1. Introducción. MICROPROPAGACIÓN La microspropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo in vitro. El cultivo es una herramienta para el mejoramiento ya que se producen plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales, esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a estímulos adecuados. Así las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que reciban. Esta regeneración ocurre en fases consecutivas: - Fase de desdiferenciación, donde las células se vuelven competentes para responder a cualquier estímulo organogenético o embriogenético. - Fase de inducción, donde las células se determinan para formar un órgano o un embrión. - Fase de realización. Donde se forma el órgano o embrión propiamente dicho. Estas fases están directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo. Así en general puede decirse que el proceso de desdiferenciación generalmente es promovido por una auxina, la de inducción por un balance hormonal específico del órgano que va a formarse y la de realización por una disminución de la concentración hormonal en el medio de cultivo. 2. Etapas de la micropropagación 2a. Etapa 0. Preparación del material vegetal. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son 1. El tipo de órgano que sirve como explanto
2. La edad ontogenética y fisiológica del mismo. Los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos de materiales adultos. 3. La estación en la que se colecta el material. Se recomienda la recolección durante la estación estival o primaveral, cuando existe una brotación activa de las yemas, el uso de yemas en dormición ocasiona problemas de contaminación. 4. El tamaño. 5. El estado sanitario general de la planta donante. Es recomendable hacer crecer las plantas donantes en invernaderos con el fin de controlar el estado sanitario. 2b. Etapa 1. Establecimiento del cultivo El objeto de esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito depende de: - La edad de la planta donante - La edad fisiológica - El estado del desarrollo - Tamaño del explanto Los materiales que muestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbáceas y tejido meristemáticos que como el cambium determinan el crecimiento en grosor de las plantas leñosas. Las yemas adventicias (yemas formadas de novo) tienen una mayor tasa de variación somaclonal en cultivo. Para asegurar las condiciones de esterilidad del cultivo se pueden hacer a priori análisis que detecten patógenos (ELISA, PCR). En el momento de manejar el explante se procede a la desinfección del mismo (etanol, hipoclorito de Na). Una vez establecido el cultivo, la aparición de hongos y bacterias puede hacer necesario la utilización de fungicidas y antibióticos. 2c. Etapa 2. Multiplicación El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.) En esta etapa es conveniente evitar la formación de callo para evitar la variación somaclonal. En esta etapa los medios de cultivo, los reguladores del crecimiento como auxinas, giberelinas y citoquininas y las condiciones de crecimiento juegan un papel muy importante sobre la multiplicación clonal de los explantos. Existen dos vías de regeneración, ambas pueden darse directa o indirectamente a través de la formación de callo: - Organogénesis. Mediante la inducción de yemas axilares o adventicias. - Embriogénesis
La embriogénesis somática es una vía más conveniente porqué permite saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento, regenerando plantas de una forma más rápida y eficiente, disminuyendo además el riesgo de variación somaclonal y además disminuye costos para su implementación a escala comercial. Los principales problemas de esta etapa son la vitrificación y la acumulación de compuestos fenólicos. Las condiciones culturales en las que crece el explanto son el resultado de la interacción de tres factores: - El estado del explanto o material vegetal (determinado en parte por el medio de cultivo) - El recipiente de cultivo - Condiciones del cuarto de cultivo La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo cambia con: - El número de subcultivos - El tipo de explanto subcultivado - Método de repique. Por esto mismo el medio de cultivo debe optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de multiplicación vegetativa. Comúnmente se usa como medio basal el MS complejo (Murashige and Skool, 1962) suplementado con un 30% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan auxinas y citoquininas. La etapa de multiplicación comprende dos periodos - Fase de inducción. Implica el empleo de altas concentraciones de reguladores del crecimiento (generalmente de auxinas más que de citoquininas), para favorecer la desdiferenciación - Fase de multiplicación propiamente dicha. Requiere un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular(en este caso el sistema es más dependiente de citoquininas). 2d. Etapa 3. Enraizamiento y aclimatación En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias más fácilmente en las herbáceas que en las leñosas dada su limitada capacidad rizogénica. Puede realizarse el enraizamiento in vitro o ex vitro. In vitro: -Sustrato: medio solidificado con agar, perlita o vermiculita humedecidos en medio nutrtivo o H 2 O - Auxinas: promueven rizogénesis a concentraciones elevadas. La más utilizada es el IBA (ácido 3-indolbutírico) a concentraciones de 1-10 μm unas pocas horas (altas concentraciones de auxinas pueden inducir la formación de callo por lo que para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizogénesis). Posteriormente se transfieren los vástagos a un medio sin reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las raíces. Aproximadamente a los
20 días se observan una cantidad adecuada de raíces funcionales que permiten que se continúe con la etapa de aclimatación. Ex vitro: Permite enraizamiento y aclimatación simultaneamente. Sin embargo el estrés debido a la evapotranspiración acelerada de las plantas en las primeras etapas de l transplante pueden reducir mucho se supervivencia. Se utilizan distintos sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos que convienen que estén esterilizados. La aclimatación debe llevarse a cabo en invernaderos o cámaras con temperatura y humedad relativa moderadas.
Cultivo in vitro Definición Cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos, debido a la propiedad de totipotencia de las células vegetales. ETAPAS DEL CULTIVO IN VITRO 1. ELECCIÓN DEL EXPLANTE 2. PREPARACIÓN MEDIO DE CULTIVO 3. DESINFECCIÓN EXPLANTE, MEDIO Y MATERIALES 4. CULTIVO DEL EXPLANTE EN SU MEDIO EN CONDICIONES DE ASÉPSIA 5. DESARROLLO DEL CULTIVO EN CÁMARA EN CONDICIONES DETERMINADAS 1. Preparación del medio de cultivo. Los alumnos prepararán medio ACM de enraizamiento, siguiendo el protocolo facilitado y a partir de soluciones madres ya constituidas. Una vez preparado lo distribuirán en vasos de cultivo que serán precintados y envueltos en papel para su siguiente esterilización. 2. Cultivo del explante en su medio - Cultivo de ajo en un medio MS + 2,4, D con el fin de obtener callo para saneamiento vegetal - Germinación de semillas de Jatropha en un medio MS 50% sales. - Medio ACM de proliferación. Para chopo. - Medio ACM de enraizamiento. Para chopo. - Medio MS de proliferación donde se cultivará Paulonia.