FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIORGÁNICA PRÁCTICA 3: PRUEBAS GENERALES PARA AMINOÁCIDOS Los aminoácidos constituyentes de las proteínas, contienen además de los grupos funcionales amino y carboxilo, otros grupos en la cadena R, situada sobre el carbono a (alfa): COOH H 2 N C H R carbono Esta estructura no puede existir en solución acuosa pues el grupo carboxilo se encuentra como R-COO- y los grupos amino de manera predominante como R-NH 3, tanto este grupo como el R-COOH son ácidos débiles. Cada aminoácido se caracteriza por las propiedades fisicoquímicas específicas de su grupo R, las cuales dependen del tipo de función química presente: oxhidrilo, fenólico, sulfhidrilo, amino, carboxilo, alifático etc. Las proteínas deben sus propiedades no solo a los aminoácidos que las integran, sino a los diferentes grados de orden estructural que poseen; la variación de su estructura por desnaturalización es conducente a cambios en sus propiedades. Las proteínas presentan reacciones propias del enlace peptídico por medio del cual se unen sus aminoácidos, como también manifiestan reacciones especificas debido al alto contenido de determinado aminoácido. Debido a las características mencionadas, existen varias reacciones de coloración útiles que permiten la identificación tanto de aminoácidos como de las proteínas. Algunas son específicas para determinados aminoácidos; otras son generales y reconocen tanto aminoácidos como proteínas. Por ejemplo, las proteínas, polipéptidos y α-aminoácidos dan positiva la prueba de la Ninhidrina, ya que reconoce sustancias que contienen el grupo α- amino, identificándolos con una coloración que puede ir desde color azul a violeta.
2. OBJETIVO Reconocer la presencia de aminoácidos o proteínas en una muestra a través de la realización de pruebas tanto específicas como generales de identificación. 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1 Cuales son los aminoácidos según su clasificación alfa, beta o gamma. De un ejemplo de cada uno de ellos con su estructura. Cuál de estos aminoácidos da positiva la prueba de Ninhidrina? 3.2 Qué compuestos dan positiva la prueba de Biuret? Que grupo o grupos funcionales son los que se busca identificar? Cuáles son los cambios de coloración que se esperan en esta prueba? 3.3 Qué proteínas dan positiva la reacción Xantoproteica? Que aminoácidos son los que se espera encontrar? Cuáles son los cambios de coloración que se esperan en esta prueba? 3.4 Cuál es la composición de los reactivos (Ninhidrina, Biuret y Xantoproteico) empleados en las diferentes reacciones de la práctica. 3.6 Consultar las fichas de seguridad de los reactivos a manipular en la práctica. 4. MATERIALES MATERIALES Tubos de ensayo 20 Pipetas graduadas de 5 ml 2 Vaso de 500 ml 1 Vaso de 100 ml 1 Vaso de 250 m L 1 Goteros de vidrio 3 Pipetas graduadas de 10 ml 2 5. REACTIVOS SUSTANCIAS Solución de Urea al 1 % (H 2 N) 2 CO Solución de Gelatina (sin color) al 1 % Aminoácidos: soluciones al 1 % 10 g 50 g 30 ml
Ácido Nítrico concentrado HNO 3 (R35, S23-26/36,37/39-45) Solución de Sulfato cúprico al 5 % CuSO 4 (R22-36/38, S22) Solución de Ninhidrina al 0.3 % C 9 H 6 O 4 (R22-36/37/38) Ácido Sulfúrico concentrado H 2 SO 4 (R35, S26-30-40) Hidróxido de sodio al 40 % NaOH (R35,S26-37/39-45) Ácido Sulfanilico al 5% C 6 H 7 O 3 N (R36-38-43,S24-37) Hidróxido de Amonio concentrado NH 4 OH (R34-50,S26-37/39-45-61) Ácido Acético concentrado CH 3 COOH (R10-35,S23-26-36/37/39-45) Nitrito de sodio al 0.5 % NaNO 2 (R8-25,S45) Hidróxido de Amonio al 10 % NH 4 OH (R34-50,S26-37 /39-45-61) 8 ml 15 ml 6. EQUIPOS EQUIPOS Baño térmico con control de temperatura 1 Plancha de calentamiento 1 Campana de extracción 1 Balanza Analítica 1 Vortex (agitador mecánico) 1 7. PROCEDIMIENTO 7.1 PREPARACION DE SOLUCIONES. 7.1.1 Preparar de solución acuosa de: Urea, Albumina de huevo y gelatina. 7.1.2 Preparar soluciones acuosas de los aminoácidos: Fenilalanina, Tirosina, Asparagina, Glicina, Alanina, Triptófano e Histidina. Tener una muestra problema y además un blanco con agua. 7.1.3 Preparación de la solución de Ninhidrina: Preparar esta solución al 2 % en etanol al 96 %, solo el volumen que se requiere para la práctica. 7.2 Cada prueba debe efectuarse en tubo de ensayo, para diez muestras diferentes. 7.2.1 Reacción Xantoproteica. Añadir con cuidado y lentamente 0.5 ml de HNO 3 concentrado a 1.0 ml de la solución de proteína y aminoácidos seleccionada. Calentar en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos. Enfriar la solución y añadir 10 gotas de solución de NaOH al 40 %. Qué sucede cuando la solución alcalina se pone en contacto con el líquido?
7.2.2 Prueba de Biuret. Añadir 0.5 ml de solución concentrada de NaOH a 2 ml de la solución de proteína o aminoácido seleccionados y mezclar; luego añadir a cada tubo 4 gotas de CuSO 4 al 5 % y agitar. Si no aparece color añadir más gotas de CuSO 4. 7.2.3 Prueba con Ninhidrina. Añadir 6 gotas de solución de Ninhidrina a 1.0 ml de solución de proteína o de aminoácido seleccionado. Calentar a baño maría hasta observar el cambio de color. 8. OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS. TABLA 1. Resultados de las pruebas de coloración de proteínas y de aminoácidos. PRUEBA Xantoproteica Biuret Ninhidrina Albumina Gelatina Urea Fenilalanina Tirosina Asparagina Glicina Alanina Histidina Triptófano Blanco Muestra Problema *En cada casilla coloque el signo + para prueba positiva o el signo para prueba negativa, escribiendo al lado el color que presenta cada prueba. Cuando realice el informe, coloree cada círculo con los colores observados en cada prueba. OBSERVACIONES:
9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 9.1 Para qué aminoácidos y para que proteínas encontró positiva cada una de las pruebas? 9.2 Para que se pone a calentar la muestra con HNO 3 en la reacción xantoproteica? 9.3 Qué caracteriza a los aminoácidos o las proteínas que dieron positiva cada una de las pruebas? 9.4 Cuál es la reacción que se lleva a cabo entre un α-aminoácido y la Ninhidrina? 9.5 Cuál es la reacción entre una proteína y el reactivo de Biuret? 10. RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUIMICOS. 10.1 RECUPERACIÓN No aplica 10.2 DESACTIVACIÓN No aplica 10.3 ALMACENAMIENTO TEMPORAL Los residuos generados durante la realización de la prueba 7.2.1 deben depositarse en el recipiente para ácidos y bases, los residuos de la prueba 7.2.2 en el recipiente para agroquímica y los de la prueba 7.2.3 deben depositarse en el recipiente para solventes orgánicos. 11. BIBLIOGRAFIA BOYER, R. "Conceptos de Bioquímica" 1era Ed. T Thomson, ciudad de México, 1999. ISBN 970-686-009-6 PLUMMER, D. T. "Bioquímica Practica" 2da Ed. Me Graw-Hill Latinoamericana, Bogotá, 1981. ISBN: 968-451-054-3