Actualización n de las actividades del EURL-GMFF y red ENGL

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1 CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Actualización n de las actividades del EURL-GMFF y red ENGL Mª Isabel Prieto Santos Servicio de Biotecnología Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos Majadahonda de 10 al 12 de junio Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

2 INDICE: Centro Actividades del EURL GMFF y red ENGL 1.- Actualización n del documento sobre Definición n de Requisitos Mínimos M de los métodos m de análisis de OMG 2.- Actualización n del documento sobre Preparación n de muestras 3.- Revisión n de la Decisión n 2011/884/UE 4.- Actividades del Grupo de trabajo sobre selección n de métodos (AG SMV) 5.- Actualización n del cálculo c de la incertidumbre en la preparación n de Mezclas de MRC (Versi Acreditación n ) (Versión n 2. Documento Alcance Flexible de Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

3 Actividades del EURL-GMFF y red ENGL Laboratorio central Comisión EU-JRC (Ispra Italia) 97 laboratorios (27 EM de la UE + 3 no EU) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

4 1) Métodos emitidos por los solicitantes de nuevas autorizaciones al EURL-GMFF de acuerdo al Reglamento (CE) Nº 1829/2003 Métodos validados por los LNR Reglamento (EC) 882/2004 (métodos de referencia) Métodos desarrollados por cualquier institución, con el propósito de que sea validado por el EURL- GMFF Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

5 Mejorar los criterios actuales: los métodos cuantitativos, la extracción de ADN (por ejemplo, la robustez, la LOD, LOQ) Introducir / desarrollar nuevos criterios para los métodos cualitativos, los métodos taxónespecíficos y métodos multiplex Mantiene la misma estructura del documento actual Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

6 Fase 1-Evaluación del rendimiento del método con el fin de decidir si el método es aceptable que ser sometido a una validación completa (criterios de aceptación del método) Fase 2-Confirmación de la aptitud del método para el uso previsto, a través de un estudio de validación completo, normalmente en un ensayo interlaboratorio (requisitos de rendimiento del método) En el documento se ha tenido en cuenta: Recomendaciones del Codex Alimentarius Commission (CAC/GL ) Requisitos de las Normas Internacionales: EN ISO EN ISO EN ISO EN ISO Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

7 El ENGL y el EU-RL GMFF respaldan el concepto de MÓDULOS ANALÍTICOS Extracción/purificación de ADN Análisisde ADN (p.ej.porpcr) Multiplex PCR (dos o más dianas en una misma reacción) ANEXO 1: DEFINICIONES RELACIONADAS CON LAS SECUENCIAS DIANAS Y LA APLICACIÓN A LOS MÓDULOS DE PCR Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

8 1.- Criterios comunes a todos los módulos m del métodom Aplicación: Descripción de analito, matrices y concentraciones a las que puede ser aplicado el método Practicabilidad: Facilidad de aplicación del método 2.- Criterios aplicables al modulo de extracción n de ADN Valoración de la extracción de ADN, debería realizarse en diferentes días (ej.3 días) y sobre un adecuado número de porciones de muestra (ej.6) Valorado en un rango representativo de matrices, de acuerdo al alcance de aplicación. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

9 Criterios de aceptación: Concentración > 40 ng/µl Rendimiento de la reacción de PCR Integridad de la estructura del ADN Pureza: ausencia de inhibidores Criterio de aceptación: la diferencia (ΔCq) promedio entre el valor Cq medido y el valor Cqextrapolado de la primera dilución de la muestra en la prueba de inhibición debe ser < 0,5 [(medida CQ - extrapolado Cq)] < 0,5 y la pendiente de la curva de inhibición debe estar dentro de -4,1 y -3,1, correspondiente a una eficiencia de amplificación de 75 % a 110 %. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

10 3.- Criterios aplicables a modulo de PCR Especificidad : Propiedad de un método de responder exclusivamente a la característica o el analito de interés. Búsquedas en bases de datos (por ejemplo, EMBL, GenBank, patentes, etc) Resultados experimentales sobre eventos transgénicos no diana y material no transgénico. Las pruebas de especificidad se deberán llevar a cabo a cabo con aproximadamente copias de ADN no diana y con al menos 100 copias de ADN diana. Descripción de la verificación de los productos amplificados (Hibridación, secuenciación, análisis con enzimas de restricción) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

11 Introducción de criterios para métodos cualitativos MULTIPLEX Especificidad Deberáser evaluada para cada secuencia diana. Criterios de aceptación igual que para singleplex Nota:En los los módulos cualitativos de de PCR multiplex, se se recomienda comprobar (por ejemplo, mediante electroforesis en en gel gel o el el análisis del punto de de fusión), si si los los cebadores pueden generar amplicones adicionales a los los esperados. Por ejemplo: Una PCR duplexdirigido a detectar P35S y patpor separado, podría generar un un amplicónp35s-paten caso de de que exista esta construcción en en el el material de de ensayo). Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

12 Eficiencia de la amplificación Definición :El rendimiento de la amplificación calculada a partir de la pendiente de la curva estándar obtenida de la representación semi-logarítmica de los valores Ctfrente la concentración de ADN Eficiencia teórica de 100% resulta de una pendiente de 3,32. Efficiency [%] = (10 1 slope 1) 100 Criterio de aceptación :El valor individual de la pendiente de la curva estándar debería estar en el rango de 4,1 pendiente -3,1, correspondiente a una eficiencia de 75 % %. La amplificación debería ser valorada para cada modulo mediante al menos 5 rondas individuales. La curva estándar debe cubrir todo el rango dinámico Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

13 NUEVOS CRITERIOS PARA MÉTODOS M CUALITATIVOS Criterios para los métodos cualtitativos: Relación de falsos positivos y falsos negativos Nuevo criterio para la evaluación del rendimiento de los métodos cualitativos : POD (probabilidad de detección) (Macarthur von Holst, 2012 Anal. Methods,,4, ) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

14 Falsos positivos (error tipo I) Definición: Probabilidad α de obtener un error de tipo I (clasificable como falso positivo) Nota: Un falsopositivose produce cuando el resultado del ensayo se clasifica como positivo (se detecta una diana MG o un OMG especifico OMG) cuando el resultado real es negativo (la diana MG o el OMG especifico estáausente) Criteriode aceptación: 5 % α. α= 100 x númerode muestrasnegativaserróneas / número total conocido de muestras negativas Nota: Los falsos positivos pueden ser causados por errores en ellaboratorio participante. Se ha observado que puede aparecer falsos positivos cuando se utilizan materiales de referencia como controles negativos, debido a que el material de referencia no estácertificado para presencia o ausencia de la secuencia de la diana analizada. En tales casos, el resultado positivo del ensayo no es necesariamente un error de tipo I y se debe investigar y discutir las causas de la aparición de los resultados positivos inesperados. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

15 Falsos negativos (error tipo II) Definición: Probabilidad β de obtener un error de tipo II (clasificable como falso negativo) Note: Un falsonegativose produce cuando el resultado del ensayo es negativo (no se detecta una diana MG o un OMG especifico), siendo el resultado real positivo (la diana MG o el OMG especifico están presentes en una concentración LOD) Criteriode aceptación:5 % βen concentraciónde MG diana LOD β= 100 x númerode muestraspositivaserróneas/número total de muestras positivas conocido Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

16 Probabilidad de Detección (POD) Definición: La probabilidad de resultados positivos con un método cualitativo para una matriz determinada y a una concentración determinada Medida de réplicas de ADN, obtenida de preparadas en diferentes concentraciones en un rango cercano al límite de detección absoluto La POD puede ser utilizada para calcular la concentración de MG diana detectada con POD = 0,95 (95% de probabilidad de detección) La valoración de POD, Proporciona información adicional sobre el rendimiento del módulo cualitativo. No puede remplazar la determinación de falsos positivos y falsos negativos Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

17 ANNEX 3 PROCEDIMIENTO PARA COMPROBAR LA ROBUSTEZ DE LOS MÉTODOSM PROCEDIMIENTO: Los factoresrelevantes de la reacción de PCR deberían ser comprobados al menos en dos diferentes condiciones Factor Condición 0 Condición 1 Thermal cycler (brand) A B Master mix concentración Sin cambio - 10 % Primer concentración Sin cambio - 30 % Probe concentración Sin cambio - 30 % Master mix volume (total de 25 µl) 19 µl master mix + 5 µl DNA de la muestra 21 µl master mix + 5 µl DNA muestra Annealing temperatura +1 C -1 C Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

18 Posibilidades de combinación de las condiciones (diseño multifactorial) Factor Combination Thermal cycler Master mix Primer concentration Probe concentration Master mix volume Annealing temperature Concentración de la secuencia diana, al nivel del límite de cuantificación del método Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

19 Cadacombinacióndebeser testadaen al menos3 réplicasde PCR Dos rondasde PCR (ronda1 a +1 C y ronda 2 a -1 C) Factor Combination Cycler A A A A B B B B Master mix Sin cambio Sin cambio - 10% - 10% Sin cambio Sin cambio - 10% - 10% Primer Conc. Sin cambio -30% Sin cambio -30% Sin cambio -30% Sin cambio -30% Probe conc. Sin cambio -30% -30% Sin cambio -30% Sin cambio Sin cambio -30% MM vol. 19 µl 19 µl 21 µl 21 µl 21 µl 21 µl 19 µl 19 µl Temp. Annelling +1 C (PCR run 1) -1 C (PCR run 2) Réplica 1 Réplica 1 Réplica 1 Réplica 1 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 3 Réplica 3 Réplica 3 Réplica 1 Réplica 1 Réplica 1 Réplica 1 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 3 Réplica 3 Réplica 3 Resultado de alguna combinación Negativo Repetir Nuevo Negativo INSUFICIENTE ROBUSTEZ Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

20 2 ) Gilbert BERBEN (CRA-W) Diana CHARELS (JRC-IHCP) Tina DEMŠAR (NIB) Rupert HOCHEGGER (AGES) Elena NARDINI (JRC-IHCP) Roberta ONORI (ISS) Patrick PHILIPP (SCL) Manuela SCHULZE (LAVES) Thomas WEBER (JRC-IHCP) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

21 1. ALCANCE Guía para la correcta preparación de las muestras en el análisis de OMG, en alimentos, piensos, semillas, plantas 2. PRINCIPIO Recoge todas las etapas: Desde muestra de laboratorio hasta la porción analítica Evitar contaminaciones cruzadas 3. DEFINICIONES Definiciones Norma UNE ISO 6498:2012 Definiciones generales- Definiciones sobre la muestra- Definiciones sobre los procedimientos de preparación de la muestra Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

22 4. ERRORES DEL MUESTREO 4.1. Errores vinculados a características de la muestra Centro TRITURACIÓN MEZCLA / HOMOGENEIZACIÓN Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

23 4.2.Errores asociados al proceso de submuestreo: 1.Error delimitación del Incremento 2.Error de extracción del Incremento 3.Error de preparación del Incremento Excluida del incremento Delimitación incorrecta Delimitación correcta Error de extracción Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

24 4.3. Errores debidos a las operaciones de submuestreo - Composición de la submuestra -La trituración (reducción de tamaño de partícula) -Mezcla /homogeneización - Reducción de la masa representativa Características de la matriz Cómo se realizado el submuestreo Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

25 5. EQUIPOS 6. CONDICIONES AMBIENTALES Sala dedicada a la molienda - Reactivos descontaminates 7. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

26 8. PROCEDIMIENTO 8.1 Identificación de la muestra.- Tamaño de Muestra de laboratorio Products Seeds Commodity grains First transformation products (semolina, flour, grits, oilcake etc.) Liquids Doughy and viscous products End products (e.g. packed rice noodles) Recommended laboratory sample size Mass equivalent of 3000 kernels (see table below for mass equivalent of 1000 kernels) Mass equivalent of grains (see table below for mass equivalent of 1000 kernels) From 100 g to 1 kg 500 ml 500 g From 100 g to 1 kg Table 1 - Recommended laboratory sample sizes according to type of matrix (Table adapted from AFNOR, 2006) Anexo IV.- Fórmula matemática para calcular el tamaño mímimo de muestra (granos) en el análisisde OMG Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

27 8.2 Reduccióndela masa Recomienda la molienda de la totalidad de la muestra de laboratorio Particulas 6 mm Premolienda Técnicas de reducción n de masa (submuestreo( submuestreo): 1.- Fraccionamiento alterno m(incremento)= m(muestra de laboratorio) / [n(submuestra)x N (incremento)] m= masa n = número Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

28 2. The spoon method Reducción factor 10 Muestra extendida capas finas de < 2 cm en forma de S 3. The long pile method Longitud 20 veces la anchura Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

29 8.3 Reducción del tamaño de partícula Molienda en pasos sucesivos: Disminución de tamaño de malla ( Factor 4) 2 mm 0,5 mm En muestras grasas: Dificultad de molienda NO aconsejable la molienda húmeda en OMG Limitar el calentamiento durante la molienda Procedimientos de submuestreo en muestras especiales: Gelatinas/ melazas/ alto contenido en grasa : Congelarla muestra O/N Triturar en congelación Evitar calentamiento ( 30 s) Muestras viscosa: miel, lecitina : Homogenizar calentando a ⁰C Aceites : Centrifugarla muestra de laboratorio 30 min g. Extraerel ADN del pellet Tejidos de planta: Congelar con Nitrógeno líquido Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

30 8.3 Muestra de ensayo FSE (expected RSD) Maximum particle size (d) 25% 20% 10% 5% 2% 1% 0.5mm 0,02 g 0,03 g 0,13 g 0,5 g 3 g 12.5 g 0.75mm 0,07 g 0,1 g 0,42 g 1,7 g 10,5 g 42 g 1mm 0,16 g 0,25 g 1 g 4 g 25 g 100 g 2mm 1,28 g 2 g 8 g 32 g 200 g 800 g 3 mm 4,3 g 6,7 g 27 g 108 g 672 g 2688 g 4 mm 10,2 g 16 g 64 g 256 g 1600 g 6400 g FSE: error fundamental de muestreo ISO/FDIS 6498:2011 Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

31 Datos teóricos Berbeny Janssen, 2008 basado en datos de Lischer, 2001b Porción mínima de muestra analítica en mgpara alcanzar una reproducibilidad de muestreo del 20 % (con un nivel de probabilidad del 95 %). a) Sin tener en cuenta el error analítico Critical GMO content Mean mass of particles 0,1 % 0,5 % 0,9 % 1,0 % 5 µg 500 mg 100 mg 55 mg 50 mg 10 µg 999 mg 199 mg 110 mg 99 mg 20 µg 1998 mg 398 mg 220 mg 198 mg b)teniendo en cuenta un 5 % debido al error analítico Critical GMO content Mean mass of particles 0,1 % 0,5 % 0,9 % 1,0 % 5 µg 499,5 mg 265 mg 147 mg 132 mg 10 µg 2664 mg 531 mg 293 mg 264 mg 20 µg 5328 mg 1061 mg 586 mg 528 mg Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

32 Test portion size GMO % 0,1 % 0,3 % 0,6 % 0,9 % 1,2 % 1,5 % 1,8 % 50 mg! ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ 100 mg! ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ 200 mg! ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ 400 mg! ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ 800 mg ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ Datos del estudio Co-Extra ( Janssen et al, 2010)! Indicaquela medidase ha obtenidocon RSD > 25 % Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

33 9. CONTROL DE CALIDAD Prueba para comprobar rendimiento de la reducción del tamaño de las partículas (molienda) Calidad de molienda Representatividad de la porción analítica 10. IDENTIFICACION DE CARENCIAS Y CONCLUSIONES Conclusiones: Importancia de la preparación de la muestra es generalmente subestimada 11. BIBLIOGRAFIA REFERENCIAS Y ANEXOS Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

34 3 ) Estado actual de Grupo de trabajo Sobre Selección de métodos analíticos ( AG SMV ) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

35 Criterios para la selección de los métodos 1)Prioridad a los métodos que sirvan para solucionar alguna carencia en el análisis de OMG 100% de la UE autorizó eventos transgénicos (EC/1829/2003) o del "Low Level Presencia" (LLP) Legislación (EC/619/2011) El mayor porcentaje posible de los OMG no autorizados conocidos 2)Métodos que ofrezcan un valor añadido (p. ej.la eficiencia de costes / hora, el rendimiento) en comparación con las estrategias adoptadas con anterioridad 3)Cumplir con los criterios de aceptación del ENGL según se especifica en el documento "Definición de los requisitos mínimos de rendimiento para los métodos de análisis de OGM" ( Los criterios también deben considerar el costo, la rapidez, la viabilidad de la implementación en el sistema Europeo, y la disponibilidad de material de control positivo. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

36 2013 : 5 métodos 1.- cry1abgene from Bacillus thuringiensis, 2.- Figwort Mosaic Virus promoter (pfmv), 3.-nopalinesynthasegene promoter of Agrobacteriumtumefaciens(pNOS) 4.-pea E9 terminator (te9) S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (P35S) Los métodosparalasdianas(1, 2, 3) cubiertosporlos métodosvalidados por German Working Group El método(4) se estávalidandodentrodel projectogmoval El método(5) estáampliamentecubiertopormétodosvalidados. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

37 NUEVAS PROPUESTAS: 1) CMV-CP element(cucumber Mosaic Virus coat protein gene). Presenteen ocho OMG No autorizados 2) Cauliflower Mosaic Virus(CaMV). Contaminación natural 3) Agrobacterium tumefaciens. Contaminación natural 4) Métodoconstrucciónespecíficoparadetecciónde Papaya MG 5) T-35S del vector pcambia 6) Estrategias de alto rendimiento o métodos multiplex 7) MétodosTaxón-especificos seleccionadosporel grupo"2013 Selected Screening targets for GMO Analysis" como: judía, trigo, alfalfa, calabaza, pimiento dulce, guisante, quingombó u ocra Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

38 2) Cauliflower Mosaic Virus(CaMV CaMV) Se han identificado: Tres métodos para la detección del virus CaMV Chaouachi et al., Eur Food Res Technol(2008) 227: CAP y CRT (manuscrito en preparación). Variación natural : 29 genomas de CaMV disponibles en GenBank La validación?de un método para la detección de contaminación por CaMV, teniendo en cuenta la gran variación natural presente en el virus Métodos para detección CaMVpuede enviarse a la red ENGL sin necesidad de una validación completa Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

39 5) T-35S from pcambia vector 30% de las publicaciones revisadas : presente en OMG No autorizados (Komoriet al, 2007 ) arroces MG han sido transformadas con vector pcambia - 83 arroces MG en ensayos de campo Se ha comprobado In silico e in vivo que no hay amplificación en el ADN extraído de OMG autorizados en la UE, ni los OMG bajo el Reglamento (UE)619/2011 Resultadospositivos sobre muestras de arroz Btobtenidas de ensayos de campo transformadas con el vector pcambia. La Secuenciación del amplicónconfirmóla presencia del elemento diana. Sensibilidad: LOD de 10 HGE Publicacióndisponible (Fraitureet al./foodchemistry147 (2014) 60 68) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

40 Este método, por lo tanto, serviría para solucionar uno de los principales problemas analíticos, ya que sirve para identificar secuencias que únicamente están presentes en los OMG NO AUTORIZADOS - JRC llevara a cabo un análisis Bioinformático más detallado -Las conclusiones del AG-SMV, se anunciaron en ENGL Steering Committee, de marzo de 2014 Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

41 4) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

42 Incluir criterios para la interpretación n de los resultados en caso de señal dudosa producida en la detección n de Cry1Ab Centro 4.1 SYBR Green PCR methods (for P-35S, T-nos and Cry1Ab/Ac) 1. A GM genetic element is considered as being present when detected by a particular method meaning that both the measured T m -value and the C t -value fall within the criteria of a positive result, defined in point 2 and 3, below. In all other cases (thus, when any of these two values is outside the range for a positive result = T m - C t values are either pos-neg, or neg-pos, or neg-neg), the GM genetic element is considered as "not detected" by the applied method (see table 1). 2. For the C t values, a measurement is defined as positive only when an (exponential) amplification is observed and the fluorescence signal of the reaction is above the PCR threshold. In all other cases the measurement is considered negative. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

43 3. For the T m values, a positive result is obtained only if the following conditions are met: A) The measured T m value corresponds to the T m of the corresponding GM genetic element in the positive control (± 1 C) (9). B) For reactions with Ct 33 with the correct Tm value, the GM target is considered detected if the height of the T m peak is 20% of the height of the T m peak of the corresponding GM genetic element in the positive control (10). (9) In the case of Cry1Ab/Ac the Tm should be compared to both positive controls (maize Bt11 and maize Mon810) as outlined in the corresponding technical guidance document. (10) The Tm peak height should be established when the amplification curve has reached its plateau and, if possible, be averaged over repeated reactions; and the value of 20% should only be used in case the amplification of the control reaction has reached its plateau. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

44 5) 2ª Versión (marzo 2014) Modificaciones en el cálculo de la incertidumbre Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

45 Cambios en la preparación de mezclas de Materiales de Referencia (Versión 2) 1.-Cambios en la preparación de Mezclas de ADN Solución A = ADN extraído de GM positivo ( p.ej. 100 % MG ) Solución B = ADN extraído de GM negativo (p.ej. 0 % MG) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

46 2.-Cálculo de Incertidumbre en las de Mezclas de MRC AOCS 0406-A < 2,0 g/kg de maíz MON88017/ MON89034/ MON87460 AOCS 0906-E Maíz MON > 994,25 g/kg Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

47 Ejemplo : Preparación de MR con un Fracción de masa 10 g/kg ( 1 % m/m) 0,01 g de MR 100 % MG 0,99 g de MR 0 % MG Fracción de masa = 10 mg/kg Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

48 INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA PESADA Incertidumbre de balanza (p.ej. Incertidumbre estándar relativa de 0,4 %) Material MG 0,01 g (0,01000 ±0,00004) g Material No-MG 0,99 g ( 0,99000 ±0,00396) g Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

49 INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA PUREZA DEL MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO MRC MG > 985 g/kg MRC No MG < 1 g/kg La pureza del material MG (1,0000 ±0,0077) La impureza del material No MG (0,0000 ±0,0005) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

50 Incertidumbre estándar Combinada Incertidumbre expandida U = k µ ( k= 2) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio

51 MUCHAS GRACIAS Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos Silvia Gil Alcalde Josefina Gangoso Herreras Mª del Camino Martín n Forero Esther Rico Cañada ada Mª Luisa Salvador Pulgar Mª Isabel Rodríguez PérezP Miriam Gómez G Martín Mercedes Fernández ndez de la Puebla Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos.Centro, 10 al 12 de junio