SÍNTESIS DE HIDROGELES PARA SU POSIBLE APLICACIÓN EN LIBERACIÓN CONTROLADA DE DROGAS.

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1 2 do Encuentro de Jóvenes Investigadores en Ciencia y Tecnología de Materiales Posadas Misiones, ctubre SÍNTESIS DE HIDRGELES PARA SU PSIBLE APLICACIÓN EN LIBERACIÓN CNTRLADA DE DRGAS. Julio C. Cuggino (1) Director/es: Prof. Dra. Cecilia Inés Alvarez Igarzabal (1) Departamento de Química rgánica Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba Ciudad Universitaria Haya de la Torre y Medina Allende- Ciudad de Córdoba - Córdoba jcuggino@fcq.unc.edu.ar TÓPIC: MATERIALES PLIMÉRICS RESUMEN Los hidrogeles son materiales poliméricos que forman una red tridimensional, tienen la habilidad de hincharse en agua, manteniendo su forma hasta un determinado equilibrio sin disolverse. El proceso de absorción de agua es reversible y en numerosos casos dependiente de las condiciones ambientales a las que el hidrogel es sometido. Esta importante característica que les permite controlar la absorción-desorción del líquido, permite que los hidrogeles sean utilizados como sistemas de liberación controlada de drogas en diferentes áreas. En base a esta importante aplicación, en este trabajo se realizó la síntesis y caracterización de nuevos hidrogeles. Los mismos se sintetizaron por polimerización a radicales libres, en solución, usando monómeros tales como N-isopropil acrilamida (Nipa) y N-acriloil tris(hidroximetil) aminometano (NAT) entrecruzados con dialiltartradiamida (DAT) a 25 ºC. Se utilizó agua como solvente, persulfato de amonio (APS) como iniciador y tetraetilenmetilendiamina (TEMED) como activador. Los nuevos materiales fueron caracterizados mediante la evaluación de algunos parámetros de red, tales como peso molecular entre puntos de entrecruzamiento (M c ), fracción en volumen de polímero en estado hinchado (v 2s ) y tamaño de poro (ξ) en función de la temperatura. Además, se realizaron estudios de cinética de hinchamiento en agua, y se determinaron los correspondientes coeficientes de difusión (D). Palabras claves: Hidrogeles termosensibles, parámetros de red, hinchamiento, liberación de drogas. INTRDUCCIÓN Los Hidrogeles son materiales poliméricos que forman una red entrecruzada con forma tridimensional. Estos materiales pueden tener origen natural o sintético y tienen la interesante propiedad que se hinchan en contacto con agua u otro fluido formando materiales blandos y elásticos, pero no se disuelven [1]. El proceso de absorción de agua es reversible y muchas veces dependiente de las condiciones a las que el material está sometido. Algunos estímulos físicos como temperatura, luz, presión o químicos como ph, fuerza iónica y algún evento de reconocimiento molecular, han sido aplicados para inducir estas respuestas inteligentes [2-4]. Esta importante característica de manejar el hinchamiento-deshinchamiento de estos materiales según el medio circundante, además de su gran retención de agua, lo cual los haría biocompatibles, permite a los hidrogeles ser buenos candidatos para utilizarlos en sistemas de liberación de drogas controlada por estímulos. Para la liberación controlada en sistemas vivos y en particular en el cuerpo humano, la temperatura es una variable que se pueden utilizar cuando se piensa en diseñar un sistema que responda a este estímulo. Como ya es conocido, los polímeros de poli (N-isopropilacrilamida) han sido ampliamente estudiados debido a que presentan cambios reversibles de su estado hinchado-deshinchado de acuerdo a la temperatura [5]. La temperatura crítica de esta transición de fase (LCST, lower critical solution temperature) se encuentra

2 alrededor de los 32 ºC. Por debajo de esta temperatura el material permanece hinchado, pero por encima de la misma el gel colapsa y se deshincha [6]. Con el objetivo de modificar la LCST de estos polímeros hacia temperaturas cercanas a la del cuerpo humano ( 37 ºC), varios investigadores han tratado de co polimerizar a NIPA con monómeros hidrofílicos, lo cual, retardaría la formación de interacciones hidrofóbicas que dan origen a la transición. Por otro lado, el monómero hidrofílico N- acriloil -TRIS (hidroximetil) aminometano (NAT), ha sido muy poco utilizado para la síntesis de hidrogeles. Solo algunos trabajos reportan el uso de este monómero en geles de electroforesis o como un componente de arcrilamidas multifuncionales [7-8]. En adición, la elección de este monómero como co-monómero de NIPA tendría la posibilidad de aumentar la LSCT, proporcionarle al material un control de su hinchamiento ph dependiente, además de introducir al material grupos funcionales útiles para futuras modificaciones. Con lo mencionado anteriormente, conocer la retención de agua y las propiedades estructurales (tamaño de poro, peso molecular entre puntos de entrecuzamientos) en función de la temperatura de estos polímeros, es el punto de partida para una futura aplicación en sistemas de liberación controlada de agentes activos con estímulos de temperatura. Por tal motivo, en este trabajo se realizó la síntesis de nuevos hidrogeles inteligentes, con dos objetivos principales. El primero, fue cambiar la LCST de los hidrogeles hacia temperaturas más elevadas y cercanas a 37 ºC co-polimerizando NIPA con NAT. El segundo, analizar como afectan las diferentes composiciones monoméricas (NIPA-NAT) y la temperatura en: la velocidad y retención final de agua y en los parámetros estructurales de los materiales. PRCEDIMIENT EXPERIMENTAL 1. Síntesis de los Hidrogeles La síntesis de los hidrogeles fue realizada por polimerización radicalaria en solución acuosa utilizando NIPA y NAT como monómeros y dialiltartradiamida (DAT) como agente entrecruzante (Figura 1), persulfato de amonio (APS) como iniciador y tetraetilenmetilendiamina (TEMED) como activador. En un procedimiento típico, los monómeros, agente entrecruzante y APS fueron disueltos en agua en un tubo de ensayo y agitados por 20 minutos en un ultrasonido, tras lo que se burbujeó nitrógeno por 5 minutos. Por último, se adicionó la solución acuosa de TEMED y la reacción se llevó a cabo por 24 hs a 25 ºC. Las condiciones experimentales se muestran en la Tabla 1. Una vez finalizada la reacción, los tubos fueron rotos y los hidrogeles extraídos. Los productos en forma de barra fueron cortados en discos de 3-4 mm de espesor, se realizaron 3 lavados de los mismos con agua destilada y se dejaron secar en bomba de vacío por 2 días a 25 ºC. NAT H 2. Experimentos de Hinchamiento NIPA CH 3 CH 3 Figura 1. Monómeros y agente entrecruzante utilizados. 2.1 Dinámica y equilibrio de hinchamiento: Muestras secas fueron colocadas en agua y mantenidas a temperatura ambiente (22 ºC), para determinar su comportamiento de hinchamiento. Las muestras hinchadas se removieron del baño de agua a diferentes intervalos de tiempo, fueron secadas superficialmente con papel tissue, pesadas y colocadas nuevamente en el baño de agua. Las medidas fueron realizadas hasta peso constante. La determinación de la relación de hinchamiento en peso a cada tiempo (q w ) se realizó gravimétricamente utilizando la ecuación 1. La misma relación, pero en el equilibrio fue calculada a partir de la ecuación 2: q w = m h / m s (1) q w,e = m e / m s (2) donde, m h es la masa del hidrogel hinchado a cada tiempo, m e es la masa del hidrogel hinchado en el equilibrio y m s es la masa del hidrogel seco. DAT

3 Para las curvas de cinética de hinchamiento, se graficó q w en función del tiempo (min). Para determinar el tipo de transporte del agua dentro de las matrices, se usó la ecuación 3 [9]: F = M t / M = k t n (3) donde M t denota la cantidad de agua difundida dentro del hidrogel a tiempo t (masa hinchada a tiempo t masa seca) mientras que M corresponde a la cantidad de agua difundida dentro de la matriz a tiempo infinito (en el equilibrio), k es una constante relacionada con la estructura de la red y el exponente n es un número que determina el tipo de transporte. Así, se grafica ln F versus ln t utilizando solo los valores hasta un 60 % de hinchamiento y luego se calcula n y k a partir de la pendiente y de la ordenada al origen de las líneas, respectivamente. El coeficiente de difusión del agua a través de las redes fue calculada de la ecuación 4 [9]. donde r = radio del hidrogel seco. D = π r 2 (k/4) 1/n (4) 2.2 Hinchamiento de la red en función de la temperatura: Para los estudios de hinchamiento en respuesta a la temperatura, los hidrogeles secos fueron equilibrados en buffer fosfato a ph=7,4 en una rango de temperaturas entre 20 y 80 ºC por 24 hs. A cada temperatura los hidrogeles fueron removidos del agua, secados superficialmente con papel tissue y pesados. Luego, fueron re equilibrados a una nueva temperatura y los pesos hinchados fueron tomados nuevamente luego de 24 hs. El hinchamiento de equilibrio y algunos parámetros de red a cada temperatura fueron calculados para todos los hidrogeles. 3. Parámetros estructurales de las redes [9] La densidad ρ de cada producto fue determinada midiendo la masa, el radio y el espesor de los discos secos. El Volumen aproximado fue calculado como un cilindro. La fracción en volumen de polímero en el estado hinchado v 2s fue calculado como la ecuación 5: v 2s = [ 1 + (((m e /m s 1) ρ 2 ) / ρ 1 )] -1 (5) donde, ρ 2 = densidad del polímero seco y ρ 1 = densidad del liquido de hinchamiento. El peso molecular entre puntos de entrecruzamientos M c fue calculado de acuerdo a la ecuación 6: M c = ( (1-(2/Φ)) V 1 ρ 2 v 2r 2/3 v 2s 1/3 ) / (ln(1-v 2s ) + v 2s + χ v 2s 2 ) (6) donde, Φ = funcionalidad del entrecruzante (Φ=4), V 1 = volumen molar del solvente (18ml mol -1 ), χ = parámetro de interacción entre polímero y solvente (χ = 1/2 + v 2s /3) y v 2r = fracción en volumen del polímero después de su preparación calculado como ecuación 7 y 8: v 2r =C 0 V r (7) V r = (M NIPA f NIPA + M NAT f NAT ) / ρ 2 (8) donde: C 0 = concentración inicial de monómeros (mol ml -1 ), V r = el volumen molar promedio de las unidades repetitivas del polímero, M= pesos moleculares de monómeros, f = fracción molar de monómeros. El tamaño de poro ξ de las redes fue calculado a partir de la ecuación 9 [10]: ξ = v 2s -1/3 (((2C n M c )/ V r ) 1/2 ) l (9) donde, C n = radio característico de Flory del polímero para un solvente determinado (aproximado como el valor de NIPA C n = 9.2) y l = largo de los enlaces de la cadena principal del polímero (1.54 Ǻ para polímeros vinílicos). RESULTADS Y DISCUSIÓN

4 1. Síntesis de los Hidrogeles Todos los hidrogeles sintetizados resumidos en la Tabla 1 dieron polímeros del tipo barra insolubles. La masa total de polímero respecto a monómeros inicial puestos a reaccionar fueron aproximadamente iguales lo cual indicaría que el rendimiento de las reacciones fue casi de 100%. Tabla 1.Condiciones de síntesis y resultados de dinámica y equilibrio de hinchamiento de los hidrogeles. NAT Mmol NIPA Mmol q w,e n k D (x 10-5 ) cm 2 /s H H H H H H a) a) Todos los geles fueron preparados con 5 ml de agua destilada, Mmol de DAT, Mmol APS y ml de solución acuosa de TEMED 0.32 M. 2. Experimentos de Hinchamiento 2.1 Dinámica y equilibrio de hinchamiento: Cuando geles secos se ponen en contacto con agua, en una primera instancia el agua comienza a penetrar dentro de la red polimérica a una velocidad determinada que comienza a disminuir poco a poco hasta llegar a un equilibrio. Este equilibrio se alcanza cuando las fuerzas que generan las moléculas de agua para ingresar y las fuerzas elásticas inversas que generan las cadenas de la red para contrarrestar dicho efecto son iguales. Según la composición química y estructural que los hidrogeles presenten, tanto la velocidad de entrada de agua como el valor de hinchamiento en equilibrio se verán modificados. En la Tabla 1 se muestran los resultados de los diferentes parámetros estudiados. El valor de q w,e disminuye conforme a la disminución de la cantidad de NIPA. Esta tendencia podría ser explicada en base a que la presencia del monómero NAT podría dar origen a mayores interacciones puente hidrogeno intramoleculares entre las cadenas, ya que posee tres grupos hidroxilos. De esta manera, las cadenas poliméricas tendrían una interacción puente hidrogeno cada vez menor con el agua a medida que aumenta la cantidad de NAT en las estructura y menor cantidad de agua podría ser absorbida H1 H2 H3 H4 H q w tiempo (min) Figura 2. Dinámica de hinchamiento de los hidrogeles en agua. En la Figura 2 se muestran las cinéticas de hinchamiento en agua de los hidrogeles a 25 ºC. Interesantemente, el equilibrio de la mayoría de los hidrogeles se alcanza luego de 50 horas. Este lentitud de entrada de agua podria ser un indicio de que el agua no entra solo por difusión, sino que el polímero ejerce

5 algún efecto para reacomodar sus cadenas lo cual hace lento el proceso. Esta explicación se condice con los valores obtenidos que determinan el mecanismo de entrada de agua (n ver Tabla 1). Los valores de n de todos los hidrogeles se encuentran en el intervalo 0,5 1, lo cual indica que el proceso de hinchamiento está controlado tanto por difusión de agua como por relajación de las cadenas (tipo no Fickniano). De todos modos, se observa una tendencia de un incremento de n a medida que NIPA incrementa, lo cual podría deberse a la diferencia de hidrofilicidad que los dos monómeros presentan. La presencia de mayores grupos con características hidrofílicas en el monómero NAT haría que la difusión de agua en los primeros estadios se viera favorecida. Esta explicación es sostenida por los valores de D para cada una de las matrices. 2.2 Hinchamiento de la red en función de la temperatura: Con el objetivo de determinar la LCST de cada uno de los hidrogeles y el efecto de la presencia de NAT sobre la misma, los q w,e se determinaron como función de la temperatura. La Figura 3 muestra los resultados de los experimentos. q w,e Figura 3. Hinchamiento en equilibrio en buffer ph=7,4 en función de la temperatura Como era esperado, la incorporación del monómero NAT a la estructura de NIPA provocó un aumento en su LCST. Ademas, el hidrogel con un 100 % de NIPA en su estructura posee un transición de fase muy marcada, pasa de un estado hinchado a temperatura ambiente a un estado colapsado por encima de los 32 ºC. A medida que aumenta la cantidad de NAT en las redes el efecto de la variación del hinchamiento con la temperatura se ve cada vez menos marcado, posiblemente a la disminución de la presencia de grupos isopropilo aportados por NIPA que dan origen a la transicion. Un fenómeno interesante fue encontrado, el hidrogel H1 con NAT solo en su estructura, presenta una transición de fase entre 60 y 70 C, lo cual podría ser atribuida a la ruptura de las fuerzas puente hidrogeno entre las cadenas que aumentaría la cantidad de agua albergada. El fenómeno disminuye muy rápido con la disminución de NAT en la estructura. 3. Parámetros estructurales de las redes temperatura ( C) En base a evaluar la posibilidad de usar un hidrogel como un material de liberación de drogas con dependencia de la temperatura, conocer los parámetros que definen su estructura a diferentes temperaturas es muy importante. En la Tabla 2 se presentan los valores de v 2s y M c para los hidrogeles hinchados en agua, ademas se presentan los valores de v 2s y ξ obtenidos para cada uno de los hidrogeles a tres temperaturas diferentes calculados con los valores de M c (a cada temperatura) obtenidos para los hidrogeles hinchados en buffer ph= 7,4. Analizando la influencia de la composición monomerica en los parámetros de red obtenidos se puede observar que a medida que NIPA incrementa los valores de v 2s disminuyen a 22 C, ciertamente debido a su mayor hinchamiento. De acuerdo a ello ξ incrementa. Contrariamente a 35 C los valores de v 2s incrementan a medida que NIPA aumenta en la serie, por lo tanto ξ disminuyen. Este comportamiento se explica debido a H1 H2 H3 H4 H5

6 que a 35 C se está por encima de la LCST de NIPA, por lo cual disminuye el hinchamiento del gel y colapsa. Cuanta más cantidad relativa de NIPA en las muestras mayor y más rápido es el colapso. Una tendencia similar ocurre a 40. Tabla 2.Valores de los parámetros de red obtenidos a diferentes temperaturas. H a) 22 ºC en agua 22 ºC a ph= 7,4 35 ºC a ph=7,4 40 ºC a ph=7,4 v 2s M c g/mol v 2s ξ (Ǻ) v 2s ξ v 2s ξ H1 0, , , , H2 0, , , , H3 0, , , H4 0, , , , H5 0, , , ,610 4 Por otro lado, si observamos la influencia de la temperatura sobre los parámetros de red, podemos observar claramente que: H1 no presenta modificaciones en v 2s y ξ debido a que su estructura no presenta cambios con la temperatura. Sin embargo, modificaciones cada vez mas marcadas en los parámetros estructurales v 2s y ξ de los geles se observan a medida que la cantidad de NIPA aumenta, posible consecuencia de la propiedad del monómero NIPA de colapsar por encima de 32 C lo cual modifica la estructura de cada hidrogel. CNCLUSINES 1. En este trabajo, nuevos hidrogeles termosensitivos con diferente composición de monómeros como NIPA y NAT han sido sintetizados. 2. El valor de difusión de agua dentro de los hidrogeles para los primeros estadios de tiempo (D) mostró una mayor velocidad de entrada de agua en los hidrogeles con mayor cantidad de NAT, sin embargo los hinchamientos en equilibrio favorecieron a los geles con mayor cantidad de NIPA. 3. La temperatura de transición de fase critica LCST de polímeros con NIPA pudo ser modificada hacia valores mas cercanos a 37 C utilizando un 30 % del monómero NAT como copolímero, sin embargo la incorporación de NAT en las matrices provoca una transición de fase cada menos abrupta en función de la temperatura. 4. Los parámetros de red presentaron modificaciones más marcadas a medida que la cantidad de NIPA aumentó con variaciones en la temperatura entre 20 y 35 C. H4 y H5 presentaron las mayores diferencias de estos parámetros. 5. Las diferencia en el tamaño de poro de H4 entre 20 y 40 C, su alto grado de contenido de agua, además de su LCST mas cercana a 37 C permite pensar en la posible incorporación a este hidrogel de drogas con un tamaño de entre 40 a 300 Å donde su liberación podría ser controlada por la temperatura de ascuerdo a los ξ. REFERENCIAS 1. J. Kopecek, Polymer chemistry: swell gels, Nature 2002, 417: Liu, Y.Y; Fan X. D. Polymer 2002, 43: Kuckling, D.; Harmon, M. E.; Frank, C. W. Macromolecules 2002, 35: Suzuki, A.; Tanaka, T. Nature (London) 1990, 346: Zakir M.. Rzaev, Sevil Dincer, Erhan Piskin Prog. Polym. Sci. 2007, 32: Hirokawa Y, Tanaka T. Volume phase transition in a non-ionic gel. J Chem Phys 1984, 81: Saito N, Sugawara T, Matsuda T. Macromolecules 1996, 29: Kozulic M, Kozulic B, Mosbach K. Anal Chem 1987, 163: Tuncer Caykara, Simin Kiper, Gökhan Demirel. Eur. Pol. Journal 2006, 42: Gudeman L. F. and Peppas N. A. J Membrane Science 1995, 107: 239