Cromatografía de Líquidos

Cromatografía de Líquidos Elba Rojas Escudero ERE

Ab o Ad???

Fundamentos Temario Definiciones básicas Aspectos teóricos Instrumentación Elementos básicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados Análisis cualitativo y cuantitativo

Cromatografía de líquidos Método físico de separación La muestra se distribuye entre dos fases Fase estacionaria: sólido o líquido Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos

Elución La muestra se aplica al principio de la columna como una banda fina El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna

Cromatografía Gas Líquido Columna Plano CLS CLL CFE CII CE CCF CP CPG CFG

Tipos de CL PM < 2000 Cromatografía de intercambio iónico Adsorción: líquido-sólido Partición: líquido-líquido Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa PM > 2000 Cromatografia de exclusión por tamaño

Requisitos de la muestra Soluble en la fase móvil Limpia No debe reaccionar con ningún componente del sistema cromatográfico

HPLC ideal para muestras con: Presión de vapor baja Compuestos iónicos Compuestos de peso molecular elevado Compuestos Termolábiles

Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Gradiente de elución Muestra Inyector Control de temperatura Columna Detector Registrador

Fase móvil Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 mω Baja viscosidad No vólatil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada)

Fase móvil Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo. Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (ml/min)

H = f (v)

Cromatografía FM FE Inyector Detector

Proceso Cromatográfico La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos Los solutos se reparten entre ambas fases Fase estacionaria Muestra Fase móvil

Cromatografía de líquidos Se realiza en columna Separación por adsorción y partición Diversidad de técnicas en función de la muestra Análisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analíticas y preparativas Análisis de mezclas relativamente complejas

Fase estacionaria (columna) Tubo de acero inoxidable Dimensiones Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm Tamaño de partícula: 3, 5, 10 µm Forma de la partícula: irregular o esférica

Dimensiones de la columna L di dp

Fase estacionaria (columna) Empaque Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polímeros Carga de Carbón 5-20 % w/w Intervalo de ph = f (FE) Límite de presión de trabajo Compatible con la fase móvil

Fase estacionaria

Soportes de la FE

Permeación o exclusión

Cuidados de la columna Instalación Introducción de muestras limpias Contaminación por fase móvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma adecuada Lavarla después de utilizarla con disoluciones reguladoras de ph

Precauciones No exceder la presión de trabajo Cambios bruscos de presión Intervalo de ph adecuado No utilizar H + y OH - concentrados Filtrar la muestra y la fase móvil w de la muestra=f (dimensiones de la columna)

Cromatografía Fase Normal FE polar FM No-polar Fase Inversa FE No-polar FM polar

Cromatografía de fase inversa FE Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C 18 octadecil, C 8 octil, C 4 tetrametil, C 2 dimetl FM Mezclas: agua/disolventes orgánicos H 2 O +(CH 3 OH, THF, CH 3 CN)

Cromatografía de fase inversa Efecto solvofóbico fuerte: Parte apolar de la molécula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H 2 O)

Fases estacionarias Fases impregnadas Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado NO son Estables

Fases estacionarias Fases químicamente unidas ( Bonded phases ) Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables

Ventajas Cromatografía de fase inversa Reproducibilidad en las separaciones Estabilidad de la FE (ph 7) Mezclas: acuosos/orgánicos H 2 O +(CH 3 OH, CH 3 CH 2 OH, CH 3 CN)

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

Polaridad

Polaridad

Detectores Indice de refracción Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroquímico Radioactividad Infrarrojo Espectrómetro de masas

Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Gradiente de elución Muestra Inyector Control de temperatura Columna Detector Registrador

Elución

Problema general de la elución

Gradiente de elución

Gradiente de elución

Elución con alta presión

Elución

Equipo con gradiente de elución

Proceso Cromatográfico El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna) La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria

Proceso Cromatográfico Las móleculas de soluto en fase estacionaria se estancan Las móleculas en fase móvil avanzan con ella Mm m m M m m M

Proceso Cromatográfico La velocidad del soluto varía inversamente con la afinidad por la fase estacionaria

Separación de los solutos Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarán Mm m m m M M M M M M

Separación de los solutos

H = f (v)

Ensanchamiento de banda

Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FE

Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FM movimiento

Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FM estancada

H= f (ensanchamiento de la banda) H L = 2γ D M / v H S = 2 k 1+k 2 vta H F = 2λdp H D = Ωvdp 2 / D M H M = H F + H D H SM = (1- θ + k ) 2 dp 2 v 30(1-θ)(1+k ) 2 γd M

H = f (ensanchamiento de la banda) H = L / N H = H L + H S + H M + H SM H = H S + H M + H SM

Ventajas Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular Diversidad de columnas y detectores Formación de derivados pre-columna y post-columna Separaciones con control de ph Separaciones preparativas

Limitantes Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase móvil Viscosidad de la fase móvil Dimensiones de la columna Presión de trabajo Intervalo de ph Utilizar un filtro (pre-columna)

Cromatografía de Líquidos Formación de derivados ERE

Derivados Fuera de línea En línea Pre-columna Post-columna

Equipo para la formación de derivados FM FE Inyector Reactor Detector FM FE Inyector Reactor Detector

Derivados

Derivados

Cromatografía de Líquidos Aplicaciones ERE

CCF - CLAE

FE = f (diámetro interno)

Diferente λ

Cambio de λ

Aplicación

Aminas

Aplicación

Fluorescencia

Polar - No polar

Qué sucedió???

Sensibilidad

Sensibilidad

Peso molecular

Propiedades = f (PM)

Oligosacáridos

Oligoglucosa

Ejemplos Campo Mezclas típicas Fármacos Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos Bioquímica Aminácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos Alimentos Edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB, fenoles Química Drogas, venenos, alcohol en forense sangre, narcóticos