PRÁCTICAS DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL Cuaderno del alumno Universidad Rey Juan Carlos. Escuela Superior de Ciencias Experimentales y Tecnología.
Prácticas de Genética y BTA Prácticas de Genética y Biotecnología Ambiental. 3 er Curso de CC. Ambientales. NORMAS GENERALES 1. El uso de la bata es obligatorio. 2. Está absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio. 3. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca. 4. Leer cuidadosamente el guión que corresponda antes del comienzo de cada práctica. 5. Las prácticas serán evaluadas mediante examen al final de las mismas. 6. Mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las prácticas, y una vez acabadas limpiarlo completamente. - 1 -
PROGRAMA A DESARROLLAR Sesión I. -Introducción a las técnicas bioquímicas y microbiológicas utilizadas en estas prácticas. -Transformación de bacterias de E. coli con DNA plasmídico y siembra en un medio sólido selectivo (Protocolo 1). Sesión II. -Comprobación de la aparición de colonias de bacterias resistentes en la placa de antibiótico (eficacia de la transformación). Siembra de una colonia en medio líquido selectivo. -Mutagénesis producida por irradiación ultravioleta. El sistema de reparación del ADN (Protocolo 2). Sesión III. -Seguimiento del efecto de la irradiación con UV de las placas de colonia de bacterias mutantes carentes del sistema de reparación de ADN, y de bacterias de una cepa salvaje. -Purificación del ADN plasmídico contenido en las bacterias transformadas (Protocolo 3). Sesión IV. -Incubación del plásmido obtenido con enzimas de restricción (Protocolo 4). -Separación del plásmido en forma de ADN circular, o cortado con enzimas de restricción, mediante electroforesis en gel de agarosa (Protocolo 5). -Discusión general sobre los resultados obtenidos a lo largo de las prácticas. 2
SESION I. TRANSFORMACION DE BACTERIAS CON DNA PLASMIDICO Y SELECCION DE CLONES QUE HAN INCORPORADO EL PLASMIDO RECOMBINANTE. Introducción. El proceso por el cual un vector plasmídico es introducido y mantenido de forma estable en una bacteria se denomina transformación. En la bacteria Escherichia coli este proceso no ocurre de forma natural y ha de inducirse en el laboratorio. Para facilitar este proceso, se tratan las bacterias con calcio incubando en frío (a unos 4º C) lo cual estimula la apertura de poros que facilitan la entrada de DNA exógeno. A estas bacterias susceptibles de incorporar DNA exógeno las denominamos bacterias competentes. El vector plasmídico que usaremos en el ensayo de transformación será el plámido pbluescript (denominado de forma abreviada pbl). La introducción de DNA exógeno en las bacterias competentes es un proceso muy ineficaz, y por ello es necesario utilizar un método que nos permita identificar al reducido número de bacterias que han incorporado y mantenido de forma estable el plásmido con el que las hemos transformado. Con este objetivo a los plásmidos se les ha dotado de un sistema de selección, que en el caso de pbl consiste en un gen de resistencia a ampicilina. Este gen confiere a las bacterias transformadas con el plásmido un fenotipo fácilmente diferenciable: sólo las bacterias que han incorporado 3
el plásmido serán capaces de crecer en presencia del antibiótico ampicilina cuando son sembradas en una placa petri conteniendo medio de cultivo con el mencionado antibiótico. Figura 1. Esquema del vector plasmídico p Bluescript II sk (-) donde aparecen indicados su origen de replicación (puc ori), el gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina (ampicillin), el origen de replicación del bacteriófago filamentoso f1 (f1 (-) ori) el promotor del gen lac (P lac), el gen lacz que codigica para la b-galactosidasa (lacz) Y el sitio de clonaje múltiple (MCS), que aparece descrito con mayor detalle debajo del esquema del vector. 4
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. A) MEDIOS Y SOLUCIONES Medio de cultivo LB: Extracto de levadura, 5 g; Bactotriptona, 10 g; ClNa, 10 g; H2O hasta 1 l; NaOH, ajustar a ph 6,1 Buffer de transformación y almacenamiento (TSB): medio de cultivo LB a ph 6.1, conteniendo un 10% de polietilen glicol (PEG), 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 20 mm de Mg++ (10 mm de MgCl 2 +10 mm de MgSO 4 ). Buffer TSB-glucosa: Buffer TSB conteniendo glucosa 20 mm Tris-EDTA (TE): Tris (base) 10 mm; EDTA-Na2, 1 mm; ClH, ajustar a ph 8,0. Tampón de muestras: glicerol 80 ml, 27 %; azul de bromofenol 0,25 g, 0,08 %; H2O hasta 300 ml. Tampón de electroforesis Tris-Borato-EDTA o (TBE): Tris base 10,8 g; ácido bórico 5,5 g; EDTA 0,5 M ph 8.0, 4 ml; H2O hasta 1 litro. B) PRECAUCIONES GENERALES Manipulación de material y soluciones estériles: Las asas de siembra, las puntas de micropipeta, las placas de agar, las soluciones de IPTG y X- Gal, y el medio de cultivo LB deben mantenerse estériles. Mantener abiertos los tubos y placas solo el tiempo mínimo imprescindible. No tocar con los dedos ni con ningún otro material presuntamente contaminado (mesa, etc.) las puntas de micropipeta. Manipulación de bacterias competentes: El tubo que contiene las bacterias competentes debe mantenerse en hielo en todo momento, excepto para el choque térmico a 42 C y la incubación a 37 C. Las bacterias competentes tienen una resistencia mecánica menor que las normales: no agitar con fuerza. Manipulación de compuestos químicos: El Bromuro de Etidio es una sustancia mutagénica, por lo que es absolutamente imprescindible el utilizar guantes cuando se hagan los geles de agarosa. No tocar nunca los geles directamente con las manos sin proteger. 5
PROTOCOLO 1. Transformación de bacterias competentes con DNA de plásmidos. 1. Marcar una identificacion del grupo de trabajo en el tubo de bacterias competentes. 2. Pipetear 2 µl (25 ng) de la solución de DNA plasmídico con micropipeta de 20 µl en el tubo de las bacterias competentes. Mezclar lentamente y con cuidado (las bacterias competentes son muy frágiles). Poner el tubo en hielo durante 15 minutos. 3. Marcar la placa de LB/agar + ampicilina con identificación del grupo, el día de la semana y la fecha. 4. Transcurridos los 15 minutos de incubación en hielo, poner el tubo de bacterias competentes en un baño de agua a 42 C durante 2 minutos. 5. Introducir inmediatamente el tubo con bacterias competentes en el recipiente que contiene el hielo. 6. Pipetear 900 µl de buffer TSB-glucosa -precalentado a 37 C- con una micropipeta de 1 ml y añadir los 900 µl al tubo de bacterias transformadas. Cerrar el tubo y mezclar invirtiéndolo con cuidado. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 C durante 30 minutos. 7. Sumergir el asa de siembra en etanol y secar al aire. Mezclar por inversión el cultivo contenido en el tubo de bacterias competentes (las bacterias E. coli no son móviles y tienden a sedimentar en cultivos no mantenidos en agitación). 8. Pipetear 100 µl del cultivo sobre la superficie de agar de la placa de LB/agar + ampicilina. Con el asa de siembra, extender los 100 µl sobre toda la superficie de agar. 9. Poner la placa boca abajo en la estufa incubadora a 37 C. Las placas se dejarán incubando a 37 C durante toda la noche. Al día siguiente se comprueba si en la placa han crecido colonias. Si la siembra de las bacterias sobre la superficie de la placa se realizó el día anterior de manera homogénea, las colonias crecidas mostrarán una distribución uniforme sobre toda la superficie de la placa. 6
Sesión I: Observaciones y comentarios. 7
SESION II ACCION MUTAGENICA DE LA RADIACION ULTRAVIOLETA. La acción mutagénica de la radiación utltravioleta se debe a que este agente físico induce la formación de dímeros de timina en la secuencia del ADN. Los organismos disponen de mecanismos de reparación del ADN, que eliminan tales dímeros e impiden que este fenómeno produzca graves alteraciones en la estructura y función del ADN. Sin embargo es éste actualmente un tema de gran interés ambiental, por cuanto es sabido que la capa de ozono que rodea la Tierra ha disminuido, provocando un aumento en la magnitud de la radiación UV que alcanza la superficie terrestre; paralelamente, se ha observado un aumento en la incidencia de cánceres de piel y de ojo. -BACTERIAS SENSIBLES A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA. En esta práctica se trata de analizar la sensibilidad de diferentes cepas de la bacteria Escherichia coli a la luz UV. Disponemos de dos cepas de tipo silvestre (E. coli OV2 y E. coli MC1061) que posee los mecanismos normales de reparación de DNA de esta bacteria y que es, por ello, resistentes a la acción de la luz ultravioleta. Además, disponemos de cepas derivada de las anteriores (E. coli OV2 reca Tn10 y E. coli MC1061 reca Tn10) en la que una mutación producida por inserción de un transposón Tn10 ha inutilizado el gen reca. Dado que este gen está involucrado en uno de los mecanismos principales de reparación de lesiones del ADN producidas por UV, las bacterias mutantes tienen una sensibilidad a UV extremadamente alta, que les impide sobrevivir tras exponerlas a dosis moderadas de radiación UV. 8
PROTOCOLO 2. 1. Cada grupo de trabajo recibirá cuatro placas de Petri, sobre cuya superficie se sembrarán -en dos áreas perfectamente delimitadas- un inóculo de bacterias OV2 y MC1061, y de bacterias OV2 reca Tn 10 y MC1061 reca Tn10, que se han mantenido en oscuridad. 2. Las bacterias sembradas en las placas de cultivo se iluminan con luz UV en un transiluminador aplicando diferentes dosis de radiación (0,001-0,005 Julios/ cm). 3. Se depositan todas las placas del paso anterior en el incubador a 37º C, y se mantienen hasta el dia siguiente, en que se analizarán los resultados Sesión II: Condiciones experimentales empleadas por el grupo de trabajo. 9
Sesión II: Aspecto de las colonias obtenidas en las placas petri irradiadas con luz U.V. 0.001 J/Cm 2 0.005 J/Cm 2 OV2 y OV2 reca Tn 10, 0.001 J/Cm 2 0.005 J/Cm 2 MC1061 y MC1061 reca Tn10 10
SESION III PURIFICACION DE DNA PLASMIDICO. Se inoculará en medio líquido una colonia (bacterias descendientes de una única célula inicial) en medio líquido de crecimiento. El DNA plasmídico se replica utilizando la maquinaria de la bacteria y el origen de replicación del plásmido (ORI). El número de copias de plásmido por bacteria puede llegar a ser muy elevado. A partir de estos cultivos líquidos de bacterias provenientes de una única bacteria portadora del plásmido recombinante, se obtiene el DNA plasmídico utilizando el protocolo 3, que nos permitirá separarlo del DNA bacteriano. PROTOCOLO 3. Minipreparación de DNA plasmídico. 1. Marcar un tubo de minicentrífuga para identificar el grupo de trabajo. 2. Pipetear 1,5 ml del cultivo en un tubo de minicentrífuga (tres veces 500 µl). 3. Centrifugar durante 1 min. en una minicentrífuga. 4. Extraer el sobrenadante con una pipeta "Pasteur", procurando dejar las bacterias lo más secas posibles. 5. Poner el tubo en hielo. 6. Pipetear 250 µl de disolución de resuspensión (contiene tampón/rnasa) que se encuentra en el frasco de tapón blanco. Resuspender las bacterias agitándolas hasta que la suspensión sea totalmente homogénea. 7. Pipetear 250 µl de disolución de lisis (en el frasco de tapón rojo) sobre la suspensión de bacterias, mezclando con suavidad por inversión del 11
tubo 3-6 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Transcurrido ese tiempo, la solución se vuelve viscosa y clara. 8. Añadir 350 µl de solución tampón de fijación (o binding buffer contenido en el frasco de tapón verde), previamente enfriado en hielo. Mezclar suavemente por inversión del tubo unas 3-6 veces. Incubr los tubos durante 5 min. en hielo. Aparecen flóculos en la solución, con tendencia a precipitar en el fondo del tubo 9. Centrifugar 10 min en la minicentrífuga a aprox. 14.000 rpm. 10. Introducir un filtro High Pure en un tubo colector. Depositar el sobrenadante obtenido tras la centrifugación del paso anterior en la cámara superior del filtro High Pure. Centrifugar de nuevo a 14.000 rpm durante 30-60 seg. 11. Separar el filtro del tubo colector y descartar el líquido recogido en éste. Colocar de nuevo el filtro sobre el tubo colector y añadir 700 µl de líquido de lavado (frasco de tapón azul) y centrifugar a 14.000 rpm durante 30-60 seg. 12. Separar el filtro del tubo colector y descartar el líquido recogido en éste. Colocar de nuevo el filtro sobre el tubo colector y centrifugar a 14.000 rpm durante 30-60 seg. Para eliminar posibles restos de la solución de lavado. 13. Descartar el líquido recogido y el propio tubo colector, que es sustituído por un tubo Eppendorf limpio de 1,5 ml. Añadir 100 µl de tampón de elución (frasco de tapón no coloreado) y centrifugar a 14.000 rpm durante 30-60 seg. 14. El tubo de 1,5 ml contiene ahora el plásmido eluído. 12
Sesión III: Observaciones y comentarios. 13
SESION IV ANALISIS DE RESTRICCION. Se digerirá el plásmido purificado con la endonucleasa de restricción Eco RI, según el Protocolo 4. Los fragmentos obtenidos se separarán por electroforesis en gel de agarosa (Protocolo 5). Se discutirán los resultados obtenidos por cada grupo y se identificarán las diferentes movilidades que muestran los plásmidos intactos, o los que han sido cortados por el enzima de restricción. PROTOCOLO 4. Incubación de DNA con Eco RI. 1. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml se pipetean sucesivamente los siguientes componentes de la reacción: DNA de plásmido eluído 10 µl Buffer de restricción 3 µl Endonucleasa Eco RI (Roche) 5 unidades Agua desionizada 27 µl 2. Se incuba a 37º C durante un mínimo de 2 horas. Mientras se incuba la reacción, se procede a preparar un gel de agarosa al 1% (en peso/volumen) en el que cargaremos las reacciones al finalizar la incubación para resolver mediante electroforesis los fragmentos de ADN obtenidos. 14
Electroforesis del ADN del plámido en geles de agarosa. Polímero de agarosa Estados sólido-líquido Aparatos utilizados (Cubeta, fuente, transiluminador) 15
Protocolo 5. 1. Se toman 20 µl de cada una de las muestras de DNA que se vayan a analizar y se depositan en tubos separados. A cada tubo se le añade ahora 2 µl de solución de muestra para electroforesis y se mezcla bien. 2. Cada muestra se deposita en un pocillo independiente del gel de agarosa, sumergido en el tampón de electroforesis. Además, se incluye una muestra del DNA marcador (mezcla de fragmentos de DNA de peso molecular conocido) para poder calibrar el tamaño de los DNA detectados. 3. Se aplica una corriente de voltaje constante de 100 voltios y se mantiene hasta que el colorante llegue al final del recorrido del gel. 4. Como el gel de electroforesis contiene bromuro de etidio, que es un agente intercalante de DNA, las moléculas de DNA pueden visualizarse mediante irradiación del gel con luz ultravioleta, utilizando un transiluminador adecuado. Sesión IV: Observaciones y comentarios. 16