Análisis de los Componentes y Propiedades de la Secreción del Caracol Resumen Diferentes estudios han demostrado diversas propiedades de la secreción del caracol, tales como: la acción cicatrizante de la alantoína; el ácido glicólico, que elimina las células muertas que se encuentran sobre la piel; el colágeno, que previene la formación de arrugas; y la elastina que otorga elasticidad y turgencia a la piel. Además, contiene antibióticos naturales que combaten las bacterias. En la primera etapa de esta investigación se demostró que la secreción del caracol, al ser mezclada con la vaselina, retarda la pudrición de las frutas. En la segunda etapa se caracterizó la secreción, obteniendo su ph y distribución de pesos moleculares de las proteínas que la componen, (mediante la electroforesis en geles de policarilamida-sds). Asimismo, se fraccionó la secreción para estudiar algunas propiedades de las moléculas orgánicas que contiene. Las fracciones obtenidas se mezclaron, unas con vaselina y otras con emulsión, y se aplicaron en dos tipos de frutas para determinar cuál de ellas es la responsable de la mayor conservación de éstas, o bien si lo es la secreción completa. La secreción completa mezclada con vaselina arroja los mejores resultados en las manzanas, pero también la fracción proteica conserva un gran porcentaje de frutas en buen estado. La secreción completa, mezclada con la emulsión, arrojó el mejor resultado en la conservación de los limones. Las mezclas con vaselina son mucho más efectivas para las manzanas como las emulsiones lo son para la protección de los limones. El objetivo de la presente investigación, es llegar a industrializar un producto que ayude a la conservación de las frutas para su exportación. 19
Investigadores Escolares Francisca González Riquelme (17 años) Loreto Montorfano Silva (17 años) Magdalena Terminel Zamora (17 años) Sara Valdés Huerta (17 años) Profesora Guía Marcia Rebolledo Arriagada Establecimiento Liceo Alemán del Verbo Divino, Los Ángeles. Asesor Científico José Martínez Oyanedel, Doctor en Ciencias, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Introducción Las frutas son un grupo de alimentos importantes para nuestra salud, especialmente por su aporte de fibra y vitaminas. La maduración de las frutas está ligada a complejos procesos de transformación de sus componentes. Las frutas, al ser recolectadas, quedan separadas de su fuente natural de nutrientes, pero sus tejidos todavía respiran y siguen activos. Los azúcares y otros componentes sufren importantes modificaciones, formándose anhídrido carbónico (CO2) y agua. Todos estos procesos tienen gran importancia, porque influyen en los cambios que se producen durante el almacenamiento, transporte y comercialización de las frutas, afectando también en cierta medida a su valor nutritivo. Fenómenos especialmente destacados que se producen durante la maduración son la respiración, el endulzamiento, el ablandamiento y los cambios en el aroma, la coloración y el valor nutritivo, (1). La descomposición de las frutas se produce por diversas razones: Alteración por microorganismos: muchos microorganismos atacan fácilmente a las frutas dañadas mecánicamente. Luz: Influye en la pérdida de sustancias nutritivas de forma indirecta. Oxígeno: cuando las frutas son peladas, troceadas o trituradas y sus tejidos se exponen al contacto con el oxígeno del aire, se producen coloraciones pardas. Calor: el calor produce pérdida de vitaminas, especialmente de vitamina C y también de flavonoides, colorantes de algunas frutas que se comportan como antioxidantes. Acidez: la acidez contribuye a reducir las pérdidas de vitaminas y a evitar los cambios de color de frutas peladas, cortadas o trituradas, (2). En cuanto a la secreción del caracol Helix aspersa, diferentes estudios han demostrado sus diversas propiedades, tales como: la acción cicatrizante de la alantoína; el ácido glicólico, que elimina las células muertas que se encuentran sobre la piel; el colágeno, que previene la formación de arrugas; la elastina, que otorga elasticidad y turgencia a la piel. Además, contiene antibióticos naturales que combaten las bacterias más comunes, (3). En el siguiente trabajo se caracteriza la secreción del caracol, indicando su ph, propiedades antibacterianas y distribución de pesos moleculares de las proteínas que la componen mediante la electroforesis en geles de policarilamida-sds. Asimismo, se fraccionó la secreción para estudiar algunas propiedades de las moléculas orgánicas que contiene la secreción. Las diferentes fracciones obtenidas fueron aplicadas en forma de emulsión, con una formulación que contenía vaselina, se aplicaron en dos tipos de frutas para determinar cual de ellas es la responsable de la mayor conservación de éstas. La interrogante que se quiere resolver es: Cuál de las dos fracciones, (proteica u 20
orgánica)o la mezcla en sí es la responsable de la mayor conservación de las frutas?. Las hipótesis planteadas son: H1: Uno de los componentes, por si solo: fracción proteica o moléculas orgánicas, es responsable de la mayor conservación de las frutas. H0: Ninguno de los componentes, por si solo: fracción proteica o moléculas orgánicas sino la mezcla, es responsable de la mayor conservación de las frutas. Materiales 1.- Reactivos químicos e instrumentos de laboratorio: Éstos fueron facilitados por el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas y por el Laboratorio de Ciencias del Liceo Alemán del Verbo Divino de Los Ángeles. Todos los reactivos químicos fueron del mayor grado de pureza disponibles. 2.- Recolección de muestras de secreción: Se recolectaron aproximadamente 100 ml. de secreción de caracol, los cuales se obtuvieron por estimulación mecánica de los caracoles, los cuales se mantenían en un terrario alimentados con lechuga y agua. Las muestras se recolectaron durante 6 días y se mantuvieron en refrigeración hasta utilizarlas para la caracterización y preparación de las emulsiones. Método Fraccionamiento de las muestras Para el fraccionamiento de las muestras la secreción se sometió a centrifugación en concentradores centrífugos con membranas de separación de limite 10.000. Es decir, las moléculas cuyo peso es inferior a 10.000 pasan a través de la membrana producto de la fuerza centrifuga, y las de mayor peso molecular son retenidas. Así se obtuvo una fracción que se llamo proteica (MP), la que contenía las moléculas de peso mayor a 10.000, y una fracción que se llamo orgánica (MO), que contenía las moléculas de peso menor a 10.000. Cuantificación del contenido proteico Para determinar el contenido proteico se utilizó un método colorimetrico llamado de Bradford. Las proteínas contenidas en las diferentes muestras se hacen reaccionar con un colorante para formar un compuesto coloreado que se puede cuantificar midiendo la absorvancia a 595 nm. Para construir una curva de calibración se utiliza la proteína estándar albúmina de suero de bovino. Caracterización de las proteínas de la secreción Para separar y analizar proteínas de diferentes pesos moleculares se utiliza la electroforesis, en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS). Se analizan los geles, midiendo la migración del frente y la migración de cada banda para calcular el Rf. Rf = migración banda / migración frente. Con los valores de Rf para el marcador de peso molecular se elabora una curva semilogarítmica y asi se estima el peso molecular de las diferentes bandas presentes en las muestras. Elaboración de la emulsión Fueron realizadas en el Departamento de Farmacia de la Facultad de Farmacia con la colaboración del Profesor Marco Fernández. Receta preparación de la secreción completa + emulsión Vaselina 35% 7 gr Alcohol Cetílico 3% 0,6 gr Arlacel 1,96% 0,39 gr Tween 80 5,04% 1,01 gr Fase Acuosa 55% 11 gr (10 secreción, TOTAL 20 gr *La fase A comprende la vaselina, alcohol cetílico, arlacel y tween 80. La fase B comprende la fase acuosa (secreción y agua). Se calentó la fase A a 55ºC y la fase B a 60ºC. Se añadió B sobre A con agitación hasta enfriar. 21
Aplicación de las diferentes emulsiones y preparaciones Se diseñaron 8 grupos, cada uno contó con 20 frutas cada uno, es decir, 10 limones y 10 manzanas. Los grupos se dividieron en: Experimental 0: Control frutas sin tratamiento Experimental 1: frutas con fracción proteica + vaselina. (Secrecol P) Experimental 2: frutas con fracción orgánica + vaselina. (Secrecol O) Experimental 3: frutas con secreción completa + vaselina. (Secrecol) Experimental 4: frutas con fracción proteica + emulsión. Experimental 5: frutas con fracción orgánica + emulsión. Experimental 6: frutas con secreción completa + emulsión. (Secrecol Refinado) Experimental 7: frutas con secreción completa + glicerina. En cada grupo se aplicó el tratamiento con pinceles, y se dejaron en cajas de plástico. Las frutas fueron separadas en estas cajas con cartulina negra a temperatura ambiente. Las frutas se observaron a diario durante un mes. La manipulación de las frutas se realizó utilizando guantes, para evitar la introducción de microorganismos en forma aleatoria a las muestras. Se realizó un registro de estado de la fruta similar al utilizado en la etapa anterior de este proyecto. Todos los grupos estuvieron en estantes por separado en el laboratorio del colegio. Interpretación de los resultados Para evaluar los diferentes tratamientos se elaboro un patrón de daño para las diferentes frutas clasificando su estado en: LIMONES EXCELENTE BUENO REGULAR MALO DESCOMPUESTO MANZANAS EXCELENTE BUENO REGULAR MALO DESCOMPUESTO 22
Resultados Determinación del contenido proteico El promedio de contenido proteico de las cuatro muestras es de 3.83 mg/ml Caracterización del contenido proteico de la muestra Los resultados de las electroforesis se presentan a continuación. Los valores de los pesos moleculares de las proteínas contenidas en las diferentes muestras de secreción se obtuvieron por interpolación en la respectiva curva de calibración. M1-M4 corresponden a las 4 muestras recolectadas, MT corresponde a la muestra total, MP a la fracción proteica y MO a la fracción orgánica. TABLA 1 DETERMINACION DE PESOS MOLECULARES DE MUESTRAS DE SECRECION POR ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS al 15% M1 M2 M3 M4 MT MP MO 8700 9300 9500 9500 10200 10200 10400 12300 12300 13400 13400 13400 13400 13400 16500 19900 21300 25100 TABLA 2 DETERMINACION DE PESOS MOLECULARES DE MUESTRAS DE SECRECION POR ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS al M1 M2 M3 M4 MT MP MO 51500 53000 53500 53500 55100 55100 55700 59700 59700 62200 62200 62200 62200 62200 68000 73100 75900 81400 Los resultados muestran que la muestra MT correspondiente a la mezcla de todas las secreciones recolectadas contiene 4 proteínas principales y están todas presentes en la muestra MP que corresponde a la fracción proteica. La muestra MO no contienen proteínas. 23
Efecto de las diferentes emulsiones en la preservación de las frutas En los siguientes gráficos se muestra el estado cada una de las frutas al final del tratamiento, los resultados del estado de cada una de las frutas en función del tiempo se incluyen en el anexo, se utiliza la siguiente escala de colores: Excelente estado Bueno estado (-50) Regular estado Mal estado (+50) Descompuesto LIMONES 40% Experimental 0 (Fruta sin tratamiento) Experimental 1 (Frutas con fracción proteica+vaselina) 60% 80% Experimental 2 (Frutas con fracción orgánica+vaselina) 30% Experimental 3 (Frutas con secreción completa+vaselina) 40% 30% 60% Cada grafico muestra el porcentaje de frutas en los diferentes estados al final de los 30 días de observación. Se muestran solo 4 de los 7 tratamientos. MANZANAS Experimental 0 (Frutas sin tratamiento) Experimental 1 (Frutas con fracción proteica+vaselina) 30% 30% 40% 50% 24
Experimental 2 (Frutas con fracción proteica+vaselina) Experimental 3 (Frutas con fracción proteica+vaselina) 40% 50% 50% Discusión Las proteínas contenidas en la fracción proteica, fueron las que arrojaron mejores resultados en la conservación de las frutas, su peso molecular era superior a 10.000. La elastina y el colágeno tienen pesos moleculares entre 100000 y 350000 daltones. Estas proteínas son cadenas asociadas, por lo que podría suponerse que no corresponden a elastina y colágeno. LIMONES: Al cabo de 30 días los limones del experimental 0 (control) mostraron un 70% en excelente estado, y un 30% en buen estado, resultado que se diferenció totalmente del experimento anterior, el cual presentaba buen estado, regular estado, mal estado y un 40% descompuesto. Esto se debió a que las frutas estaban separadas, impidiendo la dispersión de las esporas, (en el experimento anterior los limones no tenían separación física y su descomposición fue muy rápida). Finalmente, en el caso de esta fruta, hubo 5 grupos que arrojaron buenos resultados: Experimental 6 (frutas con secreción completa + emulsión) Experimental 1 (frutas con fracción proteica + vaselina) Experimental 3 (frutas con secreción completa + vaselina) Experimental 4 (frutas con fracción proteica + emulsión) Experimental 5 (frutas con fracción orgánica + emulsión). Se destacó el Experimental 6 con un 90% excelente estado y un buen estado. MANZANAS: Por su parte, las manzanas presentaron un comportamiento similar a los limones. Hubo tres grupos que conservaron mejor las frutas: Experimental 3 (frutas con secreción completa + vaselina) Experimental 1 (frutas con fracción proteica + vaselina) Experimental 4 (frutas con fracción proteica + emulsión). Se destacó el Experimental 3 con un 90% en buen estado y un regular estado, confirmando los resultados del experimento anterior. La fracción proteica presenta los componentes necesarios para la conservación de las manzanas, las cuales se descomponen y no son infectadas por esporas. La emulsión es más efectiva que la vaselina en los limones, esto pudo ocurrir por la textura de la cáscara, que es mucho más porosa en los limones. 25
La vaselina resultó más efectiva en las manzanas. En el Experimental 7 (frutas con secreción completa + glicerina) los resultados, en ambos grupos, no fueron satisfactorios y no presentaron una gran diferencia con los controles. La glicerina se unió sin mayores problemas con la secreción, pero al ser aplicadas se separó formando gotas sobre las frutas, lo que no ofreció una protección completa. Conclusiones La secreción completa con la vaselina sigue arrojando los mejores resultados para la conservación de las frutas Sin embargo la fracción proteica también arroja resultados satisfactorios. La secreción completa más la emulsión resultó ser altamente efectiva en la protección de los limones. De los datos que se recogieron se desprenden las siguientes proyecciones: La emulsión es altamente efectiva en frutas porosas como los limones, por lo tanto, se podrían diseñar grupos que contengan frutas porosas y no porosas. Como en el Experimental 0, (en el grupo de los limones), la fruta casi no presentó cambios, se propone incluir un grupo sin separación física, tal cual como se vende en el comercio. Literatura Citada Internet: www.frutas.consumer.es/documentos/con ozcamos/maduración.php www.frutas.consumer.es/documentos/con ozcamos/deterioro.php http//artículo.mercadolibre.com.mx/mlm. 10208497_crema-de-baba-de-caracol-naturalo-sintetica-_J.M. Anexos Tablas y Gráficos de Resultados: www.udec.cl/pasantias 26