ORGANOS, CELULAS y ATOMOS

ORGANOS, CELULAS y ATOMOS

TAMAÑO DE CÉLULAS, SUS COMPONENTES Y PODER DE RESOLUCIÓN DE LOS MICROSCOPIOS

Principios del MICROSCOPIO OPTICO

SISTEMA OPTICO DE UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

COLORANTES FLUORESCENTES UTILIZADOS COMUNMENTE

MICROSCOPIA FLUORESCENTE CON MULTIPLES SONDAS Célula en mitosis vista con 3 sondas fluorescentes: microtúbulos con anticuerpo (verde), centrómeros con rojo y ADN de cromosomas condensados con azul DAPI.

INMUNOCITOQUÍMICA INDIRECTA

MICROSCOPÍA CONFOCAL DE FLUORESCENCIA Comparación entre microscopía convencional y confocal. Embrión de Drosophila en el estadío de gástrula.

COMPARACIÓN DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO CON UNO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (TEM, transmission electron microscopy) Fijadores químicos que se utilizan en microscopía electrónica. El osmio se une a lípidos y proteínas y los estabiliza. En el microscopio óptico las lentes son de vidrio y en el electrónico son bobinas magnéticas. En el electrónico la muestra es colocada en un fuerte vacío (células muertas). Los tejidos se cortan en secciones muy delgadas (1/200 del espesor de una célula). Previamente, se deshidrata y polimeriza la célula con una resina. La imagen depende del contraste que se origina por los electrones que se dispersan en la muestra. Esto depende del número atómico (bajo) de los átomos de la célula (C, N, O, H). Se constrasta con plomo, uranio, oro.

Con tetraóxido de osmio pueden identificarse lípidos. Una parte de los lípidos ennegrece inmediatamente por la acción de la solución de ácido ósmico. El ennegrecimiento se forma por el doble enlace -C=C- de los ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos, que al principio se vuelven pardos, pueden ennegrecerse por tratamiento con alcohol 60-70%. Para la microscopía electrónica, las muestras fijadas con glutaraldehído se fijan posteriormente con solución de óxido de Osmio (VIII). CÉLULA DEL MERISTEMA APICAL DE RAIZ DE GRAMÍNEA CONTRASTADA CON OSMIO

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM, scanning electron microscopy) La muestra es barrida por un haz de electrones focalizado. Los cambios en la superficie de la muestra hacen que los electrones se dispersen. Un detector mide la dispersión e intensidad de los electrones dispersados. Puede escanear células pero no arganelas. El SEM es un instrumento que permite la observación y caracterización superficial de materiales inorgánicos y orgánicos, entregando información morfológica del material analizado. Con el SEM se pueden realizar estudios de los aspectos morfológicos de zonas microscópicas de los distintos materiales. Las principales utilidades del SEM son la alta resolución (~100 Å), la gran profundidad de campo que le da apariencia tridimensional a las imágenes y la sencilla preparación de las muestras.

TEM SEM (Caso particular) El sombreado metálico permite el examen de detalles superficiales con el TEM. El metal se refuerza con una capa de Carbono. Espiga (flor) de trigo en desarrollo. Se congeló, se recubrió con una capa de metal y se examinó con SEM.

AUTORADIOGRAFÍA + MICROSCOPIO ELECTRÓNICO A B Células pancreáticas marcadas con un pulso de ( 3 H)-leu (5 min) y luego se agregó exceso de leu no marcada ( caza ) (10 min). Se observan los granos negros de plata de la emulsion fotográfica que corresponde a la localización de la insulina (proteína de secreción) en el RE (A, foto tomada luego de la caza ) y luego en el Golgi (B, foto tomada 5 min después de la caza ).

Citometría de Flujo Es una tecnología biofísica/bioquímica empleada para: el conteo de células, su separación por diferentes propiedades, funcionar como detector de biomarcadores, etc. Permite el análisis simultáneo multiparamétrico de las distintas propiedades de las células Permite aislar poblaciones de células con propiedades/características idénticas

TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO # Herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño, color y propiedades. El análisis se realiza mediante la medida simultánea de múltiples características (fluorescencias asociadas y tamaño) de partículas individualizadas sobre las que se hace incidir un haz de luz láser. # Separación física de partículas (células) sobre la base de la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica. # Muy utilizada para la detección de cáncer de sangre, carga viral, etc. P. ej. El recuento de linfocitos CD4/CD8 en sangre y su relación, da una idea del estado inmunológico de la persona infectada.

Citómetro de flujo: Fluorescence activated cell sorting (FACS) 1. Suspensión concentrada de células marcadas con fluorescencia se hace pasar a través de un haz de rayos laser. 2. Con detectores se mide la luz emitida y la dispersada. Se determina asi tamaño y forma de células. 3. Se fuerza a la formación de gotitas que contienen una sóla célula y se le da una carga eléctrica proporcional a la fluorescencia que fue detectada previamente. 4. Las gotas sin carga y las que tienen cargas eléctricas diferentes son separadas por medio de un campo magnético y recogidas. Se pueden separar 10 millones de células por hora. 5. Se preparan cultivos de células con propiedades diferentes pero homogéneas.

CARACTERÍSTICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO -El análisis es multiparamétrico y simultáneo. Los parámetros analizables son: Los relacionados con las características físicas de la partícula (tamaño y complejidad: dispersión de luz frontal y lateral de la luz incidente) Las fluorescencias asociadas a la partícula. Se utilizan sondas fluorescentes asociadas de manera específica a la partícula (anticuerpos acoplados a fluorocromos, proteínas/molélulas fluorescentes) - El análisis se realiza sobre partículas individuales dentro de una población compleja. - El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000 partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad estadística (permite analizar poblaciones representadas en baja frecuencia). - Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm (bacterias, levaduras, células eucarióticas).

LAS APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO CITOMETRÍA DE FLUJO ANALÍTICA 1. Inmunofenotipo 2. Ensayos Funcionales 3. Ensayos con genes reporteros Separación celular en base a la detección diferencial de una o varias fluorescencias asociadas a un parámetro fenotípico, una característica funcional o a la expresión de un gen reportero.

APLICACIONES 1. Inmunofenotipo Identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana. - Identificación de poblaciones celulares desconocidas. - Análisis de las posibles alteraciones en poblaciones celulares conocidas (aplicaciones clínicas, análisis del efecto causado por la modificación de la expresión de un gen) Caracterización fenotípica de precursores Hematopoyéticos (desarrollo de células de la sangre) CD34 y CD44, antígenos (glicoproteínas de la superficie celular); FS, Folistatina, glicoproteína con funciones autócrinas; IL-7R, citokina; GM-CSFR, receptor del factor de estimulación de formación de colonias en granulocitos (macrófago).

APLICACIONES 1. Inmunofenotipo 2. Ensayos Funcionales (ejemplos): Análisis de ciclo celular (PI, 7-AAD, Hoechst, BrdU) Apoptosis (AnexinaV, Caspasa-3) Flujo de Ca ++ (Indo-1, Fura-3) Cuantificación de la producción de citoquinas Señalización intracelular (fosforilación de proteínas)

Ciclo celular Células T G0/G1 70% Sub-G1 3% S 18% G2/M 9% 0 200 400 600 800 1000 FL2-A (DNA dye)

Apoptosis: I. Proporción de células anexina V positivas. La anexina V es una proteina que se une al lípido fosfatidilserina de la MP con ayuda de Ca 2+. Es anticoagulante, desplaza factores de coagulación. conjugados Anexina V Apoptosis citoplasma fosfatidil serina citoplasma Yoduro de propidio viables Anexina V-FITC Muertas apoptosis