Universidad Autónoma Metropolitana- Iztapalapa MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL Academia de Microbiología, Departamento de Biotecnología Participantes: Dra. María de los Angeles Aquiahuatl Ramos Dra. Tania Volke Sepúlveda Dra. Florina Ramírez Vives Dra. Margarita Salazar González Dra. Lilia Arely Prado Barragán Dra. Keiko Shirai Matsumoto 2010
PRESENTACIÓN Este manual está dirigido a estudiantes de la UEA Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial impartidas en la UAM-Iztapalapa. Como los estudiantes iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, consideramos de gran importancia incluir al principio las reglas generales del laboratorio. En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras. En cada práctica se proponen cuadros, para la recopilación de observaciones y resultados. Al final de cada práctica se incluyen cuestionarios que el estudiante deberá resolver. La preparación de soluciones y medios de cultivo que se utilizarán en las prácticas se describe en Anexo. CONTENIDO PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO...4 PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES...8 PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL...12 PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS...17 PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA...20 PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y RECUENTO DIRECTO EN CÁMARA DE NEUBAUER...23 ANEXOS...27 1
REGLAS DE LABORATORIO* 1. Siempre deberá usar una bata de algodón bien abotonada, la que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio. No usar calzado descubierto y llevar el pelo recogido. 2. Evitar la acumulación de objetos no relacionados con la práctica sobre la mesa de trabajo. 3. Se prohíbe beber, comer, fumar y aplicarse cosméticos dentro del laboratorio. 4. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves periodos. 5. No deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo microbiano, deberá realizarse con pipetas adecuadas para este fin. 6. No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo. 7. Trabajar de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 1. Antes y después de cada sesión práctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionará para este fin. 2. Lavarse perfectamente las manos con jabón al final de la sesión. 3. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia. 4. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de sus cuadernos o prendas de vestir. 5. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará el profesor. 6. Siempre deberá dejar perfectamente limpios los equipos utilizados (microscopios, potenciómetros, balanzas analíticas, autoclave) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. 7. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado a la eliminación de materiales contaminados. MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO 1. El manual de laboratorio 2. 1 cubre bocas y 1 par de guantes de látex 3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmascarar (masking-tape), marcador indeleble o etiquetas pequeñas, jabón para manos. * Instructivo de funcionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones de los laboratorios de Docencia. Aprobado por el Consejo Académico el 9 de noviembre del 2009 2
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INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO La esterilización es un método que elimina completamente todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico, por lo que se requieren buenas prácticas de manejo de éstos. La esterilización por calor seco o húmedo se encuentra entre los métodos más utilizados en el laboratorio de microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación; un ejemplo de tal método es la exposición directa de un material a la flama de un mechero o su introducción a un horno a 150-180 C por 2 h. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El equipo más común es el autoclave, que utiliza vapor de agua a 121 C con una presión de 15 lb/in 2. El material se mantiene a dicha temperatura por 15 minutos para asegurar la inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. En la Tabla 1 se resumen otros métodos usados para la esterilización de diversos materiales. Tabla 1. Métodos de esterilización Métodos físicos Métodos químicos Calor Radiación Filtración Gases Líquidos Húmedo Seco No ionizante Ionizante Vapor a presión (autoclave) Aire caliente (horno) Flameado (calor directo) Incineración Rayos ultravioleta Rayos infrarrojos Rayos X Radiación electrónica de alta energía Membranas o filtros Flujo laminar Óxido de etileno Formaldehido Alcohol OBJETIVOS Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio. MATERIALES Por equipo 6 cajas Petri de vidrio 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 3 matraces Erlenmeyer de 250 ml 1 probeta de 250 ml 2 parrillas de calentamiento con agitación 2 agitadores magnéticos 2 espátulas 2 mecheros Fisher Por grupo 2 autoclaves con base, canastilla y válvula 2 balanzas analíticas 1 incubadora a 30 C 1 refrigerador 2 pares de guantes de asbesto Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel Papel estraza, algodón y gasa 4
Por equipo Por grupo 1 piseta con agua destilada 1 piseta con alcohol al 70% 1 porta-cajas de Petri Medios y reactivos Agar nutritivo (AN) Agar papa dextrosa (PDA) Agar eosina azul de metileno (EMB) Material que cada equipo debe traer cada sesión: franela, tijeras, masking tape PROCEDIMIENTO Preparación del material de vidrio y medios de cultivo 1. Lavar y enjuagar el material de vidrio. Escurrir el exceso de agua y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envolver. 2. Preparar 180 ml de agar nutritivo (AN, 23 g/l) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Calentar el medio en una parrilla con agitación constante hasta ebullición (cuidar que no se derrame). 3. Preparar 260 ml de medio agar papa dextrosa (PDA, 39 g/l) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición, cuidando que no se derrame. 4. Preparar 140 ml de medio de cultivo EMB (36 g/l) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición. NOTA: Cuidar que no se derrame! 5. El profesor hará la demostración para elaborar tapones y capuchones para los matraces. Esterilización de materiales y medios de cultivo 1. Colocar las cajas Petri en cajas especiales de acero inoxidable y esterilizar en autoclave. Se dejan enfriar y las cajas se abren únicamente en área aséptica (cerca del mechero). 2. Todos los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones: a. Revisar que el agua esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada. b. Conectar el autoclave y poner en máximo la perilla de control en calentamiento. Acomodar los medios y materiales en la canastilla del autoclave y colocarlos dentro. c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor por el orificio de purga, después cerrar la válvula. d. Dejar que el equipo alcance 121 C o 15 lb/in 2 de presión y mantener estas condiciones por 15 min. Revisar continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a medio o mínimo. e. Apagar el autoclave, desconectar y dejar que la presión baje a CERO. Quitar la válvula y abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor cause quemaduras. Con ayuda de los guantes de asbesto retirar la canastilla y, con mucho cuidado, los materiales estériles. Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación 1. Limpiar la mesa con solución de etanol al 70% (v/v), encender los mecheros y colocarlos a 50 cm entre sí. 2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50 C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse. 3. Verter en cada caja de Petri 20-25 ml de cada medio (2 cajas de AN, 2 de EMB, 2 de PDA), dentro de la zona aséptica. Dejar que los medios enfríen y solidifiquen. Guardar en refrigeración el resto de los medios hasta su uso. Prueba de esterilidad de materiales 1. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona aséptica (junto al mechero). Etiquetar. 5
2. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona NO aséptica. Etiquetar. 3. Colocar las cajas Petri a 30 C durante 24-48 horas, con la tapa hacia abajo. 4. Revisar las cajas para observar la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Reportar crecimiento microbiano en forma cualitativa: (-) sin crecimiento, (+) crecimiento regular y (++) crecimiento abundante. Describir la morfología de las colonias Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los materiales. Discutir acerca de las diferencias en el crecimiento observado para cada medio de cultivo. CUESTIONARIO 1. Explique las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. 2. Qué es un medio de cultivo y para qué se usa? 3. Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para elegir un método adecuado de esterilización? Cite tres ejemplos. 4. Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los matraces Erlenmeyer? 5. Por qué se incuban las cajas Petri con las tapas hacia abajo? Cuadro 1. Descripción de colonias en cajas Petri con medios de cultivo. Medio de cultivo Abierta al aire Abierta en área aséptica Crecimiento* Morfología Crecimiento* Morfología Agar nutritivo (AN) Agar EMB (EMB) 6
Agar papa dextrosa (PDA) * (-) sin crecimiento; (+) crecimiento regular; (++) crecimiento abundante 7
PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES INTRODUCCIÓN Los microorganismos en la naturaleza generalmente se encuentran como poblaciones mixtas. Para caracterizarlos de manera individual éstos deben separarse (aislarse), obteniendo un cultivo puro o axénico. Un cultivo puro está formado por un solo tipo de microorganismo y es indispensable para conocer sus características morfológicas y estructurales, actividad bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos y para su identificación. El aislamiento de microorganismos puede realizarse por métodos de dilución y siembra en medios sólidos o líquidos, considerando que cada célula bacteriana que se separa da origen a una colonia visible a simple vista. Una limitación de las técnicas de dilución es que no es útil para el aislamiento a partir de muestras donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, en donde se obtendrán los microorganismos dominantes. Para favorecer el aislamiento de microorganismos encontrados en baja concentración, se aplican métodos de cultivo especializados en los que se usan medios que contienen nutrientes especiales, antibióticos, alta concentración de sales y/o se controlan las condiciones de ph, luz o temperatura. Estos medios se conocen como selectivos o de enriquecimiento. Otro tipo de medios de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas, son los conocidos como diferenciales. Dichos medios contienen componentes como sangre, colorantes e indicadores, entre otros, para distinguir entre diferentes especies bacterianas de acuerdo a la forma en que metabolizan los sustratos. Estas diferencias se manifiestan por cambios en la apariencia del medio o por una modificación en el ph. OBJETIVOS Que el alumno aprenda una de las técnicas de aislamiento para la obtención de cultivos microbianos puros y la aplicación de medios de cultivos diferenciales y selectivos. MATERIALES Por equipo Matraces con medio EMB, PDA y AN 16 cajas Petri de plástico estériles 2 mecheros Fisher 2 asas de inoculación 2 parrillas de calentamiento con agitación 1 piseta con alcohol etílico al 70% 1 espátula Por grupo 1 incubadora a 37 C 1 refrigerador Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel PROCEDIMIENTO El profesor proporcionará cultivos puros de bacterias Gram positivas ( Bacillus sp. Kocuria rosea) y Gram negativas (Escherichia coli), y un cultivo de una levadura (Saccharomyces cerevisiae). Vaciado de medios a cajas estériles 1. Fundir los medios preparados en la práctica 1 (PDA, EMB y AN): cuidado de que no se derramen!!! 2. En área aséptica, vaciar los medios en cajas estériles y dejar que se enfríen: 4 de AN, 4 de EMB, 8 de PDA. Técnica de estría cruzada (Figura 1) 1. Dividir cada caja Petri en cuatro cuadrantes, por la parte de atrás. Esterilizar el asa con calor en el mechero. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia 2. Inocular cada muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y girar la caja Petri un cuarto de vuelta. 8
3. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar el final del primer grupo de estrías y hacer un segundo grupo igual que el anterior. Repetir el procedimiento en el tercer cuadrante y cuarto cuadrante, realizando en este último una estría más abierta (simple). 4. Las cajas se incuban a 35 C durante 24-48 horas con la tapa hacia abajo. Figura 1. Técnica de siembra por estría cruzada en cajas Petri RESULTADOS Y DISCUSIÓN Describir, en los Cuadros 2-4, la morfología colonial de cada cultivo microbiano. Base su descripción en los esquemas de la Figura 2 Comparar los resultados con la literatura y discutir por qué hay diferencias en el crecimiento de los diferentes microorganismos en cada uno de los medios utilizados. CUESTIONARIO 1. Qué es el agar y de donde se obtiene? Qué nutrientes proporciona a los microorganismos? 2. Qué es un medio simple y qué un medio complejo? Mencione tres ejemplos de cada uno. 3. Qué es un medio selectivo y qué un medio diferencial? Mencione tres ejemplos de cada uno. 4. Cuál es la composición química de los medios AN, EMB y PDA? Con base en su composición Cómo se clasifica cada medio y cuáles son los agentes selectivos y/o diferenciales en cada uno? 5. Explique al menos dos diferencias entre la morfología colonial de levaduras y bacterias. Figura 2. Características de la morfología colonial de bacterias sobre un medio de cultivo sólido Forma Borde Elevación Superficie Suave, rugosa, opaca, brillante, mucosa, seca, pulverulenta 9
Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio AN Microorganismo Color Tamaño (mm) Forma Borde Elevación Superficie Cuadro 3. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio EMB Microorganismo Color Tamaño (mm) Forma Borde Elevación Superficie 10
Cuadro 4. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio PDA Microorganismo Color Tamaño (mm) Forma Borde Elevación Superficie 11
INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL Los microorganismos vivos o activos generalmente son incoloros (excepto algas y cianobacterias), pero pueden observarse en un examen en fresco mediante la preparación de una suspensión acuosa que se coloca directamente en un microscopio de campo obscuro o de contraste de fases. En un microscopio óptico de campo claro no se pueden observar los microorganismos debido a la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis. Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña cantidad de una suspensión microbiana sobre una superficie transparente (vidrio), que se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos. Lo anterior causa la inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de las características microbianas. De acuerdo con los objetivos de estudio y el tipo y número de soluciones colorantes empleadas, se pueden realizar tres tipos de tinción: simple, diferencial y selectiva. La tinción simple emplea un solo colorante y la célula se tiñe uniformemente. La tinción diferencial utiliza más de un colorante y permite diferenciar microorganismos con base en sus características superficiales. La técnica más usada en bacteriología es la propuesta por Christian Gram (1884), que clasifica a las bacterias en dos grupos: Gram-positivas (color azul-violeta) y Gram-negativas (color rojo-rosa). Estas diferencias se deben a diferencias en la estructura y composición de la pared celular de las bacterias. La tinción selectiva permite observar estructuras especializadas, como endosporas y cápsulas, que son útiles para la clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar bacterias productoras de endosporas de los géneros Bacillus y Clostridium. OBJETIVOS Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos, así como la observación de su morfología microscópica. MATERIALES Por equipo 2 mecheros Fisher 2 asas de siembra 10 portaobjetos 1 piseta con agua destilada 1 piseta con alcohol etílico al 70% 2 microscopios ópticos 1 frasco gotero con aceite de inmersión 1 probeta de 100 ml Juego de colorantes de Gram Por grupo Papel seda Etanol absoluto Acetona Papel estraza 1 frasco gotero con azul de metileno Refrigerador Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel PROCEDIMIENTO El estudiante preparará frotis, hará tinción simple y tinción de Gram de bacterias Gram (+) y Gram (-), de una levadura (S. cerevisiae) y de una muestra problema. Preparación de frotis 1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos. 2. Los frotis de cultivos líquidos o sólidos deben prepararse de manera diferente (Figura 1). Medio sólido a) Colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada. b) Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la destrucción de los microorganismos al tomar la muestra. 12
c) Acercar la caja Petri al mechero, abrirla y tomar una pequeña muestra de la superficie de una colonia, mezclar la muestra en el agua sobre el portaobjetos, distribuirla suavemente y fijar. Medio líquido a) Esterilizar el asa, quitarle el tapón al tubo de cultivo y flamear rápidamente la boca del mismo b) Introducir el asa en el tubo y tomar la muestra c) Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir este procedimiento 3 veces más, colocando la muestra en el mismo sitio. Fijación del frotis 1. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero. 2. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zona alejada del mechero). Figura 3. Preparación y fijación de frotis. Tinción simple 1. Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos. 2. Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire. Tinción de Gram 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 60 segundos. 2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante 3. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con agua destilada. 4. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más colorante. Lavar con agua destilada. 5. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. 6. Lavar nuevamente con agua, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire. Observación al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda 13
2. Realizar iluminación Kohler al microscopio. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor. Abrir el diafragma y hacer observaciones. 3. Colocar el portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 100X, colocando previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en los cuadros de resultados. Basar los resultados anteriores en los diagramas de la Figura 4. Comparar estas observaciones con las reportadas en la literatura para cada microorganismo y discutir acerca de las similitudes o diferencias encontradas. Reportar y concluir acerca de la morfología de(l) (los) microorganismo(s) que contiene la muestra problema y discutir el por qué se llegó a ese resultado. Figura 4. Principales tipos de agrupaciones y morfología microscópica de bacterias: cocos y bacilos. CUESTIONARIO 1. Qué es un frotis y cuáles son las fuentes de error más frecuentes en su preparación? 2. Cuál es el principio básico o fundamento de la tinción de Gram? 3. Explique por qué una bacteria Gram (+) se ve azul después de la tinción de Gram 4. La tinción de Gram sirve para la tinción de hongos filamentosos? Por qué? 5. Cuáles son las ventajas y desventajas de la tinción simple? 14
Característica Aumento total: Cuadro 5. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple Microorganismo Problema Tamaño (mμ): Forma: Agrupación: Endosporas: Edad del cultivo Tamaño Localización Característica Aumento total: Cuadro 6. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram Microorganismo Problema Tamaño (mμ): Forma: Agrupación: Gram: Endosporas: Edad del cultivo Tamaño Localización 15
SESIÓN DE PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA LAS PRÁCTICAS 4 Y 5 PRÁCTICA 4 Materiales Por equipo 4 cajas Petri con 25 ml de PDA 2 mecheros Fisher 1 asa de siembra 1 piseta con alcohol etílico al 70% Por grupo Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel Incubadora a 30 C Refrigerador Actividades 1. Siembra de hongos filamentosos: Separar cuidadosamente una parte de micelio de los hongos proporcionados con el asa de siembra previamente esterilizada en la flama del mechero. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete). 2. Incubar en forma invertida las cajas inoculadas, colocadas en una bolsa de plástico (sin sellar), a 30 C durante 3-5 días. PRÁCTICA 5 Materiales Por equipo 15 pipetas de 1 ml y 2 pipetas de 10 ml 2 mecheros Fisher 1 probeta de 250 ml 7 tubos con tapón de rosca de 15 ml 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 matraz aforado de 100 ml 1 probeta de 100 ml 1 pipetero metálico 1 parrilla de calentamiento con agitación 1 piseta con agua destilada 1 agitador magnético 1 gradilla 1 espátula Propipetas de 5 y 10 ml Por grupo 2 autoclaves con base, canastilla y válvula 2 balanzas analíticas 2 pares de guantes de asbesto Incubadora a 30 C Refrigerador Papel estraza, algodón y gasa Medios y reactivos Agua destilada NaCl Agar nutritivo (AN) Actividades 1. Preparar 250 ml de medio AN en un matraz de 500 ml. 2. Preparar 100 ml de solución isotónica (NaCl 0.9%) en un matraz aforado de 100 ml. Distribuirla en 7 tubos, adicionando 9 ml por tubo. 3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero. 4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in 2 durante 15 min. Guardar en refrigeración. 16
INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS Los hongos son organismos eucariotas, por lo que resultan de mayor tamaño y complejidad que las bacterias. Se distinguen de otros organismos eucariotas, como los animales, por ser inmóviles, y de las algas y plantas, por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa, ya que utilizan como fuente de carbono compuestos orgánicos disueltos por sistemas enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de la pared y la membrana celular. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las levaduras son células de forma esférica u oval ampliamente distribuidas en la naturaleza, que con frecuencia forman una cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, un proceso por el cual brota una yema de la célula madre que, posteriormente, se separa como célula individual. Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica denominada hifa, y el conjunto de hifas ramificadas forma el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, excepto en el caso de los hongos del grupo Zygomycota, cuyas hifas se conocen como cenocíticas. El principal mecanismo de reproducción de los hongos filamentosos es asexual, a través de la producción de esporas en estructuras reproductoras llamadas conidióforos y esporangióforos. La presencia de estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de clasificación que permite ubicar a los hongos verdaderos en las siguientes divisiones: Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Basidiomycota y Ascomycota. Otros criterios importantes para la clasificación de los hongos son las características de las hifas, la formación de esporas asexuales y las estructuras reproductoras asexuales. OBJETIVOS Que el alumno aprenda las técnicas de cultivo y manipulación de hongos filamentosos. Que conozca las características morfológicas macroscópicas y microscópicas como criterios de identificación de hongos filamentosos. MATERIALES Por equipo 4 cajas Petri con 25 ml de PDA 2 mecheros Fisher 8 portaobjetos 1 asa de siembra 1 piseta con alcohol etílico al 70% 1 piseta con agua destilada 1 frasco gotero con azul de lactofenol 2 microscopios ópticos Aceite de inmersión Cinta adesiva transparente (Diurex) de 1 pulgada ancho Por grupo Papel seda Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel Incubadora a 30 C Refrigerador *NOTA: cada equipo deberá traer cinta adesiva transparente (Diurex) de 1 pulgada ancho. PROCEDIMIENTO El profesor proporcionará a los alumnos cultivos de Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Rhizopus oligosporus y Fusarium sp. El estudiante inoculará cada cepa en cajas de Petri con PDA y hará la descripción macroscópica y microscópica de cada especie. Para la observación microscópica se utilizará cinta adhesiva transparente y azul de lactofenol como colorante. Siembra de hongos filamentosos 1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa cuidadosamente una parte de micelio de los hongos proporcionados con el asa de siembra previamente esterilizada en la flama del mechero. 2. El micelio se coloca en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete). 17
3. Las cajas de Petri inoculadas se incuban en forma invertida, envueltas en papel o en una bolsa de plástico, a 28-30 C durante 3-5 días. Descripción macroscópica Describir las siguientes características de los hongos filamentosos: a) Forma, tamaño y tipo de colonia b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio c) Color del micelio y color de las esporas d) Cambios en el medio de cultivo Descripción microscópica por montaje con cinta adhesiva 1. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente, con cuidado de tomarla solo por los extremos. 2. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia. 3. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos. 4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formación de burbujas y sin alterar las estructuras. La cinta funciona como cubreobjetos. 5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 100X. Localizar y observar hifas, determinar si presentan septos o no, buscar estructuras especializadas como esporangióforos, esporangios, conidióforos, conidias y rizoides. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Reportar las observaciones realizadas en el Cuadro 7. Comparar las observaciones realizadas con la bibliografía: si corresponden o no y por qué Investigar en la literatura cómo se clasifican los hongos estudiados en la práctica. CUESTIONARIO 1. Cuáles son las diferencias entre levaduras y hongos filamentosos? 2. Elabore un cuadro comparativo de las características morfológicas, nutricionales y sensibilidad a antibióticos de hongos y bacterias. 3. Qué características deben considerarse para la clasificación de hongos? 4. Explique las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas bacterianas 5. Describa brevemente tres ejemplos de problemáticas causadas al hombre por hongos filamentosos o levaduras y tres ejemplos de su uso industrial. 18
Cuadro 7. Descripción morfológica de hongos en medio PDA Característica Cepa Descripción macroscópica (colonias) Color del micelio Color de las esporas Tamaño Aspecto Descripción microscópica con un aumento total de: Tipo de hifas: Septos (si/no) Diámetro (μ) Estructura reproductora Tamaño (μ) Tipo de esporas Tamaño (μ) Clasificación (Phyla) 19
PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA INTRODUCCIÓN El crecimiento microbiano se puede estimar mediante el número de células o la masa celular. Existen métodos directos, como el recuento de células, e indirectos, como la cuantificación de la cantidad de proteína. El método más utilizado en microbiología para cuantificar células viables (vivas), es el recuento en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Para llevar a cabo un recuento en placa pueden emplearse dos técnicas: siembra en superficie o vertido en placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas y cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles. La técnica por vertido en placa es la más utilizada y, generalmente, se emplea para estimar poblaciones microbianas en aguas, suelos y alimentos, entre otros. Este método directo se basa en la suposición de que cada célula bacteriana presente en la superficie de un medio con agar (medio sólido), se multiplicará y producirá una colonia visible denominada unidad formadora de colonia (UFC). Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas y este número, multiplicado por el inverso de la dilución correspondiente (factor de dilución), permite estimar el número de microorganismos viables. El resultado de este método debe considerarse como una estimación aproximada del número total de microorganismos en una muestra, ya que depende del tipo de medio de cultivo utilizado. También pueden presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones y durante la inoculación de las muestras. En tales casos, el número de UFC puede subestimarse si las células no se separan bien, o bien, puede sobreestimarse si la toma de muestra se hace del fondo del tubo, donde se concentran los microorganismos por gravedad. OBJETIVOS Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables. MATERIALES Por equipo (sesión 1) Por grupo (sesión 1) 15 pipetas de 1 ml y 2 pipetas de 10 ml 2 autoclaves con base, canastilla y válvula 2 mecheros Fisher 2 balanzas analíticas 7 tubos con tapón de rosca de 15 ml 2 pares de guantes de asbesto 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Incubadora a 30 C 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml Refrigerador 1 matraz aforado de 100 ml Papel estraza, algodón y gasa 1 parrilla de calentamiento con agitación 1 piseta con agua destilada Medios y reactivos 1 pipetero metálico Agua destilada 1 gradilla NaCl 1 espátula Agar nutritivo (AN) Propipetas de 5 y 10 ml Por equipo (sesión 2) Por grupo (sesión 2) 10 cajas de Petri estériles 2 vasos de precipitados de 50 ml 1 piseta con alcohol etílico al 70% 1 piseta con agua destilada 1 gradilla 2 mecheros Fisher Propipetas de 1 y 5 ml 1 agitador de tubos tipo Vórtex 1 parrilla de calentamiento con agitación 1 incubadora a 35 C Refrigerador Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel Papel estraza *NOTA: cada equipo deberá traer una muestra líquida (~10 ml) que puede ser: pulque, agua de alfalfa o fresa, jugo de zanahoria, agua de charco, etc. PROCEDIMIENTO 20
Cada equipo debe traer una muestra líquida en la que se determinarán las UFC, usando diluciones decimales y siembra en placas con medio de cultivo. Preparación de medios y reactivos (una sesión antes) 1. En un matraz de 500 ml, preparar 250 ml de medio AN. 2. En un matraz aforado de 100 ml, preparar solución isotónica (NaCl 0.9%) y distribuirla en 7 tubos, adicionando 9 ml por tubo. 3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero. 4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in 2 durante 15 min. Guardar en refrigeración. Técnica de dilución y siembra en placa 1. En condiciones asépticas, tomar 1 ml de muestra y depositarlo en un tubo con 9 ml de solución isotónica. Este tubo corresponde a una dilución 10-1. Hacer diluciones decimales de la muestra hasta 10-7 (Figura 4). Etiquetar los tubos con la dilución correspondiente. 2. Para inocular por la técnica vertido, por duplicado y bajo condiciones asépticas: tomar 1 ml de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 y ponerlo en una caja de Petri estéril. Añadir 20 ml de medio AN fundido TIBIO (~50 C) (Figura 5). 3. Homogeneizar el medio con movimientos circulares y suaves para que no salga el medio de la caja (observar las indicaciones del profesor) y dejar solidificar cerca del mechero. 4. Incubar las cajas en forma invertida a 30 C durante 72 horas y realizar el conteo de colonias. Se selecciona únicamente la dilución donde la cuenta de colonias sea entre 30 y 300. 5. La cantidad de microorganismos por gramo o ml de muestra (UFC/mL) se calcula multiplicando el número de colonias promedio por el factor de dilución (FD) y dividiendo entre la cantidad (g o ml) inicial de muestra: UFC/mL = (no. colonias promedio x FD)/mL de muestra. FD = 1/dilución = vol. total de líquido (agua + muestra)/vol. de muestra. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Muestra Tubos con 9 ml de sol. isotónica estéril 10-3 10-6 10-7 Dilución 10-1 10-2 10-3 10-6 10-7 Factor de dilución 10 100 1000 10 6 10 7 Figura 5. Técnica de dilución y cuenta en placa por la técnica de vertido 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 6. Técnica de cuenta en placa por la técnica de vertido Calcular las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o ml de muestra (UFC/mL) y reportar los resultados en el Cuadro 8. Incluir todos los cálculos realizados para obtener las UFC/mL. Discutir acerca de si los datos obtenidos son congruentes o no y por qué. Buscar en la bibliografía cuál es la microflora común de la muestra utilizada y discutir al respecto. CUESTIONARIO 1. Explique cuáles son las ventajas y las desventajas del método de recuento en placa para cuantificación de microorganismos. 2. Describa tres métodos, diferentes al recuento en placa, para aislar cultivos puros de microorganismos y compare las ventajas y desventajas de cada uno. 3. Por qué la cuenta microbiana por el método de dilución y recuento en placa se reporta como UFC? 4. Explique por qué razón se debe considerar el factor de dilución para el cálculo de la cuenta de UFC/mL. 5. Si se obtienen 140 colonias en una caja inoculada con 0.5 ml de una dilución 10-4, indique: (i) cuál es el factor de dilución? (ii) cuántas UFC/mL había en la muestra original (sin diluir)? Cuadro 8. Cuenta viable en placa Muestra Colonias/caja Caja 1 Caja 2 Número promedio de colonias (+ DS)* Factor de dilución (FD) Cuenta viable en placa (UFC/mL) * Desviación estándar 22
PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y RECUENTO DIRECTO EN CÁMARA DE NEUBAUER INTRODUCCIÓN La concentración de la biomasa microbiana es un parámetro importante que debe estimarse en diversos bioprocesos. Existen diversos métodos directos e indirectos para estimar la biomasa de un cultivo. Entre los métodos directos más comunes para cuantificar la biomasa microbiana en una muestra líquida, se encuentra la turbidimetría. La turbidez de una suspensión microbiana es el resultado de la dispersión de la luz por las células. Como la cantidad de luz dispersada en una suspensión es directamente proporcional al número de células, el crecimiento microbiano (que implica un aumento en el número de células) se refleja en un aumento en la turbidez de la suspensión. Los cambios en la turbidez de un líquido se determinan en un espectrofotómetro, el cual mide la cantidad de luz que pasa a través de un medio líquido. El crecimiento (medido de esta manera comúnmente) se reporta como un cambio en la densidad óptica (DO), el cual es directamente proporcional a la concentración celular. Es posible relacionar la DO de una suspensión microbiana con el número de células o la masa celular que hay en dicha muestra. Con el uso de una tinción adecuada y una cámara de recuento es posible contar el número de células en un volumen determinado, determinando así la concentración celular en una suspensión. Las cámaras de recuento sirven para cuantificar el número de partículas (p.ej. bacterias, esporas fúngicas, polen) por unidad de volumen en un líquido, a través de su conteo visual bajo un microscopio. A la fecha, el tipo de cámara más utilizado para el recuento directo de células, es la cámara de Neubauer (o hemocitómetro); esta es una pieza de cristal grueso con el tamaño de un portaobjetos, en donde se coloca un pequeño volumen de la suspensión a analizar. OBJETIVOS Que el alumno compare las técnicas de turbidimetría y conteo directo al microscopio para cuantificar microorganismos totales en una suspensión microbiana. MATERIALES Por equipo (sesión 1) 3 pipetas Pasteur 1 cámara de Neubauer 5 cubreobjetos 1 gradilla 3 tubos de ensaye con tapón de rosca de 25 ml 3 tubos de ensaye de 25 ml 2 pipetas de 10 ml 3 pipetas de 1 ml 2 propipetas de 1 y 10 ml 2 mecheros Fisher 1 espectrofotómetro 2 celdas para espectrofotómetro 1 vórtex 2 microscopios ópticos 1 piseta con alcohol etílico al 70% 1 piseta con agua destilada Por grupo 2 autoclaves con base, canastilla y válvula 2 pares de guantes de asbesto Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel Algodón Bolsas de plástico para esterilizar PROCEDIMIENTO El profesor proporcionará suspensiones microbianas de tres diferentes microorganismos. Se cuantificará la biomasa microbiana de cada suspensión, midiendo la densidad óptica (turbidez) y realizando una cuenta directa al microscopio. Tinción y observación de muestras 23
1. De cada suspensión, tomar una muestra de aproximadamente 5 ml y colocarla en un tubo previamente etiquetado que identifique la muestra. 2. Preparar frotis de cada muestra (microorganismo). Lavar los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos. Preparar los frotis de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3 para cultivos líquidos (Figura 1). 3. Fijar los frotis con calor: pasar el frotis rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero hasta la eliminación total del líquido. 4. Realizar tinción simple con azul de metileno, de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3. Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos. Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire. 5. Observación al microscopio: Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y realizar la iluminación Kohler. Colocar el portaobjetos con el frotis de cada muestra en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 100X. Antes de usar el objetivo de 100X, es importante colocar una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. NOTA: Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas. Cuantificación de microorganismos 1. Con la muestra de cada suspensión, realizar la medición de densidad óptica y el conteo directo al microscopio. 2. Turbidimetría. Homogeneizar la muestra en vórtex y leer la densidad óptica (DO) de la suspensión a 560 nm. Calibrar el equipo con agua destilada. Si la DO es mayor a 0.8, deben hacerse diluciones con agua destilada. La dilución debe considerarse al registrar el dato de la concentración total de células/ml en el Cuadro 10. Recuerde que: FD = V total de líquido (agua + muestra) V muestra 3. Cuenta directa al microscopio. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar un pequeño volumen con una pipeta Pasteur y colocar una gota cuidadosamente en la cámara de Neubauer, debajo del cubreobjetos de acuerdo con las instrucciones del profesor (Figura 7). Figura 7. Esquema de la observación de células en la cámara de Nuebauer Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y realizar iluminación Kohler. Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula con el objetivo 10X. Al observar el cuadro central en el objetivo 40X, éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros más pequeños. 24
Las células se cuantifican en el objetivo de 40X, contando en diagonal las células de 9 cuadros (Fig. 7), a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños). En el caso de muestras muy concentradas, deberán hacerse diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución (FD) debe considerarse para cada dilución realizada: Para calcular el número de células/ml se utiliza la siguiente ecuación: Células/mL = Número promedio de células x 25 cuadros x 10 4 x FD El número promedio de células por cuadro (de 0.2 mm) se multiplica x25 para obtener el número total de células en un volumen de 0.1 mm 3 (volumen de la cámara = 1 mm por lado x 0.1 mm de profundidad). Este valor debe multiplicarse por 10 4 para obtener el número de células/ml. NOTA: Al finalizar, la cámara debe lavarse con agua destilada y secarse cuidadosamente con papel seda. RESULTADOS Y DISCUSIÓN De acuerdo con la morfología microscópica (tamaño, forma) de las células observadas, indique el tipo de microorganismo (bacteria, hongo, alga, protozoario) que contenía cada muestra y repórtelo en el Cuadro 9. Reporte en el Cuadro 10 los datos de la densidad óptica para cada muestra original y discuta acerca de cómo puede relacionarse la DO de una muestra con el número de células que ésta contiene. Discutir los resultados con base en la conveniencia de cada método para cuantificar la biomasa microbiana. Es posible utilizar ambos métodos para los microorganismos en estudio? Porqué? De acuerdo con la experiencia de la práctica para qué tipo de células conviene usar cada método? CUESTIONARIO 1. Explique las ventajas y desventajas del uso de cámaras de recuento para la cuantificación de microorganismos. 2. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara de Neubauer para cuantificar microorganismos. En qué casos conviene usar uno u otro. 3. Ejemplifique 2 aplicaciones de estas metodologías (recuento directo en cámara y turbidimetría) en: a) alimentos y b) microbiología industrial 4. A partir de los siguientes datos encontrados en una suspensión microbiana después del conteo de células en una cámara de Neubauer, calcule: a) el factor de dilución (FD), y b) el número de células/ml en el cultivo original. Recuerde que el número promedio de células, indica el número promedio de células por cuadro. No. promedio de células Vol. inicial de muestra (ml) Vol. de agua para dilución (ml) 25 0.5 2 35 1 1 5 2 6 Factor de dilución células/ml 25
Cuadro 9. Observación morfológica y características generales de los microorganismos*. Característica Muestra Morfología microscópica Tamaño celular (μm) Color de las células Movilidad (si/no) Agrupación (si/no) Características de la suspensión Tipo de microorganismo (bacteria, hongo...) Justificación ( cómo llegó a esa conclusión?) Cuadro 10. Cuantificación de microorganismos por turbidimetría y conteo directo en cámara de Neubauer*. Microorganismo Turbidimetría DO (560 nm) Número promedio de células/cuadro Cámara de Neubauer DS FD Número de células/ml * DS: desviación estándar; FD: factor de dilución; DO: densidad óptica 26
ANEXOS A. SOLUCIONES Y COLORANTES Reactivos de Gram Cristal violeta. Este colorante se prepara de la siguiente manera: a. Solución A: en un vaso de precipitados de 50 ml, colocar 1 g de cristal violeta y disolver con 10 ml de alcohol etílico. b. Solución B: en otro vaso de precipitados, disolver 0.4 g de oxalato de amonio en 40 ml de agua destilada c. Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en la oscuridad durante 24 h. d. Filtrar con papel Whatman No. 1 o 4 y guardar la solución en frascos goteros. Solución de lugol. En un matraz aforado de 50 ml colocar 20 ml de agua destilada y disolver 0.2 g de yoduro de potasio. A continuación agregar, poco a poco, 0.1 g de yodo, mezclar completamente y aforar con agua destilada. Guardar la solución en un frasco gotero Solución decolorante alcohol-acetona. Colocar en una probeta de 50 ml, 30 ml de alcohol etílico y 20 ml de acetona, mezclar perfectamente. Poner esta solución en un frasco gotero. Puede emplearse solamente alcohol. Safranina. En un matraz aforado de 50 ml, colocar 5 ml de alcohol etílico y disolver 0.125 g de safranina. Aforar con agua destilada, filtrar y guardar la solución en un frasco gotero. Colorantes y reactivos Azul de metileno. Pesar 0.25 g de azul de metileno y disolverlo en 50 ml de agua destilada. Guardar la solución en un frasco gotero. Azul de metileno alcalino. Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 ml de alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 ml de una solución de hidróxido de potasio al 0.01%. Azul de lactofenol. Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales) en 20 ml de agua destilada, agregar lentamente 10 g (16 ml) de ácido láctico y 40 g (31 ml) de glicerol. Mezclar en parrilla de agitación durante 10 minutos y agregar 0.05 g de azul de metilo o fucsina ácida Verde de malaquita. Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita en 100 ml de agua destilada. Solución salina isotónica. Disolver 0.9 g de NaCl en agua destilada y aforar a 100 ml. 27
B. MEDIOS DE CULTIVO 1. Caldo nutritivo (CN) Ingrediente (g/l) Peptona de caseína 5.0 NaCl 8.0 Extracto de carne 3.0 ph 6.5-7.0 2. Agar de eosina - azul de metileno (EMB-agar) Ingrediente (g/l) Peptona de gelatina 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 K 2HPO 4 2.0 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065 Agar 15.0 3. Papa-Dextrosa Agar (PDA) Ingrediente (g/l) Glucosa 20.0 Extracto de papa 4.0 Agar 15.0 ph 5.6 28