Nuevos avances en el diagnós0co de la enfermedad gené0ca: Secuenciación exómica

Nuevos avances en el diagnós0co de la enfermedad gené0ca: Secuenciación exómica Luis M. Franco, M.D. Profesor Asistente Departmento de Gené:ca Humana y Molecular y Departemento de Medicina Interna Baylor College of Medicine Houston, TX E.U.A.

El paciente en el que se sospecha una enfermedad genética representa un desafío diagnóstico Miles de enfermedades genéticas Individualmente raras Fibrosis quística 1:2500 Síndrome de Hunter 1:150,000 Gran heterogeneidad clínica Pruebas especializadas son necesarias para confirmar el diagnóstico 3.5 genetistas por 1 million de habitantes, aún en países desarrollados Muchos pacientes no tienen un diagnóstico 2

Utilidad diagnóstica de las pruebas genéticas actualmente disponibles Cario:po 5-10% HGC 15-20% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pruebas de secuenciación con resultado posi0vo (ejemplos seleccionados del MGL) FOXG1 CDKL5 COL5A1 SLC2A1 UBE3A PTEN MECP2 GJB2 PTPN11 CHD7

Secuenciación exómica Qué es la secuenciación exómica? La secuenciación exómica en el laboratorio de diagnóstico molecular Experiencia inicial en Baylor College of Medicine W H O L E E X O M E S E Q U E N C I N G

Qué es la secuenciación exómica? W H O L E E X O M E S E Q U E N C I N G

Tecnologías de secuenciación de segunda generación 454: Pirosecuenciación en paralelo SOLiD: Secuenciación mediante ligamiento

Tecnologías de secuenciación de segunda generación Illumina: Secuenciación mediante síntesis Ion Torrent: Secuenciación con semiconductor de iones Complete Genomics: Secuenciación mediante nanoesferas de ADN

Ahora que podemos secuenciar genomas completos, cómo diagnos:camos las enfermedades gené:cas? Secuenciando el genoma!

Desafortunadamente, no es tan fácil Variantes iden0ficadas al secuenciar el genoma completo de un paciente. N Engl J Med 2010;362:1181-1191.

Secuenciación de genoma completo Para obtener una cobertura suficiente, el costo sigue siendo demasiado alto Las tasas de error siguen siendo rela:vamente altas (1/1000) Hay que reducir (filtrar) las variantes iden:ficadas de ~3.4 millones a una (la variante patogénica del paciente) Esto sería rela:vamente simple si supiéramos exactamente qué tan frecuente es cada variante en la población general y qué efecto :ene (en estado homocigoto o heterocigoto) sobre la función de la proteina y la salud de individuo. Sin embargo, aún estamos muy lejos de ahí.

Secuenciación simultánea de las regiones codificadoras de todos los genes (el exoma ) Es de esperar que la mayoría de las mutaciones que causan enfermedad estén en o cerca de las regiones codificadoras de los genes (~30 Mb ó 1% del genoma) Técnicas de captura de exones seguidas por secuenciación: Secuenciación exómica El costo es actualmente menor que el de muchos páneles que incluyen pocos genes Ofrecido como prueba clínica por el MGL desde octubre de 2011

La secuenciación exómica en el laboratorio de diagnóstico molecular W H O L E E X O M E S E Q U E N C I N G

Definiendo el exoma VCRome 2.1 Coding Exons from: VEGA, CCDS, RefSeq VCRome (42M) 42 Mbp 6 CCDS (26M) 1000 UTR Regiones codificadoras: Vega, RefSeq, CCDS Plataforma de NimbleGen Muestras RECome (52M) Total que pasa Alineación Bases con Bases con Cobertura Obje0vo filtro (Gb)/ única (Gb)/ Única % cobertura cobertura promedio cubierto muestra muestra de 20+ de 40+ 13.48 12.73 95.80% 168 99.40% 97% 93% 3 UTR conservados Exones predichos Regiones codificadoras: Vega, RefSeq, CCDS TFBSs

Secuenciación exómica en el laboratorio clínico Ingreso de la muestra Extracción de AND, microarreglo de SNPs Preparación de muestra de ADN Selección de exones Secuenciación de segunda generación (Illumina= CC: Can0dad y calidad de la muestra CC: Tamaño, calidad y can0dad de las moleculas a secuenciar CC: qpcr para cuan0ficar y documentar selección CC: Análisis en 0empo real (RTA) en el secuenciador CC: Análisis de datos 1) 2) Reporte clínico 3) Alineación: Tasa de error <4% error rate, >90% mapeo en un único si0o >10 Gb de datos, >95% de obje0vos con >20X, >85% de obje0vos con >40X, cobertura promedio >100X Concordancia de SNPs con el microarreglo >99.8%

Plataforma de análisis de datos (Mercury v1.0) BWA MCP Secuenciador de Illumina Atlas- SNP snp.vcf.bam.bcl final.bam.fastq CASAVA Microarreglo de SNPs Cassandra SNP final.vcf indel.vcf BAM finishing Concordancia de geno0po Atlas- indel Cassandra indel QC LIMS

Definición y anotación de variantes Definición de variantes con Atlas Suite (Fuli Yu) Regresión logística y Bayes para definir calidad de las variantes Filtro ajustable Genotipificación Dispoinble en la página web del HGSC y en el Genboree workbench Anotación con Cassandra (Matthew Bainbridge) - Utiliza bases de datos (dbsnp, TG, HGMD, etc) de variantes conocidas Identifica efectos en genes y regiones clave Incluye información sobre función de genes para ayudar en interpretación De ~200,000 a 400-700 variantes por caso

Interpretación clínica de variantes Correlación con el fenotipo del paciente Bases de datos públicas ESP (NHLBI GO Exome Sequencing Project), TG OMIM, HGMD, GeneTests, LSDB Base de datos interna de los primeros 1000 exomas clínicos Listas de variantes y mutaciones anotadas internamente Variantes comunes Nueva lista de genes asociados con enfermedad, actualizada semanalmente

Reporte clínico de un exoma completo Equipo de directores de laboratorio certificados por el ABMG, directores médicos, genetistas clínicos, consejeras genéticas Tres niveles de revisión Componentes: Resultado de secuenciación Confirmación por Sanger, patrón de herencia de variantes de interés Microarreglo de SNPs: AOH > 10Mb, del/ dup> 1 Mb 18

Reporte enfocado: Basado en el fenotipo del paciente Mutaciones en genes relacionados con el fenotipo clínico del paciente Variantes de significado clínico desconocido en genes relacionados con el fenotipo del paciente Mutaciones con implicaciones clínicas claras que requieren acción: Marfan, NF1, VHL, MEN2A, Lynch Estado de portador de enfermedades recesivas Genes de importancia farmacogenética 10/10/13 WHOLE EXOME SEQUENCING 19

Reporte expandido Mutaciones en genes aparentemente no relacionados con el fenotipo Variantes de significado clínico indeterminado en genes no relacionados con el fenotipo: Si AR, una mutación en el mismo gen debe estar presente Mutaciones que se espera sean deletéreas en genes no actualmente asociados con ninguna enfermedad 10/10/13 WHOLE EXOME SEQUENCING 20

Todos los casos reciben un reporte enfocado El reporte expandido se genera solamente a solicitud del médico y con consentimiento del paciente 21

Experiencia inicial en Baylor College of Medicine W H O L E E X O M E S E Q U E N C I N G

Estudios previos de secuenciación exómica Gahl, et al, Genet in Med 14:52, 2012 Pacientes con sospecha de enfermedad genética, pero sin un diagnóstico específico Batería de pruebas diagnósticas Proporción de diagnósticos con SE: 24% deligt, et al, NEJM 367:1921, 2012 Cohorte con discapacidad intelectual severa Diagnóstico molecular mediante SE: 16%

Solicitudes de secuenciación exómica 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Más de 2000 muestras recibidas 85% pediátrico, 15% adultos En su mayoría trastornos neurológicos Enfermedades esqueléticas y cardiovasculares En su mayoría centros médicos con afiliación académica 24

Muestras recibidas por especialidad Referral Specialty Gene:cs Neurology Pediatrics Other 24% 3% 12% 61%

Primeros 1000 casos reportados 1012 cases Resueltos/probablemente resueltos 265 casos (26%) 149: AD 91: mutaciones nuevas 29: mutaciones heredadas 29: padres no disponibles 81: AR 27: X-linked 8: Dos diagnósticos

Primeros 1000 casos reportados Diagnósticos recurrentes 19 pacientes con mutaciones en genes del complejo SWI/SNF 6 pacientes con RASopatías (espectro Noonan-CFC-Costello) 5 pacientes con mutaciones en SYNGAP1 4 pacientes con mutaciones en genes que causan CdLS

Casos con dos enfermedades genéticas Cases Genes Diseases Inheritance 1 SETBP1 CLCN1 2 TREX1 PHEX 3 RAPSN ABCC9 4 POMT2 SCN2A 5 SMARCA2 SCN1A 6 ATM AP4M1 Schinzel- Giedion Myotonia congenita Aicardi- Gou0eres Raqui0smo Hipofosfatémico dominante ligado al X Miastenia congénita Cardiomyopava dilatada 0po 1O Distrofia muscular - distroglicanopava Epilepsia RM, Coffin Siris Epilepsia Ataxia telangiectasia (AT) Paraplegia espás0ca 7 NF1 MEGF8 Neurofibromatosis 0po 1 Síndrome de Carpenter 0po 2 8 PDHA1, BBS10 Deficiencia de Piruvato deshidrogenasa E1- alpha Bardet- Biedl 0po 10 AD AR AR X AR AD AR AD AD AD AR AR AD AR X AR

Diagnósticos con impacto inmediato en el manejo médico Cases Genes Diseases 1 SLC19A3 Encefalopava con respuesta a bio0na o 0amina 2 PHOX2B Hipoven0lación central 3 ENPP1 Calcificación arterial generalizada de la infancia, 0po 1 (GACI1) 4 RAPSN Miastenia congénita 5 DOLK Miastenia congénita 6 CHRNE Miastenia congénita 7 SLC25A38 Anemia sideroblás0ca refractaria a piridoxina, AR 8 TTC37 Síndrome tricohepatoentérico 0po 1

Tasa diagnóstica según la indicación 140 120 100 80 All Cases Solved Cases 60 40 20 31% 21% 33% 25% 0 Neurologic (DD,Speech delay, au0sm, ID) Neurologic plus other organ systems Specific Neurological finding Non- neurological

Mutaciones de importancia clínica no relacionadas con el fenotipo 77 (7.6%)de los 1012 pacientes iniciales tienen mutaciones no relacionadas con implicaciones clínicas claras que requieren acción 65 (6.4%) de los 1012 pacientes iniciales son portadores de mutaciones en la lista del ACMG/ACOG

Mutaciones de importancia clínica que requieren acción FBN1 (síndrome de Marfan) Genes de predisposición hereditária al cáncer: APC, BRCA2, CDH1, MSH6 Pacientes hombres con mutaciones en G6PD Mutaciones en genes cardiovasculares (cardiomiopatías, QT prolongado)

Mutaciones en genes recientemente descritos 13% de los casos positivos tienen mutacioens en genes descritos desde enero de 2012

Evaluación diagnóstica previa La mayoría de los casos había tenido extensas evaluaciones diagnósticas HGC, pruebas metabólicas, secuenciación de genes individuales, páneles de genes para enfermedades específicas, biopsias de músculo Es posible que el uso más temprano de la secuenciación exómica ayude a reducir costos, pero estudios formales de costoefectividad no han sido realizados aún

Ejemplo de evaluación diagnóstica previa 1 AAP, AOO, PAC, cariotipo, RMN del cerebro, Prader-Willi 2 Acidos grasos de cadena larga, biopsia de músculo, enzimas de cadena respiratoria, secuenciación del ADN mitocondrial, cuantificación de ADN mitocondrial, PHOX2B, distrofia miotónica, pánel de trastornos eprevious congénitos de Evaluation glicosilación 3 Neurotransmisores en LCR, Cr/ guanidinoacetato, purinas/pirimidinas en orina, ARX, CDKL5, MECP2

Limitaciones de la secuenciación exómica No detecta cambios en el número de copias No cuantifica expansión de trinucleótidos No detecta mutaciones intrónicas o en regiones no codificadoras Puede no detectar cambios si la cobertura en una región es baja 10/10/13 WHOLE EXOME SEQUENCING 36

Aproximación actual al diagnós0co de las enfermedades gené0cas Sospecha clínica de enfermedad gené0ca Diagnós0co clínico claro (Down, Marfan, Lynch) Si Sanger o cario0po No HGC Anormal Diagnós0co confirmado Si Parar Normal Secuenciación exómica No

El esquema sigue cambiando Buenos genetistas Buenos pacientes Opciones limitadas de pruebas moleculares