Simposio Plaquetas Rol de la Citometría de Flujo Roberto G. Pozner Laboratorio Trombosis I Instituto de Medicina Experimental Academia Nacional de Medicina Conflicto de intereses: No
Biogénesis plaquetaria Seminars in Hematology 2010; 47: 220-6
Biogénesis plaquetaria Seminars in Hematology 2010; 47: 220-6
Funciones hemostáticas de las plaquetas home.ccr.cancer.gov/oncology/oncogenomics/webhemoncfiles/platelet%20disorders.html
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500 Platelet + Flow Cytometry 400 300 200 100 0 1976 1981 1986 1991 1996 2001 2006
Ventajas y desventajas de la citometría de flujo en el estudio de plaquetas
A favor En contra Permite evaluar gran cantidad de células en poco tiempo. Alta sensibilidad (detecta desde 1% de plaquetas activadas). Requiere poco volumen de muestra (bastan 5 ml por ensayo). Las plaquetas pueden ser identificadas a pesar de estar en presencia de GR y GB. Podemos estudiar plaquetas de diferentes tamaños y aún con muy bajo recuento. Alto costo del equipo. (adquisición y mantenimiento). Dificultad de estandarización para algunos ensayos aplicados a la clínica. Necesidad de procesar la muestra rápidamente. (se recomienda dentro de los 30 min. luego de la obtención). Esta última en algunos casos puede ser evitada mediante fijación. (solo para algunos receptores de membrana). Podemos evaluar su estado de activación circulante o su respuesta frente a agonistas.
Esquema general para la obtención de muestra Sangre Anticoagulante (Citrato de Na - ACD - EDTA) Dilución (minimizar formación de agregados) Trazadores fluorescentes (uno de ellos para identificar plaquetas) Agonista Fijación y dilución Análisis
Ajustes básicos del software Escala de tamaño (FCS) y complejidad intracelular (SSC) Tasa de adquisición
Ajustes básicos del software Escala de tamaño (FCS) y complejidad intracelular (SSC) Lin Lin
Ajustes básicos del software Escala de FCS y SSC Log Log
Ajustes básicos del software Umbral de FCS 000 000 000 000 000
Ajustes básicos del software Umbral de FCS 100 000 000 000 000
Estrategia de análisis mediante regiones Región A Región B Región lógica : Plaquetas Eventos contenidos en Región A y Región B
Estrategia de análisis mediante regiones Todos los eventos Región A Región B Región lógica : Plaquetas Eventos contenidos en Región A y Región B
Lisis de GR GR fantasmas Región B Región lógica : Plaquetas Eventos contenidos en Región A y Región B
Ajustes básicos del software Low Med High Tasa de adquisición
Iba: CD42b Ibb: CD42c V: CD42d IX: CD42a Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Diagnóstico de enfermedades hereditarias Plaquetas en reposo IIb: CD41 IIIa: CD61
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Normal Tromboastenia de Glanzmann
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Tromboastenia de Glanzmann Se informa el % de expresión de IIb y IIIa Alteraciones de GP IIIa <5% hasta 100% Alteraciones de GP IIb <5 hasta 10%
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Normal Síndrome de Bernard Soulier
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Síndrome de Bernard Soulier Seguimiento de transfusión T ½ = 4,6 días plaquetaria múltiple Platelets (2009) 20: 158 62
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Síndrome de Bernard Soulier Se informa el % de expresión de cada GP Deficiencias de GP Iba (CD42b) Es la más frecuente Sitio de unión al FvW y trombina mayor correlación con la clínica
Plaquetas estimuladas in vitro Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas Evaluación del estado de activación plaquetaria Plaquetas en reposo Evaluación de respuestas de activación plaquetaria
Aplicaciones tradicionales de la CF al estudio de plaquetas
Activación plaquetaria Problemas de estandarización Los parámetros de activación aumentan artificialmente luego de la toma de muestra Amplias variaciones entre los métodos Fijación Tipo y dilución de los Anticuerpos Análisis de los resultados P-selectina es rápidamente removida por proteasas (shedding)
Micropartículas Nuevas aplicaciones de la CF Fosforilación de VASP al estudio de plaquetas COATed-platelets
Definición de micropartículas (MP) Vesículas intactas derivadas de membranas celulares Tamaño: 0,1 1 mm Producidas por activación o apoptosis Plaquetas CEs Monocitos GR PMNs Clearence de la membrana
Micropartículas plaquetarias (PMP) Son las MP circulantes más abundantes (70-90%) Polvo plaquetario Peter Wolf en 1967 Identidad plaquetaria CD41 o CD42b Activación con Agonistas fisiológicos (Tr y Col) Agonistas no fisiológicos (Ionóforo de Ca)
Formación de PMP in vitro Spreading sobre Fibrinógeno - CRP + CRP + CRP + CRP Platelets (2009) 20: 158 62
Formación de PMP Superficie procoagulante Superficie procoagulante
Rol de las PMP en hemostasia Facilitan el proceso de adhesión GPIb/V/IX - P-selectina Facilitan el proceso de agregación GPIIbIIIa Propiedades procoagulantes Factor V-Va Factor Tisular Sup fosfolipídica Tenasa y Protrombinasa
Cuantificación de PMP Métodos: Citometría de Flujo ELISA
Cuantificación de PMP Preparación de la muestra para citometría de flujo: No estandarizada
Cuantificación de PMP apopbuffer 61+ PBS citrate 62P+ 61+ none PBS CaCl mouse serum 61+ 1300 10 min 10 min 100.000 HEPES 41a+ 2700 HBSS na 15 min 1300 PBS 61+ na
Plasma libre de plaquetas (PFP) Centrif 1.550 g durante 20 Sobrenadante 100.000g Pellet contaminación con Plaqutas y aumento de PS
Plasma libre de plaquetas (PFP) Centrif 1.550 g durante 20 Sobrenadante 18.000g Sobrenadante 80% menos MP
Plasma libre de plaquetas (PFP) Centrif 1.550 g durante 20 Sobrenadante 1.550g Sobrenadante PFP Recomendado Procesar antes de 4 Hs o congelar a -80 C
Cuantificación de PMP Ajuste del citómetro R2 incluye partículas de 7.2 µm R1 incluye partículas de 0.2-1.0 µm Blood 2003; 102: 2678-2683.
Cuantificación de PMP 10.000 eventos en R2 recuento por relativización
PMP en diferentes condiciones clínicas HIT PTI PTT Trombosis arterial Anemia falciforme Cáncer Artritis reumatoidea Diabetes Aumento respecto de controles sanos Curr Opin in Hematol 2010; 17: 578-84
PMP en diferentes condiciones clínicas Hay un valor de referencia en controles sanos? Si
Las PMP son producidas constitutivamente por megacariocitos Blood (2009) 113: 1112 21
Dos poblaciones de MP CD41 + Megacariocito Plaquetas PMP MegMP Adaptado de Blood (2009) 113, 981 2
Utilidad de las PMP Conocer los mecanismos fisiopatogénicos de algunas enfermedades Blanco y/o uso terapéutico? Aún no hay protocolos
Nuevas aplicaciones de la CF al estudio de plaquetas Micropartículas Fosforilación de VASP COATed-platelets
Y Ensayo de VASP Clopidogrel Ticlopidina PGE 1 ADP EP P2Y 12 Gs Gi ATP AC camp PKA VASP VASP VASP VASP VASP VASP VASP pvasp Señal Fluorescente
Ajustes para ensayo de VASP Registrar IFM de Población B sobre eje Y IMF 1 IMF 10 2 IMF 10 3
Mediciones para ensayo de VASP Registrar Registrar IFM de Población B sobre eje Y IFM de Población B sobre eje Y IMF 2 IMF 3
Cálculo para ensayo de VASP Corrección de valores de IFM IFM PGE - IFM Isotipo = IFMC PGE IFM PGE+ADP - IFM Isotipo = IFMC PGE+ADP Indice de reactividad plaquetaria (IRP) IFMC PGE - IFMC PGE+ADP x 100 IFMC PGE Menor IRP Mejor efecto antiplaquetario
Utilidad del ensayo de VASP Seguimiento de la terapia antiplaquetaria con tienopiridinas. Detección de pacientes con defectos genéticos en el receptor P2Y 12
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. Inhibición in vitro de P2Y 12 con AR-C69931MX J Thromb Haemost 2005; 3: 85-92
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. Gran proporción son resistentes y muestran más recurrencia de complicaciones isquémicas J Thromb Haemost 2005; 3: 85-92
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. Clopidogrel (Bolo de 600 mg) Resistentes 1 Bolo extra 600 mg 2 Bolo extra 600 mg 3 Bolo extra 600 mg JACC 2008; 51: 1404-11
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. 40 26 11 JACC 2008; 51: 1404-11
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. Eventos coronarios adversos (p=0.007) Sangrado mayor y menor = JACC 2008; 51: 1404-11
Seguimiento de terapia antiplaquetaria con Clopidogrel. Circulation: Cardiovascular Interventions 2010; 277-8
Detección de pacientes con defectos genéticos en el receptor P2Y 12 J Thromb Haemost 2010 (en prensa)
Nuevas aplicaciones de la CF al estudio de plaquetas Micropartículas Fosforilación de VASP COATed-platelets
Todas las plaquetas son iguales? Jóvenes o reticuladas COATed-platelets Convulxin and Thrombin
Unión de Factor V por estimulación con dos agonistas Plaquetas libres de plasma (filtradas a través de gel) Blood 2000; 95: 1694-1702
Unión de otras proteínas de gránulos a Cómo lo hacen? Nature 2002; 415: 175-9
Unión de otras proteínas de gránulos a Transglutaminasa (Factor XIII y otras) Fibrinógeno TSP Factor V PS GP IIbIIIa Adaptado de J Thromb Haemost 2005; 3: 2185-92
Niveles normales de COATed-platelets Distribución en la población normal J Thromb Haemost 2005; 3: 2185-92
Coated-platelets en diferentes condiciones clínicas Aumento Hemodiálisis Disminución Transformación hemorrágica temprana del stroke isquémico Hemorragia intracerebral espontánea
Muchas Gracias! Majo Elisa Sole Albert Santi Mirta Pao Julia Team Trombosis I
chapter 55 Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice