EVALUACIÓN MORFOMÉTRICA DE CÉLULAS DE MANZANA (Malus domestica) Y SU MECÁNICA CELULAR A TRAVÉS DE ANÁLISIS DE IMÁGENES Y MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA

Transcripción

1 XIX National Congress of Biochemical Engineering VIII International Congress of Biochemical Engineering XII Biomedicine and Molecular Biotechnology Scientific Meetings Clave: CAL188STE EVALUACIÓN MORFOMÉTRICA DE CÉLULAS DE MANZANA (Malus domestica) Y SU MECÁNICA CELULAR A TRAVÉS DE ANÁLISIS DE IMÁGENES Y MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA AUTORES: Stefany Cardenas Pérez 1, Jorge Chanona Pérez 1, Juan Méndez Méndez 2, Georgina Calderón Domínguez 1, María de Jesús Perea Flores 2, Elier Ekberg Neri Torres 1 DIRECCIÓN DE LOS AUTORES 1 Departamento de Ingeniería Bioquímica, Sección de Graduados e Investigación. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n México D.F., C.P Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías, IPN. Luis Enrique Erro s/n, Zacatenco, México D.F., C.P CORREO ELECTRÓNICO stefany_fany03@hotmail.com; jorge_chanona@hotmail.com

2 INTRODUCCIÓN Los atributos sensoriales tales como el color, textura, firmeza y jugosidad determinan la aceptación de los alimentos, principalmente en las frutas donde estas propiedades son ampliamente cotizadas por los consumidores. Sin embargo, éstas se pierden rápidamente por la alta velocidad de maduración que presentan los frutos climatéricos durante su almacenamiento. Los cambios morfométricos de las células de un fruto climatérico pueden ser considerados como un índice de calidad, ya que durante el almacenamiento de los frutos sus células sufren cambios que modifican el tamaño celular por pérdida de turgencia, humedad así como la estructura de los tejidos afectando así sus propiedades mecánicas. Aunque el cambio de las propiedades mecánicas de los frutos durante su almacenamiento ha sido ampliamente estudiado desde un punto de vista macroscópico, actualmente son escasos los estudios dedicados a evaluar las propiedades mecánicas a nivel celular en tejidos vegetales. Hoy en día gracias al desarrollo de técnicas de microscopía de última generación es posible estudiar las propiedades mecánicas a nivel celular. Es por ello que éste trabajo consistió en evaluar el tamaño de las células de manzana mediante una metodología de análisis de imágenes así como su mecánica celular mediante microscopio de fuerza atómica biológico. OBJETIVOS El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la morfología y las propiedades mecánicas a nivel celular en tejido de manzana (Malus domestica cv. Golden delicious) MATERIALES Y MÉTODOS Se llevó a cabo el estudio de los tejidos vegetales caracterizando la morfología de las células con microscopía óptica. Para ello se utilizó manzana de la variedad Golden delicious adquirida en la central de abastos del Distrito Federal proveniente de Chihuahua, la cual se obtuvo en estado inmaduro (verde). Se utilizó una rebanadora para obtener cortes delgados de la parte perimetral de la manzana de acuerdo a Seguí y col., (2010), adicionalmente se utilizó una parrilla de calentamiento para realizar una hidrólisis de las células embebidas en una solución de manitol con agitación intermedia y calentamiento ligero según McAtee y col., (2009). Las células aisladas fueron contrastadas empleando técnicas de histología específicas. Posteriormente, las células se observaron en microscopio óptico de contraste de fase (Nikon, Eclipse 50i, Japan) y con el cual se obtuvieron las imágenes de las células, para posteriormente analizar la morfometría de las células con el programa ImageJ.

3 Adicionalmente, se utlizó un criotomo para obtener cortes de m, posteriormente se observó y evaluó la morfología con microscopio de fuerza atómica biológico con microcantilever de punta piramidal (RTESP-Bruker, USA). DESARROLLO El aislamiento de células se llevó a cabo mediante la extracción de tejido parenquimático de la parte perimetral del fruto. Se utilizó una solución de manitol (0.3 M) la cual se sometió a calentamiento (45 C) con agitación por 30 minutos en una parrilla de agitación según McAtee y col., (2009). Las células aisladas se tiñeron con azul de metileno para poder ser observadas en microscopio de contraste de fase. Las imágenes obtenidas con el microscopio Nikon, Eclipse 50i, Japan fueron procesadas para su análisis en el programa ImageJ v 1.48j para obtener los parámetros de área, diámetro y circularidad de aproximadamente 200 células. Se realizó el corte de tejido parenquimático de la parte media del fruto según Seguí y col., (2010), se utilizó un microscopio de fuerza atómica biológico (Bioscope Catalyst, Bruker, USA) con el cual se indentaron los tejidos utilizando microcantilevers de punta piramidal. Para realizar las pruebas de la mecánica celular y poder obtener las curvas de fuerzas de las células, la punta del microcantilever deberá tocar las muestras y generar diferentes puntos de indentación, así la información que puede ser obtenida a partir de estas indentaciones comprende: curva de fuerza y posición en Z del piezoeléctrico en función del tiempo como se observa en la Figura 1. Desde las curvas de aproximación y retracción se pueden extraer las diferentes etapas de flexión del cantilever durante la indentación y las curvas de fuerza en función de la distancia de la punta-muestra, así como los siguientes parámetros: Modulo de Young, fuerza de adhesión, deformación (dureza) y fuerza de disipación. A B Figura1. En A se muestra la representación de indentación de la punta en la muestra. Mientras que en B se observa la Curva de fuerza contra separación punta-muestra que típicamente es usada para determinar analíticamente las diferentes propiedades micro y nanomecánicas en células. Líneas azules indican aproximación y líneas rojas retracción. Para el estudio de las curvas de fuerza, algunos parámetros fueron fijados previamente como la constante de elasticidad (0.47 N/m), deflexión del

4 sensor (16.57 nm/v), módulo de poisson (0.5), ángulo de la punta (35 ), radio de la punta (20 ), de tal forma que se obtuvieron las curvas de fuerza a partir de las cuales se analizó la mecánica celular del tejido mediante la obtención del Módulo de Young. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las células aisladas se tiñeron utilizando técnicas histológicas para poder ser fácilmente observadas en microscópio y para su posterior caracterización en el programa de ImageJ v 1.48j, en el cual se realizó un pre-procesado de imágenes de las células, binarizandolas para su segmentación y finalmente la extracción de parámetros de interés como área, diámetro y circularidad (Figura 1). probablemente debido a que las células al ser sometidas a un proceso de agitación y calentamiento son afectadas en su morfología además al perder las sustancias de soporte éstas pierden homogeneidad morfológica. La circularidad de las células fue baja (0.68) y está asociada a la amplia distribución de tamaños, ya que los valores de circularidad también variaron ampliamente ( ) %. En la figura 2A) se observa la distribución de los diámetros celulares que no tuvo una distribución normal y en donde se puede ver que a menor tamaño celular, la circularidad es mayor (Figura 2B), mientras que conforme las células tienen mayor diámetro la morfometría es más heterogénea. Frecuencia (%) A 10 A Figura 1. Se observa la tinción de las células en A, mientras que en B se observa la segmentación de las células para su caracterización. A partir de la segmentación se obtuvieron los valores para aproximadamente 200 células, estos parámetros se analizaron estadísticamente. El análisis arrojo que los valores de área mostraron una extensa distribución de tamaños con comportamiento normal que oscilo entre los 590 a 163 m. Mientras que los valores de diámetro y circularidad no tuvieron distribución normal esto B Circularidad (-) Diámetro celular ( ) Diámetro celular ( ) B Figura 2. Distribución de la morfometría celular con relación al diámetro y circularidad.

5 En la Tabla 1 se muestran los valores de la morfometría de las células de manzana, que mostró una distribución amplia con diámetro celular entre Tabla 1. Valores de morfometría y mecánica celular de células de manzana. Parámetro Promedio ± desv Diámetro ( m) 246±37 Área ( m 2 ) 353±86 Circularidad (-) 0.68±0.12 Módulo de Young 0.130±0.014 (MPa) Las indentaciónes de las células se hicieron con ayuda del MFA-Bio, obteniendo las curvas de fuerza (Figura 3) para cada una de las indentaciones, mediante el programa Nanoscope Analysis se obtuvieron los módulos de Young. Los resultados de la mecánica celular mostraron que la variación del módulo elástico fue también amplia mostrando un coeficiente de variación del 19%. Figura 3. Curva de fuerza obtenida en la indentación de células de manzana mediante Microscopio de Fuerza Atómica Biológico. La curva de fuerza se obtuvo mediante el programa de Nanoscope Analysis con el cual se ajustó a un modelo de Sneddon con el que se obtuvo mejor ajuste con una R 2 de Los módulos de Young que se obtuvieron fueron entre 0.130±0.014 MPa, estos son menores a los obtenidos en células animales aisladas como células de pulmón MPa reportadas por Weisenhorn y col., (1993) que carecen de pared celular y por consiguiente son más suaves que las células vegetales. Este resultado es importante ya que en la literatura especializada se carece de valores de propiedades mecánicas en células de ejidos vegetales comestibles. CONCLUSIONES Se desarrolló una metodología de aislamiento celular sencilla, para evaluar la morfometría celular así como su mecánica celular. Mediante análisis de imágenes, se caracterizó la morfometría de las células mientras que con la microscopía de fuerza atómica biológica se pudo determinar el módulo de elasticidad de las mismas, que fue mayor a los valores reportados para células animales. Finalmente, el modulo de Young indicó la dureza de las células vegetales, las cuales al tener pared celular presentaron un valor de elasticidad mayor que las células animales. Estos estudios podrían ser útiles en particular en las frutas climatéricas debido a que ayudan a explicar el

6 comportamiento que existe a nivel celular así como los cambios mecánicos que se producen durante su manejo postcosecha. De esta manera la información obtenida podría ser valiosa para el entendimiento de los procesos y el control de la madurez de los frutos climatéricos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Oey, M.L., Vanstreels, E., De Baerdemaeker, J., Tijskens, E., Ramon, H., Hertog, M.L.A.T.M., Nicolai B. (2007). Effect of turgor on micromechanical and structural properties of apple tissue: A quantitative analysis. Postharvest Biology and Technology 44, Schaffer R.J., McAtee, A.P., Hallet I.C., Jhonston J.W. (2009) A rapid method of fruit cell isolation for cell size and shape measurements. 3. Seguí, L. Fito, P.J., Fito P. (2010) Analysis of structure-property relationships in isolated cells during OD treatments. Effect of initial structure on the cell behavior. Journal of Food Engineering 99, Weisenhorn, A.L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V. and Butt, H.J. (1993) Nanotechnology 4,