Instrucciones de uso BAG Cycler Check Kit de para la validación de la uniformidad de la temperatura en los termocicladores listo para usar, prealicuotado REF 7104 (10 tests) REF 71044 (4 tests) Contenidos 1. Descripción del Producto... 2 2. Material... 3 2.1 Contenidos del kit BAG Cycler Check... 3 2.2 Material adicional... 3 2.3 Almacenamiento y Estabilidad... 4 3. Procedimiento de la Prueba... 4 3.1 Amplificación... 4 3.2 Electroforesis en Gel... 5 3.3 Fotodocumentación e Interpretación... 6 4. Avisos y Precauciones... 6 5. Solución de Problemas... 7 6. Explicación de los símbolos usados en las etiquetas... 7 Versión: 7/2013
1. Descripción del Producto El BAG Cycler Check es un método rápido y fácil para la validación de la uniformidad de las temperaturas en los Termocicladores. Especialmente en el diagnóstico de ácidos nucleicos es esencial asegurar la fiabilidad del termociclador en uso. Por lo tanto, esta comprobación debería realizarse con regularidad. El BAG Cycler Check está formado por una mezcla de reacción que es probada en todas las 96 posiciones de un bloque de termociclador. La mezcla de reacción contiene una pareja de primers para la validación de la temperatura de desnaturalización (540 bp) y otra pareja de primers para la validación de la temperatura de anillamiento (1040 bp). Con estas dos parejas de primers se puede probar si la temperatura de desnaturalización es más baja o la de anillamiento es más alta de los que deberían ser. En el caso de que la temperatura de desnaturalización (96 C) no pueda ser alcanzada, pueden darse resultados falsos negativos, especialmente en presencia de secuencias ricas en CG, que son propensas a formar estructuras secundarias. Si las temperaturas son correctas y el perfil de temperaturas es uniforme, deberían haber dos bandas para todas las 96 posiciones del bloque (Fig. 1). Temperaturas diferentes darán como resultado la pérdida de bandas en posiciones individuales o en todas (Fig. 2). Fig. 1: Resultados del kit BAG Cycler Check con los parametros indicados más abajo. Fig. 2: Resultados del kit BAG Cycler Check con 2ºC menos de temp. de desnaturalización. Dado la mix de prueba del kit BAG Cycler Check encaja con las condiciones de los kits BAG HISTO TYPE, Es muy apropiada para optimizar los parámetros de PCR en un termociclador concreto. Esto podría ser necesario ya que los termocicladores pueden estar ajustados de maneras bastante diferentes. 2
2. Material 2.1 Contenidos del kit BAG Cycler Check 4 ó 10 placas BAG Cycler Check, suficientes para 4 ó 10 pruebas. Las mezclas de reacción secas están formadas por dos parejas de primers y nucleótidos. 1 ó 2 viales de 1,1 ml de Tampón de PCR 10x 2 ó 5 viales de 210 µl de ADN control (60 ng/µl) 4 ó 10 láminas de PCR, suficientes para 4 ó 10 pruebas Instrucciones de use y protocolo de la prueba 2.2 Material adicional Taq Polimerasa (5 U/µl), (p.ej.: HISTO TAQ, REF 70975) No usar una Taq Polimerasa Hot-start!!! Pipetas automáticas (0,5-250 µl) Puntas estériles con filtro integrado Termociclador para ADN (p.ej. PTC 200 con tapa ajustable y calentada, MJ Research/BioRad; listado de los termocicladores validados en la página 5) Dispositivos y materiales para electroforesis en gel Agarosa para ADN 0,5x tampón TBE (45 mm de Tris base, 45 mm de ácido bórico, 0,5 mm de EDTA) Bromuro de Etidio (EtBr) Unidad de electroforesis Fuente de Alimentación (200-300 V, 200 ma) Dispositivos para interpretación y fotodocumentación Fuente UV (220-310 nm) Cámara (p.ej.: sistema Polaroid) con película (Polaroid tipo 667) o sistema de vídeo con papel térmico (p.ej.: Typ KP65HM-CE) 3
2.3. Almacenamiento y Estabilidad El kit se entrega a temperatura ambiente. Almacenar todos los reactivos a -20 C, en oscuridad y en dispositivos con temperatura monitorizada. La vidua útil se encuentra en la etiqueta del reactivo correspondiente. La estabilidad indicada en la etiqueta exterior hace referencia al reactivo con la estabilidad más corta contenido en el kit. Descongelar el Tampón de PCR 10x poco antes de ser usado. 3. Procedimiento de la Prueba La evaluación y el control de calidad se llevaron a cabo con HISTO TAQ (REF 70975) o con Taq-Polimerasa de Qiagen. 3.1 Amplification Pipetear la Master-Mix formada por tampón de PCR 10x, solución de ADN, Taq- Polimerasa y H 2 O destilada y mezclar bien con vortex. 104 µl ADN control (60 ng/µl) 824 µl Agua Destilada 104 µl Tampón de PCR 10x 8,3 µl Taq polimerasa (5 U/µl) Añadir 10 µl de esta mezcla a las mezclas de reacción precargadas. Cerrar los tubos fuertemente con la lámina correspondiente. Con termocicladores de tapa ajustable también se pueden usar alfombrillas de PCR reusables. Agitar ligeramente la placa/tira para disolver el pellet del fondo del tubo. Toda la solución de PCR debe quedarse en el fondo. No es necesario recubrir las mezclas de reacción con aceite mineral si se usa una tapa caliente y ajustada!! Colocar los tubos de reacción con firmeza en el termociclador y apretar bien la tapa. Los tubos de reacción deben estar bien encajados en el bloque. Iniciar el programa de PCR. La posición de la placa en el bloque del termociclador es importante para poder asignar las reacciónes con las posiciones (A1 en la esquina superior izquierda). 4
Parámetros de amplificación: Programa-Paso Temp. Tiempo Nº de Ciclos Desnat. Inicial 96 C 5 Min 1 Ciclo Desnaturalización 96 C 20 Seg 5 Ciclos Anillamiento+Extensión 68 C 1 Min Desnaturalización 96 C 20 Seg 10 Ciclos Anillamiento 64 C 50 Seg Extensión 72 C 45 Seg Desnaturalización 96 C 20 Seg 15 Ciclos Anillamiento 61 C 50 Seg Extensión 72 C 45 Seg Extensión Final 72 C 5 Min 1 Ciclo Termocicladores Validados: PTC 100 / 200 / C1000 (MJ Research/ BioRad), GeneAmp PCR-System 9600 / 9700 (usar tasa de calentamiento del 9600) (ABI), Mastercycler epgradient S (usar la función simular gradiente de Mastercycler ) (Eppendorf), Tprofessional (Biometra) Cuando se usen termocicladores con tasas muy rápidas de calentamiento y enfriamiento, se recomienda usar una rampa térmica reducida (~ 2.5 C/seg). Las pruebas de Control de Calidad se llevaron a cabo en un PTC-200 resp. C1000 (MJ Research / BioRad), 9700 (ABI), Mastercycler epgradient S (Eppendorf) y Tprofessional (Biometra). 3.2 Electroforesis en Gel La separación de los productos de amplificación se realiza usando un gel (horizontal) de agarosa. Como tampón para la electroforesis, se recomienda TBE 0,5x (45 mm de tris, 45 mm de ácido bórico, 0,5 mm de EDTA). La concentración del gel debe ser del 2,0 2,5% de agarosa. Dejar polimerizar el gel al menos 30 minutos antes de cargar las muestras. Al terminar la amplificación, sacer las muestras del termociclador y cargar cuidadosamente todaslas muestras de reacción completas en cada pocillo del gel. Además, aplicar 10µl de un estándar de longitud de ADN para comparar los tamaños. La separación electroforética se hace a 10-12 V/cm (con una distancia de unos 20 cm entre los electrodos, aprox. 200-240V), durante 20-40 minutos. Tras finalizar, se tiñe el gel completo en una solución de Bromuro de Etidio (EtBr) (aprox. 0,5 µg/ml de EtBr en H 2 O o tampón TBE) durante 30-40 minutos. Como alternativa, el EtBr (0,5 µg/ml) se puede añadir al tampón de electroforesis 5
o al gel de agarose. Si fuese necesario, se puede eliminar el exceso de EtBr empapando el gel en H 2 O o en tampón TBE 0,5x durante 20-30 minutos. 3.3 Fotodocumentación e interpretación Para fotodocumentación, visualizar el amplificado de la PCR usando un transiluminador UV (220-310nm) y fotografiarlo con una cámara adecuada, película y filtros (p.ej.: Polaroid, película tipo 667 o sistema de vídeo, y papel térmico KP65HM-CE). Elegir el tiempo de exposición y la apertura de tal manera que las bandas se vean nítidas y destaquen frente al fondo oscuro (apertura aproximada 11, tiempo de exposición 1 segundo). Resultados posibles: Si las temperaturas son correctas en todo el bloque del termociclador deberían salir dos bandas en todas las posiciones (540 bp + 1040 bp). Si la temperatura de desnaturalización es demasiado baja la banda de 540 bp desaparecerá de algunas o de todas las posiciones. Si la temperatura de anillamiento es demasiado alta primero la banda de 1040 bp y después la banda de 540 bp desaparecerán de algunas o de todas las posiciones. Si la temperatura de anillamiento es demasiado baja pueden dar bandas inespecíficas. Si el resultados de la PCR no cumplen los requerimientos, se deberían comprobar las temperaturas con un dispositivo electrónico de medida y si fuese necesario se debería avisar al servicio técnico del instrumento. 4. Avisos y Precauciones El Bromuro de Etidio es una sustancia mutagénica potente. Usar guantes cuando se manejen geles o soluciones que contengan EtBr! Tenga en cuenta las instrucciones de uso, avisos y precauciones del fabricante! El transiluminador emite ondas muy cortas de luz UV que puede causar quemaduras en piel y retina. Usar una máscara de seguridad! 6
5. Solución de Problemas Problema Posible causa Solución No amplificación, No hay enzima Repetir tipaje, estándar de longitud visible o concentración demasiado baja cambiar concentración del ADN Ninguna o sólo bandas débiles visibles, estándar de longitud invisible El fondo del gel tiene demasiado brillo Bandas borrosas Parámetros de amplificación incorrectos Tinción con EtBr demasiado débil La tinción fue duró demasido, concentración de EtBr demasiado alta Tampón de electroforesis demasiado caliente o agotado, tampón de electroforesis incorrecto, mala polimerización del gel optimizar los parametros de amplificación, comp. termociclador repetir teñido sumergir el gel en H 2 O o TBE disminuir concentración de EtBr disminuir el voltaje usar tampón TBE 0,5x 6. Explicación de los símbolos usados en las etiquetas Temperatura de almacenamiento Usar antes de Consultar las Instrucciones de uso Suficiente para n pruebas CONT CONTROL DNA CYCLER CHECKING IFU LOT PCRBUF 10x PCRFOIL PCRPLATE REACTIONMIX REF RTU Contenido, contiene Control de ADN Finalidad: Validación de uniformidad de temperaturas en termocicladores Instrucciones de uso Código de Sublote Tampón de PCR, concentrado 10x Láminas de PCR Placas de PCR Mezclas de Reacción Referencia Listo para usar Instrucciones de uso en otros idiomas, consultar: http://www.bag-healthcare.com http://service.bag-healthcare.com Teléfono: +49 (0)6404-925-125 Auftragsannahme/Ordering: Customer Service: BAG Health Care GmbH Tel.: +49 (0) 6404 / 925-450 Tel.: +49 (0) 6404 / 925-125 Amtsgerichtsstraße 1-5 Tel.: +49 (0) 6404 / 925-0 www.bag-healthcare.com Fax: +49 (0) 6404 / 925-460 Fax: +49 (0) 6404 / 925-421 35423 Lich / Germany Fax: +49 (0) 6404 / 925-250 info@bag-healthcare.com verkauf@bag-healthcare.com service@bag-healthcare.com 7