MEMORIA DE PRÁCTICAS Empresa: Centro Nacional de Tecnología y Seguridad Alimentaria (CNTA)- Laboratorio del Ebro. San Adrián (Navarra). Alumna: Laura Sánchez Vicente Período de prácticas: 01-07-08 hasta 08-08-08 y 26-08-08 hasta 30-09-08 OBJETIVO El objetivo de esta memoria es describir las actividades que he realizado durante mi período de prácticas en el departamento de Biotecnología del CNTA - Laboratorio del Ebro. DISEÑO DEL LABORATORIO Dentro del departamento de Biotecnología se distingue una zona destinada a los procesos de extracción de DNA provista de baño termostatizado, centrífuga, microcentrífuga y próxima a una campana de seguridad; una zona pre-pcr donde se ubica la cabina destinada a la preparación de las PCR junto a una nevera; y por último, una pequeña habitación dentro del laboratorio, pero separada de las otras áreas indicadas, denominada zona post- PCR, donde están los termocicladores, las cubetas de electroforesis, el secuenciador y el equipo de luz UV para la visualización de geles, entre otros. Además de la campana y la cabina de PCR, hay otra cabina de seguridad biológica destinada a trabajos de investigación. Otro de los equipos a destacar es el de purificación de agua, con el que se obtiene agua ultrapura o agua milli-q de uso común en los distintos análisis y trabajos de investigación de este departamento. Una de las normas características de este departamento es el uso de una bata específica para cada área del laboratorio. Los equipos y el material de cada una de las zonas son de uso exclusivo en cada una de ellas. Se procura el orden y la limpieza. De esta forma se pretende evitar contaminaciones de material genético en las distintas áreas. Casi todo el material que se emplea en los análisis y en el trabajo de investigación es material estéril desechable. En el caso de los eppendorfs y espátulas de plástico de un solo uso, se distribuyen en bolsas de plástico. Para usos determinados, se rellenan cajas de puntas de micropipetas con puntas desprovistas de filtro. Tanto las bolsas como las cajas ya rellenas se autoclavan para posteriormente ser usadas. ANÁLISIS DE RUTINA Una vez recibidas las muestras y dadas de alta en recepción de muestras, se procede a realizar el tipo de análisis solicitado para cada una de ellas.
DETECCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (OGMs) 1. HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA Las muestras más habituales en este tipo de análisis son matrices vegetales tales como: soja, arroz, tomates, cebolla, harinas de maíz, albahaca De la muestra recibida se procede a la homogeneización de aproximadamente 200gramos; en ocasiones, un envase del producto. La homogeneización se lleva a cabo en equipos como el Grindomix o el Polytron. Antes de comenzar con el proceso, se procede a limpiar con agua y lejía la superficie de la poyata y del equipo utilizado en cada caso. Este se debe desmontar y lavar cada una de las piezas con abundante agua y jabón. A continuación, se monta y se le hace funcionar efectuando distintos lavados. Antes de proceder a triturar y homogeneizar la muestra a analizar, se pasa el blanco de homogeneización constituido por agua milli-q. Si se realiza la homogeneización de varias muestras, entre muestra y muestra se debe llevar a cabo el mismo procedimiento anterior de lavados. Una vez homogeneizada la muestra, se guarda en un anaclín estéril marcado con su número correspondiente. El proceso de homogeneización no se realiza en el propio departamento de Biotecnología, ya que hay que evitar en todo momento la entrada de muestras con el fin de evitar contaminaciones en las superficies, materiales e incluso en el propio ambiente donde posteriormente se llevan a cabo los siguientes pasos del proceso de análisis. 2. EXTRACCIÓN DE DNA Para la extracción de DNA se pesan 2,5g o 5g (si el alimento ha sufrido un procesamiento considerable) del homogeneizado en un tubo falcon estéril en la sala de balanzas. El resto de la muestra homogeneizada se conserva en la cámara frigorífica durante un determinado periodo de tiempo por si hubiese que repetir el análisis. Además de las muestras y del blanco de homogeneización, se prepara un blanco de extracción con agua milli-q. Para el proceso de extracción propiamente dicho, se siguen los pasos indicados en el protocolo en vigor, entre los que se distinguen diferentes etapas de centrifugación e incubación. Se emplean detergentes encargados de romper las membranas celulares, sustancias que permiten separar el DNA de restos glucídicos y lipídicos y lo hacen precipitar y, al final del proceso, alcoholes como el etanol que permiten la visualización de un pellet blanquecino (más o menos grande dependiendo del tipo de matriz), donde está contenido el DNA extraído. Al final del proceso, el pellet se resuspende en agua. 3. CUANTIFICACIÓN DEL DNA Antes de llevar a cabo la amplificación del DNA, se comprueba que, verdaderamente, se ha extraído DNA durante el proceso de extracción mediante una cuantificación del mismo a partir de mediciones en el espectrofotómetro o en el Nanodrop. Espectrofotómetro En el caso del espectrofotómetro, la cuantificación se realiza a partir de diluciones del DNA supuestamente extraído y resuspendido en el proceso de extracción.
En primer lugar, se programa el equipo para que realice mediciones de cada muestra a 260 nm, 280nm, 230nm y 320nm. A continuación, se hace el blanco con el mismo H 2 O milli-q que ha sido usada en las diluciones. Luego se lleva a cabo una medición del DNA patrón para comprobar el buen funcionamiento del equipo y el resultado se anota en la hoja de registros correspondiente. A partir de este momento se inicia las mediciones para cada muestra. Al cambiar de muestra se efectúa un lavado de la cubeta con agua destilada. Por último, se lleva a cabo una evaluación de los resultados obtenidos en base a lo que indica cada una de las longitudes de onda: - 260nm: longitud de onda a la que absorbe el DNA. - 260nm/280nm: cociente de estimación de la calidad o pureza del DNA. El valor óptimo oscila entre 1.8-2.0-230nm: valor influenciado por la presencia de sales en la muestra. - 320nm: medida de la turbidez de la muestra. Nanodrop Se trata de un equipo conectado al sistema informático que permite llevar a cabo una cuantificación de la materia de forma muy exacta y precisa en base a la medida de absorbancia de la misma. Tras iniciar el sistema con la opción de medición de muestras de ácidos nucleicos y efectuar un lavado de las lentes (base y tapa del Nanodrop) con gotas de agua, se procede a la medición de las distintas muestras. Entre muestra y muestra basta con limpiar la base y la tapa con un trozo de papel. Los resultados referentes a las mediciones quedan guardados en el sistema informático. A partir de los datos de concentración de DNA (μg/μl) obtenidos tras las mediciones, se hacen los cálculos correspondientes para conseguir diluciones de 40 μg/μl o en el caso de concentraciones altas, diluciones 1/5,1/10 y 1/20. 4. PCR Mediante la reacción en cadena de la polimerasa, se logra amplificar el material genético hasta conseguir millones de copias de moléculas de DNA. En nuestro caso, en primer lugar se hace una PCR usando como promotor Plant1-2. De esta forma, sólo se amplifican las moléculas de DNA de procedencia vegetal. En el caso de las muestras en las que se produce amplificación, se hace una segunda PCR usando el promotor 35S y el terminador NOS. Una amplificación en este caso indicaría la presencia de DNA transgénico, es decir, que la muestra correspondiente habría sufrido alguna modificación genética. Para proceder a llevar a cabo una PCR, en primer lugar hay que efectuar los cálculos correspondientes a la cantidad que se necesita de cada reactivo en función del número de muestras. De este modo se calcula la cantidad de tampón 10x, MgCl 2 25mM, dntps, Primer1, Primer2, Taq polimerasa y H 2 O necesarias en la preparación del mastermix. La realización de la PCR tiene lugar en la cabina destinada exclusivamente a PCRs. Treinta minutos antes de comenzar la preparación de la PCR, se enciende la luz UV de la cabina para trabajar en condiciones de máxima esterilidad. La persona que se disponga a hacer una PCR debe llevar puesta la bata correspondiente a la zona pre-pcr y guantes limpios.
Usando para cada reactivo, en función de su volumen, la micropipeta adecuada; se prepara el mastermix. A continuación, éste se distribuye según la cantidad calculada en los distintos eppendorf y, posteriormente, se añade en cada uno de ellos la cantidad ya calculada de DNA diluido correspondiente a cada muestra. En el caso de los blancos de homogeneización y de extracción, en lugar de añadir DNA se añade el contenido de los blancos. Y en el caso del blanco de PCR, se adiciona el mismo H 2 O milli-q que se ha empleado en la preparación del mastermix. Una vez cerrados los eppendorf, se llevan sobre el soporte hasta el termociclador y en él, una vez encendido y seleccionado el programa adecuado con el número de ciclos y sus tiempos, se inicia la reacción de amplificación llevada a cabo por la Taq polimerasa. 5. ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA Es el procedimiento empleado para saber si ha habido amplificación del material genético extraído de cada muestra tras la PCR. Para la preparación de los geles de agarosa disuelve una cantidad determinada de agarosa, según el porcentaje al que se quiera el gel, en buffer salino. Tras calentar la mezcla en el microondas hasta conseguir una disolución transparente (teniendo cuidado de que no se evapore), se vierten sobre un molde rectangular de plástico, se colocan los peines para hacer la forma de los pocillos y se deja solidificar. Parte del contenido de cada tubo eppendorf de PCR se mezcla con gel de carga y, usando una micropipeta del volumen adecuado, se van cargando las distintas muestras en los distintos pocillos sin olvidarse de cargar en al menos uno de los pocillos el marcador del número de bases de los ácidos nucleicos. La cubeta de electroforesis con el gel cubierto de buffer salino, se conecta a la corriente eléctrica y se deja correr el material genético de las distintas muestras. El DNA, al ser una molécula con carga negativa, con el paso de la corriente eléctrica migra hacia el polo positivo. Una vez que ha corrido el gel, éste se tiñe con bromuro de etidio. Se trata de una sustancia potencialmente cancerígena. Por esa razón, hay que extremar la precaución y usar obligatoriamente guantes al introducir el gel en el recipiente que contiene el bromuro de etidio. Ya teñido el gel, se lleva a un transiluminador de luz UV para visualizar las distintas bandas. Es muy importante comprobar que no aparezcan bandas en el caso de los blancos de homogeneización, de extracción y de PCR; ya que en caso contrario, indicarían contaminación genética y los resultados no serían válidos. Habría que repetir nuevamente el análisis. Contribución a mi formación La detección de OGMs ha sido el tipo de análisis más solicitado por los clientes durante mi periodo de prácticas. Dado que he participado de forma rutinaria en los distintos pasos de los que consta dicho análisis, he creído conveniente explicarlo de una forma bastante detallada. La implicación en cada uno de los pasos del procedimiento de detección de OGMs me ha permitido: - coger soltura en el manejo de instrumentos de uso común como las micropipetas, además de precisión en el pipeteo (sobretodo en la preparación de la PCR).
- aprender acerca del funcionamiento de equipos como la centrífuga, microcentrífuga, espectrofotómetro, Nanodrop, termocicladores y del equipo de luz UV para la captura de imágenes de los geles. - comprender y entender el fundamento teórico de cada uno de los pasos seguidos y el uso de un reactivo o de una sustancia determinada en casos concretos, sobretodo en el proceso de extracción de DNA. - plantearme diferentes cuestiones acerca de las diferentes técnicas y tratar de encontrar explicaciones razonables ante la aparición de resultados inesperados. ELISA Es una técnica que permite la cuantificación de proteínas en una muestra. En nuestro caso, la técnica está enfocada hacia la detección y cuantificación del gluten que pudiera haber presente en los distintos alimentos. Alimentos como embutidos y patés eran los más comunes en este tipo de análisis. En primer lugar, se procede a homogeneizar la muestra, utilizando los mismos equipos y siguiendo un procedimiento similar que en el caso de la detección de OGMs. La diferencia fundamental es que en este caso no se requiere del uso de lejía y sí de etanol al 70% para la limpieza de los equipos y la eliminación de cualquier residuo de gluten presente en los mismos. A continuación, se procede a realizar la técnica del ELISA en sí, incubando las muestras primero con un anticuerpo contra una de las proteínas del gluten (gliadina) y, posteriormente, con un segundo anticuerpo específico contra el primer anticuerpo (ya unido a la proteína) y conjugado a una enzima. Tras las incubaciones se realizan lavados que permiten eliminar aquellos anticuerpos que no se han unido. Por último, se añade el sustrato enzimático y se lee la densidad óptica de cada muestra en un lector de ELISA. PROCESOS DE SECUENCIACIÓN En nuestro caso, el objetivo de los procesos de secuenciación génica es la identificación de un microorganismo causante de la contaminación de un alimento, a nivel de especie. Se parte de una placa con un determinado medio de cultivo en el cual ha sido aislado el microorganismo. Hay varias opciones: picar una colonia en el eppendorf de PCR en lugar de añadir DNA extraído, o bien llevar a cabo un proceso de extracción de DNA, que dependiendo del organismo (eucariota o procariota y, dentro de este último Gram + o Gram-) puede ser más o menos costoso, respectivamente. Por ejemplo, en el caso de bacterias Gram-, con un boiling puede ser suficiente. Se hace una PCR convencional usando primers específicos del RNA ribosomal 16S, caracterizado por su alto grado de conservación entre las distintas especies. Una vez finalizada la PCR, se visualiza la amplificación de material genético en un gel de agarosa. Para una misma bacteria, se trabaja con distintas diluciones y se elige aquella que dé lugar a la aparición de la banda más intensa en el gel. Dicha banda se purifica según los pasos indicados en el protocolo de un kit comercial, para posteriormente hacer una segunda PCR.
En este caso, no se trata de una PCR convencional. En el mastermix se añaden ddntps fluorescentes, aparte de los dntps. Cuando un ddntp se incorpora a la molécula de DNA en crecimiento, se interrumpe su amplificación, dando lugar a una señal fluorescente que posteriormente será detectada en el secuenciador. Una vez finalizada esta PCR de secuenciación, se lleva a cabo una purificación del material genético amplificado con el fin de eliminar los elementos sobrantes del mastermix para que no afecten de forma negativa a la detección de las señales fluorescentes en la lectura llevada a cabo por el secuenciador. Poner en funcionamiento el secuenciador lleva su tiempo. En primer lugar hay que colocar en la posición adecuada una jeringa que contiene el polímero que va a rellenar el capilar y permitir conectar los dos electrodos, y también colocar con sumo cuidado el capilar por el cual circularán las distintas moléculas de DNA cuyo proceso de polimerización se ha visto interrumpido por la presencia de un ddntp. Después hay que efectuar una serie de pruebas de movimiento del carro donde se colocan las diferentes muestras para que el sistema sepa donde tiene que pinchar. Mientras el secuenciador está en funcionamiento, las señales detectadas (a medida que aumenta el peso molecular de las cadenas de DNA interrumpidas), se van guardando en el ordenador al que está conectado y cuando finaliza, se pueden ver los resultados de la lectura de cada secuencia. La obtención de una buena secuencia se caracteriza por tener picos estrechos y bien definidos. Una vez que se ha comprobado que no hay errores en la secuencia en función de la señal detectada, hay que lanzarla. Para ello, se accede a Internet y se hace un blast. En el resultado del blast aparecen muchas especies de microorganismos ordenados de mayor a menor similitud con la secuencia. Una vez visualizados y analizados los resultados, se determina qué tipo de microorganismo a nivel de especie ha sido el causante de la contaminación. TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN Además de las analíticas de rutina, también he colaborado en proyectos de investigación que se estaban llevando a cabo por el personal de I+D de Biotecnología y del propio departamento de Biotecnología durante mi estancia en el CNTA. Los experimentos en los que he estado implicada son los siguientes: - Extracción de DNA de bacterias acéticas. Se hicieron bastantes pruebas para ver de qué forma se conseguía extraer más cantidad de DNA. Así pues, se probó a crecer las bacterias en distintos medios de cultivo y en distintas condiciones de crecimiento. Se trabajaba con bacterias obtenidas directamente del vino o bien con bacterias sometidas a un proceso de filtración a vacío con el fin de eliminar pigmentos o materia que hacían más costoso el proceso de extracción. - SDS-PAGE para la detección de bacteriocinas y posterior tinción de los geles de acrilamida con Azul de Coomassie y plata. Además de la participación activa en los trabajos anteriores, también he recibido nociones acerca de: - PCR cuantitativa
- Cuantificación de bacteriófagos de la familia Leviviridae (indicadores de contaminación fecal en aguas) por el método microbiológico, basado en la cuantificación de las calvas en placas donde ha crecido el hospedador susceptible. - Proceso de retrotranscripción in vitro a partir del genoma de los fagos de la familia Leviviridae. MANTENIMIENTO DEL SISTEMA DE CALIDAD DEL DEPARTAMENTO El sistema de calidad implantado en los departamentos del CNTA requiere de un trabajo constante y de un cumplimiento adecuado en los plazos de tiempo marcados. Está regulado por reuniones semanales de los jefes de departamento y supervisado por distintas auditorías a lo largo del año. En el departamento de Biotecnología, el mantenimiento del sistema de calidad implica tareas de diversa índole y en las cuales he participado de forma activa: - En lo referente a los reactivos, anotar en los registros la fecha de preparación, fecha de apertura y fecha en la cual se termina. - Revisión continuada de las temperaturas de las distintas habitaciones y del refrigerador. - Comprobar la temperatura del baño termostatizado con un termómetro cada vez que es encendido. - Mantenimiento de los distintos equipos del laboratorio. Se llevaban a cabo limpiezas mensuales y trimestrales (diferentes cada una de ellas) de las centrífugas, cabina de PCR, termocicladores - Limpieza de zonas comunes: sala de almacenamiento de material, cámara de refrigeración. - Calibración de las micropipetas La calibración de micropipetas consiste en pesar en una balanza de precisión la cantidad de agua recogida para un volumen. Se realizan medidas para diferentes volúmenes y en el caso de cada uno de ellos se repite la pesada varias veces. CONCLUSIONES Como conclusión, sólo cabe decir que estas prácticas me han resultado muy útiles como complemento a mi formación y para adquirir una visión general del funcionamiento de una empresa. He tenido la oportunidad de aprender acerca de diferentes técnicas, no centrándome en un solo tipo de trabajo. Por último, destacar que el trato recibido por el personal del CNTA, en especial del departamento de Biotecnología, ha sido excepcional.