ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE PROTEÍNAS 1. Sobre la determinación de proteínas. Llena la tabla Característica Aminoácidos o enlaces que reconoce Método Lowry Bradford A280 nm Sensibilidad Compuestos que interfieren Destruye la muestra Compuesto empleado para la detección de la proteína 2. Calcula: Se maceraron 2g de hojas de jitomate con 3 ml de una solución amortiguadora de fosfatos, el extracto proteico se diluyo 1:5 para determinar la concentración de proteína por el método de Bradford. Calcula la cantidad de proteína/ g de tejido usando los siguientes datos. BSA (ug) Abs Curva estándar 0 0 0.5 0,041 2.5 0,284 5 0,595 10 1,079 Muestra dil 1.5 5 ul 0,32 10 ul 0,673 15 ul 0,981 1
3. Se realizó la purificación de una proteína recombinante. Para ello se crecieron células transformantes de E. coli, después de un cultivo de toda la noche se tomó una alícuota de estas bacterias y se sembró en medio fresco y al llegar a 0.6-0.8 de Absorbancia se les añadió IPTG. Después de 2 horas se tomó todo el cultivo se centrifugó y luego se realizó la ruptura celular o lisis por sonicación, se centrifugo y el sobrenadante se usó para la purificación, la proteína de interés tiene una secuencia de cola de histidina en el carboxilo terminal que fue añadida durante la clonación del gen y la columna que se uso tiene pegado Níquel para el cual la histidina es afín. A. en el gel identifica cuál es la banda de alto peso molecular y cual la de bajo peso molecular? B. De acuerdo a lo que sabes de electroforesis el pi de la proteína estará por arriba o por debajo de 8.9. C. Se purificó la proteína?, si es así calcula el peso molecular de la banda purificada. D. Porque se hacen lavados de la columna E. Qué es el IPTG y cuál es su función? F. por qué hay que hacer ruptura celular? G. Cómo se llama la cromatografía que se usó? 2
Llena la tabla de purificación 3
Cromatografías 1. Se requiere purificar a una proteína de una mezcla y tienes las dos columnas que se te presentan en los siguientes diagramas. i. Cuál es el fundamento de la purificación de la columna a)? ii. Qué proteínas salen primero de la columna? iii. Hay un requisito especial en el tipo de amortiguador de elución? iv. Qué tipo de columna se encuentra en la figura b)? v. Qué proteínas se unen a la columna y porqué? vi. Qué requisitos debe cumplir el amortiguador para eluir a las proteínas de la columna y porqué? vii. Qué proteínas se eluyen de la columna? b) viii. Menciona nombres de resinas que se encuentran cargadas positivamente. Cuál es el grupo funcional que les da esa carga? ix. Menciona nombres de resinas que encuentran cargadas negativamente. Cuál es el grupo funcional que les da esa carga? x. Menciona resinas que no tienen carga xi. Qué tipo de ligantes tienen unidos las resinas para cromatografía de afinidad? 4
Ejercicios de cinética 1. Un científico trabajando con un sistema de fermentación observo un tipo de inhibición de su enzima al convertir el sustrato en producto. El observo con cuidado las gráficas que se le produjeron en condiciones estándar e inhibidas (ver Figura). Responde lo siguiente y resuelve el misterio. 1. Qué tipo de gráfico se está representando? A) Michaelis-Menten B) Dobles recíprocos C) Hanes D) Sigmoide 2. Cuál de las dos curvas representa el efecto del inhibidor sobre la actividad de la enzima? A) La curva A B) La curva B C) Ambas curvas D) Ninguna 3. El inhibidor presente en el fermentador produce una inhibición de tipo: A) Irreversible B) Competitivo C) No competitivo D) Mixto 4. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Vmax de la reacción? A) Incrementarla B) Disminuirla C) Ninguno D) Datos insuficientes 5. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Km de la reacción? A) Incrementarla B) Disminuirla C) Ninguno D) Datos insuficientes 6. Cómo puede el investigador resolver su problema de inhibición en su fermentador? A) Disminuyendo la concentración de sustrato B) Manteniendo la concentración de sustrato 5
C) Incrementando la concentración de sustrato D) Datos insuficientes 7. Se midió la actividad de la LDH utilizando 10 ul de una dilución 1:500 de un extracto que tiene una concentración de 4.5 mg/ml. El medio de ensayo incluyo piruvato, amortiguador a ph 7.0 y NADH, para un volumen final con todo y enzima de 800 ul. Usando los siguientes datos calcula la actividad de la enzima. Tiempo Absorbancia (min) 340 nm 0.5 1.114 1 1.006 1.5 0.855 2 0.770 2.5 0.647 3 0.538 3.5 0.422 4 0.336 4.5 0.330 5 0.143 8. Con los datos que se presentan en la tabla determina el valor de Vmax. [S] (µm) V0 sin inhibidor (µmol/min) 3 10.4 4.1 5 14.5 6.4 10 22.5 11.3 30 33.8 22.6 90 40.5 33.8 9. Cuál es la Km 10. Cuál es el tipo de inhibición? V0 inhibidor (µmol/min) La siguiente tabla representa el número de recambio o bien la capacidad de una enzima de llevar a cabo una reacción enzimática. 11. Cuál de las 6 enzimas presenta la mayor eficiencia catalítica? 9. 12. e indica qué columna de valores te sirvió para responder esto 13. Y Cuál es la enzima con la menor eficiencia de reacción? con 6
EJERCICIOS DE CINÉTICA 2. Se midió la cinética de actividad de la lactato deshidrogenasa en los dos sentidos posibles de la reacción, en presencia de diferentes concentraciones de oxamato, las gráficas que se produjeron se encuentran adelante, contesta lo que se te solicita para cada una de las gráficas. Oxamato 0 0.1 0.3 0.5 1. Escribe la reacción que cataliza la enzima 2. Para la determinación de las constantes cinéticas son varios los gráficos que se pueden hacer, como se llama el que se presenta en la Figura de arriba. 3. Cuál curva describe el comportamiento sin inhibidor? a. A b. B c. C d. D 4. Qué tipo de inhibición se presenta? a. Acompetitiva b. Competitiva c. No competitive Pura d. No competitive Mixta 5. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Vmax de la reacción? a. No hay cambio b. Disminuye c. Se incrementa d. Los datos no son suficientes 6. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Km de la reacción? a. No hay cambio b. Disminuye c. Se incrementa d. Los datos no son suficientes 7
7. Cuál es la Km para el sustrato? 8. Cuál es la Vmax de la enzima sin inhibidor? Para la gráfica b. Oxamato 0 0.1 0.3 0.5 1 9. Escribe la reacción que cataliza la enzima 10. Cuál curva describe el comportamiento sin inhibidor? a. A b. B c. C d. E 11. Qué tipo de inhibición se presenta? a. Acompetitiva b. Competitiva c. No competitive Pura d. No competitive Mixta 12. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Vmax de la reacción? a. No hay cambio b. Disminuye c. Se incrementa d. Los datos no son suficientes 13. Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Km de la reacción? a. No hay cambio b. Disminuye 8
c. Se incrementa d. Los datos no son suficientes 14. Cuál es la Km para el sustrato? 15. Cuál es la Vmax de la enzima sin inhibidor? 16. Si comparas las dos Figuras sobre la actividad de la LDH, encuentras algunas diferencias en cuanto a la inhibición que el oxamato causa en la enzima. qué propones que está sucediendo con la enzima para que presente una inhibición distinta contra el oxamato, pese a que es la misma enzima? 17. Define Km 18. Las unidades de la Km son 19. Define Vmax 20. Las unidades de la Vmax son 21. Qué significado tiene el índice Vmax/Km? 9
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. Proceso de transferencia de material genético en el que hay contacto específico célula a célula A) Transformación B) Conjugación C) Transducción D) Clonación 2. Un vector de clonación es: A) Un plásmido que aportará la resistencia a un antibiótico por ello se denomina vector B) DNA de doble cadena cerrado que depende de la duplicación del DNA cromosomal C) Es una molécula de DNA exógena que contiene un segmento de DNA que aportará información extra a la célula hospedera D) Es un DNA que resulta de la unión del DNA cromosomal de la bacteria competente con el DNA del plásmido 3. Identifica las tres características que debe contener un vector de clonación: A) B) C) 4. La transformación de bacterias es la: A) La transferencia de DNA de un virus a una bacteria B) La transferencia de la información genética entre dos especies emparentadas C) La transferencia de DNA desnudo a una bacteria D) La transferencia de DNA de bacteria a bacteria mediante el contacto directo de ambas cepas 5. Uno de los primeros experimentos que dio información sobre la función del DNA como portador de la información genética 10
A) La existencia de un factor transformante proveniente de los neumococos virulentos (lisos) que permite que neumococos no virulentos (rugosos) sean capaces de convertirse en virulentos ocasionando la neumonía. B) Un lisado de neumococos virulentos (muertos) fue sometido a tratamiento con diferentes enzimas, primero con glucosidasas, luego RNAasas y por último las DNAasas, el último tratamiento produjo un lisado que no transforma a bacterias no virulentas en virulentas. C) La capacidad de mutación del DNA de los neumococos que las lleva a ser patogénicas al ratón. D) La descripción morfológica de la capacidad virulenta de los neumococos lisos que contienen una capa de polisacáridos capaces de producir la muerte por neumonía a los ratones. 6. Cuál es la principal diferencia entre células competentes y células transformantes? A) Las primeras han sido sometidas a un tratamiento con kanamicina mientras que las células transformantes son sensibles a kanamicina. B) Las células competentes presentan una membrana poco permeable al DNA y las transformantes son altamente permeables al DNA C) Las células competentes son permeables al DNA mientras que las transformantes han tomado exitosamente el DNA D) Las primeras son capaces o competentes para expresar a los plásmidos mientras que las transformantes solo son capaces de expresar al plásmido en condiciones de crecimiento con antibiótico. 7. Da el nombre del método que utilizamos en la práctica para llevar a cabo la transformación 8. Qué método usualmente se utiliza para hacer COMPETENTES a las células de E. coli?. 9. Explica el proceso de transformación que se realizó en la práctica, brevemente. No te olvides de los controles. 11
OPERON LAC 1. Un laboratorio de investigación se dedica a la caracterización de cepas bacterianas; en este momento, están trabajando con dos cepas de Escherichia coli. Lo que han descubierto acerca de estas 2 cepas es que ambas son auxótrofas a arginina, leucina y alanina (arg - leu - ala - ), que una de ellas es resistente a ampicilina (mientras que es sensible a otros antibióticos) y que la otra es resistente a estreptomicina (y sensible a otros antibióticos). Durante un experimento, accidentalmente mezclan a las dos cepas y para tratar de separarlas, primero las crecen en medio LB y después en medios selectivos (LB + Ampicilina y LB + Estreptomicina). Para la cepa A (Amp R ) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Estreptomicina, mientras que en el medio LB + Ampicilina sí. Para la cepa B (Str R ) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Ampicilina, LB + Estreptomicina sí. Sin embargo, al realizar el aislamiento, se percatan de que las nuevas colonias son capaces de crecer en ambos medios selectivos! Cómo podrías explicar que las nuevas colonias obtenidas, son resistentes a ambos antibióticos? Cómo podrías demostrar cuál de las dos cepas actúa como donadora y cuál como receptora? Sí el fenómeno es mediado por plásmidos, Cómo determinarías si la cepa es Hfr ó F? NOTA: En el laboratorio han caracterizado diferentes cepas, algunas de ellas son: Cepa C, Escherichia coli F - leu + Cepa D, Escherichia coli F ala + Cepa E, Escherichia coli F + arg - leu - ala - 2. Explica brevemente el mecanismo de regulación positiva del operón lac 3. Explica brevemente el mecanismo de regulación regativa del operón lac 4. Qué son ONPG, IPTG y alolactosa? 12