DIRECCIÓN GENERAL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL

DIRECCIÓN GENERAL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS EN CULTIVOS DE MAÍZ EN LAS DELEGACIONES DE MILPA ALTA, TLÁHUAC Y MAGDALENA CONTRERAS DEL D.F. (2a ETAPA) OCTUBRE, 2008

Créditos Elaboraron: Biól. Jaime Aportela Cortez Técnico especialista en métodos moleculares, PNUD-INE I.A. María del Rocío Fernández Suárez Técnico especialista en sistema de control de calidad de laboratorio, PNUD-INE Dra. Martha Graciela Rocha Munive Jefa del Departamento de Análisis de Organismos Genéticamente Modificados, CENICA-INE Responsables de la colecta: Biol. Alma Delia Nava Montes Subdirectora de Apoyo Técnico y Capacitación Ambiental, CENICA-INE M. en C. Aída Juárez Cruz, Biól. Aldo Bernal, Biól. Mario Pérez. Técnicos en análisis de riesgo, INE Responsables del análisis: Biól. Jaime Aportela Cortez Técnico especialista en métodos moleculares, PNUD-INE I.A. María del Rocío Fernández Suárez Técnico especialista en sistema de control de calidad de laboratorio, PNUD-INE 2

1. Resumen ejecutivo México es el centro de origen y domesticación del maíz y este cultivo ocupa un lugar preponderante en la producción agrícola del país, así como en la vida de las poblaciones indígenas y de los agricultores de pequeña escala. Al mismo tiempo, es una de las especies de cultivos transgénicos que más se producen a nivel mundial. Aunque México no es productor de maíz transgénico, importa anualmente varios millones de toneladas de maíz de los Estados Unidos, que representan mezclas de granos convencionales y granos genéticamente modificados, principalmente para su procesamiento. Esta fuente de maíz transgénico podría liberarse de forma no intencional en zonas rurales, lo cual representaría algunos riesgos para el medio ambiente sobre todo a consecuencia de liberaciones no intencionales o accidentales (con o sin conocimiento) en las que no se ha realizado un análisis de riesgo previo a su liberación. Por tal razón, resulta necesario un monitoreo sistemático y constante en distintas zonas del país, así como contar con métodos de detección de organismos genéticamente modificados (OGMs) que sean eficaces, sólo de esta manera será posible dar seguimiento y vigilar el cumplimiento y la efectividad de la Ley de Bioseguridad de OGMs. En las áreas rurales del Distrito Federal, particularmente en las delegaciones Tlalpan, Xochimilco, Milpa Alta, Tláhuac, Magdalena Contreras y Cuajimalpa existe una alta diversidad de maíz criollo. Es por ello que resulta fundamental llevar a cabo un monitoreo de OGMs en esta zona, además de que existen reportes previos de la presencia de transgenes en los cultivos de maíz del altiplano mexicano (Serratos-Hernández, et al. 2007). Durante el año 2007, en la DGCENICA se llevó a cabo la primera parte de dicho monitoreo en la zona, en el cual se tomaron y analizaron muestras en las delegaciones Tlalpan y Xochimilco, encontrándose la presencia de material GM en altas frecuencias. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de secuencias de ADN provenientes de OGMs en cultivos de maíz de las delegaciones Milpa Alta, Tláhuac, Magdalena Contreras, Álvaro Obregón y Cuajimalpa, como parte de la continuación del monitoreo sistemático que se requiere en las zonas de conservación agroecológica del Distrito Federal. Se tomaron 23 muestras de grano de maíz en estas tres delegaciones de acuerdo a los procedimientos establecidos en el INE para asegurar la detección de OGMs aun sí se encuentran en baja frecuencia. Las muestras se analizaron mediante ensayos moleculares de PCR punto final amplificando regiones del promotor p35s del virus del mosaico de la coliflor y el terminador nos de Agrobacterium tumefasciens (ambas secuencias insertadas en los eventos comerciales de maíz transgénico). Como resultado de este estudio no se encontró la presencia de maíz genéticamente modificado en las muestras analizadas. Se recomienda realizar un monitoreo más amplio e intensivo en la zona para prevenir posibles efectos adversos por la entrada de este tipo de material en el acervo genético de estas variedades criollas y para contar con un muestreo estadísticamente representativo. 3

2. Introducción La Ley de Bioseguridad de los Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM) establece que la SEMARNAT deberá realizar el monitoreo de los efectos que pudiera causar la liberación de OGMs, permitida o accidental, al medio ambiente y a la diversidad biológica. Asimismo, el Instituto Nacional de Ecología, a través de la Dirección General del Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (DGCENICA), tiene la atribución de llevar a cabo el monitoreo de OGMs a nivel nacional. Recientemente se reportó la presencia de maíz genéticamente modificado en el suelo de conservación del Distrito Federal (Serratos-Hernández, et al., 2007). En este estudio se colectaron 208 muestras en 25 comunidades de las Delegaciones de Milpa Alta, Tláhuac, Tlalpan, Magdalena Contreras y Cuajimalpa en un muestreo realizado en el año 2003. En tal contexto, la DGCENICA decidió incluir, en su Programa de Trabajo del 2007, la realización del estudio denominado Muestreo de cultivos de maíz en zonas del Valle del México para el análisis de OGMs, cuyo objetivo general fue el de investigar si existe la presencia de secuencias provenientes de Organismos Genéticamente Modificados (OGMs) en dos delegaciones del Distrito Federal, con la finalidad de monitorear por etapas las principales delegaciones donde se realiza la siembra de maíz y se ha reportado previamente la presencia de maíz genéticamente modificado (Serratos- Hernández, et al., 2007). En una primera etapa, la DGCENICA realizó un muestreo en las Delegaciones de Tlalpan y Xochimilco en el periodo de siembra de 2007. Se colectó tejido de hojas de maíz en 107 parcelas de la delegación Xochimilco y en 38 parcelas de la delegación Tlalpan. Para cada parcela se colectaron 20 hojas y se realizó el análisis de detección de OGMs de las muestras agrupadas por parcela mediante la amplificación por PCR de los marcadores p35s y tnos. Los resultados de los análisis en ambas delegaciones indicaron la presencia de OGMs en alta frecuencia para las zonas muestreadas. Considerado los antecedentes señalados, la DGCENICA decidió continuar dentro de su Programa de Trabajo del 2008 con la segunda etapa del estudio ya mencionado y así ampliar el muestreo y análisis a las delegaciones de Milpa Alta, Tláhuac y Magdalena Contreras. 3. Justificación El maíz es una de las especies de cultivos transgénicos que más se producen a nivel mundial y tiene su centro de origen y domesticación en México. Este cultivo ocupa un lugar preponderante en la producción agrícola del país, así como en la vida de las poblaciones indígenas y de los agricultores de pequeña escala. Aunque México no produce maíz transgénico a nivel comercial, importa anualmente varios millones de toneladas de maíz de los Estados Unidos, que representan mezclas de granos convencionales y granos genéticamente modificados, mayormente para su 4

procesamiento. Esta fuente de maíz transgénico podría liberarse de forma no intencional en zonas rurales. Considerando los riesgos que los OGMs puedan representar para el medio ambiente, sobre todo a consecuencia de liberaciones no intencionales o accidentales (con o sin conocimiento), en las que no se ha llevado a cabo un análisis de riesgo previo a su liberación, resulta necesario un monitoreo sistemático y constante en distintas zonas del país, así como contar con métodos de detección de OGMs eficaces. Sólo de esta manera será posible dar seguimiento y vigilar el cumplimiento y la efectividad de todas las medidas de bioseguridad implementadas. Las delegaciones Tlalpan, Xochimilco, Milpa Alta, Tláhuac, Magdalena Contreras y Cuajimalpa del Distrito Federal son bien conocidas por la diversidad de maíz criollo en sus suelos de conservación. Es por ello que resulta fundamental llevar a cabo un monitoreo de OGMs en esta zona, sobre todo si existen reportes previos de la posible presencia de transgenes en los cultivos de maíz del altiplano mexicano (Serratos- Hernández, A. et al. 2007). 4. Objetivos Objetivo general del estudio: Detectar la posible presencia de OGMs en cultivos de maíz de zonas del Valle de México, así como establecer la frecuencia en la que se encuentran a partir de muestreos realizados en campo. Objetivos particulares: Diseñar y llevar a cabo un método de muestreo representativo del maíz que se cultiva en las Delegaciones de Milpa Alta, Tláhuac y Magdalena Contreras, pertenecientes al Distrito Federal. Realizar el análisis de detección de OGMs en las muestras de maíz colectadas mediante ensayos moleculares de PCR punto final y PCR tiempo real. Identificar los eventos de maíz transgénico presentes en los cultivos de maíz de las zonas muestreadas. Establecer de forma cuantitativa la frecuencia en la que se encuentren los materiales genéticamente modificados en la zona. 5. Materiales y Métodos Colecta Se estableció un contacto previo con representantes de la SAGARPA, para determinar los sitios de colecta y contactar a los productores. A cada productor se le pidió una muestra de su semilla, tomada a partir de 100 mazorcas de maíz, de cada una de las cuales se tomaron 10 granos de manera longitudinal, para 5

completar 1000 semillas por parcela. Se colectó un total de 23 muestras cuyos datos se encuentran en el anexo. Procesamiento de muestras. En un molino de cuchillas, se trituraron los granos de maíz hasta obtener su homogenización en un polvo fino (harina) de acuerdo al procedimiento CENICA PT/BM-02 (Extracción de ADN de tejido vegetal mediante kit de extracción). Una vez obtenida la harina de maíz, se almacenó en tubos de polipropileno a 4 C, para posteriormente llevarse a cabo la extracción de ADN. Extracción de ADN El ADN se extrajo con el método de Genetic ID LP02C (Fast ID DNA Extraction and Purification) de acuerdo al procedimiento CENICA PT/BM-02 (Extracción de ADN de tejido vegetal mediante kit de extracción), a partir de 2 gramos de harina, debido a que esta cantidad se recomienda para tener una muestra analíticamente representativa que permita detectar frecuencias de OGMs de hasta 0.01% (Fagan, 2004, CEN/ISO, 2002a, 2002b, 2002c). El ADN obtenido fue cuantificado por espectrofotometría y se llevó a una concentración de 30ng/µl. Estándares empleados Se emplearon los siguientes materiales de referencia: ERM-BF412f Bt11 5.0%, ERM- BF412a Bt11 0.0%, de los cuales se extrajo el ADN empleando el mismo procedimiento que para extraer el ADN de las muestras, aunque para los materiales de referencia el ADN se obtuvo a partir de 100mg de harina. Amplificación por PCR punto final de los marcadores p35s y tnos Para verificar la amplificación del ADN obtenido de las muestras se realizó la amplificación por PCR del gen endógeno zeina. Una vez verificada la amplificación con el gen endógeno, se realizó la detección de material GM en las muestras, mediante la amplificación por PCR punto final de los marcadores p35s y tnos de acuerdo al procedimiento acreditado de CENICA (CENICA/PT/BM-01: Detección de maíz genéticamente modificado mediante la amplificación de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa). La amplificación se realizó con la enzima de alta fidelidad HotStar Taq ADN polimerasa de Qiagen, debido a la alta eficiencia que se requiere en el ensayo. Los iniciadores empleados y las condiciones de reacción de la PCR y el programa de amplificación se encuentran en el anexo. Las muestras se corrieron en el termociclador Px2 marca Hybaid. Los productos resultantes se verificaron mediante visualización en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. 6

6. Resultados Verificación de la calidad del ADN. La amplificación mediante PCR en punto final de cada una de las muestras con el marcador endógeno zeina, produjo el amplicón esperado de 277 pares de bases (pb) al igual que en dos controles positivos, lo que nos confirma la calidad del material (Figura 1). MP CP CN B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Figura 1: Amplificación por PCR punto final del gen endógeno zeina (277 pb). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) Los números indican las muestras analizadas que se especifican en la Tabla 1. Amplificación de los marcadores P35S y Tnos por PCR punto final. En la figura 2, se observa la amplificación para el marcador p35s, en donde se observa que ninguna de las veintitrés muestras presentaron una banda del mismo tamaño a la del control positivo (CP) para dicho marcador, lo cual indica que no existe la presencia de material GM con promotor 35s para esa muestra. MP CP CN B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Figura 2: Amplificación por PCR punto final del marcador p35s (200 pb aprox.). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) Los números indican las muestras analizadas que se especifican en la Tabla 1. 7

En la figura 3 se observa la amplificación para el marcador tnos, en donde se observa que sólo una (muestra número 16) de las veintitrés muestras presenta una banda del mismo tamaño a la del CP para dicho marcador, lo cual indica la posible presencia de material GM con terminador nos para esas muestras. MP CP CN B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Figura 3: Amplificación por PCR punto final del marcador tnos (118 pb aprox.). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) Los números indican las muestras analizadas que se especifican en la Tabla 1. Debido a la necesidad de que los resultados sean contundentes el análisis de amplificación de los marcadores p35s y tnos se realizó por duplicado para corroborar los resultados anteriores. En la figura 4, se observa el duplicado de la amplificación para el marcador p35s, en donde se observa que ninguna de las veintitrés muestras del duplicado de las muestras, presentaron una banda del mismo tamaño a la del control positivo (CP) para dicho marcador, lo cual corrobora los resultados de la primera amplificación. MP CP CN B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Figura 4: Amplificación por PCR punto final del marcador p35s (200 pb aprox.). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) Los números indican las muestras analizadas (duplicado) que se especifican en la Tabla 1. En la figura 5, se observa el duplicado para la amplificación del marcador tnos, en donde se observa que ninguna de las veintitrés muestras presentó una banda del mismo tamaño a la del control positivo (CP), lo cual indica que no se verifica la presencia de material GM 8

con este elemento en las muestras analizadas. La banda de baja intensidad observada en uno de los duplicados puede deberse a un artefacto de amplificación. MP CP CN B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Figura 5: Amplificación por PCR punto final del marcador tnos (118 pb aprox.). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) Los números indican las muestras analizadas (duplicado) que se especifican en la Tabla 1. 7. Conclusiones No se observó la presencia clara de amplificación de los marcadores p35s y tnos en las muestras analizadas. Sin embargo, para el caso de tnos en ambos duplicados se observa la presencia de bandas muy tenues que no se diagnosticaron como positivas ya que no se verificó inequívocamente esto con otros métodos. Para llevar a cabo esta verificación, estas muestras fueron analizadas mediante PCR en tiempo real (técnica que es más sensible que la PCR en punto final) y no se obtuvo la amplificación de las mismas. Por lo tanto, se concluye que no se encuentra material genéticamente modificado en las muestras colectadas. 8. Recomendaciones De los resultados obtenidos en el presente estudio se pueden proponer las siguientes recomendaciones: a) Realizar un muestreo más intensivo en las localidades en las que se observaron señales tenues en el análisis de PCR en punto final (correspondientes a las delegaciones de Cuajimalpa y Tláhuac), para verificar la ausencia de OGMs en las mismas, ya que el muestreo realizado en dichas zonas durante 2008 fue muy limitado. b) Realizar el monitoreo en las fechas posteriores a la cosecha, para que sea posible obtener un número mayor de muestras y por lo tanto un muestreo más representativo. 9

c) Elaborar encuestas con los productores de las zonas para poder determinar las posibles vías de entrada del material genéticamente modificado. Con los resultados de las encuestas se podrán predecir los puntos críticos en los que hay mayor riesgo de ingreso de OGMs para posteriormente enfocar los esfuerzos del monitoreo en esos puntos. d) Una vez identificadas las vías de entrada, evitar la futura siembra de este material por los productores, para ello es necesario contar con una estrategia elaborada de manera conjunta con otras instituciones, como la Secretaria de Medio Ambiente del Distrito Federal, las delegaciones políticas involucradas y la SAGARPA. e) Continuar con una tercera fase del proyecto, en la cual en el año 2009 en el periodo de cosecha se colecten muestras de semillas en las delegaciones Tláhuac, Milpa Alta, Magdalena Contreras, Álvaro Obregón y Cuajimalpa, con un muestreo que sea estadísticamente representativo de las zonas de siembra de estas delegaciones. f) Elaborar con la Coordinación del Programa de Bioseguridad del INE una estrategia de comunicación del riesgo dirigida a los productores de maíz del Distrito Federal. g) Continuar con el programa de monitoreo de OGMs en el territorio nacional incluyendo los cultivos y zonas prioritarias para México con la finalidad de conocer la situación actual y contar con la información confiable que apoye en el diseño de políticas ambientales en materia de Bioseguridad. 9. Referencias Fagan, J. 2004. DNA based methods for detection and quantification of GMOs: Principles and standards. En: F. E. Ahmed [ed.], Testing of genetically modified organisms in foods, p. 163-220. Food products press, Estados Unidos de América. Gutiérrez, H. 2005. Calidad Total y Productividad, Segunda edición. McGraw-Hill Interamericana. México. ISBN 970-10-4877-6. Serratos-Hernández, A. et al. 2007. Transgenic proteins in Maite in the soil conservation area of Federal District, Mexico. Frontiers in Ecology and Environment 5:247-252. Studer, E., I. Dahinden, J. Luthy, y P. Hübner. 1997. Nachweis des gentechnisch veräderten "Maximizer"-Mais mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und Hygiene 88: 515-524. Trapmann, S., P. Corbisier, y H. Schimmel. 2004. Reference materials and standards. En: F. E. Ahmed [ed.], Testing of genetically modified organisms in foods, p. 101-116. Food products press, Estados Unidos de América. Windels, P., S. Bertrand, A. Depicker, W. Moens, E. Bockstaele, y M. Loose. 2003. Qualitative and event-specific PCR real-time detection methods for StarLink maize. European Food Research and Technology 216: 259-263. 10

10. Anexos Anexo 1. Muestras colectadas y analizadas en el presente estudio. No. de muestra Tipo de muestra No. de granos Nombre del productor Delegación 1 Granos de maíz 1000 Amada Vértiz Rosas Magdalena Contreras 2 Granos de maíz 1000 Juan Ruiz Magdalena Contreras 3 Granos de maíz 1000 Nicolas Fragoso Magdalena Contreras 4 Granos de maíz 1000 Margarito Pérez Vértiz Magdalena Contreras 5 Granos de maíz 1000 María Martínez Magdalena Contreras 6 Granos de maíz 1000 Carlos Melquíades Amaya Magdalena Contreras 7 Granos de maíz 1000 Javier Ávila Monroy Magdalena Contreras 8 Granos de maíz 1000 Regino Fuentes Magdalena Contreras 9 Granos de maíz 1000 Felix Bassoco Magdalena Contreras 10 Granos de maíz 1000 Víctor Saldívar Álvaro Obregón 11 Granos de maíz 1000 Eulalia Velásquez Cortés Cuajimalpa 12 Granos de maíz 1000 Luis González Castro Álvaro Obregón 13 Granos de maíz 1000 Graciela Chávez Flores Cuajimalpa 14 Granos de maíz 1000 Joaquín Ávila Cuajimalpa 15 Granos de maíz 1000 Susana Chávez Cuajimalpa 16 Granos de maíz 1000 Higinia Guzmán Cuajimalpa 17 Granos de maíz 1000 Carlos Miranda Tláhuac 18 Granos de maíz 1000 No fue proporcionado Tláhuac 19 Granos de maíz 1000 Francisco Leyva Milpa Alta 20 Granos de maíz 1000 No fue proporcionado Milpa Alta 21 Granos de maíz 1000 No fue proporcionado Milpa Alta 22 Granos de maíz 1000 No fue proporcionado Milpa Alta 23 Granos de maíz 1000 No fue proporcionado Milpa Alta 11

Anexo 2. Reacciones y programas de amplificación para los marcadores empleados Reactivo Tabla 1. Reacción de PCR para el marcador zeina Concentración inicial Concentración final Buffer para PCR 10X 1X 2.5 µl Mezcla de dntp 10 mm 0.2 mm 0.5 µl Solución MgCl 2 25 mm 2.5 mm 2.5 µl iniciador Zein3 20 µm 0.5 µm 0.625 µl iniciador Zein4 20 µm 0.5 µm 0.625 µl Taq DNA polimerasa 5U µl 0.025 U/µl 0.125 µl Agua ultrapura ---- ---- 17.625 µl ADN molde 30 ng/µl 0.6 ng/µl 0.5 µl Volumen total ---- ---- 25 µl Volumen para una reacción de 25 µl Reactivo Tabla 2. Reacción de PCR para el marcador p35s Concentración inicial Concentración final Buffer para PCR 10X 1X 2 µl Mezcla de dntp 2.5 mm/cu 0.1 mm/cu 0.8 µl Solución MgCl 2 25 mm 1.2 mm 0.96 µl Solución Q 4 µl Primer Mix P35S 0.4 µl Taq DNA polimerasa 5U µl 1.25 U/µl 0.1µl Agua ultrapura ---- ---- 7.74 µl ADN molde 30 ng/µl 0.025 ng/µl 4µl Volumen total ---- ---- 20 µl Volumen para una reacción de 20 µl 12

Reactivo Tabla 3. Reacción de PCR para el marcador tnos Concentración inicial Concentración final Buffer para PCR 10X 1X 2 µl Mezcla de dntp 2.5 mm/cu 0.1 mm/cu 0.8 µl Solución MgCl 2 25 mm 1.2 mm 0.96 µl Solución Q 4 µl Primer Mix TNOS 0.4 µl Taq DNA polimerasa 5U µl 1.25 U/µl 0.1 µl Agua ultrapura ---- ---- 7.74 µl ADN molde 30 ng/µl 0.025 ng/µl 4 µl Volumen total ---- ---- 20 µl Volumen para una reacción de 20 µl Tabla 4. Programas de amplificación para las diferentes regiones amplificadas Nombre del evento Zeina (endógeno) p35s y tnos Etapa Paso Temperatura Tiempo Número de ciclos 1 1 95 ºC 0:03:00 1 2 1 2 3 96 ºC 60 ºC 72 ºC 0:01:00 0:01:00 0:00:45 3 1 72 ºC 0:03:00 1 2 4 ºC 1 1 95 ºC 0:15:00 1 2 1 2 94 ºC 55 ºC 0:00:20 0:00:55 3 1 72 ºC 0:10:00 1 2 4 ºC 40 37 13