1 Servicio de cultivo de plantas 1
2 I. Información general del Servicio de Cultivo de Plantas. Aplicaciones Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales proporcionan los medios para producir asexualmente gran número de clones o generar material libre de virus mediante cultivo de meristemos; además de la regeneración de plantas completas a partir de órganos, tejidos, protoplastos y células aisladas. Esta técnica se caracteriza porque se multiplican las plantas rápidamente en un corto periodo de tiempo utilizando poco espacio y manteniendo el cultivo en condiciones óptimas de crecimiento y en ausencia de patógenos. El cultivo in vitro de tejidos puede aplicarse tanto para la recuperación de plantas en peligro de extinción como para la mejora mediada por transformación genética. Los métodos de transformación genética de plantas permiten la introducción de nuevos genes que generen cambios específicos en las plantas; siendo una alternativa a la mejora genética clásica. Equipamiento El laboratorio de Cultivo in vitro de Plantas de los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Málaga pone a disposición de la Comunidad Universitaria, Organismos Públicos de Investigación y Empresas Privadas sus instalaciones con la adecuada dotación instrumental para llevar a cabo el desarrollo y/o crecimiento in vitro en condiciones de asepsia con fotoperiodo y temperatura programables. En nuestras instalaciones también se puede llevar a cabo la generación de plantas transgénicas vía Agrobacterium además del asesoramiento para llevar a cabo esta técnica. El laboratorio consta de - 6 cámaras de cultivo in vitro (Versatile Environmental Test Chamber, Modelo MLR-350, Sanyo). Cada cámara consta de 5-6 baldas móviles de 50x50cm. Se pueden programar en temperatura (5ºC hasta 40ºC) con control de humedad relativa (50%-80%). El rango de iluminación programable está entre 0-20000 lx durante 6 pasos. Tanto la temperatura como la iluminación permiten una programación de hasta 9 ciclos. - 1 fitotrón (Ibercex) con control de temperatura e iluminación para germinación, cultivo, ensayos y crecimiento de plantas. - 2 cámaras de flujo laminar horizontal Teistar (micro-h y MH-100) con 2 esterilizadores (steri 350) - 2 agitadores orbitales para cultivo en medio líquido. 2
3 Técnicas disponibles en el Servicio Asesoramiento y contratación del servicio para desarrollar las siguientes técnicas (en todos los casos deben de estar optimizados los protocolos con anterioridad y proporcionarse): 1. Transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens de Populus tremula x P. alba y otras especies con los protocolos optimizado. 2. Cultivo in vitro de explantos, formación de órganos axilares y/o adventicios, su clonación y su mantenimiento. 3. Cultivo ex vitro de plantas: germinación de semillas, aclimatación de material in vitro y propagación mediante estaquillado. Condiciones de uso 1. Podrán solicitar el Servicio de Cultivos de Plantas de la Universidad de Málaga, todo el Personal Docente e Investigador de la UMA, así como otras entidades públicas (Universidades, CSIC, IFAPA, Ayuntamientos, etc) y empresas privadas. 2. Será indispensable la solicitud previa del mismo, dirigida al Director del Centro en el impreso especial para este Servicio. En la solicitud se especificará el tipo de material vegetal y especie a cultivar, así como los medios de cultivo necesarios y espacio para el trabajo a desarrollar. En el caso de material recombinante, se deberá especificar los datos de la construcción génica, vector empleado y medidas de bioseguridad de los OMGs (Real Decreto 951/1997). Los solicitantes deberán también incluir información relativa a los proyectos de investigación que dan soporte a las actividades solicitadas. 3. Tras la aceptación, las muestras deberán llegar a la cámara de cultivo en el medio de cultivo adecuado y en condiciones de total esterilidad. Las muestras contaminadas se retirarán de forma inmediata. En caso de requerir que las muestras sean preparadas por el servicio de Cultivo de Plantas, implicaría tarifas adicionales. 3
4 Tarifas Las siguientes tarifas se aplicarán para cada una de las actividades realizadas en el Servicio: Tarifas Laboratorio de Cultivo in vitro de Plantas UMA Cuota por uso del Servicio (persona/mes) * 4 * Gastos de emisión de tarjeta de acceso Por determinar Tarifa mensual por balda en cámara de crecimiento o fitotrón. ** 4,0 ** Transformación de Populus y transferencia a medio selectivo (10 placas) 200 Generación 10 líneas transgénicas de Populus a partir de callos (al menos un año) 1000 Envío de material bote o placa (precio por unidad, no incluye gastos de envío) 1,5 Cultivo in vitro de explantos, formación de órganos axilares y/o adventicios y su clonación. (30 plántulas) Consultar*** Mantenimiento de material in vitro 30 botes (mes) 20 Mantenimiento de material in vitro transgénico que necesite antibiótico, 10 líneas con 3 replicas (mes) 40 Cultivo ex vitro de plantas: germinación, aclimatación y propagación por 50 estaquillado (20 macetas) Precio/hora 12 * Basado en costes de mantenimiento de cámaras de flujo ** Basado en coste de mantenimiento de cámaras de cultivo in vitro ***Consultar para otras tarifas Los reactivos especiales (antibióticos, factores de crecimiento, etc.) deberán ser suministrados por los grupos de investigación. Personal Responsable del Servicio Responsable Técnico: Dra. Lara S. Jiménez Bermúdez lsjimenez@uma.es Tel +34-9521-32379 Responsable Científico: Dr. Fernando Gallardo Alba fgallardo@uma.es Tel +34-9521-31579 4
5 II Normas de uso del Servicio de Cultivo de Plantas 1. REGISTRO DE USUARIOS y CUMPLIMIENTO DE NORMAS DEL LABORATORIO 1. Para poder utilizar el Servicio de Cultivo in vitro de Plantas deberán de ponerse en contacto con el responsable técnico del servicio Dra. Lara Jiménez Bermúdez (Lsjimenez@uma.es, tel: 952132379), que le asesorará sobre como registrarse como Usuario del servicio y les proporcionará la solicitud (véase formularios adjuntos). 2. Los usuarios previamente registrados tendrán un plazo de un mes para aportar o renovar los datos de la solicitud de acuerdo con los impresos adjuntos y aportar la información requerida en el caso de tener OMGs en la instalación. 3. Los usuarios deberán cumpliar las normas que se indican debajo. La no observancia de las mismas llevará a su baja en el registro de usuarios y acceso a la instalación. 2. NORMAS PARA LOS USUARIOS DEL LABORATORIO 1. El acceso al Laboratorio y a las dependencias del Servicio está completamente restringuido a los usuarios registrados del Servicio. 2. La actividad desarrollada en el laboratorio quedará adecuadamente registrada en el libro de uso del Laboratorio tanto si tiene lugar dentro como fuera del horario del técnico del mismo. 3. Las cabinas de flujo laminar se pueden reservar por horas en el libro de reservas. Se encenderá solamente 30 minutos antes de su utilización, pudiendo poner el UV si esta puesto el plástico protector y no hay nadie en el laboratorio. 4. Una vez terminado el trabajo en el laboratorio, se deberá limpiar y apagar la cámara empleada. El esterilizador, luz del laboratorio y cámaras y aire acondicionado se deberá apagar. Al salir el usuario deberá cerrar el Laboratorio y solicitar en la conserjería o al servicio de Seguridad su cierre con llave. 5. Cada usuario puede traer el material necesario para llevar a cabo sus cultivos de su laboratorio, en el caso de necesitar material del servicio deberá solicitarlo con antelación hablas con el responsable 3 NORMAS PARA LOS USUARIOS DE LAS CAMARAS DE CULTIVO 1. Los frascos/placas deben de estar perfectamente rotulados. 2. Los frascos/placas de cultivo in vitro tienen que estar limpios y que no haya posibilidad de pérdidas de medio de cultivo; las placas que se sitúen verticalmente deben estar selladas y con una tira de papel de filtro donde se apoyen. Si se produce un derrame de medio en las cámaras ha de secarse y limpiarse inmediatamente con etanol al 70%. 3. Los usuarios deben de venir a ver su material al menos 1 vez por semana. 4. En los casos de detectarse alguna contaminación en los cultivos debe de sacarse inmediatamente de la cámara. 5
6 5. No puede permanecer material viejo en las cámaras. Una vez desconectada la cámara en uso debe quedarse limpia de material. 4 NORMAS PARA LOS USUARIOS DEL FITOTRÓN 1. Las macetas deben de estar bien rotuladas y las bandejas limpias por fuera 2. El riego debe ser moderado y que no se salga el agua ya que las cámaras no disponen de desagüe en el suelo. 3. Una vez terminado de utilizar se debe limpiar la zona y apagar 5 NORMAS PARA USUARIOS DEL EQUIPOS QUE PERTENECEN A GRUPOS DE INVESTIGACIÓN 1. Los usuarios de los equipos de grupos de investigación se regirán por las mismas normas generales. Deberán estar registrados en el Servicio y prestar especial atención al cuidado y limpieza de los mismos para no afectar a los equipos y otras instalaciones del SCAI. 2. No se le aplicará la tarificación mensual por balda o estante en cámara de crecimiento o fitotrón. 3. Debido a la falta de espacio para la introducción de nuevos equipos de cultivo in vitro y fitotrones, los responsables de los equipos de los grupos de investigación deberán compartir un 20% la capacidad del mismo cuando haya suficiente espacio libre en los mismos y no se pueda disponer el espacio requerido en los equipos propios del SCAI. 6. RESUMEN DE NORMAS PARA USUARIOS QUE TRABAJEN CON ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE (OMGs). Real decreto 951/1997. 1. Los usuarios que trabajen con OMGs deberán realizar su actividad conforme al Real Decreto 951/1997 sobre la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de OMGs. 2. Deberán realizar una evaluación previa sobre los riesgos de las muestras para la salud humana y medio ambiente, llevar un registro de la evaluación y cumplir con las normas específicas de seguridad (artículo 8 ). Asimismo, deberá comunicar cualquier cambio relevante en la evaluación de los riesgos de las muestras durante el tiempo que las mantenga en la instalación. 3. Los responsables de los OMGs deberán proporcionar la información necesaria para el Libro de Registro (artículo 10) y en el que debe de quedar reflejado todos los trabajos realizados y específicamente los datos de nombre y cualificación profesional de las personas responsables de la operación, objetivo del ensayo, nombre del organismo modificado y características de la modificación genética introducida y volumen de cultivo. La información depositada en el libro o como anexo al mismo tendrá carácter confidencial y únicamente se facilitará al órgano competente cuando éste lo solicite (artículo 10). 4. Véase Sección IV para una descripción detallada sobre requerimientos para el uso de OMGs en la instalación. 6
7 III Impresos de solicitud del Servicio de Cultivo de Plantas 1. FORMULARIO GENERAL DE USO SERVICIO DE CULTIVO DE PLANTAS Datos del grupo del IP, usuarios y proyecto FECHA DE ENTRADA DATOS DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL DEL PROYECTO (IP): NOMBRE: DEPT y CENTRO: UNIVERSIDAD / EMPRESA: DIRECCIÓN POSTAL: TELÉFONO: E-MAIL: INVESTIGADORES QUE REQUIEREN AUTORIZACIÓN 1. NOMBRE: Teléfono y e-mail: Requiere usar la instalación fuera de horario de apertura del centro?: 2.NOMBRE: Teléfono y e-mail: Requiere usar la instalación fuera de horario de apertura del centro?: Utilice hojas adicionales si autoriza a más de dos usuarios GRUPO PAI (código): PROYECTO DE INVESTIGACIÓN (Referencia completa y fecha de duración) TARIFA: UMA OPIS (organismos públicos de investigación) PRI (empresas privadas) Firma del IP y fecha A rellenar por el Servicio Fechas de autorización: Nº Referencia para actualizaciones (Control, Servicio): 7
8 2. SOLICITUD DE USO DE CÁMARAS DE CULTIVO IN VITRO MATERIAL VEGETAL IN VITRO* TIPO DE MATERIAL: MEDIO DE CULTIVO: Nº DE MUESTRAS TEMPERATURA FOTOPERIODO TIEMPO DESCRIPCIÓN DEL MATERIAL: ESTIMACIÓN Nº BALDAS QUE NECESITA**: TIEMPO QUE REQUIERE EN CULTIVO: MATERIAL VEGETAL EX VITRO* ESPECIE NUMERO DE MACETAS Y BANDEJAS ESPACIO QUE SE NECESITA: TIEMPO QUE REQUIERE EN CULTIVO TEMPERATURA FOTOPERIODO *Atención: Si es material es un OMG, deberá realizar la evaluación previa de riesgo del mismo y proporcionar la información requerida en el Libro de Registro de OMGs de la instalación (Real decreto 951/1997) Firma del IP y fecha Fecha de autorización: Nº Referencia para actualizaciones (Control, Servicio): **Las cámaras de cultivo se pueden emplear para cualquier tipo de material vegetal: algas, briófitos, pteridofitos y fanerógamas. En el caso de necesitar condiciones de cultivo muy excepcionales y se necesite la cámara entera, se tarifara como tal. 8
9 3. SOLICITUD DE APOYO TÉCNICO PARA CULTIVO IN VITRO, TRANSFORMACIÓN GENÉTICA Y CULTIVO EX VITRO CULTIVO IN VITRO* TIPO DE MATERIAL Nº DE MUESTRAS TEMPERATURA FOTOPERIODO MEDIO DE CULTIVO (Añadir anexo con el medio completo) TRANSFORMACION GENETICA*: TIPO DE TRANSGEN Y PLÁSMIDO CEPA DE AGROBACTERIUM NECESARIA (Aportada por el solicitante) MEDIO DE CULTIVO DE LA BACTERIA (Añadir anexo con el medio completo) TIEMPO ESTIMADO DE CRECIMIENTO OPTIMO EN MEDIO LIQUIDO AGENTE SELECTIVO ANTIBIÓTICO DE CONTROL CULTIVO EX VITRO DE PLANTAS* ESPECIE PARA ACLIMATAR Y/O CULTIVAR EN TIERRA TIPO DE SEMILLAS TEMPERATURA FOTOPERIODO *Atención: Si es material es un OMG, deberá realizar la evaluación previa de riesgo del mismo y proporcionar la información requerida en el Libro de Registro de OMGs de la instalación (Real decreto 951/1997) 9
10 IV Requerimientos para el empleo de OMGs en el Servicio de Cultivo de Plantas En cumplimiento del Real Decreto 951/1997 sobre la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de OMGs, los usuarios del Servicio de Cultivo de Plantas deberán considerar las siguientes medidas: 1. Deberán realizar una evaluación previa sobre los riesgos de las muestras para la salud humana y medio ambiente, llevar un registro de la evaluación y cumplir con las normas específicas de seguridad (artículo 8 ). Asimismo, deberá comunicar cualquier cambio relevante en la evaluación de los riesgos de las muestras durante el tiempo que las mantenga en la instalación. Únicamente se mantendrán en el Servicio OMGs considerados de bajo riesgo. 2. Los responsables de los OMGs deberán proporcionar la información necesaria para el Libro de Registro (artículo 10) y en el que debe de quedar reflejado todos los trabajos realizados y específicamente los datos de nombre y cualificación profesional de las personas responsables de la operación, objetivo del ensayo, nombre del organismo modificado y características de la modificación genética introducida y volumen de cultivo. La información depositada en el libro o como anexo al mismo tendrá carácter confidencial y únicamente se facilitará al órgano competente cuando éste lo solicite (artículo 10). 3. Las actualizaciones sobre el volumen de OMGs en el Servicio, así como las entradas y salidas de material de cultivo deberán contar con la firma del investigador responsable o bien de un investigador autorizado por el mismo en el Impreso General de Uso del Servicio. 4. Documentos Anexos: - Declaración de riesgo de OMGs - Datos específicos de los OMGs para el Libro de Registro 10
11 Declaración del riesgo de OMGs (artículo 7 y 8, Real decreto 951/1997) D., Profesor, etc.. e investigador responsable de la línea.. Declara que Ha realizado la evaluación del riesgo de la línea indicada, y de acuerdo con el artículo 7 del Real Decreto 951/1997 considera la misma como OMG de bajo riesgo. Quedo enterado/a, de acuerdo con los artículos 7 y 8, Real decreto 951/1997, que debo (1) realizar un registro de la evaluación del riesgo del OMG y comunicar a los responsables del Servicio cualquier cambio en la evaluación del riesgo del mismo, y (2) cumplir las normas específicas de seguridad e higiene profesional aplicando los principios de las buenas prácticas de microbiología que se establecen en el artículo 8 del Real decreto. En Málaga a.. Fdo: 11
12 Información para el libro de registro de OMGs* *Unicamente se considerarán OMGs de bajo riesgo Nombre: Cualificación profesional de la persona responsable de la operación: Investigadores autorizados y datos de contacto: Objetivo del ensayo**: Organismo modificado: Características de la modificación genética introducida: Volumen de cultivo y fecha: ** De acuerdo con el artículo 10 del Real Decreto 951/1997, estudios con fines industriales o comerciales o a gran escala requieren una solicitud adicional al Órgano competente 12