El contenedor utilizado para la vitrificación fue el VitriSafe (VitroSafe, UK) que es un contenedor cerrado.
Concluyen que la transferencia con 18 horas de cultivo post desvitrificación mejoró la tasa de embarazo en mórulas de día 5 (de 38,5% a 52%) y la empeoró en blastocistos completamente eclosionados (de 65% a 12,5%). El incremento de la duración entre el momento de la desvitrificación y la transferencia fue sólo beneficioso en mórulas de día 5, mientras que lo contrario ocurrió en el resto de los estadios, siendo muy perjudicial en los blastocistos totalmente eclosionados. Sugieren que las mórulas vitrificadas endía 5 deben ser transferidas luego de una incubación de 18 hs y que los blastocistos en el resto de los estadios (en particular los que se encuentren eclosionando ó totalmente eclosionados) deben ser transferidos no más allá de 3 horas post desvitrificación.