Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre 2016 3 er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 21-23 de Septiembre 2016 Memorias Análisis y comparación del nivel de expresión de ezrina en líneas celulares tumorales cervicales. Ricardo Alonso Galeana Ascencio (Becario) rigaas99@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No. 16, Universidad Autónoma de Guerrero. Marco Antonio Leyva Vázquez (Asesor) leyvamarco13@gmail.com Miguel Ángel Mendoza Catalán (Asesor) mglmendoza7@gmail.com Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Introducción El cáncer cervical es una alteración celular que se origina en el epitelio del cuello del útero y se manifiesta inicialmente a través de lesiones precursoras, habitualmente de lenta y progresiva evolución (Ministerio de Salud., 2005). El cáncer cervical empieza creciendo lentamente; los tejidos normales del cuello uterino pasan por un proceso conocido como displasia, durante el cual empiezan a aparecer células anormales precursoras del cáncer, que normalmente son asintomáticas (Instituto de Salud del Estado de México, 2016). El factor de riesgo más importante para el cáncer de cuello uterino es la infección con el virus del papiloma humano (VPH) (American Cancer Society, 2016). Prácticamente todos los casos de cáncer cervical son causados por infecciones por VPH, y solo dos tipos, el 16 y el 18, son responsables de casi 70% de todos los casos (Instituto Nacional del Cáncer (NIH), 2015). 801
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Muchas moléculas de señalización y proteínas reguladoras se localizan en la membrana celular, lo que lo convierte en un punto focal para la generación, organización y dinámica de la corteza de actina, y por lo tanto para la morfogénesis celular. (Marco Fritzsche, 2013). Los resultados de varios estudios sugieren que Ezrina puede jugar un papel clave en el desarrollo tumoral, invasión, y la metástasis, probablemente a través de regulación de la adhesión moléculas, la participación en la transducción de señal celular, y señalización a otros canales de la membrana celular en el tumor. Ezrina está sobre-expresado en el cáncer de cuello de útero, y su expresión está estrechamente relacionada con metástasis y mal pronóstico. (Jienan Kong, 2016) Objetivos Determinar el nivel de expresión de Ezrina y su localización en células C33A, Hela, SiHa y HaCaT para poder conocer la diferencia de expresión en las diversas líneas celulares. Conocer el nivel de expresión de Ezrina en las líneas celulares tumorales cervicales. Conocer la ubicación de Ezrina dentro de la célula y poder compararla entre las líneas celulares tumorales cervicales. Metodología Inmunofluorescencia. El método de inmunofluorescencia, es una técnica de laboratorio que identifica la presencia de diversas sustancias gracias a los anticuerpos que se han vuelto fluorescentes. Coloreando los anticuerpos y observándolos con una luz especial, es fácil de detectar e identificar las sustancias sobre las que se fijan. Este método se utiliza para encontrar bacterias o anticuerpos en muestras biológicas. (Kioskea, 2014) a) Preparación de las muestras. 1) Se retiró el cubreobjetos del medio y se colocó en una portaobjetos limpio. 2) Se permeabilizaron las muestras con PBS-TRITÓN 0.2% por 5 minutos. Se lavó con PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno. b) Bloqueo de uniones inespecíficas. 802
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 21-23 de Septiembre 2016 3) Se realizó el bloqueo de las uniones inespecíficas colocando 20 ul de PBS+BSA 0.1% durante 30 minutos a cada portaobjetos. c) Incubación de los anticuerpos. 4) Se agregaron 20µl del anticuerpo primario Anti-Ezrina 1:100 a cada una de las muestras, y se dejaron reposar durante una hora dentro de la cámara húmeda. 5) Se lavaron con PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno. 6) Se agregaron 20µl del anticuerpo secundario Anti-Mouse 1:50 a cada una de las muestras, y dejamos reposarla durante 2hrs dentro de la cámara húmeda. 7) Se lavaron con PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno. d) Montaje con DAPI. 8) Se realizó el montaje con DAPI, colocando una gota de éste en un portaobjetos nuevo y se colocó el cubreobjetos de manera invertida. Dejamos en reposo toda la noche. e) Observación en el microscopio. 9) Las laminillas se observaron en el microscopio de epiflourescencia en objetivos 40x y 60x. Western Blot. Técnica analítica, ampliamente utilizada para el estudio de proteínas. Este método permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones posttraducionales como la fosforilación, y ser utilizada para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. (Advansta Corporation, 2011) a) Preparación de las muestras. 1) Se cuantificaron las proteínas totales. 2) Se colocó el volumen necesario para que hubiese 50µg de proteínas totales equivalente a 6µl y se agregó 1.5 µl de buffer de muestra 4x 3) Se preparó el gel y a la par los reactivos. b) Electroforesis en gel de acrilamida. 803
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 4) Se añadió el marcador de peso molecular y las proteínas totales en los pocillos del gel. 5) El gel se colocó dentro de una cámara de electroforesis con buffer de corrida, y se realizó la electroforesis durante una hora a 80 volts fijos, mientras las proteínas pasaban al gel separador, una vez sucedido esto se incrementó la potencia a 120 volts. c) Transferencia. 6) El gel se colocó dentro del casssette de transferencia en el siguiente orden: esponja, papel filtro, gel, membrana, papel filtro y esponja. Este procedimiento se realizó en húmedo. 7) Se colocó dentro de la cámara de transferencia con buffer de transferencia, y se realizó la transferencia durante tres horas a 60 volts fijos. d) Bloqueo de uniones inespecíficas. 8) Se retiró la membrana y se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS Leche 5% durante 1 hora e) Tinción con Rojo de Ponceau. 9) Se realizó la tinción con Rojo de Ponceau para verificar que la transferencia de las proteínas del gel a la membrana se haya realizado de manera correcta. f) Incubación de anticuerpos. 10) La membrana se incubó con el anticuerpo primario Anti-Ezrina a una dilución 1:1000 durante toda la noche a 4 C. 11) Posteriormente, se incubó el anticuerpo secundario Anti-Mouse 1:1000 durante dos horas a temperatura ambiente. 12) Se realizaron diez lavados con PBS por intervalos de 10 minutos. g) Detección. 13) Se colocaron 500 µl de Luminol en la membrana para realizar la detección quimioluminiscente, colocándola en el C-Digit por 12 minutos. 804
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 21-23 de Septiembre 2016 Resultados. Inmunofluorescencia. Western Blot 2.5 Expresión de Ezrina total Nivel de expresión 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 HaCat C33A HeLa Líneas celulares SiHa 805
Conclusiones Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Mediante la técnica de Inmunofluorescencia y Western Blot se pudo conocer la localización y el nivel de expresión de Ezrina respectivamente dentro de las líneas celulares tumorales cervicales. Referencias bibliográficas Advansta Corporation. (2011). Análisis de Proteínas. Barcelona: ecogen. American Cancer Society. (29 de 1 de 2016). American Cancer Society. Obtenido de www.cancer.org Dugdale, D. C. (9 de marzo de 2012). University of Maryland. Obtenido de http://umm.edu/health/medical/spanishency/articles/cancer Instituto de Salud del Estado de México. (4 de julio de 2016). Gobierno del Estrado de México. Obtenido de http://salud.edomexico.gob.mx/html/article.php?sid=1011 Instituto Nacional del Cáncer (NIH). (19 de Febrero de 2015). Instituto Nacional del Cáncer (NIH). Obtenido de http://www.cancer.gov/espanol/cancer/causasprevencion/riesgo/germenes-infecciosos/hoja-informativa-vph Jienan Kong, C. D. (2016). Ezrin contributes to cervical cancer progression through. Oncotarget, Vol. 7, No. 15, 19631, 19631. Jienan Kong1, 2. C. (s.f.). Kioskea. (Julio de 2014). Kioskea.net. Obtenido de http://salud.ccm.net/faq/7939- inmunofluorescencia-definicion#q=inmunofluorescencia&cur=1&url=%2f Marco Fritzsche, R. T. (27 de Noviembre de 2013). Biophysical Journal. Obtenido de http://www.cell.com/biophysj/fulltext/s0006-3495(13)05796-2 Ministerio de Salud. (2005). Cáncer Cérvico Uterino. Santiago: Guías Clínicas Auge. 806