Identificación de proteínas reguladas por la simbiosis micorrízica arbuscular en tomate No. de Proyecto: 20060436 Dr. Sergio Medina Godoy CIIDIR-UNIDAD SINALOA Resumen La simbiosis micorrízica arbuscular en tomate ha tomado gran relevancia por el papel bioprotector que obtiene la planta contra factores abióticos y bióticos. Aun cuando la interacción se lleva a cabo en raíces, el tejido foliar es también afectado. Por lo anterior se planteó el objetivo de dilucidar aquellas proteínas que están siendo afectadas por la asociación micorrizica en plantas de tomate con el hongo Glomus intraradicen. Como primer objetivo se evaluaron tres variedades de tomate: Missouri, Gavilán y Micro- Tom, siendo las dos primeras las que presentaron un mayor y uniforme porcentaje de micorrización (mayor del 80%), mientras que en el caso de las plantas de Micro-Tom, se obtuvieron resultados variables. El segundo objetivo fue el establecer las condiciones óptimas de separación electroforética en dos dimensiones. Se evaluaron dos métodos siendo el mas eficiente el propuesto por Hurkman y Tanaka 1986, con modificaciones, y las proteínas se separaron de una manera mas eficiente en un gradiente de 4 a 7. En resumen se logró determinar que variedades de tomate presenta una mejor micorrización, así como el método de extracción para tener proteínas de tomate resueltas de manera adecuada para electroforesis bidimensional. Introducción Este trabajo está enfocado en la identificación de proteínas reguladas en la simbiosis micorrízica arbuscular en tomate, sobre todo en la parte aérea de la planta, en la cuál también se suceden efectos derivados de la simbiosis, los cuales se están tratando de clarificar con este estudio, generando un listado de proteínas con efectos en el metabolismo de las plantas. El tomate como cultivo tiene gran importancia económica mundial y regional, que constituye también un buen modelo de estudio que se han utilizado para entender los mecanismos moleculares por los cuales se establece la relación hongo-planta.
El término micorriza, fue utilizado por primera vez en 1885, para describir la asociación simbiótica entre raíces de las plantas y los hongos del suelo. La palabra micorriza tiene raíces griegas y literalmente significa raíz fúngica (Munyanziza y col., 1997). Las micorrizas son asociaciones mutualistas altamente evolucionadas que están formadas por hongos formadores de micorriza, raíces de las plantas y su interacción con el suelo, el cual participará en la interacción dependiendo de sus características físicas, químicas y biológicas. Entre las herramientas que se han empleado para el entendimiento de las interacciones planta-hongo, se encuentra la proteómica. Esta técnica se basa en la comparación del perfil de proteínas para determinar que proteínas están siendo afectadas por la interacción y su subsiguiente identificación mediante técnicas de espectrometría de masas. La proteómica y otras estrategias han sido empleadas para dilucidar los cambios que existen principalmente en raíces de planas micorrizadas, pero existen distintos reportes en la bibliografía que indican que en las hojas también se observan modificaciones en la expresión genética. Es por lo anterior que el presente proyecto tiene como objetivo determinar cuales son los cambios a nivel de expresión de proteínas que se observan en plantas micorrizadas en hojas (tejido aéreo) de plantas de tomate. El entendimiento de estos fenómenos podrá dar mas elementos para interpretar fenómenos como resistencia a patógenos foliares, resistencia a estreses bióticos y abióticos atribuidos a la micorrización de las plantas. Hipótesis: La simbiosis micorrízica arbuscular produce cambios diferenciales en la expresión de proteínas en las partes aéreas de la planta de tomate. Objetivo General Identificar proteínas expresadas diferencialmente en la parte aérea de plantas de tomate micorrizadas. Objetivos específicos: 1. Generar plantas micorrizadas. 2. Extraer proteínas de plantas micorrizadas y no micorrizadas. 3. Determinar el rango de ph y peso molecular en el que se observa mayor variabilidad. 4. Realizar análisis cualitativos para la determinación de proteínas. 5. Identificar proteínas seleccionadas. Estrategia general Métodos y Materiales
Establecimiento de un sistema de micorrización Extracción de proteínas Electroforesis unidimensional Electroforesis bidimensional Comparación de geles Figura. 1. Estrategia general para la identificación de proteínas reguladas en la simbiosis micorrizica arbuscular en las partes aéreas de las plantas de tomate.
Materiales. Químicos Los reactivos químicos en general se obtuvieron de Sigma (San Louis, MO, EUA), Merck (Whitehouse Station, NY, EUA), Biorad (Hercules, CA, EUA), los marcadores de peso molecular fueron obtenidos de Biorad (Hercules, CA, EUA), algunos otros reactivos se conseguieron de Invitrogen (México, D.F., México). 6.2.2. Material vegetal y hongos Las semillas que se emplearon para evaluar el establecimiento de tomate micorrizados fueron: Micro-tomate (Lycopersicum esculentum cv. Micro-Tom) se obtuvo de la marca Tomato Growers Supply Company; Missuouri y Gavilán, estas dos variedades se obtuvieron de agricultores de la región. Y el inoculo utilizado en este estudio Glomus intraradices que fue donado por el Dr. Maldonado del CIIDIR-IPN unidad Sinaloa. Métodos Establecimiento de la simbiosis micorrízica Preparación de sustrato. El sustrato se formó con 75% de vermiculita estéril y 25 % de arena fina libre de materia orgánica, formando una mezcla 3:1 de vermiculita: arena lavada, procurar que la mezcla sea homogénea. Establecimiento del sistema de micorrización. Para establecer el sistema de micorrización se germinaron plantas de tomate de las distintas variedades (Micro-Tom; Missouri y Gavilán), una vez germinada la planta y que tengan hojas verdaderas, se puede proceder a inocular con las esporas del hongo, en este caso Glomus intraradices. Inoculación con Glomus intraradices El procedimiento que se seguió para el aislamiento de esporas a partir de agar fué el método de (Doner y Bécard, 1991), ya que Glomus intraradices fué mantenido en cultivo in vitro con raíces de zanahoria. En el cuál, primero se selecciona la parte de la placa a utilizar, después con unas pinzas muy finas, se extraen las raíces, luego se muele el medio de cultivo, con micelio y esporas con cantidades iguales de citrato de sodio 10
mm, después se pasan por varios tamices hasta quedarse con las esporas únicamente, se suspenden en 10 ml de agua destilada y se procede a cuantificar las esporas. Las plantas se inocularon a partir del momento en que las plántulas presenten hojas verdaderas con el hongo micorrízico estas se transplantaron, a macetas conteniendo 0.250 Kg de sustrato con 1 ml de esporas conteniendo 700 esporas aproximadamente por planta/maceta. El mismo se regará hasta capacidad de campo y 24 horas después se aplicó el inóculo. De esta manera se evita que las esporas sean arrastradas hasta el fondo de la maceta por efecto del agua de riego. Para compensar las pérdidas por evapotranspiración las plantas se regaron con agua, según lo requerido, en los subsiguientes días después del transplante, se aplicará por vía foliar un complemento de Fosfato (P) vía solución Hoaglans, el cuál contiene (fórmula de Hoaglans) a las plantas inoculadas con el hongo micorrízico y a las plantas testigo. Se permitió el establecimiento de la micorrización por tres semanas en las cuales se adicionó la solución Hoaglans dos veces por semana (4 ml por planta) las cuales se mantuvieron a 30 C. A la tercer semana se determinará el nivel de micorrización y se almaceno el tejido foliar a -80 C hasta su procesamiento. Análisis de proteínas Extracción de proteínas Para extraer las proteínas de hojas de tomate, se evaluaron dos métodos, el de fenol (Hurkman y Tanaka 1986) y un método que involucra la extracción y precipitación con sulfato de amonio. Método para la extracción de proteínas fenol. Cinco gramos de tejido de plantas congelado, se pulverizan en nitrógeno líquido usando un pistilo y mortero, y se resuspende en 15 ml de buffer de extracción 1 (1% polyvinilpolypirrolidona (PVPP) 1%, sucrosa 0.7 M, KCl 0.1 M, Tris-HCl ph 7.5 al 0.5 M, EDTA 50 mm, PMSF 1mM, β-mercaptoetanol 2%). La mezcla fué extensivamente homogeneizada en frío usando un politron PT 10/35 con un SM generador estándar, adicionando un volumen igual de Tris-HCl ph 7.5 fenol saturado y vuelto a homogeneizar por 30 min. a 2 ºC y finalmente centrifugado a 10 000x g por 30 min. Se remueve la fase superior de fenol y se vuelve a extraer dos o tres veces con buffer de extracción 1. Las proteínas precipitan de la fase final de fenol con cinco volúmenes de acetato de amonio saturado en metanol toda la noche a -20 ºC y finalmente se obtiene la pastilla por centrifugación a 10000 x g
por 30 min. En este paso se evaluaron dos distintos amortiguadores, con y sin PVPP, para evaluar la pertinencia de este reactivo. Método de extracción con sulfato de amonio. Este método consiste en tratar 5 gr de tejido molido con 15 ml de buffer de extracción 2 (NaCl 100 mm), tras la agitación a 4 C por treinta minutos se recuperaron las proteínas solubles mediante centrifugación a 10000 x g por 20 min a 4 C. El sobrenadante se llevó a 80 % de saturación con sulfato de amonio sólido, se permitió la precipitación por toda la noche a 4 C. Las proteínas precipitadas se recupearon centrifugando de la misma manera. La pastilla se resuspendió en Agua desinonizada. La proteína se cuantificó y trató con el kit 2D-Clean up de Amersham, para eliminar interferencias. Separación de proteínas por carga eléctrica [Electroisoenfoque (IEF)] La pastilla de proteínas a partir del protocolo descrito anteriormente será lavado con metanol en frío, en esta etapa se obtuvieron dos tratamientos con y sin lavados con acetona fría, para posteriormente realizar la resuspensión en buffer IEF (Urea 7 M, CHAPS 4%, DTT 10mM, anfolitos ph 3-10 al 1.0 % peso/volumen). Una vez resuspendida la pastilla se cuantificará empleando el reactivo de Bradford (Sigma, San Louis, MO, EUA) y se empleo para rehidratar una tira de gel de poliacrilamida en gradiente inmovilizado ph 3-10 (Ready Strip IPG Strip, Ph 3-10, 7 cm, BIORAD). Se permitirá la rehidratación por 12 h posterior a la etapa de rehidratación las proteínas se enfocaron en el sistema Protean IEF Cell (BIORAD) aplicando un total de 20000 Volts.h. Las tiras tratadas se almacenaron a -80 C hasta su aplicación en la segunda dimensión. Separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE) El paso de la segunda a la primera dimensión involucra 2 etapas: primero, la reducción, y segundo la alquilación de los grupos sulfhídricos. Las tiras de IPG fueron equilibradas adicionando 2.0 ml de buffer de equilibrio I (Urea 6 M, SDS 2%, Tris/HCl 0.05 M, ph 8.8, Glicerol 20%, DTT 2%) para reducir los grupos sulfhídricos, durante 15 min. en agitación. Posteriormente, se decantó y se adicionó el buffer de equilibrio II (Urea 6M, SDS 2%, Tris/HCl 0.05M, ph 8.8, Glicerol 20%, Iodoacetamida 2.5%) para alquilar los grupos sulfhídricos. Se agitaron las tiras en el gel para correr en una segunda dimensión. Las proteínas resueltas y equilibradas, se separaron en base a su peso molecular en geles desnaturalizante en condiciones reductoras (SDS-PAGE). Se utilizo un marcador peso
molecular (BenchMark 10 a 220 kda (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA)). La corrida electroforética se realizo en una cámara vertical (Mini Protean 3 System, Bio-Rad) a temperatura ambiente y 70 V, por 4 horas y en buffer de electroforesis 1X (Tris 25mM, Glicina 192 mm, SDS 0.1%). Para visualizar las manchas de proteínas, los geles se tiñeron con azul de Comassie. Visualización de proteínas. La mayoría de las proteínas requiere el uso de compuestos que identifican los enlaces peptídicos. El procedimiento que se utilizará en este caso será el método de tinción con azul de Coomassie. La principal ventaja es que es un procedimiento rápido y simple, produce geles teñidos mostrando las bandas o manchas de proteínas en un color azul oscuro y un fondo transparente. Después de realizar la corrida de SDS-PAGE, los geles serán teñidos con 50 ml de solución de azul de Coomassie R-250 (10%), se agitarán a temperatura ambiente por 30 minutos, se lavaran 2 veces con agua destilada para retirar el exceso de solución de tinción. Los geles se destiñeron lavando con una mezcla de metanol 10%, ácido acético 10%, disuelto en agua, por al menos 3 horas en agitación. Una vez teñidas las proteínas, se documentarán en el sistema Chemi Doc (BioRad). Resultados Meta 1. Se ha continuado la revisión bibliográfica a la fecha. Meta 2. Generación de plantas micorrízadas. Las tres variedades de tomate que se evaluaron germinaron de manera correcta y fueron inoculadas con G. intrarradices como se describió en Materiales y Métodos y las plantas lograron permanecer durante el período de observación. A la cuarta semana post-inoculación. Se procedió a almacenar el tejido aéreo (tallo y hojas) tanto de las plantas inoculadas como de los controles (plantas no inoculadas). La raíz se utilizó para medir el porcentaje de micorrización por medio de la tinción con Azul de Tripano. Se hicieron slides para leer el porcentaje de micorrización en las plantas de tomate, las variedades Gavilán y Missouri presentaron valores de micorrización del 80% y la variedad MicroTom no presentó buena micorrización
(micorrización menores del 80%) y las plantas presentaron síntomas de enfermedad y se fueron eliminando durante este proceso. a) Vesículas dentro de la raíz de tomate indican micorrización b) Figura 2. Imágenes de raíces teñidas con azul de tripano. a) Slide correspondiente a una planta micorrizada de tomate en asociación con el hongo G. intraradices. b) slide planta control sin inoculación.
Meta 3. Toma de muestra y extracción. Las plantas que se colectaron tras 4 semanas de inoculación fueron almacenadas a 80 C, previa congelación rápida con nitrógeno líquido, esto para evitar posible degradación debido a la acción de proteasas. Los tejidos almacenados una vez triturados en presencia de nitrógeno líquido se sometieron a tres distintas técnicas de extracción de proteínas para plantas en tejidos recalcitrantes, método del sulfato de amonio, fenol y acetona, de estas tres metodologías la que dio mejor resultado fue la técnica del fenol Hurkman y Tanaka (1986), por dar el mejor rendimiento, y los extractos también mostraron más pureza en los geles de acrilamida de primera dimensión al 12 % (Figura 3). Se observó que el mejor tratamiento fue el método de extracción con fenol, seguido del de fenol con lavado con acetona y por último el de precipitación con sulfato de amonio. Lo anterior se determinó del número de proteínas que se lograron separar en la segunda dimensión y a la presencia o no de artefactos, como podría ser proteínas aglomeradas. Posteriormente para tener un mayor grado de separación, se resolvieron las proteínas obtenidas por el método del fenol de Hurkman y Tanaka en un rango de ph de 4-7. En la Figura 4, se observa con gran claridad la excelente separación tanto por punto isoeléctrico como por peso molecular que se logra con la metodología aquí descrita.
a) MPM ph 3 ph 10 b) MPM ph 3 ph 10 c) MPM ph 3 ph 10 Figura 3. Comparación de los distintos métodos de extracción. a) Método de sulfato de amonio; b) Método del fenol más lavado con acetona; c) Método del fenol. 100 ug de proteína fueron aplicados a una tira de IPG 3-10, las proteínas enfocadas se separaron en SDS-PAGE al 12% y las proteínas visualizadas con azul de Coomassie.
D) ph 4 MM Punto isoeléctrico MPM ph 4 ph 7 Peso molecular Figura 4. Separación bidimensional de proteínas de hoja de tomate. La proteína obtenida del método de fenol, se separo en un gradiente de ph de 4 a 7, y posteriormente se separo por peso molecular en un gel SDS-PAGE al 12%. La proteína fue visualizada con azul de Coomassie. (100 ug de proteína fueron cargados).
Impacto El principal impacto que tendrá el presente proyecto se observará en la continuación del presente proyecto, donde se analizarán las muestras que actualmente se tienen en refrigeración. Además, esta metodología esta siendo empleada para el análisis de proteínas de hoja de tomate en otros proyectos, donde se esta investigando la interacción tomate-virus de la marchitez manchada, que actualmente me encuentro dirigiendo.