Aspectos microbiológicos PROGRAMA 1. Introducción- Vida útil. 2. Control de la Vida útil. 3. Exigencias microbiológicas. 4. Examen para determinación de la calidad de las conservas. 5. Patrones de incubación en envases (CNTA). 6. Normas y criterios microbiológicos de análisis de conservas. La vida útil es la duración estimada que un objeto puede tener cumpliendo correctamente con la función para la cual ha sido creado La vida útil es el período de tiempo durante el cual un producto sigue siendo especificaciones de calidad almacenamiento y uso previsto. seguro y cumple en con condiciones sus de 1
Vida útil determinada por: -Aspectos organolépticos -Aspectos microbiológicos: Microorganismos legislados para cada tipo de producto (tabla resumen) Microorganismos patógenos Microorganismos indicadores Microorganismos alterantes: afectan las características organolépticas del producto Cuándo realizar estudios de vida útil? 1. Desarrollo de productos nuevos o modificados 2. Desarrollo de procesos nuevos o la modificación de desarrollo de envases nuevos 3. Cambio significativo ifi de ingredientes o en el envase para un producto existente 4. Cambios en el lugar de producción 5. No se han realizado anteriormente estudios de vida útil RTS para la elaboración y venta de conservas y semiconservas vegetales. Real Decreto de 2 de junio 1978, nº 2420/78 Las conservas habrán sido sometidas a esterilización industrial o técnica según articulo 2.05.07 del código alimentario Español. Articulo 2.05.07 del código alimentario Español: Esterilización:...En el ámbito industrial, proceso por el que se destruyen o inactivan por un periodo determinado de tiempo, todas las formas de vida de microorganismos patógenos o no patógenos capaces de producir alteraciones en los alimentos en las condiciones normales de almacenamiento. 2
PRODUCTOS COMERCIALMENTE ESTÉRILES Si conserva microbiológicamente estable. no va a sufrir alteración microbiológica durante la vida útil de la misma, (3-5 años). Norme francaise NF V 08-408. Côntrole de la stabilité des produits apertissés et assimilés. Methode de Routine : Incubación de dos envases durante 7 días a 37±2ºC y 55±2ºC; Comparados con Muestra Testigo a Tª Amb: 18-25ºC ESTIMACIÓN DE VIDA ÚTIL DE ALIMENTOS EN CONSERVA BASADA EN ANÁLISIS DE ESTABILIDAD MICROBIOLÓGICA / ESTERILIDAD COMERCIAL Conserva microbiológicamente estable se considera que no va a sufrir alteración microbiológica durante la vida útil de la misma, usualmente estipulada en 5 años, dependiendo del producto y del envase (en envases plásticos, está vida útil es inferior debido a la menor integridad de los mismos respecto de los envases metálicos o de vidrio). Esta característica es muy importante ya que afecta al manejo del stock siendo improbable que estos alimentos tengan que retirarse de la cadena comercial por haber superado el período de vida útil. (The stability and shelf-life of food, Kilkast and Subramanian, CRC Boca Raton 2000 / Microbiología alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Pascual Anderson, Díaz de Santos ed. 1992 / AOAC Official Method 972.44, AOAC Official Method of Analysis 1995). Por lo tanto, en base a los criterios especificados la herramienta más usada para comprobar si una conserva va a tener la vida útil estipulada, es el análisis de estabilidad microbiológica (también denominada esterilidad comercial). 1.-Control de estabilidad microbiológica ó esterilidad comercial determinar si la muestra es susceptible de alterarse por causas microbiológicas o no durante su vida útil 2.-Control de esterilidad (Investigación microorganismos) determinar si ha quedado algún microorganismo viable en la muestra. 3
PRODUCTOS ph < 4.6: Ausencia de microorganismos patógenos y sus toxinas Ausencia de gérmenes acidófilos (Mohos, levaduras y Lactobacillus.) Se toleran esporas inertes de Bacillus en escaso número. PRODUCTOS ph > 4.6: LEGUMBRES, ESPÁRRAGO, CHAMPIÑÓN... Ausencia total formas vegetativas y esporas: Cl. botulinum y Cl. perfringens. Ausencia de Salmonella, Shigella y St. aureus Ausencia de toxinas botulínica y estafilocócica. Ausencia termófilos; Hasta 10 bacilaceae termoestables /g En definitiva, ESTERILIDAD COMERCIAL Criterio microbiológico para conservas CENAN 1982. Se exige esterilidad comercial. Ausencia de formas vegetativas o esporuladas de gérmenes patógenos o toxigénicos, así como ausencia de microorganismos capaces de crecer y alterar el producto envasado en las condiciones normales de almacenamiento. A- TAMAÑO Y ELECCIÓN DE LA MUESTRA. B- EXAMEN PRELIMINAR DEL ENVASE: 1- Examen externo del envase antes de abrirlo en busca de irregularidades de fabricación, cierre u otras. 2- Anotación de las observaciones. 3- Incubación preliminar de la muestra. C- ÁNALISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTO: 1- Preparación del envase para el análisis. 2- del envase bajo condiciones asépticas. 3- Preparación de cultivos apropiados. Siembras. 4- Examen microscópico. D- OBSERVACIONES SUPLEMENTARIAS: 1- Determinación del ph del producto. 2- Determinación del peso neto y del peso escurrido. 3- Otras determinaciones químicas apropiadas. 4- Examen del interior del envase, cierre y de las soldaduras en lateral y fondo. Conservas de baja acidez (ph > 4.6), tomate, con adición de almidón o acidificadas: - 3 envases: - muestra incubada 7 días a 37ºC. - muestra incubada 7 días a 55ºC - muestra de referencia a Tª ambiente. Conservas ácidas (ph<4.6): - 2 envases: - muestra incubada 7 días a 37ºC - muestra de referencia a Tª ambiente (Hay dif. patrones de incubación según normas y países de aplicación) Criterio de aceptación Criterio de aceptación No puede haber modificaciones de las características del alimento durante la incubación (a 55ºC, se admite un pardeamiento), ni abombamiento de los envases o rezumado de producto y la variación máxima de ph entre las incubadas y la testigo es de 0.5 puntos. 4
En caso de sospecha, realizar tinción microbiológica del producto y no tiene que observarse en la tinción de la muestra incubada flora microbiológica 100 veces superior respecto de la muestra testigo u observarse microorganismos distintos, aunque estén en bajo número, a los observados en la muestra testigo. Adicionalmente, y a modo complementario a la prueba de estabilidad, se determinan los grupos de microorganismos genéricos que suelen alterar las conservas: En la muestra incubada a 37ºC y en la muestra Testigo mantenida a Tª ambiente: - Detección de Mesófilos Aerobios - Detección de Mesófilos Anaerobios - Detección de Clostridium sulfito-reductores (sólo en conservas de ph 4.6). - Detección de Lactobacilos (sólo en conservas de ph <4.6). - Detección de Mohos y Levaduras (sólo en conservas de ph <4.6). En la muestra incubada a 55ºC - Detección de Termófilos aerobios - Detección de Termófilos anaerobios Criterio de aceptación Los valores recomendables y que usualmente se obtienen, para todos los parámetros citados, son de <1 ufc/g ó <10 ufc/g según sea el límite de detección de la técnica. En el caso de conservas ácidas, pueden detectarse mesófilos aerobios y anaerobios en muestras comercialmente es, debido a que el ph de los medios de cultivo que se utilizan (en torno a 7) no son limitantes para el su crecimiento, mientras que el ph del producto (<4.6) sí lo es. En determinadas ocasiones, en conservas de baja acidez (ph 4.6) comercialmente es también se han detectado mesófilos aerobios en bajo número (<100 ufc/g) sin que se haya visto afectada la estabilidad de la misma. En algún caso en concreto, se han realizado para empresas determinadas pruebas complementarias de verificación de vida útil que se resumen a continuación: - Incubación de un determinado número de envases (usualmente 10) durante 3 meses a 37ºC para simular periodos estivales. Ningún lote previamente analizado como estable ha sufrido alteración microbiológica durante este periodo adicional a 37ºC. - Prolongación de la incubación de 55ºC a14 días en el caso de exportar a países cálidos o en contenedores transportados por barco. A nivel de producción, en estos casos, se incrementa el tratamiento térmicoavalores de Fo>12-16 para asegurar la destrucción de termófilos. - Mantenimiento de conservas durante 5 años a temperatura ambiente para verificar empíricamente la estimación de la vida útil. La experiencia ha demostrado que una conserva microbiológicamente estable permanece estable mientras el envase permanece íntegro. De hecho, a modo de curiosidad, se han encontrado envases fabricados a principios del siglo XX que continúan siendo microbiológicamente estables. 5
Incubación para Incubación para comprobar comprobar Norma estabilidad Exigencias a las muestras incubadas estabilidad frente a frente a termófilos mesófilos AFNOR V 08-401 Ausencia de alteración envase y de rezumado de producto Control Estabilidad Método de Referencia Ausencia de modificación de textura, color y aroma del alimento Incubación a las tres Tª (2 muestras /Tª): 21 días a 32± 7 días a 55± productos de ph>4.5, tomate y productos En tinción, ausencia de modificaciones cualitativas y cuantitativas entre acidificados o con adición de almidón. muestra incubada y no incubada en 20 campos: Factor R<100 Resto de productos: se anula incubación a 55ºC Variación de ph entre muestra incubada y no incubada < 0.5 AFNOR V 08-408 Ausencia de alteración envase y de rezumado de producto Control estabilidad Ausencia de modificación de textura, color y aroma del alimento Método de Rutina Si variación ph entre 0.3 y 0.5: Tinción, ausencia de modificaciones Incubación a las tres Tª: productos de 7 días a 37± 7 días a 55± ph>4.5, tomate y productos acidificados o cualitativas y cuantitativas entre muestra incubada y no incubada en con adición de almidón. 20 campos Factor R<100 Resto productos: se anula incubación a 55ºC Variación de ph entre muestra incubada y no incubada < 0.5 5-7 días a (sólo en Ausencia de abombamiento del envase, de rezumado de producto y de productos que se APHA (ph>4.6) 10 días a 30- alteración del alimento así como un límite de variación de ph. sabe van a estar a Tª>) Si hay alteración: confirmación de microorganismos alterantes (mesófilos APHA (ph<4.6) 10 días a 25- ----- aerobios y anaerobios, termófilos aerobios y anaerobios). Búsqueda de microorganismos alterantes tras la incubación: mesófilos Gov. of Canada. MFHPB-01, 2001. aerobios y anaerobios, (conservas ph < 4.6: microorganismos acidófilos). Comercial sterility and presence of viable 7 días a 30- ----- microorg. in canned food Investigar termófilos aerobios y anaerobios sólo en productos que se sabe van a estar a Tª > 40ºC. Realización de análisis microbiológicos (ph>4.6) Muestra 1 7 días 37ºC Clostridium sulfito-reductores (ME.M.09) (siembra en profundidad en tubos con agar SPS y 48 h Muestra 2 7 días 55ºC Termófilos aerobios(me.m.05) (siembra en masa, P.C.A., incubación 48 h a Termófilos anaerobios (ME.M.06) (siembra en profundidad en tubos con Caldo de Hígado y 48 h incubación en anaerobiosis (vaselina ) a ph (ME.C.04) (diferencia incubados <0.5) Muestra 31 7 días Tª ambiente Clostridium sulfito-reductores (ME.M.09) (siembra en profundidad en tubos con agar SPS y 48 h Realización de análisis microbiológicos (ph<4.6) Muestra 1 7 días 37ºC Lactobacilos (ME.M.07) (siembra en caldo MRS y 48 h incubación a 37ºC) Resiembra en PCA de tubos positivos y 24-48 h a 37ºC/prueba catalasa) Mohos y levaduras (ME.M.08) (siembra en masa en agar glucosa Sabouraud-cloranfenicol., incubación 5 días a 22ºC) Muestra 2 (tomate y productos acidificados: pimiento, alcachofas, puerros) 7 días 55ºC Termófilos aerobios(me.m.05) )(siembra en masa, P.C.A., incubación 48 h a Termófilos anaerobios (ME.M.06) (siembra en profundidad en tubos con Caldo de Hígado y 48 h incubación en anaerobiosis (vaselina ) a ph (ME.C.04) (diferencia incubados <0.5) Muestra 31 7 días Tª ambiente Lactobacilos (ME.M.07) (siembra en caldo MRS y 48 h incubación a 37ºC) Resiembra en PCA de tubos positivos y 24-48 h a 37ºC/prueba catalasa) Mohos y levaduras (ME.M.08) (siembra en masa en agar glucosa Sabouraud-cloranfenicol., incubación 5 días a 22ºC) 6
Realización de análisis microbiológicos (ph<4.6) en conservas alteradas Siembra directa Mesófilos aerobios (siembra en tubos con glucosa púrpura bromocresol, incubación 48-96 h 37ºC) Mesófilos anaerobios (siembra en profundidad en tubos con caldo de hígado y 48-96 h incubación en anaerobiosis (vaselina ) a 37ºC) Termófilos aerobios (siembra en tubos glucosa púrpura bromocresol, incubación 48-96 h a Termófilos anaerobios (siembra en profundidad en tubos Caldo de Hígado y 48-96 h incubación en anaerobiosis (vaselina ) a Resiembra en NAMn incubación 48 h 37ºC) Resiembra en Agar hígado incubación 48 h 37ºC) Resiembra en NAMn incubación 48 h Resiembra en Agar hígado incubación 48 h Muestra Alicuota de la muestra, 10 min. a 98ºC (ph>4.6) 80ºC (ph<4.6) Mesófilos aerobios (siembra en tubos con glucosa Resiembra en NAMn incubación 48 h Tinción, púrpura características bromocresol, organolépticas incubación 48-96 del producto h 37ºC) y aspecto del envase 37ºC) Mesófilos anaerobios (siembra en profundidad en tubos con caldo de hígado y 48-96 h incubación en Resiembra en Agar hígado incubación 48 h anaerobiosis (vaselina ) a 37ºC) 37ºC) Termófilos aerobios (siembra en tubos glucosa Resiembra en NAMn incubación 48 h púrpura bromocresol, incubación 48-96 h a Termófilos anaerobios (siembra en profundidad en tubos Caldo de Hígado y 48-96 h incubación en Resiembra en Agar hígado incubación 48 h anaerobiosis (vaselina ) a Gracias por su atención! Patricia Ruiz Resp. Dpto. Tecnologías Área Asistencia Técnica pruiz@cnta.es Tel. +34 948670159 Fax +34 948696127 www.cnta.es www.alinnova.com 7