Murex HCV Ag/Ab Combination

es 4J24-01/-02 Primera edición 10/2009 Murex HCV Ag/Ab Combination Enzimoinmunoanálisis para la detección simultánea del antígeno core del virus de la hepatitis C (VHC) y de anticuerpos anti-vhc en suero o plasma humanos Centro de Asistencia Técnica Si desea más información, póngase en contacto con el Centro de Asistencia Técnica local. Lea atentamente estas instrucciones de uso antes de utilizar este producto. No se puede garantizar la fiabilidad de los resultados de este ensayo si no se siguen exactamente estas instrucciones de uso. Clave de los símbolos utilizados Número de referencia Almacénese entre 2 C y 8 C Número de lote Fecha de caducidad ATENCIÓN: Consúltense los documentos adjuntos Consulte las instrucciones de uso Producto sanitario para diagnóstico in vitro Si desea una explicación más detallada sobre los símbolos utilizados para cada componente, consulte el apartado REACTIVOS. 9

FINALIDAD DE USO El ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination es un inmunoanálisis cualitativo para la detección simultánea del antígeno core y de los anticuerpos anti-vhc en suero o plasma humanos. Este ensayo está diseñado para la detección precoz mejorada de la infección por VHC en el cribado de la sangre y en la clínica. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente causante de las hepatitis no A, no B (NANB) postransfusionales 1. El VHC es un virus de RNA de cadena sencilla y de polaridad positiva con similitud con los flavivirus y los pestivirus 2,3 y presenta una gran divergencia geográfica. Aunque el estadio agudo del VHC no suele ser grave (sólo el 25% de los pacientes desarrollan ictericia), una cantidad elevada de individuos infectados (superior al 50%) desarrollan hepatitis crónicas con secuelas graves y, a veces, mortales, tales como cirrosis y hepatocarcinomas. 4,5 El diagnóstico del VHC depende normalmente de la detección directa del RNA vírico mediante PCR o la detección de los anticuerpos anti-vhc. Los últimos ensayos para la detección del antígeno del VHC disponibles en el mercado confirman que su detección puede reducir el "período ventana" anterior a la detección del anticuerpo. Estudios realizados indican que el período de tiempo medio desde la primera extracción con viremia hasta la primera extracción positiva para el antígeno del VHC es de 2,0 días y que el período de tiempo hasta la primera extracción positiva para el anticuerpo anti-vhc es de 50,8 días 6. En comparación con los ensayos de cribado serológico del anticuerpo anti-vhc convencionales, el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination combina en un sólo ensayo la detección de anticuerpos anti-vhc y del antígeno core; lo que reduce en gran medida el "período ventana" desde la infección hasta la detección. PRINCIPIOS BIOLÓGICOS DEL PROCEDIMIENTO Murex Ag/Ab HCV Combination es un enzimoinmunoanálisis. Los pocillos se recubren con el anticuerpo monoclonal anti-core y con el antígeno recombinante y los péptidos que representan las regiones inmunodominantes de los antígenos víricos NS3 y core. Las muestras y los sueros de control se incuban en los pocillos y el antígeno core del VHC o los anticuerpos anti-vhc se unen al micropocillo recubierto. Después del lavado para eliminar la muestra y el exceso de analito, se añade el conjugado marcado con peroxidasa, que contiene los epítopos antigénicos del NS3 y del core con los anticuerpos monoclonales anti-core. El conjugado se une tanto al anticuerpo específico como al core del VHC que ya esté unido a los reactivos en el pocillo. En las muestras que no contengan ni antígeno core ni anticuerpos específicos, el conjugado no se une al pocillo. Después del lavado para eliminar el conjugado no unido, se añade en los pocillos una solución con 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. En los pocillos que contienen antígenos específicos o anticuerpos anti-vhc, aparece un color azul verdoso que se convierte en naranja cuando se suspende la reacción con ácido sulfúrico. Los pocillos no reactivos prácticamente no cambian su color amarillo inicial hasta que se añade el ácido sulfúrico y el color amarillo se transforma en rosa. REACTIVOS DESCRIPCIÓN, PREPARACIÓN PARA EL USO Y ALMACENAMIENTO Si desea más información, consulte el apartado Advertencias y precauciones de estas instrucciones de uso. A menos que se indique lo contrario, todos los componentes del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination se deben almacenar a una temperatura entre 2 C y 8 C (bajo estas condiciones permanecen activos hasta la fecha de caducidad del equipo). COATED 1 placa (4J24-01) o 5 placas (4J24-02) de 96 pocillos recubiertos con antígeno del VHC recombinante purificado, péptidos y anticuerpo monoclonal core anti- VHC. Deje que los pocillos alcancen una temperatura entre 18 C y 30 C antes de sacarlos de la bolsa. Procure cortar la bolsa metalizada lo más cerca posible de la parte sellada. Si no se utiliza toda la placa, coloque los pocillos con secante que no se hayan usado en la bolsa metalizada, ciérrela con cuidado con cinta adhesiva y almacénelos de nuevo a una temperatura entre 2 C y 8 C hasta 3 meses. SAMPLE 1 frasco (4J24-01) ó 2 frascos (4J24-02) que contienen 18 ml de una solución de tampón verde que contiene proteínas bovinas y murinas con detergentes. Conservante: Nipasept al 0,3%. CONTROL 1 frasco que contiene 2,8 ml de suero humano y proteínas bovinas en una solución de tampón de color azul. Conservante: Nipasept al 0,3%. CONTROL 1 frasco que contiene 1,8 ml de sueros humanos inactivados, diluidos en suero humano y proteínas bovinas con colorante naranja. Conservante: Nipasept al 0,3%. CONTROL WELLS DIL Ab Ag 1. Pocillos recubiertos 2. Diluyente de muestra 3. Control negativo 4. Control positivo para el anticuerpo 5. Control positivo para el antígeno 1 frasco que contiene 1,8 ml de diluyente que contiene péptido de control para el antígeno del VHC con colorante rosa. Conservante: azida sódica al 0,084%. CONJUGATE 6. Conjugado 1 frasco (4J24-01) o 3 frascos (4J24-02) que contienen 1,25 ml de antígenos del VHC y anticuerpo monoclonal conjugados con peroxidasa de rábano y liofilizados. Una vez reconstituido, un frasco es suficiente para analizar hasta 2 placas. CONJUGATE DIL 7. Diluyente de conjugado 1 frasco (4J24-01) o 3 frascos (4J24-02) que contienen 25 ml de una solución amarilla compuesta por tampón, proteína bovina, saponina y detergentes, suficiente para reconstituir un frasco de conjugado. Conservante: ProClin 300 al 0,1%. 10

Reconstitución del conjugado Golpee suavemente el frasco de conjugado sobre la superficie de trabajo para eliminar los materiales que se hayan podido quedar pegados al tapón de goma. Vierta por completo el contenido del frasco de diluyente de conjugado en el frasco de conjugado. Tápelo y mézclelo invirtiéndolo suavemente y deje que se rehidrate durante al menos 15 minutos agitándolo ocasionalmente. El conjugado reconstituido es de color rojo. Tras la reconstitución, el conjugado se puede almacenar hasta 24 horas a una temperatura entre 2 C y 8 C o hasta 5 meses congelado en alícuotas a una temperatura inferior o igual a 15 C. El conjugado reconstituido se puede someter a un máximo de 3 ciclos de congelación y descongelación. SUBSTRATE 1 frasco que contiene 35 ml de una solución incolora con citrato trisódico y peróxido de hidrógeno. SUBSTRATE DIL CONC 8. Diluyente de sustrato 9. Concentrado de sustrato 1 frasco (35 ml) de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) y estabilizantes en una solución naranja. Solución de sustrato Para preparar la solución de sustrato, añada una parte de diluyente de sustrato incoloro a la misma cantidad de concentrado de sustrato naranja en una cubeta limpia de vidrio o de plástico, tal y como se indica en la Tabla 1. Es importante que siga este orden para realizar la mezcla y que las pipetas y los materiales de vidrio que utilice para preparar la solución de sustrato estén limpias. La solución de sustrato también se puede preparar vertiendo todo el contenido del frasco del diluyente de sustrato en el frasco del concentrado de sustrato. Al añadir el diluyente de sustrato, el color del concentrado de sustrato cambia de naranja a amarillo. Tabla 1 Volumen de concentrado de sustrato y de diluyente de sustrato necesarios Número de pocillos Número de placas 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 96 1 2 3 4 Concentrado de sustrato (ml) 1,0 1,5 2,0 2,5 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 4,5 6,0 6 12 18 22 Diluyente de sustrato (ml) 1,0 1,5 2,0 2,5 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 4,5 6,0 6 12 18 22 Si se utilizan instrumentos automáticos, puede ser necesario reactivo adicional. Evítese la exposición a la luz solar. La solución de sustrato debe ser amarilla; en el caso de que sea verde antes del uso, se debe desechar y preparar una solución de sustrato nueva. La solución de sustrato preparada con los reactivos de este equipo se puede utilizar indistintamente con la solución de sustrato de otros equipos de Murex que usen el concentrado de sustrato naranja. Asegúrese de que la solución de sustrato se prepare con el diluyente de sustrato y el concentrado de sustrato que se suministran conjuntamente. La solución de sustrato preparada se mantiene estable si se almacena refrigerada (a una temperatura entre 2 C y 8 C) o a una temperatura entre 15 C y 25 C hasta 2 días. Si aparecen cristales en la solución, deséchela. WASH 10. Líquido de lavado 1 frasco (4J24-01) ó 2 frascos (4J24-02) que contienen 125 ml de líquido de lavado Tween/solución salina (concentración 20 veces superior a la concentración de trabajo). Conservante: Bronidox al 0,2%. Añada un volumen de concentrado de líquido de lavado a 19 volúmenes de agua destilada o desionizada para obtener el volumen necesario o diluya todo el frasco de líquido de lavado hasta obtener un volumen final de 2500 ml. Conservante: Bronidox al 0,01% (una vez diluido). Se puede utilizar el líquido de lavado de este equipo indistintamente con el líquido de lavado Tween/solución salina de cualquier otro equipo de Murex HCV Ag/Ab Combination. Almacene el líquido de lavado a la concentración de trabajo a una temperatura entre 18 C y 30 C en una cubeta cerrada. Bajo estas condiciones, el líquido de lavado permanece activo durante 1 mes. NOTA: no utilice los concentrados de la solución de sustrato y del líquido de lavado transcurrida la fecha de caducidad impresa en las etiquetas. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Los reactivos son sólo para uso en diagnóstico in vitro. Sólo para uso profesional. Si desea más información sobre los componentes potencialmente peligrosos, consulte la hoja de datos de seguridad del fabricante y el etiquetado de los productos. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD ATENCIÓN: Este equipo contiene componentes de origen humano. Los sueros humanos utilizados para la fabricación de los reactivos han sido cribados y se han determinado como reactivos o no reactivos para los siguientes marcadores, como se indica en la Tabla 2. Tabla 2 Componente Reactivo para No reactivo para Control negativo Control positivo para el anticuerpo FLUID N/A anti-vhc HBsAg, anti-vih (tipos 1 y 2) y anti-vhc HBsAg, y anti-vih (tipos 1 y 2) Todos los sueros reactivos utilizados se han inactivado antes de su uso para la preparación de los reactivos. Sin embargo, todos los materiales de origen humano se deben considerar potencialmente infecciosos. Maneje este equipo y las muestras del ensayo de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. El diluyente del conjugado y el conjugado reconstituido contienen ProClin 300 al 0,1% que ha sido clasificado según las directivas de la Comunidad Europea (CE) como irritante (Xi). A continuación se indican las frases relativas a los riesgos (R) y medidas de seguridad (S). 11

Xi R43 S24 S35 S37 S46 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. Evítese el contacto con la piel. Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. Úsense guantes adecuados. En caso de ingestión, acuda inmediatamente al médico y muéstrele la etiqueta o el envase. Información para clientes: para aquellos productos que no hayan sido clasificados como peligrosos según la directiva europea 1999/45/EC, la ficha de datos de seguridad está a disposición del usuario profesional. 1. Los materiales potencialmente contaminados se deben desechar según las normativas vigentes. 2. Las salpicaduras de los materiales potencialmente infecciosos se deben eliminar inmediatamente con papel absorbente y se debe limpiar la zona contaminada con, por ejemplo, hipoclorito sódico al 1% antes de seguir con el análisis. 7 El hipoclorito sódico no se debe utilizar para limpiar los ácidos de las salpicaduras, a menos que antes se seque la zona salpicada. Los materiales utilizados para limpiar las salpicaduras, incluidos los guantes, se deben eliminar junto con los desechos potencialmente infecciosos. No esterilice en autoclave los materiales que contengan hipoclorito de sodio. 3. Los ácidos neutralizados y los demás desechos líquidos se deben descontaminar añadiendo un volumen suficiente de hipoclorito de sodio para obtener una concentración final de al menos 1,0%. Puede que sea necesaria una exposición de 30 minutos al hipoclorito de sodio al 1,0% para garantizar una descontaminación efectiva. 4. No pipetee con la boca. Utilice guantes desechables y protección para los ojos cuando maneje las muestras y realice el ensayo. Lávese bien las manos cuando haya terminado. 5. El ácido sulfúrico (necesario para la solución para suspender la reacción) y el ácido clorhídrico (utilizado para lavar los recipientes de vidrio) son corrosivos y se deben manejar con cuidado. Si alguno de estos ácidos entra en contacto con la piel o los ojos, lávese con agua abundante. 6. Si cualquiera de los reactivos entra en contacto con la piel o los ojos, lávese con agua abundante. PRECAUCIONES EN EL ANÁLISIS 1. No utilice los reactivos transcurrida la fecha de caducidad. Se debe evitar la contaminación microbiológica de los reactivos, ya que puede afectar a su rendimiento y producir resultados erróneos. 2. No modifique el Procedimiento del ensayo ni utilice reactivos de otros fabricantes ni de otros lotes, a menos que se indique que el reactivo pueda utilizarse indistintamente. No reduzca el tiempo de incubación recomendado. 3. Antes del uso, deje que los reactivos y las muestras alcancen una temperatura entre 18 C y 30 C. Inmediatamente después del uso, vuelva a almacenar todos los reactivos en las condiciones antes indicadas. 4. Lave, con ácido clorhídrico, 2 mol/l, todos los materiales de vidrio que vaya a utilizar con los reactivos y, a continuación, enjuáguelos con agua destilada o desionizada de primera calidad. 5. Para almacenar los reactivos y las muestras no utilice refrigeradores que se descongelen automáticamente. 6. No exponga los reactivos a la luz intensa ni a vapores de hipoclorito durante el almacenamiento o la incubación. 7. Evite que los pocillos se sequen durante el ensayo. 8. No cause contaminación cruzada en los reactivos. Utilice siempre la misma pipeta para la solución de sustrato de los ensayos Murex. Asimismo, deberá utilizar siempre la misma pipeta (distinta a la del sustrato) para el conjugado. 9. En los ensayos para el anticuerpo frente al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (anti-hbs), el diluyente de muestra de este ensayo puede provocar resultados positivos falsos si se produce contaminación cruzada del reactivo. Si analiza este ensayo con un test anti-hbs en un instrumento de punta fija, asegúrese de que, durante el proceso de validación, queda excluida la posibilidad de que exista contaminación cruzada. 10. No toque ni salpique el borde de los pocillos con el conjugado. No pipetee expulsando aire hacia afuera. Se recomienda, siempre que sea posible, el pipeteo con la técnica inversa. 11. Asegúrese de que el fondo de la placa esté limpio y seco y de que no haya burbujas en la superficie del líquido antes de la lectura de la placa. 12. Evite contaminar los micropocillos con el talco de los guantes desechables. 13. Si utiliza procesadores de microplacas completamente automáticos: i) No es necesario tapar las placas ni secarlas golpéandolas. ii) No permita que los líquidos del sistema procedentes de los procesadores de microplacas automáticos contaminen las muestras o los reactivos. iii) Se debe excluir la posibilidad de contaminación cruzada entre ensayos cuando valide ensayos en procesadores de microplacas automáticos. 14. Asegúrese de que el ensayo se procesa dentro de los límites de temperatura definidos en el protocolo del ensayo. 15. No utilice incubadores de CO 2. 16. Después del uso, no almacene la solución para suspender la reacción en un recipiente con poco fondo ni la devuelva a un frasco de almacenamiento. 17. Se debe excluir la posibilidad de contaminación cruzada entre ensayos cuando valide protocolos de ensayos en el instrumento. RECOGIDA, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS RECOGIDA DE LAS MUESTRAS Con este ensayo se pueden utilizar muestras de suero o plasma recogido en tubos con EDTA o citrato. Asegúrese de que las muestras de suero estén totalmente coaguladas. Elimine las partículas en suspensión mediante centrifugación. Si las muestras se preparan con anticoagulantes líquidos como, por ejemplo, el plasma recogido con citrato, debe tenerse en cuenta el efecto de la dilución. TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Almacene las muestras a una temperatura entre 2 C y 8 C. En aquellas muestras que no se vayan a analizar antes de que transcurran 72 horas desde la recogida, se debe separar el coágulo o el sobrenadante de las muestras y almacenarlas congeladas a una temperatura inferior o igual a 15 C. Evite someter las muestras a 12

múltiples ciclos de congelación y descongelación, ya que basta con someter las muestras que contienen sólo antígeno a aprox. 5 ciclos para reducir la señal hasta un 25%. Tras descongelar las muestras, asegúrese de que estén bien mezcladas antes del análisis. PROCEDIMIENTO MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRA- DOS 1. Solución para suspender la reacción (ácido sulfúrico entre 0,5 mol/l y 2 mol/l). Ejemplo: añada entre 3 ml (para 0,5 mol/l) y 11 ml (para 2,0 mol/l) de ácido sulfúrico concentrado de grado analítico (18,0 mol/l) a aproximadamente 80 ml de agua destilada o desionizada y añada más agua hasta obtener un volumen de 100 ml. De forma alternativa, también se puede utilizar el reactivo siguiente: ácido sulfúrico 1 N (N0164). 2. Agua destilada recién preparada o desionizada de primera calidad, para diluir el líquido de lavado, para preparar la solución para suspender la reacción y utilizarla con los sistemas de lavado automáticos. 3. Micropipetas y micropipetas multicanales para dispensar el volumen adecuado. 4. Incubador capaz de mantener los límites de temperatura definidos en el protocolo del ensayo. 5. Bloque calefactor (5F09-02). Para el uso con los incubadores. El bloque calefactor se debe guardar dentro del incubador utilizado; en caso de que esto no sea posible, se debe colocar en el incubador al menos 4 horas antes de comenzar el análisis. 6. Instrumentos a) Sistema de lavado automático de tiras de las microplacas b) Sistema de lectura de microplacas o c) Procesadores automáticos Antes del uso se deben validar todos los instrumentos. Rogamos que contacte con el representante local si necesita detalles sobre los sistemas recomendados, la programación de los analizadores o los procedimientos de validación. 7. Bateas de reactivo desechables (5F24-01). 8. Hipoclorito de sodio para la descontaminación (Consulte el subapartado Precauciones de seguridad). 9. Solución de hidróxido de sodio (0,1 mol/l) (Consulte el apartado Precauciones en el análisis). PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Antes de realizar el ensayo, lea atentamente el apartado Precauciones en el análisis de estas instrucciones de uso. Asegúrese de que se hayan añadido los diferentes componentes del ensayo a los pocillos comprobando que la placa tenga los colores siguientes: El diluyente de muestra es de color verde. Después de añadir la muestra o el control, el diluyente cambia de color a azul. Aunque el tono varía de muestra a muestra, el cambio siempre debe ser visible. El conjugado reconstituido es de color rojo. La solución de sustrato es, al principio, amarilla y, si las muestras de los pocillos son reactivas, cambia a color azul verdoso. Después de añadir la solución para suspender la reacción, el color azul verdoso de las muestras reactivas cambia a naranja, mientras que el color de las muestras negativas cambia a rosa. Asegúrese de haber añadido la muestra o el reactivo utilizando un lector de microplacas de la manera siguiente: el diluyente de muestra y la muestra se leen a 570 nm ó 620 nm con una longitud de onda de referencia de 690 nm; el conjugado se lee a 490 nm con una referencia de 690 nm y la solución de sustrato a 450 nm (sin referencia). PROCESAMIENTO SEMIAUTOMÁTICO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Utilice sólo el número de pocillos que necesite para el análisis. Prepare el líquido de lavado, reconstituya el conjugado. Añada 50 µl de diluyente de muestra en cada pocillo. Añada 50 µl de muestra o de control a los pocillos. Añada en cada análisis control negativo a los pocillos A1 y B1, control positivo para el anticuerpo al pocillo C1 y el control positivo para el antígeno al pocillo D1. Añada los controles en los pocillos designados después de dispensar las muestras. Si coloca la placa sobre una superficie blanca, le será más fácil añadir la muestra. Tape los pocillos con la tapa e incúbelos durante 60 minutos a una temperatura de 37 C ± 1 C. Terminado el período de incubación, lave la placa de acuerdo con las instrucciones descritas en el apartado Procedimientos de lavado de estas instrucciones de uso. Una vez que haya terminado el lavado, invierta la placa y elimine el líquido de lavado restante golpeando la placa sobre papel absorbente. Añada inmediatamente 120 µl de conjugado en cada pocillo. Tape los pocillos con la tapa e incúbelos durante 60 minutos a una temperatura de 15 C-28 C. Prepare la solución de sustrato. Una vez que se haya terminado la incubación, lave la placa de acuerdo con las instrucciones descritas en el apartado Procedimientos de lavado de estas instrucciones de uso. Una vez que haya terminado el lavado, invierta la placa y elimine el líquido de lavado restante golpeando la placa sobre papel absorbente. Inmediatamente después de lavar la placa, añada 80 µl de solución de sustrato en cada pocillo. Tape los pocillos con la tapa e incúbelos durante 30 minutos a una temperatura de 37 C ± 1 C. Evítese la exposición directa al sol. Añada 50 µl de solución para suspender la reacción. Lea la absorbancia de cada pocillo en los 15 minutos siguientes a 450 nm con una longitud de onda de referencia entre 620 nm y 690 nm (si es posible). Ajuste el blanco del instrumento con aire (no debe haber ninguna placa en el carril). 50 µl 50 µl 60 min 120 µl 60 min 80 µl 30 min 50 µl 450 nm 13

PROCEDIMIENTOS DE LAVADO Su representante local le puede facilitar los protocolos para los sistemas de lavado y los métodos para la verificación de éstos y de los analizadores. Le recomendamos que proceda de la manera siguiente: a. Protocolo para el sistema de lavado de microplacas de tiras automático Efectúe 5 ciclos de lavado con el líquido de lavado a la concentración de trabajo, asegurándose de que: i) El volumen de llenado del lavado sea de 500 µl por pocillo con los instrumentos DiaSorin. Si utiliza otros instrumentos, en los que esto no sea posible, asegúrese de que los pocillos se llenan por completo. ii) La altura de dispensación esté ajustada para llenar cada pocillo sin que el líquido rebose y se obtenga un ligero menisco positivo. iii) El tiempo necesario para completar un ciclo de aspirado/lavado/remojo sea de aproximadamente 30 segundos. iv) Asegúrese de que no queda líquido en el pocillo (realizando un paso de aspirado doble en el ciclo final, siempre que sea posible). v) Una vez realizado el lavado, invierta la placa y golpéela sobre una superficie con papel absorbente para eliminar el líquido de lavado restante. NOTA: evite que los pocillos se sequen durante el ensayo. Después del análisis, se debe enjuagar bien el sistema de lavado con agua destilada para evitar la obstrucción y la corrosión. PROCESADORES DE MICROPLACAS COMPLETA- MENTE AUTOMÁTICOS Póngase en contacto con su representante local para obtener información sobre los protocolos validados actualmente disponibles: 1. No programe tiempos inferiores a los especificados en el procedimiento. 2. Para la primera y segunda incubación, se pueden programar tiempos entre 60 y 70 minutos (65 ± 5 minutos). Para la incubación final, se pueden programar tiempos entre 30 y 35 minutos (32,5 ± 2,5 minutos). 3. Los pocillos que contienen diluyente de muestra se pueden dejar reposar a una temperatura entre 18 C y 30 C hasta 60 minutos antes de comenzar con el 4 del protocolo del ensayo. 4. Asegúrese de que se cumplan los requisitos descritos en el apartado Precauciones en el análisis. Los protocolos que se hayan redactado siguiendo estas pautas se deben validar por completo antes de su uso, de acuerdo con los procedimientos de su laboratorio. RESULTADOS CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Cuando se calculen y se interpreten los resultados del análisis, se debe interpretar cada placa por separado. Para el cálculo y la interpretación de los resultados se puede utilizar el software validado. Control negativo Calcule la absorbancia media de los controles negativos. Si uno de los pocillos del control negativo tiene una absorbancia superior a 0,25, elimine ese valor y calcule el valor del punto de corte a partir de del control negativo restante. Si ambos valores del control negativo son superiores a 0,25, el ensayo no es válido. Valor del punto de corte Calcule el valor del punto de corte sumando 0,2 a la absorbancia media del control negativo. Ejemplo: Absorbancia del control negativo: Pocillo 1 = 0,182 Pocillo 2 = 0,172 (0,182 + 0,172) Media del control negativo = = 0,177 2 Valor del punto de corte = 0,177 + 0,2 = 0,377 CONTROL DE CALIDAD Los resultados de un ensayo son válidos si los controles cumplen los requisitos siguientes: Control negativo La absorbancia media es inferior a 0,25. Controles positivos La absorbancia supera en 0,8 la absorbancia media del control negativo. Los ensayos que no cumplan estos criterios se deben repetir. Si los resultados obtenidos incumplen repetidamente los criterios de control de calidad o el funcionamiento correcto del ensayo, póngase en contacto con el Centro de Asistencia Técnica. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Resultados no reactivos Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores al valor del punto de corte se consideran no reactivas. Resultados reactivos Las muestras cuyos valores de absorbancia sean iguales o superiores al valor del punto de corte se consideran inicialmente reactivas con este ensayo. Si desea más información, consulte el apartado Limitaciones del procedimiento en estas instrucciones de uso. Estas muestras se deben volver a analizar por duplicado utilizando más muestra de la misma extracción original, siempre y cuando los procedimientos de su laboratorio no estipulen lo contrario. Las muestras que sean reactivas en al menos uno de los reanálisis son reactivas para VHC. Estas muestras se deben analizar con otros ensayos adicionales y los resultados se deben evaluar con otros datos. Las muestras no reactivas en ambos pocillos en el reanálisis se deben considerar como no reactivas con este ensayo. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL FUNCIONA- MIENTO Se determinó el funcionamiento del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination analizando muestras de pacientes con hepatitis aguda e infección crónica por el virus de la hepatitis C, pacientes con infecciones no relacionadas con el virus de la hepatitis C y muestras de donantes de sangre habituales. Sensibilidad diagnóstica Asimismo, se analizó con el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination un total de 509 muestras de pacientes con infecciones por VHC confirmadas y todas resultaron reactivas. La sensibilidad diagnóstica del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination para estas muestras fue del 100% (509/509), con un límite inferior de 99,28% para el intervalo de confianza del 95%, según una distribución binomial. El rendimiento del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination se analizó para mostrar su eficacia en la detección de la infección por VHC en su fase inicial comparada con los análisis de sólo anticuerpos. Para 14

ello se utilizaron 30 paneles de seroconversión comercialmente disponibles con 265 muestras en total. En estos estudios, el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination detectó 196 muestras positivas mientras que un análisis para el anticuerpo anti-vhc, bien establecido en el mercado, detectó 94 muestras positivas. Expresado como tiempo transcurrido hasta la primera detección, resulta que el ensayo Murex HCV Ag/ Ab Combination detecta positividad una media de 20,57 días antes que el análisis de sólo anticuerpos, con un intervalo de 0 a 72 días antes. En este último estudio, 10 de los 30 paneles de seroconversión incluían muestras iniciales que fueron negativas con análisis de detección de ácidos nucleicos y con análisis serológicos. El rendimiento del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination en estos 10 paneles de seroconversión mostró que el ensayo detectó la infección una media de 33,2 días antes que el análisis de anticuerpos anti-vhc y sólo una media de 1,0 días después que el análisis de detección por técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Panel Subtipo Detectado al primer día RNA del VHC Retraso en días con respecto a la extracción positiva del RNA del VHC Anticuerpo del VHC Murex Ag/Ab BCP6211 1a 140 42 0 BCP6213 1a 11 32 7 BCP6222 1a 17 23 0 BCP6225 1a 45 35 0 BCP6227 1a 42 32 0 BCP9041 1a 24 37 0 PHV917 2b 13 72 0 BCP9054 3a 56 3 0 BCP9055 NC 31 34 3 PHV901 1a 65 32 0 Media: 34,2 1,0 Especificidad diagnóstica El ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination se ha diseñado para que cumpla los requisitos de la directiva de especificaciones técnicas comunes (2002/364/EC) de tener una especificidad > 99,5% en las muestras de donantes de sangre. Este requisito se superó en ensayos en la práctica realizados en los principales bancos de sangre. En dos bancos de sangre se cribaron 8292 muestras de donantes de sangre habituales. En el estudio, el 99,82% (8277/8292) de las muestras fueron no reactivas con un límite inferior de 99,70% para el intervalo de confianza del 95% según una distribución binomial*. Un total de 15/8292 muestras supuestamente negativas fueron repetidamente reactivas con el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination (0,18%). Dos muestras fueron positivas con el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination y por PCR pero negativas con el análisis de anticuerpos anti-vhc. Asimismo se analizaron 376 muestras de pacientes con posible reactividad cruzada con muestras de pacientes con infecciones no relacionadas con el virus de la hepatitis C. Se incluyeron muestras de mujeres embarazadas, de pacientes con enfermedades autoinmunitarias y otras infecciones víricas agudas. Una de las muestras fue reactiva con el ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination con una especificidad diagnóstica de 99,73%*, con un límite inferior de 98,53% para el intervalo de confianza del 95%, para esta población en particular. Una muestra que fue positiva con Murex HCV Ag/Ab Combination y con el análisis de PCR, pero negativa con el ensayo de anticuerpos del VHC, se excluyó al considerarla verdaderamente positiva. * Estos datos son orientativos de lo obtenido en los estudios. Los resultados obtenidos en otros laboratorios podrían ser distintos. Reproducibilidad del ensayo La reproducibilidad del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination se estimó analizando un panel de 5 muestras en replicados de 10 en 4 ocasiones distintas. En la Tabla 3 y la Tabla 4 se resumen los resultados del análisis. Muestra Tabla 3 Ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination Reproducibilidad del ensayo Lote 1 Nº de ensayos Nº de replicados Absorbancia media Intraserial CV % Interserial CV % Ab Positivo 4 10 1,558 8,9 15,6 QC1 (Antígeno) 4 10 1,655 3,1 6,1 QC2 (Negativo) 4 10 0,118 4,8 5,0 QC3 (core) 4 10 1,152 5,1 7,2 QC4 (NS3) 4 10 0,874 4,0 8,1 Muestra Ab Positivo QC1 (Antígeno) QC2 (Negativo) QC3 (core) QC4 (NS3) Tabla 4 Ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination Reproducibilidad del ensayo Lote 2 Nº de ensayos Nº de replicados Absorbancia media Intraserial CV % Interserial CV % 4 10 1,731 7,8 10,1 4 10 1,114 4,1 10,2 4 10 0,084 4,8 4,9 4 10 1,398 4,2 6,0 4 10 0,938 7,9 10,3 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. Se deben seguir exactamente las instrucciones indicadas en los apartados Procedimiento del ensayo e Interpretación de los resultados de estas instrucciones de uso. 2. Este ensayo sólo ha sido evaluado para su uso con muestras (sin mezclar con otras) de suero o de plasma recogido con EDTA o citrato. No se ha validado el uso del ensayo Murex HCV Ag/Ab Combination para otros fines. 3. Un resultado negativo con un ensayo para la detección de anticuerpos/antígenos no excluye la posibilidad de una infección. 4. Se pueden obtener resultados reactivos no repetibles con cualquier enzimoinmunoanálisis. 15

5. Las causas más habituales de error son: a) La muestra, el conjugado o el sustrato no se han añadido en los pocillos de manera adecuada. b) El sustrato se ha contaminado con el conjugado. c) Contaminación con conjugados de otros ensayos. d) Las sondas del sistema de lavado están total o parcialmente obstruidas. e) El líquido de lavado no se ha aspirado totalmente y queda líquido en los pocillos. f) El fondo de los pocillos no está limpio y seco y hay burbujas en la superficie del líquido antes de la lectura de las placas. g) La lectura no se ha realizado con la longitud de onda adecuada o se ha utilizado una longitud de onda de referencia incorrecta. 6. Las muestras intensamente hemolizadas, el suero coagulado parcialmente, las muestras de plasma que contengan fibrina o las muestras con contaminación microbiana pueden dar resultados erróneos. 7. Este ensayo no se ha validado para su uso con muestras de cadáveres. Nipasept, Bronidox y ProClin no son marcas comerciales DiaSorin. 16

REFERENCES 1. Choo, Q.L., Weiner, A.J., Overby, L.R., Kuo, G., Houghton, M. (1990). Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-a, non-b hepatitis. Br. Med. Bull., 46, 423-411. 2. Miller, R.H., Purcell, R.H. (1991). Hepatitis C shares amino acid sequence similarities with pestiviruses and flaviviruses as well as two plant virus supergroups. Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 2057. 3. Weiner, A.J., Brauer, M.J. et al. (1990). Variable and hypervariable domains are found in the regions of HCV corresponding to the flavivirus envelope glycoproteins. Virology, 180, 842. 4. Jove, J., Sanchez-Tapias, J.M. et al. (1990). Post transfusional vs sporadic non-a, non-b chronic hepatitis. A clinicopathological and evolutive study. Liver, 8, 42. 5. Hopf, U., Möller, B. et al. (1990). Long term follow up of post transfusion and sporadic chronic hepatitis non-a, non-b and frequency of circulating antibodies to hepatitis C virus (HCV). Hepatology, 10, 69. 6. Couroucé, A.M., Le Marrec, N., Bouchardeau, F., Razer, A., Maniez, M., Laperche, S., Simon, N. (2000). Efficacy of HCV core antigen detection during the preseroconversion period. Transfusion, 40, 1198-1202. 7. Centres for Disease Control (1985). Recommendations for preventing transmission of infection with human T-lymphotropic virus type III / lymphadenopathy-associated virus in the workplace. MMWR, 34, No. 45, 681. DiaSorin South Africa (Pty) Ltd. Kyalami Boulevard, Kyalami Business Park, Kyalami, Republic of South Africa C05DS4J24GB, October 2009 HCV-combo-rf.fm 4J24-01/-02