CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Detección n de arroz MG no autorizado en productos de arroz procedentes de China Silvia Gil Alcalde Servicio de Biotecnología Jornadas de Referencia 2012. Análisis de Alimentos. Majadahonda 11-13 de junio
Decisión 2011/884/UE Métodos propuestos (Puesta a punto) Estudio CNA
ESTUDIO SOBRE PRODUCTOS DE ARROZ PROCEDENTES DE CHINA : PLANTEAMIENTO Adquirir muestras de arroz y/o productos de arroz procedentes dechina y otros países asiáticos: -Productos adquiridos en supermercados -Productos adquiridos en centros de distribución de productos asiáticos Realizar el estudio comparativo de los métodos propuestos en Decisión. Comprobación screening: Promotor 35S y Tnos - SYBR Green - TaqMan Duplex Búsqueda del gen CryIAb/Ac: SYBR Green Muestras positivas: Comprobación de construcciones específicas: Pubi-cry/ 35S-hpt/ Cpti-nos
MUESTRAS Distintos tipos de muestras fijándonos en el anexo de la decisión
TIPO DE PRODUCTOS UTILIZADOS 8 6 4 2 SOPA NOODLES HARINA DE ARROZ PASTA DE ARROZ PAPEL DE ARROZ ARROZ EN LÁMINA ARROZ VERMICELLI FIDEOS DE ARROZ RICE STICK GALLETAS DE ARROZ 0 OTROS NºMUESTRAS TOTALES: 35
PROCEDENCIA
COMPOSICIÓN DE LAS MUESTRAS COMPOSICIÓN Nº MUESTRAS Arroz único ingrediente 26 Soja 5 Otros 4
EXTRACCIÓN Método CTAB MODIFICACIONES: + Agua + Buffer extracción Partir de mayor cantidad de muestra (>100mg) Volumen elución 50 µl(más concentrado)
Rendimiento de la extracción GRUPO CONCENTRACIÓN (ng/µl) PUREZA (A260/A280) Arroz (granel) 44,81 1,91 Sopas 26,54 1,90 Harina y pasta de arroz 17,63 1,85 Papel de arroz 51,4 1,85 Arroz en lámina 29,9 2 Arroz vermicelli 40,4 1,8 Rice stick 35,65 1,97 Galletas de arroz 38,52 1,88 Fideos arroz 44,44 1,97 Otros 41,94 1,84
RESULTADOS TOTALES INICIALES Nº muestras 35 NEGATIVAS 20 POSITIVAS 8 DUDOSAS 7
RESULTADOS DE 35S- tnos Nº MUESTRAS SYBR Green TAQMAN 35S tnos 35S tnos 21** ND ND ND ND 8 * + + + + 4 + ND + ND 2 + ND ND ND * Una de las muestra contenia soja RR ** 3 resultaron positivas para Cry1Ab
MUESTRAS POSITIVAS EN SCREENING: ASEGURAR RESULTADO -Contaminación por organismos (virus o bacterias) -Existencia de otras variedades vegetales Negativas Negativas Una muestra positiva a RR
RESULTADOS DE CRYIAb/Ac Dificultades en la interpretación de resultados: Ct aproximadamente ciclo 36 Tm dentro del rango de T de los controles (Rango muy amplio de Temperaturas 2 controles Bt11 y MON810) Picos más pequeños 35S/NOS/CryIAb Algunas muestras únicamente resultado de CryIAb/Ac No existe criterio para el punto de corte CryIAb MUESTRAS 4 3
CryIAb: Muestras con Ct ~ 36 y Tm similar a los controles pero señal muy pequeña Señal de los controles Bt11 y MON810 Señal de las muestras Ct 36.64 y Ct 36.05 Dificultad en la interpretación de las señales detectadas (Tm y valor de Ct)
77,7 ºC 82,4 ºC Tm: 79,2ºC Bt11 y 80,9 ºC MON810 Rango aceptado: 77,7-82,4 º C
IDENTIFICACIÓN: BÚSQUEDA DE CONSTRUCCIONES ESPECÍFICAS Pubi-cry Cpti-nos 35S-hpt De las 7 muestras positivas en screening, sólo 3 dieron resultados positivo * A testingcascadeforthedetectionofgeneticallymodifiedrice by real-time PCR in foodandits applicationfordetectionofanunauthorizedrice linesimilar tokefeng6 Ralf Reiting, Lutz Grohmann, Dietrich Mäde(2010)
RESULTADOS POSITIVAS 35S -NOS -CryIAb/Ac Pubi-cry- Cpti-nos - 35S-hpt 3 35S -NOS -CryIAb/Ac 4 DUDOSAS CryIAb/Ac 3 35S 4
RESULTADOS FINALES 23% 67% Nº muestras 35 NEGATIVAS 21 POSITIVAS 3* DUDOSAS 7 10% De las 7 positivas 4 son la misma muestra y 2 son misma muestra y marca
ALERTAS Fuente: RASSF (10/05/2013)
CONCLUSIONES CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN 1.-Se han detectado secuencias transgénicas que indicarían la presencia de arroz MG no autorizado, en 7 de las 35 muestras analizadas 2.-De las siete muestras con resultados positivos, 4 correspondían al mismo tipo de producto, sopas china de distintos sabores, y 2 a galletas de arroz de la misma marca comercial. 3.-Siete de las muestras analizadas, se han considerado dudosas, en 4 de ellas se ha detectado únicamente secuencias de CryIAb/Ac y en 3 secuencias correspondientes al promotor 35S. 4.-Ninguna de las muestras en las que se ha detectado la presencia de secuencias transgénicas, contenían elementos naturales como virus (CaMV) o Agrobacterium. 5.-Se ha considerado que la presencia de secuencias transgénicas 35S y T-nos en una de las muestras era debida a la presencia de soja RR entre sus ingredientes. 6.-Los estudios llevados a cabo, ponen de manifiesto la dificultad en la interpretación de resultados del método SYBR Green para la detección de CryIAb/Ac
Centro Nacional de Alimentación MUCHAS GRACIAS Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.es 91 3380688 Silvia Gil Alcalde sgil@mssi.es 91 3380888 Josefina Gangoso Herreras Mª Luisa Salvador Pulgar Esther Rico Cañada ada Miriam Gómez G Martín Mª del Camino Martín n Forero Mercedes Fernández ndez de la Puebla Mª Isabel Rodríguez PérezP