Demostración de la naturaleza proteica de la enzima catalasa en vegetales I.- Introducción: Las enzimas están en el centro de cada proceso bioquímico. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. Una enzima actúa sobre un elemento específico llamado sustrato, el sustrato es una molécula y esto se convierte luego en moléculas diferentes llamadas productos al haber actuado con la enzima. Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, es decir que esta transcurre a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. Las enzimas son generalmente proteínas globulares que pueden presentar tamaños muy variables, desde 62 aminoácidos hasta los 2.500 presentes en la sintasa de ácidos grasos. Casi todas las enzimas son mucho más grandes que los sustratos sobre los que actúan, y solo una pequeña parte de la enzima está directamente involucrada en la catálisis. Existen diferentes tipos de enzimas, una de las más importantes es la catalasa. La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. El peróxido de hidrógeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima catalasa. Esta tiene diferentes usos, por ejemplo en la industria utiliza para diversas cosas como en la industria textil para eliminar residuos de peróxido de hidrógeno.
II.- Objetivos: Obtener un extracto crudo de la enzima catalasa. Demostrar cualitativamente el efecto de ácidos, bases y sales sobre la actividad de la catalasa. III.- Equipos materiales y reactivos: EQUIPOS: - Congeladora - Centrífuga - Estufa MATERIALES Y REACTIVO: PROPORCIONADO POR EL ALUMNO: -Tomates verdes (inmaduras) -Papas verdes (inmaduras) -Manzanas verdes (inmaduras) -Un cuchillo de cocina -Un rayador -Dos paquetes de gasa o papel de filtro PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO: -Hidróxido de sodio 2N - Ácido clorhídrico 0.5N -Ácido tricloroacético 20% -Sulfato de cobre 20% -Buffer fosfato 0.05 M, y 0.1 M ph 6,5 -Peróxido de hidrógeno 3% -Cloruro de sodio 0.15 M
-Tubos de ensayo -Embudos -Matraces -Pipetas de 5 y 10 ml -Mortero IV._PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: 4.1 OBTENCION DEL EXTRACTO CRUDO 4.1.1. Pelar los tomates verdes y eliminar la cáscara, el pericarpio almacenarlo a -70 0C 4.1.2. Limar el pericarpio congelado, adicionar 3 ml de Buffer fosfato 0.1 M ph 6,5 4.1.3. Filtrar el extracto crudo a través de 2 capas de gasa o papel de filtro y centrifugar a 10 000 rpm por 15 minutos y guardar las alícuotas a -18 0C 4.2 DEMOSTRACIÓN DE LA NATURALEZA PROTEICA 4.2.1 Armar el siguiente sistema: TUBOS (ml) I II III IV V VI enzima 1 1 1 1 1 1 NaOH 2N. 2.4.... HCL 0.5N.. 2.4... ATCA 20%... 2.4.. CuSO4 20%.... 2.4. buffer fosfato 0.05 M ph 6.5.... 2.4 Dejar en reposo los 6 tubos durante 20 minutos a 30 C 4.2.2 Preparar el siguiente sistema TUBOS (ml) I II III IV V VI Buffer fosfato 0.05 M ph 6.5 2 2 2 2 2 2 NaCL 0.15 M 1 1 1 1 1 1 H2O2 3% 1 1 1 1 1 1
4.2.3 Preincubar por 2 minutos a 25 0C, luego agregar a cada uno de los tubos 2,0 ml de la enzima tratada en el paso 4.2.1. 4.2.4 Dejar en incubación durante 5 minutos a 25 0C y determinar la actividad enzimática cualitativamente de la siguiente manera: Presencia de actividad enzimática (+) = Formación de gas Ausencia de actividad enzimática (-) = Ausencia de gas V._RESULTADOS: Cuadro n 1: TUBOS I II III IV V VI papa + - + - + + plátano + + - - - - manzana + + - + - - Cuadro n 2: TUBOS I II III IV V VI papa + - + - + + plátano + + + + + - manzana + + + - - -
VI.- Discusiones: Esta enzima actua en conjunto con el sustrato. Este será el peróxido de hidrogeno (H2O2). Este contiene radicales libres y lo que hace la catalasa es eliminar estos radicales para evitar de esta manera que se oxide el alimento; por lo tanto la catalaza se considera un antioxidante..en las imágenes de arriba se observo en que tubos hubo mayor actividad enzimática. Esta actividad difiere mucho en la proporción que se encuentra la catalasa en los diversos tejidos vegetales. -El proceso de la aparición de burbujas fue más lento en los tejidos vegetales de la papa, existían abscesos en la manguera que permitían la fuga del agua y poca segregación VII.- CONCLUSIONES: La actividad de la catalasa puede medirse por diversos procedimientos, sin embargo hay que procuraroperar con la menor concentración posible de sustrato, agua oxigenada, a temperatura baja (baño de hielo), para evitar la inactivación de la enzima por el sustrato.. Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas. La enzima actúa sobre un sustrato definido. El sustrato es una molécula y esto se convierte luego en moléculas diferentes llamadas productos al haber actuado con la enzima Para incrementar la velocidad de las reacciones enzimáticas, las enzimas aumentan la temperatura. Las enzimas muestran especificidad por el sustrato ya que solo puede actuar con uno específicamente. La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.
VIII.- CUESTIONARIO. 1. Qué es un extracto crudo? Según el experimento llevado en el laboratorio, el extracto crudo es el jugo del vegetal en estado primitivosin adición de ningún reactivo. 2. A qué clase de enzima corresponde la catalasa. Su nombre y su código E.C? Corresponde a las oxido reductasas y dentro de las hidroperóxidasas, se denomina catalasa y su código E.C.es 1.11.1.6. 3. Qué otros factores pueden considerarse para demostrar que las enzimas son proteínas? Los factores principales que alteran la actividad enzimática son: la concentración de la enzima y del sustrato, temperatura, ph e inhibidores. Ya que cuando están en su punto óptimo, las enzimas se desarrollan normalmente, pero cuando salen de su rango establecido, las enzimas se desnaturalizan. 4. Indique 4 enzimas que pueden extraerse de los Vegetales. Maltasa, que convierte el disacárido de malta en 2 unidades de glucosa. Alfa Amilasa, sintetiza el almidón.citocromooxidasas, que contienen proteínas distribuidas en tejidos vegetales y animales. IX.- Referencias bibliográficas:. Braverman, J.B. 1980. Introducción a la Bioquímica de los alimentos. El manual moderno. México. Metzler, E.D. 1981. Bioquímica, Omega. Barcelona. http://es.scribd.com/doc/143674185.