LAB. BIOLOGIA CELULAR PRACTICA XIII PROTEÍNAS FUNDAMENTO Las proteínas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrógeno. La mayoría de ellas contienen además azufre, y algunos fósforos. Sus moléculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas molecularmente y tienen alto peso molecular. La molécula proteica esta compuesta de una combinación de aminoácidos por condensación. Las pro teosas, peptonas, péptidos y aminoácidos son derivados de las proteínas formados en síntesis e hidrólisis. Hay ciertas reacciones coloreadas que dan las proteínas y dependen de los aminoácidos presentes en la molécula proteica. Todas dan la reacción de BIURET. Esta es debida al grupo NH CO. Las que contienen tirosina dan las reacciones Xantoproteica y de Millon, las que contienen triptofano dan la reacción de este nombre, y las que contienen cistina dan la reacción de la cistina (azufre). OBJETIVO Ver la presencia de proteínas y su importancia dentro de los organismos vivos y su mecanismo de acción a nivel molecular. GENERALIDADES Las proteínas Son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polímeros de unas pequeñas moléculas que reciben el nombre de aminoácidos y serían por tanto la monómera unidad. Los aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídico. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si la n: de aa. Que forma la molécula no es mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si la n: es superior a 50 aa. Se habla ya de proteína. LOS AMINOÁCIDOS Los aminoácidos se caracterizan por poseer un Grupo carboxilo ( COOH) y un grupo amino ( NH2). 1
Las otras dos valencias del carbono se saturan con un átomo de H y con un grupo variable denominado radical R. Según éste se distinguen 20 tipos de aminoácidos. ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el espacio. ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria es la secuencia de aa. De la proteína. Nos indica qué aas. Componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aas. se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. ESTRUCTURA SECUNDARIA La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aas., a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria. 2
Existen dos tipos de estructura secundaria: la a(alfa) hélice la conformación beta Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el C=O de un aminoácido y el NH del cuarto aminoácido que le sigue. En esta disposición los aas. No forman una hélice sino una cadena en forma de zigzag, denominada disposición en lámina plegada. Presentan esta estructura secundaria la queratina de la seda o fibroína. ESTRUCTURA TERCIARIA La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por tanto la terciaria.. 3
Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte, enzimáticas, hormonales, etc. Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces: el puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre. los puentes de hidrógeno los puentes eléctricos las interacciones hidrófobas. ESTRUCTURA CUATERNARIA Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero. 4
El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60 unidades proteícas. PROPIEDADES DE PROTEINAS Especificidad. La especificidad se refiere a su función; cada una lleva a cabo una determinada función y lo realiza porque posee una determinada estructura primaria y una conformación espacial propia; por lo que un cambio en la estructura de la proteína puede significar una pérdida de la función.además, no todas las proteinas son iguales en todos los organismos, cada individuo posee proteínas específicas suyas que se ponen de manifiesto en los procesos de rechazo de órganos transplantados. Desnaturalización. Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha estructura. Todas las proteínas desnaturalizadas tienen la misma conformación, muy abierta y con una interacción máxima con el disolvente, por lo que una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita. CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Se clasifican en: HOLOPROTEÍNAS Formadas solamente por aminoácidos HETEROPROTEÍNAS Formadas por una fracción proteínica y por un grupo no proteínico, que se denomina "grupo prostético HOLOPROTEÍNAS Globulares Fibrosas HETEROPROTEÍNAS Glucoproteinas Prolaminas: Zeína (maíza),gliadina (trigo), hordeína (cebada) Gluteninas: Glutenina (trigo), orizanina (arroz). Albúminas: Seroalbúmina (sangre), ovoalbúmina (huevo), lactoalbúmina (leche) Hormonas: Insulina, hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas...etc. Colágenos: en tejidos conjuntivos, cartilaginosos Queratinas: En formaciones epidérmicas: pelos, uñas, plumas, cuernos. Elastinas: En tendones y vasos sanguíneos Fibroínas: En hilos de seda, (arañas, insectos) Ribonucleasa 5
Mucoproteínas Anticuerpos Hormona luteinizante Lipoproteínas Nucleoproteínas Cromoproteínas De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lípidos en la sangre. Nucleosomas de la cromatina Ribosomas Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxígeno Citocromos, que transportan electrones FUNCIONES Y EJEMPLOS DE PROTEÍNAS Estructural Enzimatica Como las glucoproteinas que forman parte de las membranas. Las histonas que forman parte de los cromosomas El colágeno, del tejido conjuntivo fibroso. La elastina, del tejido conjuntivo elástico. La queratina de la epidermis. Son las más numerosas y especializadas. Actúan como biocatalizadores de las reacciones químicas 6
Hormonal Defensiva Transporte Reserva Insulina y glucagón Hormona del crecimiento Calcitota Hormonas tropas Inmunoglobulina Trombina y fibrinógeno Hemoglobina Hemocianina Citocromos Ovo albúmina, de la clara de huevo Gliadina, del grano de trigo Lacto albúmina, de la leche METODO En las siguientes reacciones puede usarse albúmina desecada preparar una solución de ovo albúmina agitando una pequeña cantidad de polvo con agua. REACCIÓN DE BIURET Añadir 10 gotas de solución de hidróxido de sodio y luego UNAS gotas de solución débil 3 gotas de sulfato de cobre. se produce un color violeta (una reacción similar SE obtiene con el Biuret, sustancia obtenida calentando la urea de ahí el nombre de esta reacción, pero las proteínas no contienen Biuret. Ejecutar la prueba de Biuret con una solución acuosa de peptona. Se obtiene un color rosado. REACCIÓN XANTOPROTEICA Añadir 2 gotas de ácido nítrico a 2ml de albúmina. Se obtiene un precipitado blanco. Calentar. Se vuelve amarillo enfriar bajo el grifo y añadir exceso de 6 10 gotas de hidróxido de amonio de o.88 % se vuelve naranja. REACCIÓN DE MILLON 7
Añadir 2 gotas de de reactivo de MILLON (es una mezcla de nitrato mercuroso y mercurio en ácido nítrico). Se obtiene un precipitado blanco. Hervir. Se vuelve rojo. REACCIÓN DEL TRIPTOFANO Añadir en exceso de ácido acético glacial que ha sido expuesto a luz (y por tanto contiene ácido glioxilico, del que depende la reacción). Luego mediante un tubo de ensaye añadir cuidadosamente sulfúrico concentrado. Se forma un anillo morado en la superficie de separación (el color del anillo es muy leve, observar cuidadosamente). REACCIÓN DE ARGININA Añadir 2 gotas de de hidróxido de sodio seguido de unas gotas de alfa naftol alcohólico y luego unas 3 gotas de hipoclorito de sodio. Se forma un color rojo. REACCIÓN DE CISTINA Añadir 2 gotas de solución de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Añadir suficiente solución de hidróxido de sodio para disolver este y luego hervir. La solución se torna pardo obscura (debido a la formación de sulfuro de plomo). REACCIÓN DE MOLISCH Añadir unas gotas de alfa naftol alcohólico y agitar. Luego echar cuidadosamente con un embudo de separación (el color del anillo formado es muy leve, observar cuidadosamente). Esta es una reacción debida a la presencia de un grupo hidrocarbonato en la molécula proteica. MATERIAL REACTIVOS Tubos de ensayo Sol. De ovo albúmina Baño Maria Hidróxido de sodio Sulfato de cobre 1% Ac. Nítrico conc. Hidróxido de amonio de 0.88% Reactivo de Millón Ac. Acético glacial Beta naftol alcohólico Hipoclorito de sodio Acetato de plomo Ac, sulfúrico conc. 8
OBSERVACIONES REACCIÓN DE BIURET La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico ( CO NH ) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, de fórmula: Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovo albúmina precipito a una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. A los 2 ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. B) REACCIÓN XANTOPROTEICA Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro. En el caso de esta reacción nuestro tubo arrojo un precipitado blanco con grumos. C) REACCIÓN DE MILLON Los compuestos mercúricos en medio fuertemente nítrico (reactivo de Millon) se condensan con el grupo fenólico del aminoácido tirosina, formando complejos de color rojizo. El precipitado se torno blanco lechoso y se separo la parte blanca que dando bajo del tubo y arriba de el reactivo de Millon. D) REACCIÓN DEL TRIPTOFANO El grupo indol del aminoácido triptófano se condensa con el ácido glioxílico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequeña cantidad de ácido sulfúrico concentrado puro, aumenta la sensibilidad de la reacción. En este caso el precipitado fue la formación de un anillo color morado en la superficie de separación, reacción positiva. E) REACCIÓN DE ARGININA El grupo guanidino del aminoácido arginina se condensa con el alfa naftol del reactivo, y luego forma un complejo coloreado con el hipoclorito de sodio. La reacción nos precipito a un rojo ladrillo. Reacción positiva. 9
F) REACCIÓN DE LA CISTINA Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presenten azufre en su estructura, como son la cistina, la cisteina y la metionina. La reacción consiste en someter la muestra a una hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio. R SH + 2 NaOH R OH + SNa2 + H2O De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo SNa2 + (CH3 COO)2 Pb 2 CH3 COONa + SPb (precipitado) Al contacto con el acetato de plomo se forma una precipitación lechosa al agregar hidróxido de sodio la precipitación formada desaparece. Al contacto del baño Maria la coloración cambia a pardo. G) REACCIÓN DE MOLISCH Todos los Glúcidos por acción del ácido sulfúrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfúricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos compuestos furfúricos reaccionan positivamente con el reactivo de Molish (solución alcohólica de alfa naftol). Al contacto con la albúmina se obtuvo un precipitado blanco sin juntarse las sustancias al contacto con el agua caliente empieza a tornarse una coloración amarillo huevo en forma de una bolita amarilla dejamos en baño Maria hasta lograr el precipitado rojizo reacción positiva. ESQUEMAS 10
CONCLUSIONES Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 700C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria. BIBLIOGRAFÍA Murray, R. Et al (1997): BIOQUIMICA DE HARPER; Editorial El Manual Moderno. México. 11
Curtís Barnes (1994): BIOLOGIA. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. De Robertis Hib (1998): FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. El ateneo. Buenos Aires Castro et al (1996): Actualizaciones en Biología. Eudeba. Buenos Aires. 12