Separación e identificación de lípidos de membrana Objetivos Separación e identificación de especies de fosfolípidos por cromatografía de capa fina (TLC, Thin Layer Chromatography) TLC monodimensional (1) TLC bidimensional (2) Tinción: yodo cobre-fosfórico 1
Separación de lípidos Solventes no polares Principio: Diferencias en polaridad = solubilidad en solventes no polares Interacción diferencial de los solventes con la matriz Terminología: Solventes: fase móvil Matriz: fase estacionaria ESFINGOLIPIDOS COLESTEROL GLICEROFOSFOLÍPIDOS 2
Matriz Material insoluble y polar sílica gel (ácido silícico Si(OH) 4 ) La sílica gel se esparce como una capa fina sobre un soporte generalmente vidrio Matriz 3
Separación de Lípidos Las muestras se colocan en el borde de la placa La placa se encuentra en una cámara con un ambiente saturado del vapor del solvente A medida que el solvente sube por la placa por capilaridad, va arrastrando a los lípidos. Los lípidos polares se unirán fuertemente a la sílica, mientras que los lípidos neutrales no serán retenidos. La separación ocurre por una interacción entre los lípidos y la sílica y su solubilidad relativa en los solventes utilizados. Sistema de TLC placa de TLC tanque de vidrio con tapa 4
Sistema de TLC T 0 origen 5
T 1 T f frente de corrida 6
frente de corrida Interacción matriz - solvente SITUACION IDEAL: El solvente que interactúa más fuerte con la silica (A) es extraído de la mezcla y forma una capa de adsorción en la superficie (X) La mezcla binaria remanente continuúa migrando, y el segundo solvente en fuerza de interacción (B) es adsorbido formando la capa Y Finalmente el solvente C continúa migrando y forma la capa Z SITUACION REAL: No existe una separación total de los solventes por su interacción con la sílica, siempre habrán fases con 3 componentes, en diferentes proporciones dependiendo de su interacción con la matriz. 7
Interacción matriz - solvente El sistema matriz solvente es difícil de predecir de forma teórica El sistema se hace más complejo a mayor número de solventes y de sus concentraciones relativas Lo mejor: hacer pruebas de ensayo y error Esto no invalida la exactitud y precisión del TLC como método de separación y cuantificación de lípidos 8
Identificación de Lípidos Los lípidos una vez separados pueden ser detectados en las placas de TLC mediante distintos métodos de tinción. Las moléculas que actúan como reveladores reaccionan con diferentes componentes de los lípidos, como los dobles enlaces de los ácidos grasos, el fósforo o los grupos amino de la cabeza polar. Identificación de Lípidos Las diferentes especies lipídicas son identificadas en Las diferentes especies lipídicas son identificadas en base a su migración relativa en las placas, al compararlos con muestras patrón que se incluyen en las corridas. 9
Procedimiento 10
primera dimension: cloroformo/metanol/agua (75:25:2.5,v/v) segunda dimension: cloroformo/metanol/ácido acético/agua (80:9:12:2,v/v) Separación de Lípidos: Materiales y Reactivos Muestra Estándares de fosfolípidos Placas de TLC (Merck, Sílica 60 sobre vidrio) Tanque de TLC Jeringas Hamilton Mezclas de solventes: solución acetona/hexano (1:3) v/v, solución cloroformo/metanol/acético/agua (50:25:8:2) v/v, reactivo cobre-fosfórico. Nitrógeno grado cromatográfico (AGA S.A., Lima, Perú) 11
Procedimiento Extracto con isopropanol/cloroformo (11:7) v/v ~ 0.2 umol fosfolípidos / ml = 0.2 nmol fosfolípidos / ul Volumen aprox: 20 ml Concentrar evaporando bajo corriente de nitrógeno Resuspender en 800 ul benceno/metanol (4:1) v/v con BHT al 0.05% ~ 5 nmol fosfolípidos/ul TLC Unidimensional (1) PREPARACION DE LA PLACA Colocar las placas de cromatografía en una estufa a 100 C por 20 minutos Dejar enfriar las placas en una cámara sellada, conteniendo un desecante activo Una vez fría la placa, trazar una línea paralela a uno de los bordes a un centímetro t de distancia i con un lápiz blando de punta roma 12
TLC Unidimensional (2) MUESTRAS: Sembrar las muestras (5µl, equivalente a 8-12 nmol de fósforo inorgánico) en forma lineal, dejando 1 cm libre a cada lado de la placa. La muestra se aplica sobre una superficie lineal de 5 mm El espacio entre muestra y muestra es de 5 mm IMPORTANTE: evaporar el solvente con una corriente de aire, a medida que se va aplicando la muestra sobre la placa TLC Unidimensional (3) Desarrollar la placa en la cámara estabilizada previamente por 10 min con acetona/hexano (1:3) v/v este sistema arrastra a los lípidos no polares Retirar la placa de la cámara y secar por 15 min con aire caliente. Una vez seca la placa, desarrollar la placa en una cámara para cromatografía de capa fina estabilizada por 10 min con cloroformo/metanol/acético/agua (50:25:8:2) v/v IMPORTANTE: Terminar la corrida antes que el solvente llegue al borde superior de la placa. 13
TLC Unidimensional (4) Luego de la cromatografía, secar la placa con aire caliente por 15 minutos, y posteriormente a 100 C por 20 minutos Dejar enfriar la placa en una cámara sellada conteniendo un desecador activo (sílica gel) TLC Bidimensional (1) PREPARACION DE LA PLACA Colocar las placas de cromatografía en una estufa a 100 C por 20 minutos Dejar enfriar en una cámara sellada, conteniendo un desecante activo Una vez fría la placa, trazar una línea paralela a dos de los bordes convergentes, a un centímetro t de distancia con un lápiz blando de punta roma 14
TLC Bidimensional (2) MUESTRA Sembrar la muestra (8 µl, equivalente a 16-20 nmol de fósforo inorgánico) en forma de punto, en la intersección de ambas líneas IMPORTANTE: Evaporar el solvente con una corriente de aire, a medida que se va aplicando la muestra sobre la placa TLC Bidimensional (3) Desarrollar la primera dimensión de la placa la cámara estabilizada por 10 minutos con cloroformo/metanol/hidróxido de amonio (13:5:1) v/v Secar la placa con aire caliente por 15 minutos Una vez seca la muestra, desarrollar la segunda dimensión de la placa en la cámara estabilizada por 10 minutos con cloroformo/acetona/metanol/acético/agua (6:8:2:2:1) v/v IMPORTANTE: Terminar la corrida antes que el solvente llegue al borde superior de la placa 15
Identificación de Lípidos: Materiales y Reactivos Reactivo cobre-fosfórico: 10 gr de CuSO4.5H2O en 100 ml de ácido fosfórico 8% PRINCIPIO: La tinción es proporcional a los ácidos grasos presentes en los fosfolípidos. Tinción de yodo: recipiente saturado con vapor de yodo PRINCIPIO: El yodo interactúa reversiblemente con los dobles enlaces de los ácidos grasos, dando un color amarillo Identificación de Lípidos: Procedimiento COBRE FOSFORICO Una vez fría, rociar la placa con un aspersor cargado de reactivo cobre-fosfórico Colocar la placa húmeda en una estufa a 120 C por 20 minutos Identificar las especies lipídicas en base a las muestras patrón 16
Identificación de Lípidos: Procedimiento YODO Una vez fría, colocar la placa sobre un recipiente con yodo. Esperar que los vapores de yodo impregnen la placa Identificar las especies lipídicas en base a las muestras patrón TLC Unidimensional: Resultados esperados PA PE PI / PS PC SM 17
TLC Bidimensional: Resultados esperados PA PS PE PI LPC PC SM Rodamina 6G 18
Cálculos (Rf) Factor de Retardo: Rf = distancia recorrida por la muestra (d1) distancia recorrida por el solvente (d2) Cada especie molecular presenta un Rf particular: para un tipo de matriz Para un sistema de solvente determinado TLC Unidimensional: Rf PA PE PI / PS Rf d2 Rf d1. PC SM 19
TLC Bidimensional: Rf PA PE PS Rf1-d2 PI Rf1-d1 LPC PC Rf2 d2 SM Rf2 d1 20