Actividades del CNA en la detección de alérgenos alimentarios: Detección de Avellana mediante PCR

Actividades del CNA en la detección de alérgenos alimentarios: Detección de Avellana mediante PCR Mª del Camino Martín-Forero Servicio de Biotecnología

Reglamento (UE) Nº 1169/2011 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre la información alimentaria facilitada al consumidor Obligatoriedad de etiquetar por : Presencia/ausencia del ingrediente alergénico, no a partir de un determinado umbral del alergeno ANEXO II Cereales que contengan Gluten Crustáceos Huevos Pescados Cacahuetes Soja Leche Frutos de cáscara Apio Mostaza Sésamo Sulfitos y dióxido de azufre>10mg/kg Altramuces Moluscos..y sus derivados

Norma UNE-EN 15634-1 (Septiembre-2009) Detección de alergenos mediante métodos Biológicos moleculares. Consideraciones generales

Norma UNE-EN 15634-1 Describe el procedimiento para detectar de forma cualitativa y/o cuantificar ADN como marcador de constituyentes o ingredientes alimentarios potencialmente alergénicos, mediante el análisis de ácidos nucleicos extraídos a partir de la muestra sometida a estudio» Detección cualitativa de ADN diana» Detección cuantitativa de ADN diana

5.-PROCEDIMIENTO El análisis cualitativo consiste en la extracción específica y la detección de secuencias diana de ácidos nucleicos presentes en la porción para análisis Un resultado cualitativo debe demostrar claramente la presencia o ausencia de la diana estudiada, en relación a los controles apropiados y dentro de los límites de detección del método analítico empleado y de la porción para análisis analizada Norma UNE-EN 15634-1

5.2.-Generalidades Aislamiento de los ácidos nucleicos: EXTRACCION Amplificación y detección de las secuencias diana específicas Confirmación de la especificidad del fragmento amplificado Cuantificación de los fragmentos amplificados en referencia a los calibradores Norma UNE-EN 15634-1

6.-AISLAMIENTO/EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Preparación de la muestra Extracción de ADN Cuantificación del ADN Calidad del ADN: Se recomienda preparar dos porciones para análisis a partir de cada muestra PurezaA 260 /A 280. Libre de inhibidores La calidad del ADN se puede comprobar mediante el uso de un sistema de PCR basado en la amplificación de una diana universal Norma UNE-EN 15634-1

7.-AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS DIANA ESPECÍFICAS 7.2.-Diseño de primers: Entre 18 y 30 nucleótidos de longitud. Se debe determinar experimentalmente la Tª óptima de hibridación. Mantener la proporción GC:AT en 50:50 o lo mas cercana posible Evitar los tramos Gs y Cs en segmentos cortos Mayor estabilidad interna Mínima complementariedad en extremos 3 para evitar los dímeros Mínima estructura secundaria interna Mínima formación de dímeros de la sonda de detección específica diseñada para la PCR Validación de los primers: Teórica Centro Experimental: capacidad de discriminar de los mismos entre el ADN diana y clases, órdenes, familias, géneros y especies relacionadas REACTIVIDAD CRUZADA Norma UNE-EN 15634-1

7.3.-Procedimiento de PCR Reacción óptima no más de 40 ciclos. En aplicaciones de PCR en tiempo real puede utilizarse un nº de ciclos mayor Escoger un tamaño de amplicón adecuado a la muestra: para muestras procesadas ( ADNs desnaturalizados): 60-150 pb Para muestras no procesadas hasta 250 pb Las secuencias diana no tienen que provenir directamente del ADNque codifica las secuencias de las proteínas alergénicas, ya que estas no se detectan directamente. Pero tienen que ser específicas de la diana concreta Controles de la PCR» Control positivo de ADN diana» Control negativo de ADN diana» Blanco de extracción» Control de los reactivos de la amplificación: Agua Norma UNE-EN 15634-1

10.-EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Expresión de un resultado positivo Para la muestra Xse detectóla presencia de la secuencia diana Y Expresión de un resultado negativo: Para la muestra X no se detectó la presencia de la secuencia diana Y El LOD del método es de xnúmero de copias, determinadas con ABC (identificando el MR). Un nº de copias x corresponde a z mg de constituyentes alergénicos/kg de alimento Expresión ambigua: +/- Norma UNE-EN 15634-1

11.-INFORME DE ANÁLISIS Resultados expresados como ya se ha indicado Descripción de la especificidad del método analítico Material de referencia utilizado Referencia a esta norma europea Norma UNE-EN 15634-1

ESTUDIO REALIZADO EN EL CNA PARA COMPROBAR LA EFECTIVIDAD DE LA PCR DE AVELLANA

Detección de ADN de avellana mediante PCR en tiempo real Determinación de la sensibilidad del ensayo Preparación de la avellana mezclada y molida Extracción de la mezcla de avellana Detección de ADN de Avellana Comparación PCR vs ELISA sobre muestras reales Comprobación del L.C. del ELISA mediante PCR Preparación de muestras cargadas

Preparación del Patrón de Avellana Pesar avellanas molidas (mezcla 1:1 tostadas-crudas) Lavado con Hexano Centrifugación x 3 Anotar cuidadosamente el peso del extracto seco Calcular la pérdida relativa de peso debida al desengrasado

EXTRACCIÓN DE ADN DEL PATRÓN DE AVELLANA CTAB Método Guanidina/Wizard

RENDIMIENTO Extracción Patrón de Avellana Concentración Pureza A260/280 Método 42,6 1,56 G-Wizard 17 1,41 G-Wizard 21,1 1,37 G-Wizard 22 1,57 G-Wizard 19,4 1,49 G-Wizard 130,4 1,58 G-Wizard 237,7 1,59 G-Wizard 112,3 1,61 G-Wizard 117,9 1,62 G-Wizard 146,4 1,54 G-Wizard 114 1,59 G-Wizard 52,3 1,64 G-Wizard 44,4 1,61 G-Wizard 64,7 1,51 G-Wizard 55,8 1,58 G-Wizard 135 1,57 G-Wizard 68,6 1,47 G-Wizard

PCR Avellana Centro Secuencia diana : Gen que codifica la proteína Cora 1 COMPONENTE [ ] INICIAL [ ] FINAL µl/reacción TaqMan Universal (BioRad) 12,5 Primer F 10µM 300nM 0,75 Primer R 10µM 300nM 0,75 Sonda 10µM 200nM 0,50 Agua libre de nucleasas 5,5 ADN 5 Volumen Total 25 ETAPA Tª (ºC) TIEMPO (s) Nº de CICLOS 1 DESNATURALIZACIÓN 95 180 1 2 AMPLIFICACIÓN 95 15 45 3 EXTENSIÓN 60 60

Sensibilidad del ensayo Preparación de solución de trabajo : 20 ng/ul de ADN Curva: Concentración de 100 ng 0,005 ng CONCENTRACIÓN CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 CURVA 6 ng ST1 100 21,8196 20,1585 22,3154 21,0109 19,3769 18,1843 1,55 ST2 10 25,2469 23,3342 25,5869 24,2057 22,5807 21,3769 1,61 ST3 1 28,5956 26,5351 29,0228 27,5357 26,0347 24,8476 1,59 ST4 0,1 31,9123 29,8700 32,2767 30,8308 29,3236 28,1851 1,57 ST5 0,01 33,3778 32,8995 35,3786 34,6325 32,8088 31,3649 1,43 ST6 0,005 36,6321 34,1201 35,6541 35,0809 34,3196 32,5891 1,39 Pendiente -3,189-3,227-3,173-3,339-3,435-3,339 R 2 0,992 0,999 0,997 0,993 0,998 0,999 Eficiencia 106% 104% 107% 99% 96% 99% SD Sensibilidad: 0,005 ng de ADN de avellana El tamaño del genoma de C.avellana es 0,48 pg (Bennett MD, Smith JB (1991) Philos Trans R Soc London B 334:309-345) LD absoluto de 10 copias de genoma de avellana

Comparación ELISA/PCR sobre muestras reales Muestras DUDOSAS (Puede contener trazas de avellana) Muestras POSITIVAS (Figura Avellana como ingrediente) Muestras NEGATIVAS (No figura avellana como ingrediente) MUESTRA RESULTADO ELISA RESULTADO PCR mg/kg Bollo Qé caña. 8 37,35± 1,02 Galletasc/chocol >20 36,54±1,33 Corazones barquillo <2,5 ND Conguitos >20 38,50±3,85 Turrón de cacahuete <2.5 38,33±1,41 Cereales trigo y chocolate >20 34,30±0,24 Muesli. Barritas cereales > 20 33,59±0,15 Barritas cereales.avellanas > 20 25,03±0,02 Palitos de trigo con chocolate y > 20 27,37±0,05 Minis de Bollycao > 20 29,63±0,06 Knoppers > 20 24,07±0,05 Fruta y fibra > 20 24,66±0,01 Phoskitos.Crash(2%) <2.5 ND Copos de maíz < 2.5 ND Desayuno a la taza < 2.5 ND MiniDinosaurios < 2.5 ND Pan molde sin corteza < 2.5 37,33±0,46 Galletas multivitaminadas 9 37,69±0,82 Centro

Comprobación del L.D. del ELISA mediante PCR Se prepararon muestras negativas cargadas: al L.Cdel ELISA (2,5 mg/kg) al doble del L.C(5 mg/kg) Detección de ADN de avellana mediante PCR cualitativa (PCR en tiempo real) Muestras por duplicado / 3 réplicas de PCR Controles positivos: LD absoluto (0,005 ng de avellana 10 copias) 0,01 ng 20 copias

MUESTRAS BLANCO NIVEL 2,5 mg/kg NIVEL 5 mg/kg Control L.D. (0,005 ng) 34,73±1,41 Control L.D. (0,01 ng) 33,19±1,67 Control efecto matriz (Arroz) 35,89±0,56 37,26±1,36 Turrón ND 37,41±2,51 Cereales infantiles ND 40,60±0,44 Galletas maría ND 36,95±0,66 Corazones barquillo 36,49±1,01 36,29±1,64 Galletas 37,04±0,92 36,87±1,03 Minidinosaurios choc. 36,20±0,91 35,76±1,08 Bizcocho 36,81±2,02 35,04±1,29 Copos de maíz ND 38,56±0,47 Phoskitos Crash ND 40,87±1,23 Desayuno a la taza ND 41,46±1,44

CONCLUSIONES 1.- Los resultados obtenidos mostraron que los métodos de PCR podrían considerarse una opción válida para la detección de avellana en muestras de alimentos 2.- El sistema de PCR en tiempo real utilizado en este trabajo, mostró suficiente sensibilidad para la detección de ADN de avellana. 3.- Mediante el estudio comparativo PCR vs ELISA se comprobó que el método era capaz de detectar ADN de avellana en las muestras en las que se había detectado proteína alergénica. 4.- En algunas ocasiones, en muestras complejas, no ha sido posible la detección mediante PCR de una concentración de avellana igual al Límite de Cuantificación de la técnica ELISA, posiblemente debido al efecto matriz.

Muchas gracias!! Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.es 913380688 Mª del Camino Martín-Forero MmartinForero@msssi.es 913380928 Mercedes Fernández de la Puebla Mª Isabel Rodríguez Pérez Silvia Gil Alcalde Josefina Gangoso Herreras Esther Rico Cañada MªLuisa Salvador Pulgar Míriam Gómez Martín