Química Biológica Patológica Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica Tema 2 Dra. Silvia Varas qbpatologica.unsl@gmail.com

Tema 2 PCR Historia Bases Optimización de una reacción de PCR

Un poco de historia

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): no fué un descubrimiento pero fué mas que una invención Una ADN polimerasa especial (Taq) es usada para hacer muchas copias de una corta longitud de ADN (100-10.000 pb) y que esta definida por cebadores o primers Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química

Steamboat Geyser: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone 1994 Yellowstone Association for Natural Science http://www.bact.wisc.edu/bact303/b27 En el año 1960, el microbiólogo Dr. Thomas Brock viaja al Parque Yellowstone National (Wyoming) para investigar a los microorganismos termófilos que viven en el calor de los géiser. El descubrió una bacteria de la especie de la Eubacterias que vivía a altas temperaturas en los géiser Barco de vapor (Steamboat Geyser) del parque: Thermus aquaticus En 1976 se purificó la Taq DNA polymerasa desde Thermus aquaticus. En 1983 la empresa Cetus Corporation patentó la técnica y el uso de la enzima DNA polimerasa de Thermus aquaticus y sentó las bases para el desarrollo de esta tecnología Hubo en paralelo un desarrollo de un blocks de calentamiento programables (termocicladores)

Termocicladores para PCR

El ciclo de amplificación de PCR Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

El perfil de temperatura de un ciclo de PCR es controlado por el programa del termociclador. Hay un incremento exponencial del producto de PCR hasta cerca del ciclo nº 30.

PROCEDIMIENTO..

PCR: PRINCIPIOS

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) PCR es una técnica la cual es usada para amplificar un numero de copias de una región especifica del ADN hasta producir una cantidad de DN que sea adecuadamente testeada. El propósito de la PCR es hacer un alto numero de copias de un gen. Como resultado es posible y caracterizar fragmentos de ADN hallados en una gota de sangre, en una escena de crimen o de un dinosaurio extinguido.

Definición PCR es un sistema no celular de clonado del ADN Es un método de amplificación selectiva de secuencia específicas. A partir de una población heterogénea de moléculas, como puede ser ADN genómico o cdna. PCR es un proceso de replicación in vitro.

Ventajas y Desventajas VENTAJAS: Rapidez Sensibilidad Fortaleza DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN

Infidelidad: Errores cometidos por la enzima: Taq pol 1 error / 2x10 4 pb incorporadas Tli pol (Thermococcuslitoralis) 1 error/ 4x10 5 pb incorporadas Pfu pol (Pyrococcusfuriosus): 1error/ 7x10 7 pb incorporadas In vivo ADN polimerasa: 1 error/ 3x10 9 pb incorporadas Eficiencia: 88 % 70% 60%

Eficiencia de una PCR Especificidad Rendimiento Fidelidad

PCR En un tubo de PCR con una mezcla de DNA genómico, DNA polimerasa, buffer, nucleósido trifosfatos y primers Termociclador

Nomenclatura Hebras de ADN! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5 3 3 5 Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

Paso 1: Desnaturalización del DNA Esto ocurre a 92-95 ºC

Paso 2: Annealing o Unión de Primers Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

Paso 3: Extensión o Primer Extension 5 3 extension extension 3 5 DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5 3

El nuevo ciclo se inicia por desnaturalización de las nuevas hebras formados en el ciclo previo.

El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

Elementos de una PCR especifica 1) Templado 2) Enzima 3) Iniciadores Calidad Concentración Secuencia Concentración, pureza y estabilidad 4) Temperatura de anneling 5) Concentración de Magnesio 6) Concentración de Nucleótidos 7) Condiciones del medio: Buffer, ph, etc. 8) Aditivos: Formamida, DMSO, glicerol, etc.

1)Templado ADN genómico CALIDAD: CONCENTRACION: 10pg-1µg

2) Enzima

DNA Polimerase de Taq (Thermusaquaticus) Esta enzima tolerante al calor y sobrevive a los distintos ciclos de desnaturalización

La actividad 3'5 exonucleasa remueve en posición 3 todo nucleótido mal apareado (Realiza una función de lectura de prueba) (proofreading) La actividad 5'3 exonucleasa desplaza nucleótidos por delante de la adición por la actividad polimerasa

La actividad 3'5 exonucleasa (proofreading) In vivo 1 base en 3x10 9 nt es copiado incorrectamente

3) Elección de los Primers o Iniciadores I 1. Tamaño: generalmente cerca de 20 nt 2. Tº de anneling semejante 3. Tm= 4(G+C) + 2 (A+T) ºC 4. Evitar repeticiones, buscar regiones con una distribución homogeneas de bases 5. Contenido de GC (40-60%) 6. Elección de primers para cdna

3) Elección de los Primers o Iniciadores II 7. Elegir iniciadores con residuos G o C en 5 o en la zona central 8. Evitar secuencias complementarias en el extremo 3 9. Evitar secuencias que formen estructuras secundarias. 10. CONCENTRACION : 20-50 pm/ul 11. Proporción molecular: Iniciadores/ADN molde = 10 8 :1 12. Si es disminuye la eficiencia 13.Si es disminuye el rendimiento

3) Primers o Iniciadores: Resumen 1. Específicos de la secuencia de interés 2. Longitud 18-30 nucleótido 3. Tº Annealing 50 o C-70 o C Idealmente 58 o C-63 o C 4. GC contenido 40-60% 5. Extremo 3 critico Evitar:regiones GC (G or C en extremo 3 terminal) 4. Secuencia Complementarias entre si mismas y con otros Hairpins <5, dimers <9

Se debe evitar:

4) Temperatura de anneling Temperatura de Annealing: ~ 5 o C menos que la Tm de los primers Tm = 4(G + C) + 2(A + T) o C (o usar el Tm provisto por planilla del proveedor) en la tº anneling resulta en una union noespecífica. en la tº annealing resulta en reducción en el rendimiento

G: 3 ; A: 11 C:5 ; T: 7 TOTAL= 26 nt Tm= 4.8+2.18=32+36=68ºC

Efecto de la temperatura de anneling vs rendimiento y especificidad Los pares de primer o cebadores 1 y 2 generan altos niveles del producto de PCR correcto a 55ºC. Sin embargo el par 3 de cebadores funciona mejor a 50ºC.

5) Concentración de Mg 2+ 1.Importante para la actividad de la enzima. 2.Debe hacerse una curva de titulación 1-3 mm con incrementos de 0,5mM. 3.MgCl 2 : se requiere para la unión del primer

5) Concentración de Mg 2+ - II MgCl 2 afecta la union de los cebadores, Tm del templado del ADN, actividad de la enzima y fidelidad Los dntps, cebadores y el templado quelan y secuestran ion Mg su concentración debe ser mayor que los dntps Exceso de Mg 2+ aumenta la inespecificidad Pequeñas cantidades de Mg 2+ reduce el rendimiento

6) Concentración de dntps 1. Debe variar según el tamaño de la secuencia target a amplificar. 2. Por ejemplo: para un rendimiento de 10 12 moléculas de 100pb, se necesitan 10 14 moléculas. 3. Generalmente la mix que se prepara son de 2-2,5 mm

7) Mezcla de reacción 1. El buffer, ph y concentración de Mg 2+ óptimos de acuerdo a la secuencia y al par de iniciadores elegidos 2. Uso de estabilizantes de la enzima: gelatina, Tritón X-100, Tween 20, BSA 3. Elementos que facilitan la desnaturalización del ADN molde: glicerol, dimetilsulfóxido y formamida

7) Mezcla de reacción II La mayoría de los buffers tienen KCl (50mM) y Tris (10mM): 1. Estas concentraciones pueden ser alteradas, KCl facilita la unión de los cebadores pero a concentraciones 50mM inhiben la Taq 2.Los buffer pueden tener: DMSO, BSA, gelatina, glicerol, Tween-20, Nonidet P-40, Triton X-100, DTT. la especificidad de la reacción pero tambien pueden ser inhibitorios.

1. El 8) Típica reacción de PCR:

Optimización: número de 25-40 ciclos ciclos El tiempo de vida media de Taq es de 30 minutes a 95 o C Si se usa mas de 30 ciclos con un tiempo de desnaturalización de 1 minuto, la eficiencia de la Taq será menor. No caer en la fase de Plateau

Rendimiento Teórico = 2 n Por ej.. ciclo 1 = 2, ciclo 2 = 4, ciclo 3 = 8, etc Ej. Si Ud. inicia la PCR con 100 copias después de 30 ciclos obtendrá 1.073.741.800 copias

Amplificación Exponencial Ciclos 1 2 4 10 15 20 25 30 Copias 2 4 16 1.024 32.768 1.048.576 33.554.432 1.073.741.824

Fases en una reacción de PCR El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La fase plateau resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

Causas de Efecto Plateau Agotamiento de los sustratos (dntps o primers). Estabilidad de los reactivos (dntps o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA). Competición de los reactivos por productos no específicos o dímeros de cebadores. Incompleta desnaturalización / separación de hebras a altas concentraciones del producto.