RESULTADOS Perfil Electroforético (SDS-PAE) de Proteínas Solubles de. lamblia S/M 83 H7 Se realizó la separación de proteínas del extracto antigénico soluble de. lamblia mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12 % en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAE) para conocer el patrón de proteínas. La figura 1 muestra el perfil electroforético de las proteínas solubles de. lamblia S/M 83 H7 que consistió en una mezcla heterogénea de proteínas de diferentes masas moleculares, que se encuentran en un rango de 21 a 203 kda. Fusión de Células de Bazo con Células de Mieloma P3X63.A8 Para la generación de anticuerpos monoclonales se realizó la fusión celular utilizando células de bazo obtenidas a partir de ratones infectados con trofozoítos de. lamblia, con células de mieloma P3 X 63.Ag8. Posterior a la fusión se obtuvieron 33 hibridomas de células B, con los cuales se realizó el tamizaje utilizando los métodos de ELISA, Inmunofluorescencia y Dot-Blott, con la finalidad de obtener los hibridomas específicos hacia proteínas del parásito. 16
kda A B 200 11 97 66 45 31 21 Figura 1. Perfil Electroforético (SDS-PAE) de Proteínas Solubles de. lamblia Cepa S/M-H7. El carril A muestra al marcador de masas moleculares y el carril B el patrón de proteínas solubles de. lamblia cepa S/M-83-H7. 17
Tamizaje de los Hibridomas de Células B. El tamizaje se realizó para obtener los hibridomas de células B específicos contra antígenos de. lamblia. La Inmunofluorescencia indirecta de trofozoítos fue utilizada para identificar a los hibridomas de células B que reconocen proteínas de superficie, para esto se utilizaron trofozoítos S/M 83 H7 y de un aislado clínico de la región (MH), obteniendo 5 hibridomas específicos hacia proteínas que se encuentran solamente en la superficie de la clona S/M 83 H7 (figura 2), estos fueron los anticuerpos monoclonales 58, 1B10, 3C10, 3D10, 2C9 y la clonas 58.B5 y 58.D7, 2C9.D11, 3C10.E5, 3C10.E9 y 3C10.F8. Igualmente se utilizó el ensayo de Dot-Blotting para identificar hibridomas capaces de reconocer proteínas solubles (figura 3), utilizando como antígeno el extracto de proteínas solubles de. lamblia S/M-83 clona H7, B clona C6 y el aislado clínico JJ. Se confirmó el resultado obtenido en los análisis de microscopia de fluorescencia, ya que estos hibridomas solo reconocieron proteínas de la cepa S/M-83-H7. Adicionalmente se observaron otros hibridomas que reconocen proteínas de. lamblia S/M-83-H7 como son los hibridomas 3C3, 3C5, 4C7 y 5F4. Los resultados mediante la técnica ELISA de los sobrenadantes fueron negativos para todos los hibridomas. 18
Contraste de fases Inmunofluorescencia Contraste de fases Inmunofluorescencia Figura 2. Reconocimiento de Antígenos de Superficie de. lamblia por los Anticuerpos Monoclonales enerados. Se muestra la inmunofluorescencia indirecta en los recuadros, A y B representan el control de trofozoítos sin teñir, el anticuerpo policlonal anti-. lamblia (suero control positivo en dilución 1:20) esta representado por los recuadros C y D, los recuadros E y F muestran el control de medio (HAT) y al igual que estos controles también se realizó tinción de un control negativo con un suero de ratón preinmune (datos no mostrados). Los recuadros y H (58), I y J (58.D7) y K y L (3C10) muestran la presencia de anticuerpos en el sobrenadante de los hibridomas respectivos. 19
PBS HAT (-) + 1B10 2C9 3C10 3D10 58 58. B5 58. D7 5F4 4C7 3C5 3C3 Figura 3. Reconocimiento de Antígenos Solubles de. lamblia por los Anticuerpos Monoclonales Mediante Dot-Blotting. Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal especifico hacia. lamblia, como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, los controles de PBS y HAT). Se utilizaron proteínas solubles de. lamblia de la clonas S/M 83 H7 (), B C6 () y el aislado clínico JJ (), la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 1B10, 2C9, 3C10, 3D10, 58, 58.B5, 58.D7, 5F4, 4C7, 3C5 y 3C3 se muestra en la figura (anexo 8 muestra los resultados por ensayo). 20
Isotipo de los Anticuerpos Monoclonales Específicos Hacia. lamblia Con el propósito de identificar el isotipo de los anticuerpos monoclonales específicos hacia antígenos de. lamblia, se realizó el método de ELISA, utilizando anticuerpos específicos para cada uno de los isotipos de los anticuerpos de ratón (IgA, IgM, Ig1, Ig2a, Ig2b e Ig3). Se observó que 8 hibridomas de células B y 6 clonas presentan un isotipo Ig2b (2C9, 2C9.D11, 3C10, 3C10.E5, 3C10.E9 y 3C10.F8, 3D10, 58, 58.B5, 58.D7, 5F4, 4C7, 3C5 y 3C3) en tanto que solo un hibridoma resultó de isotipo Ig2a (1B10) (anexo 9). Reconocimiento de los Antígenos Inmunodominantes de la Cepa S/M 83 H7 por Parte de los Anticuerpos Monoclonales Anti-. lamblia. Para identificar la masa relativa de los antígenos de. lamblia reconocidos por los anticuerpos monoclonales, se realizó el ensayo estern blotting utilizando los anticuerpos monoclonales seleccionados mediante el ensayo de Dot-Blott, donde en ensayos preliminares fue observado que el reconocimiento de los anticuerpos monoclonales era sensible a la presencia de SDS y β-mercaptoetanol (4 % de SDS y 2 % de β-mercaptoetanol), concentraciones utilizadas en condiciones estándar de electroforesis. Tras modificar las condiciones desnaturalizantes y reductoras de electroforesis (0.05 % de SDS y 0.05 % de β-mercaptoetanol). Se observó un reconocimiento antigénico de moléculas del parásito con masa molecular relativa de 71 kda por los hibridomas 58.D7, 3C10.F8, 1B10, 58.B5, 3C10.E5. Esta proteína también fue reconocida por sueros de ratones infectados tanto en una primoinfección como en reinfección (figura 4). Los hibridomas: 3C3, 3C5, 3D10, 4C7, 5F4, 3C10.E9 y 2C9.D11 no reconocieron antígenos de. lamblia bajo las condiciones utilizadas, sugiriendo que el reconocimiento de estos anticuerpos es hacia epítopes conformacionales. 21
Figura 4. Reconocimiento Antigénico de los Anticuerpos Monoclonales Anti-. lamblia Mediante estern Blotting. Carril 1 suero obtenido de ratón infectado (S. P. I.), carril 2 suero obtenido de ratón reinfectado (S. R. I.), carril 3 58.D7, carril 4 al 3C10.F8, carril 5 al 1B10, carril 6 al 58.B5, carril 7 al 3C10.E5, carril 8 a un anticuerpo irrelevante (40F) y carril 9 medio D5F. En la figura se indica la banda antigénica de iardia cepa S/M 83 H7 reconocida por los anticuerpos monoclonales, que reconocen bajo condiciones modificadas de desnaturalización y reducción (0.05 % de SDS y 0.05 % de β-mercaptoetanol). 22
DISCUSIÓN Con la finalidad de generar anticuerpos monoclonales dirigidos hacia antígenos inmunodominantes de. lamblia, a partir de células que se activaron durante la infección por este parásito en ratones de la cepa C3H/HeJ, los ratones fueron infectados en 3 ocasiones, con 5 x 10 6 trofozoítos para favorecer la activación de las clonas especificas al parásito. Posterior a la última infección los ratones se sacrificaron y se extrajeron las células de bazo, para fusionarlas con células de mieloma P3 X 63.Ag8, obteniendo 33 hibridomas de células B, posterior al tamizaje se obtuvieron 9 hibridomas y 6 clonas específicos hacia. lamblia provenientes de la respuesta inmune provocada por el parásito, por lo que estos anticuerpos monoclonales reconocen antígenos presentados naturalmente durante la infección, los cuales son probablemente inmunodominantes. Contrario a Heyworth y col. (1989), que generaron anticuerpos monoclonales a partir de ratones inmunizados intra-peritonealmente con trofozoitos de. muris, que no necesariamente representan a los antígenos inmunodominantes del parásito, puesto que el proceso inflamatorio es generado de forma obligada por el adyuvante y ajena a la inmunogenicidad que las proteínas pudieran expresar en una giardiasis. Lo anterior aporta evidencias que sugieren que aun cuando el parásito no invade al organismo, éste es capaz de desencadenar una respuesta inmune humoral sistémica, lo cual implica un panorama complejo en cuanto a un modelo que pueda explicar el transporte de proteínas del parásito, tomando en cuenta que la mayoría de los antígenos reconocidos son de superficie y de tipo conformacional. Para seleccionar a los hibridomas de células B específicos contra antígenos de. lamblia generados a partir de la fusión, se realizó el tamizaje utilizando inmunofluorescencia indirecta de trofozoítos de. lamblia de la clona S/M-83-H7 y del aislado clínico MH, obteniéndo de esta manera 5 hibridomas con anticuerpos 23
específicos contra proteínas de superficie de trofozoítos de. lamblia S/M-83-H7 ya que solamente los trofozoítos de esta clona fueron reconocidos por los anticuerpos monoclonales, resultando los trofozoítos del aislado clínico negativos a la fluorescencia. Al realizar Dot-Blott de los anticuerpos monoclonales se obtuvieron 9 hibridomas (1B10, 2C9, 3C10, 3D10, 58, 5F4, 4C7, 3C5 y 3C3) y 6 clonas, (2C9.D11, 3C10.E5, 3C10.E9 y 3C10.F8, 58.B5 y 58.D7) específicas solo hacia antígenos de. lamblia S/M-83-H7 como se observa en la figura 3, de tal manera que se generaron hibridomas de células B que reconocen proteínas tanto de superficie como intracelulares exclusivamente de. lamblia S/M 83 H7, debido probablemente a la variabilidad antigénica que presenta el parásito, lo que explicaría por qué estos anticuerpos monoclonales no son capaces de reconocer proteínas de otras cepas del parásito. La determinación del isotipo de los anticuerpos monoclonales fue realizada mediante la metodología de ELISA, dando como resultados Ig2b para los hibridomas 2C9, 3C3, 3C5 3C10, 3D10, 4C7, 5F4, 58, las clonas 2C9.D11, 3C10.E5, 3C10.E9, 3C10.F8, 58.B5 y 58.D7 y solo un hibridoma resultó ser de isotipo Ig2a (1B10). El cambio de isotipo por una célula B esta influenciado por varios factores entre los que encontramos el microambiente de citocinas en el que se presenta o se capta el antígeno así como también las citocinas liberadas por los linfocitos T durante la presentación del antígeno para potenciar la respuesta hacia éste. Entre otros factores, lo anterior sugiere que estas clonas fueron activadas generando células B de memoria y bajo la influencia de TF-β ya que esta citocina se encuentra relacionada con el cambio de isotipo a Ig2b, en contraste con el cambio de isotipo hacia Ig2a en el cual la interleucina involucrada es IFN-γ (Peng y col., 2001). El tipo de respuesta aparente que se está presentando combina tanto la respuesta humoral como celular, ya que los altos niveles de TF-β inhibe la inflamación, de esta manera se modera el daño al intestino, así como también junto con IL-5 promueve el cambio de isotipo y secreción de IgA en intestino (Kaminski y Stavnezer, 2006., Choi y col., 2007), por lo que la recirculación de células B activadas pudo transportarlas a bazo para que la respuesta sea sistémica donde bajo la 24
influencia solo del TF- β maduraron con un cambio de isotipo hacia Ig2b. Otro mecanismo que pudiera estar presentándose es el transporte de antígenos de. lamblia hasta el bazo donde pudieran ser captados por células B, activándolas generando anticuerpos anti-. lamblia generándose de esta manera una respuesta inmune humoral sistémica. El reconocimiento de las proteínas de. lamblia fue realizado por el método de estern-blotting modificando al 0.05 % las condiciones reductoras y de desnaturalización. Se identificó el reconocimiento de la banda proteica de aproximadamente 71 kda por parte de los hibridomas: 58.D7, 3C10.F8, 1B10, 58.B5, 3C10.E5, esto nos dice que el reconocimiento de los hibridomas generados es hacia epítopes conformacionales, así como el reconocimiento de los hibridomas 3C3, 3C5, 3D10, 4C7, 5F4, 3C10.E9, 3C10.F8, 2C9.D11 que no reconocieron bajo estas condiciones, pero que reconocen proteínas en su forma nativa de. lamblia en dotblotting. De esta manera los anticuerpos monoclonales generados a partir de infección de ratones reconocen epítopes conformacionales de proteínas de superficie así como proteínas intracelulares solo de la cepa S/M 83 H7. Adicionalmente, se observa que esta banda proteica es reconocida por anticuerpos Ig durante la infección en el modelo murino, lo que es esperado ya que como se mencionó anteriormente, estos anticuerpos monoclonales fueron generados a partir de ratones infectados. La activación de células B de bazo para generar memoria a partir de la infección provocada por un parásito que radica en el lumen intestinal de manera no invasiva, así como el mecanismo por el cual se lleva acabo el transporte de antígenos hasta el bazo, aun no es comprendido a pesar de las evidencias que demuestran que la respuesta inmune humoral se presenta. Sin embargo, se sabe que existe un sistema de transporte de moléculas en el intestino en el cual están implicadas las células M, las cuales transportan proteínas o complejos proteicos (antígeno-anticuerpo) hacia el interior del intestino en donde son presentados a las diferentes células efectoras tales como linfocitos B, células dendríticas y éstas a los 25
linfocitos T, activándose las células específicas, siendo este tal vez el panorama que se éste presentando aún en un nivel mucho más complejo (Abbas, 1998). Los anticuerpos monoclonales generados durante este estudio ayudarán en el desarrollo de futuras investigaciones encaminadas a caracterizar bioquímica e inmunológicamente a los antígenos inmuno-dominantes del parasito, así como para conocer su interacción con el hospedero y la inmuno-biología de los antígenos de. lamblia. 26