TRABAJO PRESENTADO EN EL CONGRESO COLOMBIANO - CALI 2005 Inyección intracitoplasmática con espermatozoides testiculares criopreservados en pacientes con azoospermia Experiencia en 34 pacientes Resumen Luis Eduardo Cavelier C. Médico Urólogo, Gerente PMA. Pablo Gómez C. Médico Urólogo - Andrólogo. Ivonne Díaz Y. Ginecología, Infertilidad, Directora Científica. Gloria Martínez U. y Mónica Valencia A. Bacterióloga PMA. Unidad de Fertilidad, Procreación Médicamente Asistida (PMA) - Grupo asociado a la Clínica de Marly, Bogotá - Colombia. El éxito de criopreservar espermatozoides no eyaculados, ha sido reportado en pacientes con azoospermia no obstructivas. La inyección intracitoplasmática (ICSI) con espermatozoides de origen testicular se ha convertido en un método para el tratamiento de parejas infértiles por azoospermia. Diferentes técnicas quirúrgicas para la obtención de espermatozoides testiculares han sido utilizadas como lo son la biopsia testicular abierta (TESE) y la aspiración con aguja (PESA) entre otras. Reportamos la experiencia en nuestro centro de fertilidad de 34 pacientes a quienes se les realiza biopsia testicular diagnóstica y terapéutica, con congelación de los espermatozoides obtenidos o su utilización en fresco, para posteriormente ser utilizados bajo la técnica de ICSI. El rango de edad de los pacientes es de 26 a 59 años, con un promedio de edad de 37.7 años. En 16 ciclos iniciados se transfieren 48 embriones, y se reportan 8 embriones implantados, 4 embarazos y 7 bebes en casa, para una tasa de embarazo por aspiración de 25% y tasa de embarazo por transferencia de 26.66%. Se recomienda realizar biopsias diagnósticas de testículo en pacientes azoospermicos, en centros de fertilidad calificados, para que en el caso de encontrar espermatozoides estos puedan ser utilizados en fresco o ser crio preservados, para posteriormente realizar Micromanipulación. Enviado para publicación: Julio de 2005 Aceptado para publicación: Enero de 2006 ARTÍCULO ORIGINAL 29
30 Introducción La azoospermia se encuentra en el 1% de los hombres, y la incidencia en las parejas subfertiles ha sido reportada hasta en un 10%- 15%. 16 En los últimos años las técnicas en reproducción asistida se han orientado hacia el tratamiento del hombre infértil. Con la aparición de la inyección intracitoplasmatica del espermatozoide (ICSI) 12 se ha incrementado de manera significativa la fertilización y tasas de embarazo en pacientes con severo compromiso en la calidad del esperma. El éxito de criopreservar espermatozoides no eyaculados, ha sido reportado en pacientes con azoospermia no obstructivas 1,2. Cada día más la inyección intracitoplasmática con espermatozoides de origen testicular se está convirtiendo en un método para el tratamiento de parejas infértiles por azoospermia 3,4,5,6. Diferentes técnicas quirúrgicas para la obtención de espermatozoides han sido utilizadas, siendo las biopsias de testículo a cielo abierto (TESE) 7,8 ; la técnica estándar, además se describen otras alternativas como la aspiración percutanea de epidídimo con aguja (PESA) 9, o la aspiración percutanea de testículo con aguja (TESA), o la aspiración microscópica de espermatozoide de epidídimo (MESA) Romero y cololaboradores 10 reportaron fertilización con espermatozoides testiculares congelados y posteriormente; Hovatta y col 11 describieron un embarazo logrado con ICSI utilizando espermatozoides testiculares congelados. La realización de biopsia testicular en pacientes con azoospermia no obstructiva, es cada día más utilizada, no solo para el diagnóstico, sino también para tratamiento; usualmente, estos pacientes tienen testículos pequeños y son sometidos de manera repetida a biopsias, lo que lleva a una disminución progresiva, tanto del tamaño como de la función testicular. Varios estudios han reportado que 41% - 58% de hombres con azoospermia no obstructiva, tienen espermatozoides presentes después de biopsias diagnósticas testiculares abiertas (TESE). Reportamos el análisis retrospectivo de 34 pacientes con azoospermia, a quienes se les realiza la toma de biopsias testiculares a cielo abierto con propósitos diagnósticos y terapéuticos, desde Mayo de 1998 a Agosto de 2005. Posterior a las biopsias se procede a realizar la congelación de los espermatozoides obtenidos, y finalmente en una segunda etapa estos son utilizados para lograr la fertilización de mediante la técnica de ICSI. Material y Métodos Se estudia y trata un total de 34 pacientes que consulta a nuestra unidad de fertilidad por azoospermia. Todos los pacientes son estudiados bajo el protocolo de Azoospermia. Típicamente se realizan como mínimo 2 estudios de espermograma; cuando se confirma el diagnóstico de azoospermia se inicia el estudio hormonal, consistente en Hormona Folículo Estimulante (FSH), Hormona Luteinizante (LH), y Testosterona. El rango de edad de los pacientes es de 26 a 59 años, con un promedio de edad de 37.7 años. (Tabla 1). Tabla 1 Edad (Años) Pacientes 26-30 5 31-35 12 36-40 7 41-45 3 46-50 5 51-55 1 56-60 1 Total 34 El tejido de las biopsias se envía a estudio patológico, encontrando diferentes causas o problemas histológicos que se resumen en los siguientes disgnósticos: (a) Arresto en la maduración (b) aplasia de células germinales (c) Hipoespermatogénesis. En el presente estudio se identifican problemas de Azoospermia Obstructiva y No obstructiva. El 35.2% de los pacientes presentan patología obstructiva y
64.8% son no obstructivos. De los primeros se identifican varias etiologías de la obstrucción, siendo las más importantes la vasectomía y los procesos infecciosos. (Tabla 2). Tabla 2: Causas obstrucción Causa Pacientes Pos Vasectomía 7 Herniorrafia Inguinal Bilateral 1 Infecciosa 2 Prostatectomía Radical 1 Agenesia Deferentes 1 Total 12 En los 34 procedimientos, se realizan varias técnicas para obtener esperma-tozoides, siendo en nuestra serie la Biopsia testicular a cielo abierto la más frecuente en un 50% de los casos. Se practican otras técnicas que se resumen en la tabla 3. Tabla 3 Procedimiento Cantidad TESE DERECHO 12 TESE IZQUIERDO 2 TESE BILATERAL 8 TESE + MESA 4 TESE + MESA + TESA 1 TESE + TESA 4 MESA 2 TESA 1 Total 34 Las biopsias testiculares son realizadas bajo anestesia local o anestesia general. La intervención se practica con apertura transversal del escroto y exposición del testículo; se realiza apertura de túnica vaginal y se procede a la extracción de la biopsia testicular, de un tamaño aproximado de 0.5 mililitros. por muestra; se obtienen entre una y cuatro muestras en cada testis. Se realiza cierre de la albuginea con catgut cromado 3 ceros y sutura de escroto en dos planos; no se reportan complicaciones en el postoperatorio. Las aspiraciones percutaneas se practican con aguja pericraneal número 19. En todas las muestras se anotan los cambios macroscopicos del tejido testicular y se entrega tejido para análisis patológico, material enviado en medio Buin (Acido picrico + formol + ácido acético). Los cortes se entregan al biólogo en medio Global w/hepes (ref. GMGH-100) suplementado con 10% SSS (Irvine Scientific ref. 99193) previamente calentado a 37 grados centigrados, en cajas de petri 35x10 mm Flacon. Allí el biólogo ayudado por el esteroscopio en camara de flujo laminar, se procede a la disección de cada uno de ellos. Dejando una caja para cada testículo. Este proceso se realiza con bisturí o con aguja de insulina. En la medida que se va separando los tubos seminiferos, el biólogo realiza observaciones por microscopio de luz, para observar la presencia de células espermáticas maduras. Encontrando en 22 pacientes (64.7%) espermatozoides, 54.5% de los casos con movilidad pendular y colocando este material en tubos estériles (Falcon 352099),, el tejido restante se le adiciona 1-2 ml. De medio Global 10% SSS y se coloca en la incubadora de CO2 a 37 C por espacio de 2 horas, esto se realiza para favorecer que algunos espermatozoides que hayan quedado atrapados dentro de los túbulos puedan salir al medio y también poder lograr en lo posible obtener algo de movilidad. En los casos en que se requiere congelar la muestra, se toma el sobrenadante; se centrifuga por 10 minutos a 250g, desechando el sobrenadante y dejando un pellet entre 250 a 500 microlitros, se procede a realizar la mezcla en relación 1:1 con medio de congelación (Ackerman). Esta dilución se mantiene por 15 minutos a temperatura ambiente y se procede al llenamiento de las pajillas de 0.25cc (una a tres pajillas), para realizar en un segundo tiempo el procedimiento de congelación. De las 34 biopsias realizadas se practica Inyección Intracitoplasmática (ICSI) en 16 parejas, lo que corresponde al 47% de los pacientes a quienes se les realiza el procedimiento testicular o epididimario para la obtención de espermatozoides. 4 ICSI se reali- 31
32 zan con biopsia fresca y 12 con biopsia descongelada. La muestra de espermatozoides testiculares se descongela, lavada una vez, resuspendida en 1 ml de medio tamponado con HE- PES y mantenida a temperatura ambiente hasta el momento de ser empleada. En caso de no observar espermatozoides móviles se realiza una prueba de vitalidad con Eosina (OMS, 1992), para detectare gametos con adecuada integridad de membrana. En la placa de ICSI (Beckton Dickinson, USA), se dispone del siguiente material: Cuatro gotas de medio tamponado, dos gotas de Polivinilpirrolidona - PVP (Irvine Scientific, USA), una gota de suspensión de espermatozoides, una gota de solución hiposmótica (OMS). Por medio de micromanipulación se seleccionan los espermatozoides de morfología normal y se transfirieren a la gota de solución hipo-osmótica, observandolos uno a uno; aquellos donde fue evidente una reacción positiva se transfirieron a una de las gotas PVP. Para procedimiento de ICSI se empleó una pipeta de microinyección con un diámetro interno de 5-7 um y se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Van Steirteghem 12. Se iniciaron 16 ciclos de ICSI, las parejas con edad promedio de 32.1 años fueron sometidas a un protocolo largo de estimulación, utilizando análogos de la GnRH en la fase lutea día 21 del ciclo precedente, hacia el tercer día del ciclo menstrual siguiente y habiendo logrado un descensibilización confirmando con un estradiol menor de 20 pg/ml, la estimulación folicular se inicio con dosis entre 150 a 225 UI de acuerdo a la edad materna, se iniciaron los controles ecográficos y de estradiol al 5 día de estimulación y la dosis fue ajustada de acuerdo a la respuesta, una vez se alcanzó un tamaño folicular de 18 mm; se colocaron 10.000 UI de gonadotropina coriónica humana y la paciente fue llevada a aspiración folicular vía transvaginal 36 horas más tarde bajo sedación intravenosa, posterior al procedimiento se inició sustento de la fase lutea utilizando progesterona IM o progesterona micronizada vaginal hasta el día de resultado de BHCG, en caso de positivo, esta se continuó hasta la semana 12 de embarazo. Un total de 115 oocitos fueron microinyectados, se observó fertilización normal con la presencia de 2PN en 68 oocitos (59%), clivaron 56 zigotos (83%), en 15 ciclos se transfirieron 48 embriones, con un promedio de embriones transferidos de 3.2, la transferencia se llevó acabo 48 horas postmicroinyección; una tasa de embarazo clínico por transferencia de 26.66%, nacidos vivos 26.66%. (Ver tabla 4). Tabla 4: Resultados Resultados Ciclos iniciados (ICSI) 16 Ciclos transferidos 15 Ambarazos 4 Embriones transferidos 48 Embriones implantados 8 Tasa de embarazo por aspiración 25% Tasa de embarazo por transferencia 26.66% Tasa de implantación 16.66% Tasa de embarazo multiple 50% Tasa de parto por aspiración 25% Tasa de parto por transferencia 26.66% Los resultados de los ciclos iniciados desde enero de 2004 se observan en la tabla 5. Tabla 5: (ciclos iniciados desde 2004) Resultados Ciclos transferidos 4 Embarazos 2 Embriones transferidos 12 Embriones implantados 3 Nacidos vivos 3 Tasa de embarazo por aspiración 50% Tasa de embarazo por transferencia 50% Tasa de implantación 33% La presenta revisión muestra la diferencia en los resultados cuando se utilizan espermatozoides criopreservados o muestras en fresco. Nuestra experiencia revela un porcentaje de fertilización de 54.4% y utilizando
muestra fresca obtenemos un 58.3%. Se resumen los datos en la tabla 6. Tabla 6 Material # Oocitos % Nacidos Inyectados Fertilización Embarazos Vivos Esperma crio preservado 90 54.4% 2 2 Esperma fresco 25 58.3% 2 5 Las pacientes se someten a dosificación de Beta HCG cuantitativa los días 10, 12 y 14 pos trasferencia, las cuales reflejan el resultado del tratamiento. Una vez confirmada la implantación se inicia el seguimiento del embarazo de acuerdo a los estándares internacionales en obstetricia. Discusión La tasa de embarazo por transferencia según la Red Latinoamericana de Reproducción Asistida del 2002 de ICSI en general fue del 33.7% de un total de 8430 aspiraciones, no existen datos del porcentaje de embarazo en la red de resultados con espermatozoides obtenidos del testículo. El presente serie demuestra una vez más la factibilidad de criopreservar tejido testicular durante una biopsia o aspiración diagnóstica para la realización de reproducción asistida con espermatozoides frescos o en un segundo tiempo. La realización de biopsia testicular abierta es una buena elección en los pacientes con cualquier causa de azoospermia, siendo una técnica sencilla y rápida de realizar. Creemos que la aspiración con aguja es una técnica apropiada para la recolección de espermatozoides en estos pacientes, requiere una considerable experiencia para obtener muestras suficientes para lograr las tasas de embarazo deseadas. Se hace imperioso realizar los procedimientos diagnósticos en los casos de azoospermia en un centro de fertilidad que disponga de todos los equipos y del personal especializado en estas tareas, para convertir el procedimiento en una herramienta terapéutica. Con frecuencia los pacientes se ven obligados a repetirse la biopsia testicular en varias ocasiones; la búsqueda especializada de espermatozoides por disección y su congelación posterior, evitaría una nueva biopsia con los efectos deletéreos que esto conlleva (14). Cabe aclarar; que esta búsqueda de espermatozoides debe ser meticulosa, la cual requiere de tiempo, que se puede reducir de acuerdo a la experiencia adquirida. El desarrollo tecnológico y el mejoramiento en el conocimiento científico permiten desarrollar técnicas y habilidades que mejorar considerablemente los resultados en estas complejas alternativas de tratamiento para pacientes que desean tener hijos con azoospermia. Por último, es nuestra recomendación para pacientes con azoospermia no obstructiva y obstructiva que no puedan ser manejados de otra forma, la realización de biopsia testicular abierta para diagnóstico y congelación; así ellos se pueden beneficiar de una técnica de reproducción asistida en el futuro cercano. Bibliografía 1. Nagy Z, Liu J, Janssenwillen C, Silber S, Devroey P, Van Steirteghem AC. Usin ejaculated, fresh and frozenthawed epididymal and testicular spermatozoa gives rise to comparable results after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1995; 63:808-15. 2. Devroey P, Silber S, Nagy Z, Liu J, Tournaye H, Joris H, et al. Ongoong pregnancies and birth after intracytoplasmic injection with frozen-thawed epididymal spermatozoa. Hum Reprod 1995; 10:903-6. 3. Schoysman, R., Vandervalzem, P., Nijs, M. et al. (1993) Pregnancy after fertilization with human testicular spermatozoa. Lancet, 342, 1237. 4. Devroey, P., Liu J., Nagy, Z. et al. (1995a) Pregnancies after testicular sperm extration and intracytoplasmic sperm injection in non-obstructive azoospermia. Hum. Reprod., 10, 1457-1460. 5. Hovatta, O., Moilanen, J., von Smitten, K. and Reima, Y. (1995) Testicular needle biopsy, open biopsy, epididymal aspiration and intracytoplasmic sperm injection in obstructive azoospermia. Hum. Reprod., 10, 2595-2599. 33
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