Proteasoma de 26S - 2.5 Mda - 32 polipeptidos diferentes 8 no-atpasas Binding a la cadena de poli-ubiquitina (?) (regulatoria) 18 subunidades (6 ATPasas) de la flia AAA Funciones: - Selección y preparación del sustrato - Su translocación al 20S 6 ATPasas 2 no- ATPasas (catalítica) Péptidos de 3 a 23 aa 3 de las subunidades con actividad de proteasa (6 en total), c/u con especificidad diferente
Los complejos SCF Skp1 F-box Cul1-NTD Rbx1 E2 Cul1-CTD
ANGIOGENESIS / VASCULOGENESIS: Nuestro sistema vascular es plastico y responde a hipoxia Hypoxic Vascularized Normal Ischemic
Hipoxia Respuesta sistemica HIF-1 Respuesta celular VEGF EPO transferrin inos tyrosine hydroxylase HRE Glut1 ALDA ENO1 PFK PGK1 LDH-A
Un poco de historia: HIF fue aislado merced a su capacidad de unirse a HREs Wang et al, JBC 268: 21513-18 (1993)
HIF es un heterodimero a/b de proteinas bhlh-pas HIF-1b
Luc Fragmento de HIF-1a Gal4 DNA BD UAS
Quimeras HIF-1a/Gal4 son regulables por oxígeno
La degradacion de HIF-1a Depende del sistema ubiquitina/proteasoma
Angioblastoma retinal
La pérdida de VHL lleva a la sobre-expresión de genes inducibles por hipoxia
HIF-a está controlado directamente por VHL Reporteros Gel Shift Western
VHL forma complejos con Culina 2 y Elongina B Fibronectina Culina 2 Elongina B
Estructura del complejo VHL/Elongina B/Elongina C
VHL tiene asociada actividad ubiquitina ligasa Células marcadas metabólicamente con met S35, IP ahif y Western antiubiquitina
La actividad ubiquitina ligasa depende de la región de binding a elongina B/C y a Culina 2
La actividad de VHL es específica para HIF-1a
Ratones transgénicos que sobre-expresan HIF-1aDODD tienen hiper-vascularización
La hiper-vascularización de los ratones transgénicos correlaciona con los niveles de expresión de VEGF
La prolina 564 de HIF-1a es necesaria para la interacción con VHL Union de un peptido de HIF-1 a VHL
HIF-1a se une a VHL solo si la Pro564 esta hidroxilada Experimento de competencia VHL sintetizado in vitro y a-hif endogeno
La Prolina 864 efectivamente se hidroxila
La reacción de hidroxilación de las prolinas de HIF
Mutaciones en el gen egl-9 de C.elegans presentan aumento constitutivo en los niveles de CeHIF-1
Alelos mutantes de fatiga presentan inducción constitutiva de la respuesta a hipoxia
El sistema traqueal de Drosophila (btl-gal4/uas-gfpn)
El oxigeno puede modular la ramificacion de las celulas terminales traqueales Jarecki et al., 1999
Branchless atrae ramas terminales Branchless (target tissues) Breathless (tracheal cells) Breathless Branchless
O 2?? Branchless Ramificación traqueal
Nuestro sistema vascular es plastico y responde a hipoxia Hypóxico Vascularizado
El sistema HIF esta conservado en la evolucion Mamiferos Drosophila O 2 O 2 PHD Fatiga HIFa/b Sima/Tango Transcripcion de genes-blanco
Regulacion transcripcional del remodelado traqueal en hipoxia
Las ramas terminales gruesas (TTBs)
Ramificación traqueal dependiente de oxígeno 12 10 8 * 6 4 2 0 w 21% O2 w 60% O2 w 5% O2 fga- 21% O2 sima- 21% O2 sima- fga- 21% O2
Fatiga y Sima controlan la ramificación tracheal O 2 Fatiga 12 10 8 6 * * 4 2 Sima Ramificación 0 w 21% O2 w 60% O2 w 5% O2 fga- 21% O2 sima- 21% O2 sima- fga- 21% O2
Hipótesis (angiogenesis-like) TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 Fatiga Breathless Sima/Tango Branchless RAMIFICACION
La sobre-expresión de Sima en células no-traqueales no atrae el crecimiento de terminales traqueales
La sobre-expresión de Sima en células no-traqueales induce la formación de largos filopodios
Hypótesis II TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION
Reportero inducible por hipoxia 5 region of Lactate deshydrogenase-a gene (murine) Sima Sima Gal4 HRE HRE CRE HRE HRE CRE GFPn-lacZ UAS
Las células terminales traqueales son hiper-sensibles a hipoxia
Las células terminales traqueales responden a hipoxia con alta sensibilidad ON in terminal cells only ON in other tracheal cells as well
TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION
Sima es requerida dentro de las células traqueales para la sobre-ramificación en respuesta a hipoxia GFP in a wt cell GFP sólo en la célula mutante para sima
TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION
La sobre-expresión de Sima en las tráqueas provoca sobre-ramificación
La sobre-expresión de Sima en las tráqueas provoca sobre-ramificación
Sima induce a Breathless btl-gal4/uas-gfp btl-gal4/uas-gfp /UAS-Sima
Sima induce la transcripción de breathless en células S2
TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Fatiga Sima Breathless Breathless Breathless Branchless RAMIFICACION
La sobre-expresión de breathless en las tráqueas provoca sobre-ramificación